CN105473129A - 在化妆品、饮食补充剂和/或功能食物中掺入培养的越橘细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了组合物，包括与化妆品组分或食物组分混合的培养的越橘细胞或其提取物，以获得化妆品、饮食补充剂和/或功能食物。培养的越橘细胞或提取物可具有高水平的多酚，伴随很少的花青素或无花青素。与来自常规越橘植物组织的多酚级分相比较，来自培养的越橘细胞的多酚级分是独特的。培养的细胞具有高水平的天然黄酮醇、黄烷-3-醇和原花青素，但显著缺乏花青素和绿原酸。

Description

在化妆品、饮食补充剂和/或功能食物中掺入培养的越橘细胞

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2013年6月26日提交的临时申请号61/839,808的利益和优先权，所述临时申请以引用的方式全文并入。

技术领域

本发明涉及具有抗炎和抗氧化剂特性的越橘细胞(bilberrycell)、由这些细胞制备的提取物和掺入细胞或提取物的组合物的产生。

背景技术

存在显著未满足的天然抗炎剂的需要。健康炎症应答是运转良好的免疫系统的标志。无论是被物理性损伤攻击、被微生物侵袭还是被外来物质污染，人体能够将杀伤细胞和防御化合物的军队驱使(herald)至损伤部位。局限性炎症是该应答的结果，并且在急性损伤的情况下，它是有效和适当的，只要它是短暂的。

当炎症应答变得延长时，炎症开始具有严重不利效应。随着时间过去，发炎组织开始分解且异常工作。这种功能丧失是如此严重，使得慢性炎症通常被视为慢性疾病的根源。慢性或不受控制的炎症可导致广泛范围的病理状态，包括脓毒症、癌症、关节炎、神经变性疾病、肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化。(GlassCK，SaijoK，WinnerB.，MarchettoM.C.，GageF.H.Mechanismsunderlyinginflammationinneurodegeneration.Cell.2010，140：918-934.；MedzhitovR.Originandphysiologicalrolesofinflammation.Nature2008，454：428-435.；GrivennikovS.I.，GretenF.R.，KarinM.Immunity，inflammation，andcancer.Cell2010，140：883-899.；HotamisligilG.S.Endoplasmicreticulumstressandtheinflammatorybasisofmetabolicdisease.Cell2010，140：900-917.)考虑到该严峻的列表，明确的是能够对抗慢性炎症及其不利效应的试剂具有潜在更大的价值。

然而，炎症只是促成慢性疾病的一种因素；另一种偶然因素是氧化。事实上，这两种因素是联系的，因为氧化性应激是炎症应答的主要触发剂。因此，如果不同时考虑氧化的作用，则炎症的任何讨论均是不完全的。活性氧(ROS)的增加连同氧化还原平衡中的伴随破坏，导致慢性炎症的状态。证据越来越多地指向氧化炎症作为老化和慢性疾病的主因的新出现的理论。已创造术语氧化-炎症-老化(oxi-inflamm-aging)，以描述该过程，并且存在发现用于其的补救措施的渐增需求(DelaFuenteM.，MiquelJ.Anupdateoftheoxidation-inflammationtheoryofaging：theinvolvementoftheimmunesysteminoxi-inflamm-aging.CurrPharmDes.2009，15(26)：3003-26)。

越橘(欧洲越橘(Vacciniummyrtillus))是具有医学使用的长期历史的几种植物之一。最出名的是其浆果的花青素(花青苷，anthocyanin)含量，越橘植物(特别是叶)还含有黄酮醇、儿茶素、原花青素(procyanidin)和酚酸。

然而，越橘难以生长且因此很少栽培。果实一般从在其有限生长季节(五月直到九月)期间发现的野生植物收集。因此，浆果的供应是不可靠的，并且浆果以有限数量可获得。此外，果实比相关蓝莓更柔软和多汁，使得它们必须手工收获，并且难以运输，这促成新鲜果实的高成本。还由于成熟果实的高需求，未成熟果实和叶并非经济上可行的收集产品，从而增强现有商业越橘衍生产品对花青素而不是未成熟材料中通常最多发现的原花青素的聚焦。

附图说明

图1举例说明了在本文描述的培养的细胞的一些细胞系中以高浓度产生的化合物；

图2显示了培养的越橘细胞的总离子质量色谱图，其举例说明了在培养的细胞中天然产生的广泛数目的多酚化合物；

图3显示了通过就快速生长和高多酚生产选择的培养的越橘细胞系的多酚生产的时序；和

图4举例说明了培养的越橘细胞的HPLC图谱。

具体实施方式

I.引言

本发明涉及掺入培养的越橘细胞或提取物的化妆品、饮食补充剂和/或功能食物，所述培养的越橘细胞或提取物具有高水平的多酚，伴随很少的花青素或无花青素。与来自常规越橘植物组织的多酚级分相比较，来自培养的越橘细胞的多酚级分是独特的。培养的细胞具有高水平的天然黄酮醇、黄烷-3-醇和原花青素，但显著缺乏花青素。花青素是深色化合物，其给予天然浆果其深色。因为本发明的培养的细胞产生很少的花青素或无花青素，所以细胞及其提取物是淡色至无色的，同时仍产生与植物组织相比较一样多或更多的有益多酚。已发现当掺入皮肤病学(dermatological)组合物、饮食补充剂和/或功能食物内时，本发明的培养的全细胞和提取物是令人惊讶地有力抗氧化、抗炎和抗老化化合物。

通过培养的越橘细胞产生的抗氧化剂和抗炎剂是天然衍生的化合物，其已显示产生合成的非类固醇抗炎药(NSAID)和皮质类固醇的利益中的许多，但没有与合成药物的长期使用相关的有害副作用。

除了是抗炎剂之外，培养的越橘细胞中的多酚中的许多也是有力的抗氧化剂。多酚的特征在于一种或多种羟基苯部分的存在，并且通常来源于类苯基丙烷(phenylpropenoid)生物合成途径。多酚作为一个类别还可再分成酚酸、芪、查耳酮、类黄酮、花青素及其他。这个类型的许多分子具有至少一些抗氧化和/或抗炎活性，并且虽然某些化合物已证明比其他有力得多，但广泛公认的是对多酚的暴露与慢性疾病的预防特别联系，并且与老化过程的缓和更一般联系(ScalbertA.，ManachC.，MorandC.，RémésyC.，JiménezL.Dietarypolyphenolsandthepreventionofdiseases.CritRevFoodSciNutr.2005；45(4)：287-306)。

来自培养的细胞的多酚级分由酚类分子的多样化混合物组成。培养的细胞产生原花青素包括二聚体、三聚体、四聚体等。除了广泛的B型原花青素之外，培养的越橘细胞还产生双重连接的A型原花青素，其是对越橘(越橘属(Vaccinium))独特的一类化合物。还存在黄酮醇，最通常以槲皮素和山柰酚苷的形式。槲皮素葡糖苷(异槲皮苷)是尤其丰富的，如二氢山柰酚(香橙素)一样。最后，存在酚酸：香豆酸、咖啡酸和芥子酸。在本发明的培养的细胞中天然产生的特别需要的化合物的例子可包括图1中所示的化合物的全部或一部分，包括儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素、香豆酸、异槲皮苷、原花青素B2和原花青素C1。

图2显示了培养的越橘细胞的总离子质量色谱图，其举例说明了在培养的细胞中天然产生的广泛数目的多酚化合物。

前述多酚中的许多已知天然存在于越橘中，但浓度比本文描述的培养的细胞中发现的更低。在本发明的一些实施例中，培养的越橘细胞含有在干重基础上的至少10％、15％、20％、25％多酚，和/或小于40％、35％、30％多酚，和/或在前述浓度的任意组合的范围内。

令人惊讶的是，这些浓度可伴随很少的花青素或无花青素而达到。花青素浓度可在干重基础上小于1.0％、0.5、0.1％、0.01或甚至0.001％。值得注意的是，花青素明显不存在于培养的细胞中。大多数越橘补充剂在颜色中是深紫色的，并且对花青素含量标准化，因此具有含很少的花青素或无花青素的越橘产品是相当独特的。细胞中的许多是几乎白色而不是紫色的事实在其中美学是重要的化妆品和食物中具有独特优点。

本发明的细胞还可含有很少的绿原酸(氯原酸，chlorogenicacid)。在一些实施例中，绿原酸可在干重基础上小于1％、0.1％或甚至0.01％。尽管没有要求，但使绿原酸降到最低对于某些人可为有用的，所述某些人可患有由于绿原酸存在的变态反应的致敏作用。

另外，在细胞培养物中生长的细胞不表达显著数量的叶绿素，所述叶绿素是在叶中发现的色素，其给予叶其深绿色。令人惊讶的是，培养的细胞具有类似于叶的代谢产物谱，即使培养的细胞非常不同于叶且不含例如叶绿素。叶绿素的量可在干重基础上小于0.1％、0.01％或0.001％，或基本上不含叶绿素。

已显示独特的多酚谱在掺入化妆品组合物、饮食补充剂和/或功能食物内时是高度有利的，所述多酚谱包括类似于天然叶的大量的抗炎和抗氧化化合物，同时不产生花青素、叶绿素和/或绿原酸。包括培养的越橘细胞产品的皮肤护理制剂可应用于皮肤，以降低肿胀、发红和刺激。组合物可抑制自由基诱导的对皮肤的氧化的有害效应。培养的越橘细胞还可配制成具有抗炎和/或抗氧化特性的饮食补充剂或功能食物。

本发明的培养的越橘细胞可产生多酚伴随很少的花青素或无花青素，多酚浓度通常比已知多酚很高的其他细胞培养系(例如可可)大50％或更多。此外，这些结果可在比其他细胞系更短的时间段内且使用更少的碳水化合物来达到。在生长期结束时，例如在小于或等于10、9、8、7或6天内，收获的越橘细胞通常可具有与在相同的生长期内且在相同或相似的生长条件下培养的可可细胞系三倍的多酚。虽然可通过在接近生长期结束或在生长期结束后(例如在5-7天后)添加补充性葡萄糖，来优化可可细胞系中的多酚产生，但已发现当产生高浓度的多酚时(例如如本文描述的)，培养的越橘细胞通过就多酚生产而言的显著余裕(例如50％)仍比培养的可可细胞表现更佳。例如，当从仍处于生长期的培养物收获时，培养的越橘细胞可具有在干重基础上的大于30％多酚。这些结果是令人惊讶和出乎意料的。

II.培养的细胞的产生

本公开内容涉及欧洲越橘的细胞培养物，其配置为在液体培养基中的悬浮培养物中生长。细胞来源于一种或多种欧洲越橘植物部分。松散型愈伤组织可由下胚轴、子叶、叶、茎段根等等起始。植物组织可通过用合适试剂洗涤且处理细胞进行灭菌。种子可通过在琼脂糖中悬浮进行发芽且铺平板到平板上。例如，愈伤组织可在具有琼脂的Murashige和Skoog培养基(4.43g/L)上在16小时光和8小时暗的光周期下在23℃下进行发芽。愈伤组织形成的首个征兆一般在铺平板后几周出现。

愈伤组织细胞通过分析愈伤组织且选择细胞而选择用于传代培养，所述细胞当掺入皮肤病学组合物、饮食补充剂和/或功能食物内时，显示出所需或优良特性。例如，愈伤组织可就高生长率、低花青素生产(例如无色)和/或高原花青素生产加以选择。

细胞悬浮液可通过将新鲜的幼苗愈伤组织引入液体培养基内且在振荡器中搅动混合物来制备。为了建立细胞培养物，可去除耗尽的培养基且定期加入新鲜培养基(例如对于2次传代培养每周)。

细胞的生长可通过测量培养基的折射率(RI)增量(如通过BRIX程度(即％BRIX)测量的)，通过消耗的碳水化合物速率进行估计。如果RI小于或等于培养基的初始RI的一半，则新鲜培养基可加入细胞中。如果RI大于一半，则新鲜培养基可在2周后加入。传代培养物可根据需要每周或每两周转移一次。

保留形成为细胞的粒状或微细粒悬浮液的培养物，而弃去不形成悬浮培养物的培养物。收集的细胞体积(PCV)和RI可在每次传代培养时进行记录，以测量细胞生长。持续的稳定悬浮液可在由愈伤组织起始悬浮液的6次传代培养内获得。

细胞培养物生产力根据细胞生长率和细胞生长在其下停止的密度而增加。为了测定最佳接种密度，欧洲越橘细胞的悬浮培养物可用接种量起始，所述接种量获得12.5％-15％收集的细胞体积(“PCV”)和25％PCV的起始细胞密度，并且允许生长7天。细胞选择可用于捕获在7天或更少时间内达到所需PCV或更多的培养物(快速生长的细胞培养物)。弃去花费比所需时间更长时间的培养物。优选地，培养物在7天内生长到至少30％、40％或50％的PCV。

在生长优化后，多酚生产的所需生产可通过改变培养基配方且使用用于细胞选择的另外标准来达到。液体培养基可通过调整碳水化合物水平以维持培养物而无营养素饥饿进行优化。在一些实施例中，制剂可用30g/L蔗糖进行配制，以避免细胞的糖饥饿。在一些实施例中，原花青素的生产值可从在20g/L蔗糖时的约1-2g/LPCV增加到在30g/L蔗糖时的约3-7g/LPCV。在一些实施例中，碳水化合物浓度可为至少20g/L、30g/L、40g/L、50g/L或60g/L。

细胞适合产生高浓度的多酚和/或原花青素且基本上无花青素。优选地，多个欧洲越橘细胞的至少12.5％、15％、20％、25％、30％或更多的干质量由多酚组成。在一些实施例中，多酚可为选自(-)-表儿茶素、(+)-儿茶素、原花青素、槲皮素、异槲皮素(槲皮素3-O-葡糖苷)、槲皮素3-O-阿拉伯糖、柚皮素(柚皮苷，naringenin)或这些的组合的抗氧化和/或抗炎化合物。在一些实施例中，至少50％、60％、70％、80％或90％的多酚化合物可为抗炎和/或抗氧化化合物。优选地，多个欧洲越橘细胞的至少7.5％、10％、15％、20％或更多的干质量由原花青素组成。

还优选细胞质量基本上不含花青素。例如，优选多个欧洲越橘细胞的干质量包括小于0.5％、0.1％、0.01％、0.001％或更少的花青素。

在一个实施例中，增加悬浮细胞培养物中的欧洲越橘细胞生长的方法还包括选择响应液体培养基中增加的糖浓度，具有增加的多酚和原花青素累积的悬浮细胞培养物。增加的糖可在接近细胞培养中的生长期结束时提供，或在生长期后的第二阶段提供。在一个实施例中，糖浓度可增加至少5、10、15、20、25或30g/L的细胞培养基。糖的初始浓度(即在生长期过程中)可为小于20g/L的细胞培养基。增加浓度的葡萄糖可为至少25、30、40、50或60g/L，和/或小于100、80或60g/L，或在前述较高浓度和较低浓度的范围内。在一个实施例中，液体培养基中的糖浓度包括大约30-60g/L葡萄糖。在一个实施例中，悬浮培养物中的细胞中的原花青素累积从在20g/L蔗糖时的约1-2g/LPCV增加到在30g/L蔗糖时的约3-7g/LPCV。在一个实施例中，悬浮培养物中的细胞中的多酚累积从在20g/L蔗糖时的约2-4g/LPCV增加到在60g/L蔗糖时的约5-10g/LPCV。

III.来源于培养的越橘细胞的产物

培养的越橘细胞首先通过去除耗尽的细胞培养基进行收获。分开可使用离心或其他合适方法来达到。分离的细胞可使用合适的流体(例如水)进行洗涤，以去除残留细胞培养基的一部分。

分离的细胞可进行干燥，以产生可贮存的产物。在一个实施例中，干燥的培养的细胞的含湿量小于25％、20％、15％、10％或甚至5％。在一些实施例中，细胞可为冷冻干燥的。

在一些实施例中，分离的细胞可磨成粉末。中值粒度可小于500μm、300μm、150μm或100μm，和/或大于2μm、5μm、10μm、50μm或100μm，或在前述较高粒度和较低粒度的范围内。所需粒度可通过控制研磨时间、研磨类型或配置、和/或通过筛去不希望有的粒度来达到。

在一些实施例中，产物是细胞培养物提取物。细胞培养物提取物可通过将一定体积的细胞悬浮于用于提取所需化合物或代谢产物的合适溶剂中来获得。提取溶剂可包括水和/或有机化合物。在一个实施例中，溶剂包括丙酮、乙酸和水。在一个实施例中，溶剂包括70％丙酮(v/v)和0.5％乙酸(v/v)。

有机化合物优选是食物级别的化合物例如食物级别乙醇。在一个优选实施例中，提取溶剂是无己烷的。

在另外一个实施例中，本发明描述了从培养中的欧洲越橘细胞提取多酚的方法。该方法包括(1)选择适合在悬浮培养物中生长的多个欧洲越橘细胞，和(2)使用溶剂从细胞中提取多酚，其中多个欧洲越橘细胞的至少10％的干质量由多酚组成，并且多个欧洲越橘细胞的至少5％的干质量由原花青素组成。

粗提取物可进行过滤以去除不希望有的颗粒物。提取溶剂可通过干燥去除，以由细胞培养物产生干燥的越橘提取物。类似于培养的细胞，提取物具有与天然植物组织相比较的独特代谢产物谱。

IV.皮肤护理产品、饮食补充剂和功能食物

本发明涉及掺入培养的越橘细胞的皮肤病学组合物，所述培养的越橘细胞具有高浓度的多酚和低浓度的花青素。皮肤病学组合物可配制为糊剂、乳膏、凝胶、喷雾剂、粉末、溶液或乳状液。当组合物配制为糊剂、乳膏或凝胶时，组合物可包括动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等。当组合物配制为粉末或喷雾剂时，组合物可包括乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末。特别地，喷雾剂组合物可包括推进剂例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。

对于溶液或乳状液，组合物可包括溶剂、增溶剂或乳化剂。可使用的例子包括水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油、脂肪族甘油酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。

对于悬浮液，组合物可包括液体稀释剂例如水、乙醇或丙二醇，悬浮剂例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶等等。

对于含表面活性剂的清洁剂，组合物可包括脂肪族醇硫酸酯、脂肪族醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸酯、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰氨基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等可用作载体。皮肤病学组合物还可包括常见佐剂例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和/或香料。

皮肤病学组合物可包括培养的越橘细胞，其浓度按重量计大于和/或等于0.01％、0.1％、0.5％或1％，或者按重量计小于或等于20％、10％、5％或1％或在其范围内。

皮肤病学组合物可包括培养的越橘细胞的提取物，其浓度为按重量计至少0.0001％、0.001％、0.01％或0.1％，和/或按重量计小于10％、5％、1％或0.1％或在其范围内。

存在其中可使用越橘多酚的抗炎和抗氧化特性的一系列实际应用。饮食补充剂和功能食物市场是快速增长的商业领域，具有关于疾病对抗和抗老化产品的高需求。当包括在与消化道的敏感组织接触的饮食补充剂和功能食物中时，导致对于皮肤的有益结果的培养的越橘细胞的特性还可具有有益结果。这些组织也可经历炎症，并且因此获益于本发明的培养的越橘细胞或其提取物。

饮食补充剂是经口获取的产品，其包括预期补充饮食的饮食组分(即“饮食成分”)。饮食组分可包括：维生素、矿物质、草药或其他植物性药材、氨基酸、以及物质例如酶、器官组织、腺体和代谢产物。饮食补充剂还可为提取物或浓缩物，并且可以许多形式例如片剂、胶囊、软胶囊、囊形片(gelcap)、液体或粉末存在。

培养的植物细胞可掺入任何食物产品内。植物细胞可掺入其内的食物类型的例子包括乳制品、水果、蔬菜、肉或甜点。植物细胞可掺入原始烹饪材料(例如面粉)内，或在制备产生的成品食物(例如烘焙制品)中作为分开的成分加入。食物组分可具有各种不同类型和形式。例如，植物细胞可与食物组分组合，所述食物组分例如但不限于以各种不同形式的煎饼、饼干、沙拉酱、冰沙、乳(牛奶，milk)、烤饼、炸薯片(薄片，chips)、酸奶、干酪、蔬菜、豆类、鸡蛋、面包、谷物、面团或面粉。在另外一个实施例中，异养细胞可掺入营养补充剂例如健康片剂内。

培养的植物细胞通常与作为干粉或粒状生物质的食物组分混合。例如，粉末状的植物细胞可与面粉混合，或者在食物例如烘焙制品中用作面粉，或者与饮料例如乳或果汁混合，或者加入液体或悬浮液例如酸奶中或掺入面团内(例如用稀面糊(batter)挤出以制备面团)。研磨或未研磨的粒状植物细胞可包括在燕麦棒或谷物中。

在一些实施例中，食物组分还可包括粉末或粒状组分。在一些实施例中，食物组分的中值粒度可小于150μm、100μm、50μm或10μm，和/或大于0.5μm、1μm或5μm，或在前述较高尺寸和较低尺寸的范围内。

当与面粉组合或烘焙成食物产品时，培养的植物细胞可与食物组分密切混合。可替代地，植物细胞和食物组分的混合物可为更宏观的。例如，植物细胞片可与传统片(例如来源于栽培玉米的玉米片)混合。在一个实施例中，食物组分可为面粉、油、糖、乳制品、水果、肉、草药和/或香料(spice)。

食物产品中包括的培养的植物细胞的量可极大改变。然而，包括足够的植物细胞，以对食物产品的营养或其他所需特性具有显著影响。在一些实施例中，培养的植物细胞的量为按食物产品的重量计至少1％、5％、10％或20％，和/或按食物产品的重量计小于80％、50％、30％、15％或5％，和/或在前述较高值和较低值的范围内。

在一些实施例中，培养的植物细胞可用作亮肤剂。当用作亮肤剂时，培养的植物细胞足够缺乏色素(例如花青素)，当加入皮肤病学组分(dermatologicalcomponent)、功能食物组分或饮食补充剂组分中时，培养的植物细胞稀释总色素浓度，由此增亮生物学相容性组合物。

V.用于选择具有所需特性的细胞系的方法

如所述的，本发明的培养的细胞选择为具有所需特性，例如高多酚和/或特定代谢产物，同时使某些化合物例如花青素、叶绿素和/或绿原酸的产生降到最低。下述方法提供了技术的例子，所述技术可用于鉴定产生的细胞系中的所需特点，由此允许选择特别需要的细胞系。可选择具有所需特性的细胞系，并且改变生长条件，以诱导细胞系中的变化直至获得所需结果。

越橘细胞的代谢产物谱分析

开发LC/PDA/MS方法，以测定通过越橘悬浮细胞产生的次级代谢产物的量和种类。使用自动采样器，将10μl越橘细胞提取物注射到配备超水性C18，3μm，100x2.1mm柱的Waters626HPLC内。代谢相由各自含有0.1％甲酸的水(溶剂A)/乙腈(溶剂B)梯度组成。梯度经过35分钟为90％A/10％B，在20分钟内至60％A/40％B，随后在30分钟内至100％B，随后为在100％B处的5分钟保留。流速为0.3ml/分钟。检测通过从191到780nm的Waters2996光电二极管阵列(PDA)检测器，随后为四极杆质谱仪检测。质谱仪为以电喷射正电离模式(ESI+)操作的MicromassQuattromicro仪器，伴随从198到1980amu的四级杆扫描。使用这种方法，由越橘细胞阐明一系列多酚次级代谢产物(图1)。

用于测试活性的方法

越橘多酚的抗氧化剂活性是众所周知的且相对易于在实验上显示。体外抗氧化剂测定例如ORAC、FRAP、FCR、TEAC、TRAP和DPPH是广泛使用的，并且在越橘中产生的多酚的抗氧化能力是有据可查的(HuangD.，OuB.，PriorR.L.Thechemistrybehindantioxidantcapacityassays.JAgricFoodChem.2005，23；53(6)：1841-56；Maatta-RiihinenKR，KahkonenMP，TorronenAR等人Catechinsandprocyanidinsinberriesofvacciniumspeciesandtheirantioxidantactivity.JAgricFoodChem.2005，2；53(22)：8485-91)。关于越橘多酚的抗炎活性的证据也是丰富的，并且几种体外测定已用于该背景下(TriebelS，TrieuHL，RichlingE.Modulationofinflammatorygeneexpressionbyabilberry(VacciniummyrtillusL.)extractandsingleanthocyaninsconsideringtheirlimitedstabilityundercellcultureconditions.JAgricFoodChem.2012，12；60(36)：8902-10；ChenJ，UtoT，TanigawaS，KumamotoT，FujiiM，HouDX.Expressionprofilingofgenestargetedbybilberry(Vacciniummyrtillus)inmacrophagesthroughDNAmicroarray.NutrCancer.2008；60Suppl1：43-50；KarlsenA，PaurI，SK，SakhiAK，BorgeGI，SerafiniM，ErlundI，LaakeP，TonstadS，BlomhoffR.BilberryjuicemodulatesplasmaconcentrationofNF-kappaBrelatedinflammatorymarkersinsubjectsatincreasedriskofCVD.EurJNutr.2010，49(6)：345-55)。抗炎剂的功效通常通过其降低炎性标记物例如细胞因子IL-1、IL-6和IL-8、TNF-α的水平，以及更一般地阻断NF-kB的作用的能力进行测量。

抗氧化能力的测定

ORAC和总多酚含量用于测定越橘细胞的抗氧化潜力。如通过BrunswickLabs(用于ORAC测试的行业领导者)测定的ORAC值为＞10,000umoleTE/g。如通过Folin-Ciocalteu测定来确定的总多酚含量为按干重计＞20％PP。

针对促炎细胞因子TNF-α和IL1-β的活性的测定

越橘细胞提取物在促炎细胞因子抑制测定中进行测试。测定使用由脂多糖刺激的经分离的人单核细胞，并且设计为测量在测试物质的存在下的TNF-α和IL1-β的抑制。诱导的TNF-α和IL-1β蛋白质通过ELISA进行测量。(OsteoarthritisCartilage.2002Dec；10(12)：961-7)对该测定添加越橘细胞提取物导致脂多糖诱导的细胞因子产生的显著抑制。

基于细胞的针对NF-κB的测定

越橘细胞提取物在基于细胞的生物测定中测试针对NF-κB的抑制活性，作为提取物的抗炎活性的证实。A204NF-κB基于细胞的生物测定显示越橘细胞提取物降低NF-κB的水平，且导致炎症应答的改善。

NF-kBELISA测定

该测定使用具有结合的NF-κB生物素化的共有序列的链霉抗生物素蛋白包被的平板，以仅捕获活性形式的NF-κB。所捕获的活性NF-κB与特异性NF-κBp65抗体一起温育，所述特异性NF-κBp65抗体随后使用HRP缀合的二抗进行检测。测定用化学发光底物进行显色，并且信号使用光度计进行检测。

脂多糖(LPS)诱导的炎症模型

LPS诱导的炎症模型提供了关于治疗候选物的功效研究的测试系统，所述治疗候选物旨在降低和/或消除过度炎症应答。在LPS施用后，能够测量且表征召募的白细胞的细胞谱，以及测量促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等)或诱导性一氧化氮(iNOS)的水平。LPS诱导的水肿提供了用于表征越橘细胞提取物的细胞因子调节活性的有用的功能模型。

IL-1β表达的抑制

伴随脂多糖(LPS)的刺激，IL-1β是过表达的并且它的产物通过炎症信号转导而增加。人二倍体成纤维(HDF)细胞用LPS和不同体积的越橘细胞提取物进行处理，并且每6小时收集HDF细胞，以通过蛋白质印迹定量IL-1β表达。将定量的蛋白质与溴酚蓝染料溶液混合，并且随后实施10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在电泳后，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore)，并且浸入含0.5％脱脂乳的TBS(Tris缓冲盐水)-吐温溶液(10mMTris.HCl、100mMNaCl、0.1％Tween20，pH7.5)中，以阻断非特异性反应。随后，允许膜与对于IL-1β的抗小鼠抗体的1∶500稀释物在室温下反应3小时，并且随后与作为二抗的抗小鼠IgG抗体反应。在反应完成后，膜用TBS(Tris缓冲盐水)-吐温溶液洗涤4次，并且允许与ECL(增强化学发光)检测试剂反应1分钟，并且随后在室温下暴露于X光胶片。结果证实IL-1β在通过LPS与越橘细胞提取物处理的样品中是降低的。

IL-8表达的抑制

伴随脂多糖(LPS)的刺激，IL-8是过表达的并且它的产物通过炎症信号转导而增加。人二倍体成纤维(HDF)细胞用LPS和不同体积的越橘细胞提取物进行处理，并且每6小时收集HDF细胞，以通过蛋白质印迹定量IL-8表达。将定量的蛋白质与溴酚蓝染料溶液混合，并且随后实施10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在电泳后，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜(Millipore)，并且浸入含0.5％脱脂乳的TBS(Tris缓冲盐水)-吐温溶液(10mMTris.HCl、100mMNaCl、0.1％Tween20，pH7.5)中，以阻断非特异性反应。随后，允许膜与对于IL-8的抗小鼠抗体的1∶500稀释物在室温下反应3小时，并且随后与作为二抗的抗小鼠IgG抗体反应。在反应完成后，膜用TBS(Tris缓冲盐水)-吐温溶液洗涤4次，并且允许与ECL(增强化学发光)检测试剂反应1分钟，并且随后在室温下暴露于X光胶片。结果证实IL-8在通过LPS与越橘细胞提取物处理的样品中是降低的。

角叉菜胶诱导的大鼠爪水肿炎症模型

通过角叉菜胶诱导的炎症是急性、无免疫、充分研究和高度重现性的。炎症主征-水肿、痛觉过敏和红斑-在皮下注射后立即发展，起因于促炎因子-缓激肽、组胺、速激肽、补体和活性氧、以及氮分子(nitrogenspecies)的作用。此类因子可在创伤部位处原位生成或通过浸润细胞生成。嗜中性粒细胞迅速迁移至炎症部位，并且可生成促炎活性氧及其他种类。炎症应答通常通过爪尺寸的增加(水肿)进行定量，所述爪尺寸在角叉菜胶注射后大约5小时是最大的，并且通过炎症级联内的特异性分子的抑制剂进行调节。小鼠爪水肿用于测试越橘细胞提取物的抗炎活性。

人皮肤急性炎症测定

新鲜的全层厚度皮肤样品在伦理上得自美容外科手术。该测定通过局部加入越橘细胞提取物或将越橘细胞提取物加入培养基中(模拟全身存在)，用于评价越橘细胞的抗炎效应。验证的测定对于LPS、PHA和UV光诱导的急性炎症可获得。上清液可就大范围的细胞因子、生物标记物和炎症调节剂进行分析，使用从相同活组织检查可能的多个时间点取样。

VI.实例

实例1

实例1描述了用于获得具有所需多酚谱的培养的细胞的方法，其中多酚浓度基于干重很高，而花青素和叶绿素色素的浓度很低或不存在。

新鲜的欧洲越橘材料例如在不同成熟阶段时的叶和浆果得自Corvallis，Oregon，USA的OregonStateUniversity。叶和浆果取自在Oregon地方性生长的样本。在原材料灭菌后，收集外植体且置于具有不同生长培养基的皮氏培养皿中。在培养数周后，外植体开始去分化成愈伤组织材料。随后选择最增殖性和松散型的愈伤组织，并且移动到液体悬浮液内用于进一步的细胞选择。

一旦悬浮于液体培养基中，细胞系就经过数月关于生长特征和原花青素生产重复选择，使用修饰版本的Swain和Hillis方法以及Porter等人方法。丁醇-HCl提取测定用于测量在基于丙酮的欧洲越橘提取物中，以(-)-表儿茶素和花青色素单体水解的那些原花青素的浓度；将出现与单体浓度关联的粉红色，并且通过在520nm处的吸光度进行测量。使用Folin-Ciocalteau测定来测量越橘细胞提取物的总多酚含量，且以没食子酸当量表示。

经过三年选择过程，多酚(和占优势的原花青素)的产生增加大致30x倍，如下文再现的图3中突出显示的。在开发过程中晚期的一些较低数据点的存在仅揭示测试最佳生长和生产条件的不同实验。在三年开发自始至终，分析了超过10,000种细胞系，并且使用适于高流通量筛选和巨大相关数据生成的生物信息学平台进行排序。图3显示了通过培养的越橘细胞系的多酚生产的时序，其举例说明了生成的数据。

在反复选择后获得的最终产物是产生按干重计约30％多酚的细胞系，其中大比例的多酚由原花青素构成，如举例说明了培养的越橘细胞的HPLC谱的图4中所示。

特定细胞系就其高生长率和原花青素的产生加以选择。代谢组成谱是令人惊讶的，因为细胞系由浆果外植体生长，但代谢组成更接近于越橘叶的那种。绿原酸令人惊讶地不存在，有可能作为朝向其他多酚例如原花青素的再定向流出的补偿。

下表1提供了与整颗浆果(第二列)、整片叶(第三列)和来自浆果的商业提取物(第四列)相比较，在本发明的培养的细胞(第一列)中发现的多酚化合物的比较。

表1

如表1中可见，培养的细胞在多酚方面更类似于整片叶而不是整颗浆果或提取物，但就其他化合物例如绿原酸而言仍不同于整片叶。

实例2：冷冻干燥的研磨的越橘细胞粉末的制备

实例2描述了冷冻干燥的越橘材料的制备。从生物反应器中收获通过实例1的方法制备的新鲜的越橘细胞，并且将细胞用DI水洗涤以去除残留的耗尽培养基。将细胞冷冻，随后冷冻干燥至＜5％水分。将干燥细胞通过250μm筛磨碎，以获得灰白色粉末。

实例3：越橘细胞提取物的制备

实例3描述了用于制备越橘细胞提取物的方法。将新鲜或干燥的越橘细胞悬浮于一定体积的70％乙醇中。将混合物匀浆化随后过滤，以获得澄清滤液。固体细胞团块用另一份70％乙醇再提取，且再次过滤。将合并的滤液蒸发至干燥，以获得粗制越橘细胞提取物。

实例4：皮肤病学制剂

实例4提供了根据本发明的一个实施例的化妆乳霜的制剂。

实例5：皮肤病学制剂

实例5提供了根据本发明的一个实施例的示例皮肤病学制剂。

实例6：功能皮肤病学软膏

实例6提供了根据本发明的一个实施例的皮肤病学软膏的制剂。

Claims (20)

1.一种生物学相容性组合物，所述生物学相容性组合物包含：

培养的越橘细胞，所述培养的越橘细胞包括在干重基础上至少10％的多酚化合物和小于1.0％干重的花青素化合物；和

一种或多种生物学相容性组分，所述一种或多种生物学相容性组分包括皮肤病学组分或食物组分，所述生物学相容性组分与所述培养的越橘细胞混合，以获得所述生物学相容性组合物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多酚化合物包括至少50％的选自由(-)-表儿茶素、(+)-儿茶素、原花青素、槲皮素、异槲皮素(槲皮素3-O-葡糖苷)、槲皮素3-O-阿拉伯糖、柚皮素或这些的组合组成的组中的一种或多种抗氧化剂和/或抗炎化合物。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述培养的细胞具有小于1％绿原酸。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种生物学相容性组分是皮肤病学组分，并且所述皮肤病学组分和所述培养的细胞的组合获得皮肤病学悬浮液、乳状液、糊剂、凝胶、乳膏、洗剂、粉末、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳状液粉底、蜡粉底或喷雾剂。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物配制为糊剂、乳膏或凝胶，所述组合物包括动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种生物学相容性组分是食物组分，并且所述食物组分和所述培养的细胞的组合获得功能食物。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述食物组分包括面粉、油、糖、乳制品、水果、肉、草药、香料或其组合。

8.根据权利要求6所述的组合物，其中所述功能食物是煎饼、饼干、沙拉酱、冰沙、乳、烤饼、炸薯片、酸奶、干酪、蔬菜制品、豆类制品、鸡蛋制品、面包、谷物或面团。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述一种或多种生物学相容性组分是食物组分，并且所述食物组分和所述培养的细胞的组合获得饮食补充剂。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述饮食组分是维生素、矿物质、植物性药材、氨基酸、酶、器官组织、腺体或代谢产物。

11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述饮食补充剂配制为片剂、胶囊、软胶囊、囊形片、液体或粉末。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括浓度范围为按重量计0.1％-20％的培养的细胞。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述培养的细胞是选自由节、节间、嫩叶、成熟叶、茎、根及其组合组成的组中的非花营养组织的细胞。

14.一种用于制备生物学相容性组合物的方法，所述方法包括：

在包括液体培养基的悬浮培养物中培养经分离的越橘细胞；

通过去除所述液体培养基收获所述培养的越橘细胞，并且任选从所述培养的越橘细胞获得提取物；和

将收获的所述培养的越橘细胞或其提取物与选自皮肤病学组分或食物组分的至少一种或多种生物学相容性组分混合。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述越橘细胞和液体培养基选择为产生这样的培养的细胞，所述培养的细胞具有在干重基础上的至少25％多酚化合物、小于1.0％花青素化合物和小于1％绿原酸。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述组合物包括浓度范围为按重量计0.1％-20％的培养的细胞。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述培养的越橘细胞的提取物与所述生物学相容性组分混合，其中所述提取物通过使用提取溶剂提取所述越橘细胞进行生产，所述提取溶剂包括水、无水或水性的含有1-4个碳的低级醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷(CH₂C1₂)、氯仿、己烷、1，3-丁二醇或其组合。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种组分是皮肤病学组分，所述皮肤病学组分与所述培养的越橘细胞或其提取物组合，以获得溶液、悬浮液、乳状液、糊剂、凝胶、乳膏、洗剂、粉末、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳状液粉底、蜡粉底或喷雾剂。

19.一种生物学相容性组合物，所述生物学相容性组合物包含：

包括培养的越橘细胞的干粉，所述培养的越橘细胞具有在干重基础上的至少20％多酚化合物、小于1.0％花青素化合物和小于1％绿原酸。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述培养的细胞是选自由节、节间、嫩叶、成熟叶、茎、根及其组合组成的组中的非花营养组织的细胞。