CN105462951B - 一种聚合物表面固定化酵母细胞的方法 - Google Patents

Abstract

一种聚合物表面固定化酵母细胞的方法属于细胞固定化技术领域。本发明提供了特征在于在聚合物基材上实施可见光/紫外光照射下表面接枝三维网络聚合，从而将细胞原位包埋固定的一种方法。该固定细胞的方法操作简便，所得固定化细胞活性高，催化反应后易与反应液分离重复利用。以酿酒酵母为模型，发现在最优条件下由葡萄糖转化乙醇的产率可达90％，反复间歇发酵25批次乙醇产量保持稳定。

Description

一种聚合物表面固定化酵母细胞的方法

技术领域：

本发明属于细胞固定化技术领域，涉及一种聚合物表面固定化酵母细胞发酵的方法。

背景技术：

由于石油危机和气候环境的变化，寻找一种可以替代石油的液体燃料至关重要。其中放能大、清洁无污染的燃料乙醇无疑是最佳选择之一。现在已经有很多国家开始利用酵母菌的固定化来生产燃料乙醇，从而降低对进口石油的依赖。

固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催化活性、反复使用的方法。酵母菌的固定化主要有以下四个优点：提高发酵中的乙醇产率；降低发酵过程中酵母菌的污染率；有利于酵母菌从产物中的分离；在连续操作中更好地保持细胞的稳定性。

目前使用最多的固定化方法是吸附法和包埋法，吸附法多根据物理作用(如范德华力、氢键)使细胞吸附在载体上，其优点是细胞未通过化学修饰，最大限度的保持细胞活性，然而其最大的缺点是吸附作用力比较弱，在使用中细胞容易泄露；而包埋法多采用凝胶形成小球对细胞进行包埋，虽然也可以保持细胞活性，但凝胶球本身强度较差，且限制了氧气及新陈代谢物质的传质速率(Applied Energy，2011，88：4400-4404)，如果将小球的直径做的很小，又产生了难以分离的问题。另外还有其他采用聚合物载体的固定化方法，如专利CN 101381720A采用乳液接枝共聚技术将丙烯酰胺接枝共聚到天然橡胶分子链上，之后固定化酵母生产燃料乙醇，可反复使用12-16次；专利CN 103773650A以壳聚糖磁珠为载体固定化酿酒酵母进行发酵生产果酒。上述固定化技术使用的载体力学性能好，酵母活性高，但存在发酵重复周期短，固定化方法较为复杂的问题。故选用一种力学性能好，酵母活性高，同时固定化方法简单，重复发酵周期较长的载体才是生产燃料乙醇的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种在聚合物表面固定化酵母的方法。以聚合物为载体，通过在可见光或紫外光(短时间)照射下实施酵母细胞存在下的可控/活性接枝聚合技术，形成三维交联网络，这些网络原位将酵母细胞固定于聚合物表面。这种室温下的可见光或紫外光(短时间)照射可保持酵母细胞的活性；而细胞的网络固定一方面易于反应物与细胞的接触以及产物的离开，可保证高的生物催化活性，另一方面可固定细胞不使其泄露，从而可多次重复利用。此外，这种表面网包有细胞的复合型膜或片材，在生物催化反应中特别易与反应液分离，可保持稳定的乙醇产量连续发酵20-30批次。

本发明所述的一种基于聚合物表面固定化酵母细胞的方法，制备步骤和条件如下：

(1)在聚合物载体上接枝感光休眠基后，取酵母菌菌体与凝胶单体混合均匀并涂覆在预辐照膜上，由两片石英片夹住得到“三明治”结构。

(2)根据可控/活性聚合接枝原理，对预辐照膜进行光照5min～120min，从而形成三维交联网络，将酵母菌细胞均匀地固定在聚合物表面；实验流程图以感光休眠基异丙基硫杂蒽酮为例，如图1：

(3)在无菌条件下将固定细胞后的聚合物载体放入发酵培养基(葡萄糖为糖源)中，在恒温摇床内开始发酵，发酵条件为温度25℃～35℃，摇床转速100rpm～250rpm，每12h～48h为一发酵批次。每一批次发酵完，取出固定细胞后的聚合物载体，用无菌水清洗干净，进行下一批次发酵。

步骤(1)中所述的酵母菌菌体为取10mL～30mL酵母菌菌悬液，在转速3500rpm～4500rpm的离心机内离心5min～15min弃掉上清液得到菌体，用无菌水清洗菌体2～4次。

上述酵母菌菌悬液为将成熟的酵母细胞，取一环接种到灭菌后的液体培养基中，在28℃～30℃、200r/min的恒温摇床内培养24h～72h，得到浓度为10⁶～10¹⁰/mL的酵母菌菌悬液。

步骤(1)中所述的凝胶单体为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚乙二醇双甲基丙烯酸脂(PEGDMA)，浓度为体积分数10％～80％。

步骤(1)中所述的聚合物载体为纺织品、非织造织物、膜或片材。

步骤(1)中所述感光休眠基是硫杂蒽酮、氧杂蒽酮及其衍生物。

步骤(3)中所述的最佳发酵温度为30℃。

步骤(3)中所述的最佳发酵转速为200rpm。

步骤(3)中所述的每升发酵培养基组成为葡萄糖10g～100g，蛋白胨20g，NaCl 5g，KH₂PO₄1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g；最佳发酵葡萄糖浓度为20g/L。

发酵结束后，将发酵液离心去除沉淀，之后用0.22μm水相聚醚砜滤膜进行过滤分离。利用气相色谱分析发酵液中的乙醇含量，用生物传感仪分析发酵液中的葡萄糖含量。

与现有技术相比，本专利优势在于：采用可控/活性接枝聚合的技术将酵母细胞固定在聚合物表面，操作简单、用时短；通过此种固定化方法，在不对细胞进行化学修饰的前提下，由聚合物及三维交联网络相结合固定细胞，保持了酵母细胞良好的活性，可见使用的聚合物载体生物相容性好。固定化酵母细胞进行间歇发酵，可保持稳定的乙醇产量连续发酵多个批次。

附图说明

图1以感光休眠基异丙基硫杂蒽酮为例的实验流程图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不构成对本发明的限制。

本发明所用的菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ACCC 20065，购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，以下所用液体培养基均为常用YPD培养基。发酵培养基组成(质量分数)为：葡萄糖2％～10％，蛋白胨2％，NaCl 0.5％，KH₂PO₄0.1％，MgSO₄·7H₂O0.05％。

实施例1：

取10ml酵母菌菌悬液(浓度为10⁶/mL)离心后得菌体，加入液体培养基与凝胶单体聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)各5ml(即凝胶单体体积为50％)，混合均匀得到混合液。取接枝过光引发剂异丙基硫杂蒽酮(浓度为0.5M)且用丙酮清洗干净、边长4cm的聚丙烯无纺布做聚合物基材。将混合液均匀涂覆在无纺布两侧，用两片石英片夹紧形成“三明治”结构，放在光强为1050μW/cm²的可见光下，光照60min，得到固定酵母细胞的聚合物载体。

将上述制得的固定酵母细胞后的聚合物载体，清洗干净，放入装有100ml发酵培养基灭菌后发酵培养基的250ml锥形瓶内。在30℃、摇床转速200rpm、葡萄糖浓度20g/L的情况下进行发酵，24h为一发酵批次，得到乙醇浓度为8.96±0.16g/L，乙醇转化率为87.8％。进行重复间歇发酵，在保持稳定乙醇产量的前提下，固定酵母细胞的聚合物载体可重复使用27批次，相对乙醇产量维持在80.65±0.37％到95.53±6.32％。

实施例2：

取15ml酵母菌菌悬液(浓度为10⁷/mL)离心后得菌体，加入液体培养基与凝胶单体凝胶单体聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)各8ml和2ml(即凝胶单体体积为20％)，混合均匀。取接枝过光引发剂氧杂蒽酮(浓度为0.5M)且用丙酮清洗干净、边长6cm的尼龙膜做聚合物基材。将混合液均匀涂覆在尼龙膜两侧，用两片石英片夹紧形成“三明治”结构，放在光强为9900μW/cm²的汞灯下，光照5min，得到固定酵母细胞的聚合物载体。

将上述制得的固定酵母细胞后的聚合物载体，清洗干净，放入装有100ml发酵培养基灭菌后发酵培养基的250ml锥形瓶内。在30℃、摇床转速200rpm、葡萄糖浓度20g/L的情况下进行发酵，24h为一发酵批次，得到乙醇浓度为7.96±0.10g/L，乙醇转化率为78.7％。进行重复间歇发酵，在保持稳定乙醇产量的前提下，固定酵母细胞的聚合物载体可重复使用20批次，相对乙醇产量维持在85.65±0.21％到94.12±4.32％。

实施例3：

取20ml酵母菌菌悬液(浓度为10⁸/mL)离心后得菌体，加入液体培养基与凝胶单体聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)各2ml和8ml(即凝胶单体体积为80％)，混合均匀。取接枝过光引发剂异丙基硫杂蒽酮(浓度为0.3M)且用丙酮清洗干净、边长5cm的BOPP(双向拉伸聚丙烯)膜做聚合物基材。将混合液均匀涂覆在BOPP膜两侧，用两片石英片夹紧形成“三明治”结构，放在光强为3000μW/cm²的低压汞灯下，光照20min，得到固定酵母细胞的聚合物载体。

制得的固定酵母细胞后的聚合物载体，清洗干净，放入装有100ml发酵培养基灭菌后的250ml锥形瓶内。在30℃、摇床转速200rpm、葡萄糖浓度10g/L的情况下进行发酵，24h为一发酵批次，得到乙醇浓度为4.16±0.26g/L，乙醇转化率为83.2％。进行重复间歇发酵，在保持稳定乙醇产量的前提下，固定酵母细胞的聚合物载体可重复使用20批次，相对乙醇产量维持在79.22±0.11％到92.53±4.12％。

实施例4：

取10ml酵母菌菌悬液(浓度为10⁹/mL)离心后得菌体，加入液体培养基与凝胶单体聚乙二醇双甲基丙烯酸脂(PEGDMA)各3ml和7ml(即凝胶单体体积为70％)，混合均匀。取接枝过光引发剂氧杂蒽酮(浓度为0.3M)且用丙酮清洗干净、边长4cm的PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)微孔膜做聚合物基材。将混合液均匀涂覆在PET两侧，用两片石英片夹紧形成“三明治”结构，放在光强为5000μW/cm2的中压汞灯下，光照30min，得到固定酵母细胞的聚合物载体。

制得的固定酵母细胞后的聚合物载体，清洗干净，放入装有100ml发酵培养基灭菌后的250ml锥形瓶内。在30℃、摇床转速200rpm、葡萄糖浓度40g/L的情况下进行发酵，24h为一发酵批次，得到乙醇浓度为17.95±0.16g/L，乙醇转化率为88.8％。进行重复间歇发酵，在保持稳定乙醇产量的前提下，固定酵母细胞的聚合物载体可重复使用25批次，相对乙醇产量维持在82.60±0.37％到90.53±1.32％。

实施例5：

取15ml酵母菌菌悬液(浓度为10¹⁰/mL)离心后得菌体，加入液体培养基与凝胶单体聚乙二醇双甲基丙烯酸脂(PEGDMA)各4ml和6ml(即凝胶单体体积为60％)，混合均匀。取接枝过光引发剂异丙基硫杂蒽酮(浓度为0.3M)且用丙酮清洗干净、边长5cm的EVA(乙烯-醋酸乙烯酯共聚物)片材做聚合物基材。将混合液均匀涂覆在EVA片材两侧，用两片石英片夹紧形成“三明治”结构，放在光强为8000μW/cm2的汞灯下，光照15min，得到固定酵母细胞的聚合物载体。

制得的固定酵母细胞后的聚合物载体，清洗干净，放入装有100ml发酵培养基灭菌后的250ml锥形瓶内。在30℃、摇床转速200rpm、葡萄糖浓度60g/L的情况下进行发酵，24h为一发酵批次，得到乙醇浓度为25.96±0.16g/L，乙醇转化率为85.6％。进行重复间歇发酵，在保持稳定乙醇产量的前提下，固定酵母细胞的聚合物载体可重复使用25批次，相对乙醇产量维持在85.65±0.37％到96.13±6.12％。

实施例6：

取20ml酵母菌菌悬液(浓度为10⁸/mL)离心后得菌体，加入液体培养基与凝胶单体聚乙二醇双甲基丙烯酸脂(PEGDMA)各6ml和4ml(即凝胶单体体积为40％)，混合均匀。取接枝过光引发剂氧杂蒽酮(浓度为0.5M)且用丙酮清洗干净、边长6cm的PMMA(聚甲基丙烯酸甲醋)做聚合物基材。将混合液均匀涂覆在PMMA基材两侧，用两片石英片夹紧形成“三明治”结构，放在光强为10000μW/cm2的汞灯下，光照10min，得到固定酵母细胞的聚合物载体。

制得的固定酵母细胞后的聚合物载体，清洗干净，放入装有100ml发酵培养基灭菌后的250ml锥形瓶内。在30℃、摇床转速200rpm、葡萄糖浓度80g/L的情况下进行发酵，24h为一发酵批次，得到乙醇浓度为38.50±0.12g/L，乙醇转化率为95.2％。进行重复间歇发酵，在保持稳定乙醇产量的前提下，固定酵母细胞的聚合物载体可重复使用25批次，相对乙醇产量维持在83.65±0.37％到95.10±1.02％。

实施例7：

取20ml酵母菌菌悬液(浓度为10¹⁰/mL)离心后得菌体，加入液体培养基与凝胶单体聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)各7ml和3ml(即凝胶单体体积为30％)，混合均匀。取接枝过光引发剂异丙基硫杂蒽酮(浓度为0.3M)且用丙酮清洗干净、边长4cm的PCL(聚己内酯)做聚合物基材。将混合液均匀涂覆在无纺布上，用两片石英片夹紧形成“三明治”结构，放在光强为900μW/cm²的可见光下，光照60min，得到固定酵母细胞的聚合物载体。

制得的固定酵母细胞后的聚合物载体，清洗干净，放入装有100ml发酵培养基灭菌后的250ml锥形瓶内。在30℃、摇床转速200rpm、葡萄糖浓度100g/L的情况下进行发酵，24h为一发酵批次，得到乙醇浓度为47.46±0.16g/L，乙醇转化率为93.9％。进行重复间歇发酵，在保持稳定乙醇产量的前提下，固定酵母细胞的聚合物载体可重复使用25批次，相对乙醇产量维持在81.05±0.37％到94.03±0.32％。

Claims (2)

1.一种聚合物表面固定化酵母细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)对聚合物基材进行紫外光辐照处理，表面引入感光休眠基；(2)将酵母菌菌体与聚合物单体溶液混合均匀，涂于聚合物基材表面，并用石英片覆盖，形成预辐照膜；(3)将预辐照膜置于光源下照射5min～120min，使单体接枝交联聚合形成三维交联网络从而将酵母菌细胞固定化，清洗即得聚合物基固定化酵母细胞载体；

步骤(1)中所述感光休眠基是硫杂蒽酮、氧杂蒽酮或两者的衍生物；

步骤(2)中所述酵母菌菌株是酿酒酵母，浓度10⁶～10¹⁰/mL；

步骤(2)中所述单体是聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇双甲基丙烯酸脂，聚合物单体溶液浓度为体积分数10％～80％，其余是酵母菌培养基；

步骤(3)中所述光源为可见光或者紫外光引发接枝聚合，光强为900μW/cm²～10000μW/cm²。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述聚合物基材是纺织品、非织造织物、膜或片材。