CN105452270A - 流行性感冒病毒疫苗及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供多种流行性感冒血球凝集素主干域多肽，这些多肽包括(a)流行性感冒血球凝集素HA1域，该HA1域包括HA1？N-末端主干区段，该HA1？N-末端主干区段包括从该HA1域的位置1至位置x、优选地从位置p至位置x的氨基酸，并通过具有0-50个氨基酸残基的连接序列共价连接至HA1C-末端主干区段，该HA1？C-末端主干区段包括从该HA1域的位置y的氨基酸至C-末端氨基酸并且包括该C-末端氨基酸，以及(b)流行性感冒血球凝集素HA2域，其中该血球凝集素主干域多肽对在HA1和HA2之间的接合点处的蛋白酶切割具有抗性，并且其中相比于野生型流行性感冒HA中的对应位置，在位置337、340、352、353、402、406、409、413和/或416处的氨基酸的一个或多个氨基已经突变。
Description
引言
本发明涉及医学领域。此处提供了多种流行性感冒血球凝集素主干域多肽，提供多种血球凝集素主干域多肽的方法，包括这些多肽的组合物，包括这些多肽的疫苗及其使用方法，特别是在流行性感冒的检测、预防和/或治疗中的使用。
背景
流行性感冒病毒是主要的人病原体，引起呼吸系统疾病(通常称为“流行性感冒”或“流感”)，其严重性范围为从亚临床感染至可导致死亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床影响随着流行性感冒株的毒力和宿主的暴露、病史、年龄、以及免疫状态而变化。全世界每年估计大约10亿的人经受流行性感冒病毒感染，导致3-5百万例严重疾病以及估计300,000至500,000例流行性感冒相关死亡。这些感染大多数可能归因于携带H1或H3血球凝集素亚型的甲型流行性感冒病毒，较少程度由乙型流行性感冒病毒促成，并且因此所有三种的代表包括在季节性疫苗中。当前免疫实践依赖于流行的流行性感冒病毒的早期鉴别以允许及时生产有效的季节性流行性感冒疫苗。除了在预测将在下一季中占主导的毒株方面的固有困难之外，抗病毒耐受性以及免疫逃逸也在当前疫苗在防止发病率和死亡率上的失败中发挥作用。除此外，由起源于动物贮器的高毒力病毒株引起大流行并且重配而增加人与人传播的可能性构成了对全球健康的显著且现实的威胁。
甲型流行性感冒病毒广泛分布于自然中并且可感染多种鸟类以及哺乳动物。流行性感冒病毒是属于正粘病毒科的包膜RNA病毒。其基因组由八个单链RNA区段组成，这些区段编码11种不同的蛋白、一种核蛋白(NP)、三种聚合酶蛋白(PA、PB1、以及PB2)、两种基质蛋白(M1以及M2)、三种非结构性蛋白(NS1、NS2、以及PB1-F2)、以及两种外膜糖蛋白：血球凝集素(HA)以及神经氨酸酶(NA)。这些病毒是基于HA以及NA蛋白的抗原结构的区别而分类的，其不同组合表示独特的病毒亚型，这些亚型进一步被分类为特异的流行性感冒病毒株。尽管所有已知的亚型都可以在鸟类中发现，当前流行的人甲型流行性感冒亚型是H1N1以及H3N2。系统发育分析已证实血球凝集素细分为两个主要的组：尤其在系统发育组1中的H1、H2、H5以及H9亚型，以及尤其系统发育组2中的H3、H4以及H7亚型。
乙型流行性感冒病毒株是严格地针对人的。乙型流行性感冒病毒株内的HA中的抗原变化小于甲型株内观察到的那些。乙型流行性感冒病毒的两个遗传上和抗原性上不同的谱系在人中流行，如由B/山形/16/88(也称为B/山形)以及B/维多利亚/2/87(B/维多利亚)谱系(弗格森(Ferguson)等人，2003)代表的。尽管由乙型流行性感冒病毒引起的疾病的光谱通常比由甲型流行性感冒病毒引起的更加温和，仍频繁观察到需要住院治疗的严重疾病具有乙型流行性感冒感染。
已知中和该流行性感冒病毒的抗体主要针对血球凝集素(HA)。血球凝集素或HA是一种三聚体糖蛋白，其被锚定到病毒衣并且具有双功能：它负责结合到细胞表面受体唾液酸并且摄取之后它介导病毒和内涵体膜的融合，导致在该细胞的胞液中释放病毒RNA。HA包括大的头部域以及较小的主干域。附接至该病毒膜是通过连接至该主干域的C-末端锚定序列介导的。该蛋白在指定的环中被翻译后切割以产生两种多肽，即HA1和HA2(全长序列被称为HA0)。膜远端头部区主要源自于HA1，并且膜近端主干区主要来自HA2(图1)。
季节性流行性感冒疫苗必须每年更新的原因是该病毒的大的可变性。在血球凝集素分子中，此变化具体地显现在头部域，其中抗原漂移和移位导致大量的不同变体。由于这也是免疫显性的区域，大部分中和抗体是针对此域并且通过干扰受体结合起作用。该头部域的免疫显性和大的变化的组合也解释了用具体株进行感染为什么不会导致对其他株的免疫：通过第一次感染引发的抗体仅识别有限数目的与原发性感染的病毒紧密相关的毒株。
近来，已描述了缺少所有或基本上所有流行性感冒血球凝集素球状头部域的流行性感冒血球凝集素主干域多肽，并且将其用于产生对该主干域多肽的一个或多个保守表位的免疫应答。认为该主干域多肽的表位比球状头部域的高免疫原性区域具有较小免疫原性，因此在该主干域多肽中缺少球状头部域可能允许发展针对该主干域多肽的一个或多个表位的免疫应答(斯蒂尔(Steel)等人，2010)。斯蒂尔(Steel)等人因此通过使A/波多黎各/8/1934(H1N1)以及A/香港/1968(H3N2)株的来自HA一级序列的HA1的氨基酸残基53至276缺失并且将其用短的柔性连接序列GGGG替代而建立了新的分子。用H3HK68构建体对小鼠进行疫苗接种不会引发与组1HA具有交叉反应性的抗血清。此外，如示于PCT/EP2012/073706，这些主干域多肽是高度不稳定的并且不会采取如通过缺少抗体结合(显示结合到该主干区中的保守表位)证明的正确构象。
此外，博姆玛坎蒂(Bommakanti)等人(2010)描述了基于HA2的多肽，其包括HA2的氨基酸残基1-172、7-氨基酸接头(GSAGSAG)、HA1的氨基酸残基7-46、6-氨基酸接头GSAGSA，随后为HA1的残基290-321，在HA1中具有突变V297T、I300E、Y302T以及C305T。该设计是基于H3HA的序列(A/香港/1968)。该多肽仅提供针对H3亚型(A/Phil/2/82)内的另一个流行性感冒病毒株的交叉保护，而不提供针对H1亚型(A/PR/8/34)的交叉保护。在博姆玛坎蒂(Bommakanti)等人(2012)的一篇更近的论文中，描述了来自H1N1A/波多黎各/8/1934(H1HA0HA6)的基于HA的主干域序列。在此多肽中，残基55至302的等价物已经缺失，并且已经进行了突变I311T、V314T、I316N、C319S、F406D、F409T、以及L416D。基于H3的多肽和基于HA的多肽两者都表达于大肠杆菌，并且因此缺少作为天然存在的HA蛋白的部分的聚醣。当表达于大肠杆菌中时，该多肽主要作为高分子量聚集体和小单体部分回收。以两个表观解离常数即9和0.2μM，该多肽结合CR6261。作者们显示用佐以100μg的CpG7909的20μg的蛋白免疫(两次，4周间隔)之后，小鼠可幸存于用同源H1N1A/波多黎各/8/1934病毒的1LD90进行的激发。作者们也描述了循环置换的多肽可比得上以上针对A/香港/1/1968衍生的多肽所述的那些。这些多肽是源自于来自H1N1A/波多黎各/8/1934、H1N1A/北卡罗来纳州/20/99或H1N1A/加利福尼亚/07/2009的HA，并且在H1N1A/波多黎各/8/1934(即相同亚型内)的小鼠的温和激发(1LD90)模型中可提供部分保护。当在中和测定中测试时，来自用这些多肽免疫的豚鼠的血清未展现可检测水平的中和。
因此仍存在对安全且有效的通用疫苗的需要，该疫苗刺激产生稳固的广泛中和抗体应答，并且提供针对当前和未来流行性感冒病毒株(季节性和大流行两者)的广泛集合的保护，具体而言提供针对系统发育组1和/或组2内一个或多个甲型流行性感冒病毒亚型的保护，以有效预防和治疗流行性感冒。
概述
此处提供了多种流行性感冒血球凝集素主干域多肽，提供多种主干域多肽的方法，包括这些多肽的组合物，包括这些多肽的疫苗及其使用方法。
在第一方面，本发明提供了新的免疫原性多肽，这些多肽包括流行性感冒血球凝集素主干域并且缺少球状头部，称为流行性感冒血球凝集素(HA)主干域多肽。当给予至受试者(具体而言人类受试者)时，这些多肽能够诱导免疫应答。在不存在优势表位(存在于膜远端头部域中)的情况下，本发明的多肽将膜近端主干域HA分子的保守表位呈现给免疫系统。为此，构成该头部域的HA0蛋白的一级序列的部分被去除，并且剩下的氨基酸序列直接地或在一些实施例中通过引入短的柔性连接序列(‘接头’)再连接以恢复氨基酸链的连续性。所得到的序列通过引入特定突变被进一步修饰，这些特定突变稳定了该HA0分子的剩下部分的天然3-维结构。这些免疫原性多肽不包括流行性感冒病毒的全长HA1和/或HA2。
根据本发明，这些多肽是基于H1亚型的甲型流行性感冒病毒的HA。
本发明提供多种流行性感冒血球凝集素主干域多肽，这些多肽包括(a)流行性感冒血球凝集素HA1域，该HA1域包括HA1N-末端主干区段，该HA1N-末端主干区段通过具有0-50个氨基酸残基的连接序列共价连接至HA1C-末端主干区段，以及(b)流行性感冒血球凝集素HA2域，其中这些血球凝集素主干域多肽对在HA1和HA2之间的接合点处的蛋白酶切割具有抗性，并且其中相比于野生型流行性感冒HA2域，连接HA2的A螺旋和螺旋CD的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸已经突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置337、340、352或353、或该H1亚型的其他流行性感冒病毒中的等价位置上的一个或多个突变。突变意指特定位置上的氨基酸已被不存在于野生型流行性感冒HA(即，该主干多肽所基于的流行性感冒病毒的HA)中的对应位置上的另一个氨基酸取代。
在某些实施例中，本发明的多肽进一步包括将螺旋A的C-末端残基连接至螺旋CD的N-末端残基的HA2氨基酸序列中的一个或多个突变，如图1中指出的。
在某些实施例中，该HA1N-末端主干区段包括HA1的氨基酸1-x，并且该HA1C-末端主干区段包括HA1的氨基酸y-端(即HA1的C-末端氨基酸)。因此，在某些实施例中，该HA1区段中的缺失包括从在位置x+1处的氨基酸直至在位置y-1处的氨基酸并且包括在位置y-1处的氨基酸的氨基酸序列。在某些实施例中，这些多肽不包括信号序列。在某些实施例中，该HA1N-末端区段因此包括HA1的氨基酸p-x，其中p是该成熟HA分子的第一个氨基酸(例如在SEQIDNO:1的情况下p＝18)。技术人员将能够制备此处所述的不具有信号肽(例如SEQIDNO:1的氨基酸1-17)的多肽。
在某些实施例中，本发明的多肽包含HA的细胞内序列以及跨膜域。在其他实施例中，本发明的多肽不包括HA的细胞内序列以及跨膜域。在某些实施例中，该细胞内序列以及跨膜序列，例如从该HA2域的位置519、520、521、522、523、524、525、526、527、526、528、529、或530(或等价位置)至该HA2域的C-末端的氨基酸序列已被去除。
本发明的多肽不包括全长HA1。
在某些实施例中，这些多肽是糖基化的。
在某些实施例中，这些免疫原性多肽实质上比HA0小，优选地缺少所有或基本上所有的HA球状头部。优选地，这些免疫原性多肽长度上不超过360，优选地不超过350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275、或270个氨基酸。在某些实施例中，这些免疫原性多肽长度上是从约250至约350，优选地从约260至约340，优选地从约270至约330，优选地从约270至约330个氨基酸。
在某些实施例中，相比于HA1和HA2域所基于的HA的氨基酸序列，这些多肽进一步在该HA1和/或HA2域中包括一个或多个另外的突变。
本发明的多肽包括组1交叉中和抗体CR6261(如披露于WO2008/028946)和/或抗体CR9114(如描述于WO2013/007770)的保守主干域表位，该抗体CR9114是能够结合到并且中和组1和组2甲型流行性感冒病毒两者、连同乙型流行性感冒病毒的一种抗体。因此本发明的另一个方面是提供多种HA主干域多肽，其中所述多肽稳定地呈现抗体CR6261和/或CR9114的表位，如通过所述一个抗体或多个抗体结合至所述多肽表明的。在一个实施例中，这些多肽不结合到CR8020以及CR8057(描述于WO2010/130636)，它们是仅结合到H3流行性感冒病毒的单克隆抗体。此处提供的流行性感冒血球凝集素主干域多肽适合用于能够针对多个甲型和/或乙型流行性感冒病毒株发生免疫应答的免疫原性组合物(例如疫苗)中。在一个实施例中，这些流行性感冒血球凝集素主干域多肽能够针对系统发育组1和/或组2的甲型流行性感冒病毒株发生免疫应答，特别是针对系统发育组1和组2两者的流行性感冒病毒株。在一个实施例中，这些多肽能够针对同源流行性感冒病毒株发生免疫应答。在一个实施例中，这些多肽能够针对相同和/或不同亚型的异源流行性感冒病毒株发生免疫应答。在另一个实施例中，这些多肽能够对系统发育组1和组2两者的流行性感冒病毒株以及乙型流行性感冒病毒株发生免疫应答。
根据本发明的多肽可用于例如孤立型治疗和/或预防和/或诊断由流行性感冒病毒、特别是系统发育组1或2甲型流行性感冒病毒和/或乙型流行性感冒病毒引起的一种疾病或病况，或与其他预防和/或治疗性处理诸如(现存的或未来的)疫苗、抗病毒剂和/或单克隆抗体组合。
在另一个方面，本发明提供编码这些流行性感冒HA主干域多肽的核酸分子。在又另一个方面，本发明提供包括编码这些免疫原性多肽的核酸的载体。
在另一个方面，本发明提供在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向该受试者给予根据本发明的多肽和/或核酸分子。
在另一个方面，本发明提供包括根据本发明的多肽和/或核酸分子的免疫原性组合物。此处提供的免疫原性组合物可以处于任何允许将这些组合物给予至受试者例如小鼠、白鼬或人的形式。在特定实施例中，这些免疫原性组合物适合于人给药。这些多肽、核酸分子以及组合物可用于预防和/或治疗流行性感冒病毒疾病的方法中和/或用于诊断目的。这些组合物可进一步包括药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施例中，此处描述的组合物包括佐剂或与佐剂组合给予。
在另一个方面，本发明提供用作疫苗的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。本发明具体而言涉及在预防和/或治疗由系统发育组1和/或2的甲型流行性感冒病毒亚型和/或乙型流行性感冒病毒引起的一种疾病或病况中用作疫苗的免疫原性多肽、核酸和/或免疫原性组合物。
根据本发明的多肽的不同实施例以及用途将从以下本发明的详细描述中变得清晰。
附图简要说明
图1显示了如以天然三聚体存在的处于融合前状态的HA单体的模型。HA1是以浅灰色示出，HA2是以深灰色示出。指明了螺旋A(CR6261的表位的重要部分)以及螺旋CD(三聚体接口的部分)，还指明了连接这些二级结构元素的环。也指明了HA1的C-末端以及HA2的N-末端。融合肽位于HA2的N-末端。
图2.使用生物膜层干涉技术将本发明的可溶多肽结合至单克隆抗体CR6261以及CR9114。顶图显示暴露于变化浓度的本发明的可溶多肽的固定化单克隆抗体的个体结合曲线，底图显示用以估计Kd的稳态分析。A：s127H1SEQIDNO:66。B：s86B4SEQIDNO:67。C：s74H9SEQIDNO:65。D：s6E12SEQIDNO:69。E：s55G7SEQIDNO:68。
图3.在不存在和存在CR8020、CR6261以及CR9114的Fab片段的情况下，本发明的可溶多肽的尺寸排阻色谱。对于本发明的所有可溶多肽，对CR6261和CR9114Fab片段观察到复合体形成，但对CR8020Fab片段未观察到。A：s127H1SEQIDNO:66。B：s86B4SEQIDNO:67。C：s74H9SEQIDNO:65。D：s6E12SEQIDNO:69。E：s55G7SEQIDNO:68。
图4.本发明的多肽s74H9SEQIDNO:65和s86B4SEQIDNO:67在致死的流行性感冒H1N1A/NL/602/09激发模型中的保护效力的评价。A：顶行：阴性(PBS)和阳性对照(CR6261)组的存活率、平均体重改变以及临床中值得分。底行：用s74H9或s86B4免疫的实验组的存活率、平均体重改变以及临床中值得分。出于比较的原因，还显示了阴性对照PBS组。B：s74H9(SEQIDNO:65)和s86B4(SEQIDNO:67)的免疫原性。顶行：左图和中图：免疫诱导能够识别同源抗原(s74H9左图，s86B4中图)连同来自H1N1A/布里斯班/59/07的全长HA(右图)的抗体，如通过ELISA确定的。底行：在竞争ELISA中诱导的抗体能够与CR9114竞争结合到来自H1N1A/布里斯班/59/07的全长HA(左图)。出于比较的原因，在独立的图中指明了未标记的CR9114(即自我竞争)和非结合单克隆抗体CR8020(两者都从5μg/ml起始浓度连续稀释)的竞争水平。
图5.本发明的多肽s127H1(SEQIDNO:66)在致死的流行性感冒H1N1A/波多黎各(PuertoRico)/8/1934激发模型中的保护效力的评价。A：顶行：阴性(PBS)和阳性对照(CR6261)组的存活率、平均体重改变以及临床中值得分。底行：用s127H1(SEQIDNO:35)免疫的实验组的存活率、平均体重改变以及临床中值得分。出于比较的原因，还显示了阴性对照PBS组。
B：s127H1(SEQIDNO:35)的免疫原性。顶行：免疫诱导能够识别同源抗原s127H1(SEQIDNO:35)(左图)连同来自H1N1A/布里斯班/59/07的全长HA(右图)的抗体，如通过ELISA确定的。底行：在竞争ELISA中诱导的抗体能够与CR9114竞争结合到来自H1N1A/布里斯班/59/07的全长HA(左图)。出于比较的原因，在独立的图中指明了未标记的CR9114(即自我竞争)和非结合单克隆抗体CR8020(两者都从5μg/ml起始浓度连续稀释)的竞争水平。
图6.在显示与CR6261的改善结合的集合1序列中的指明位置处的氨基酸观察到的和期望的出现频率。值被表示为占显示改善的CR6261结合的集合1序列的总数目的百分比。期望值被计算为100％除以包括在该集合中的每个位置处的可变氨基酸的数目。
图7.在来自集合1的改善的CR6261结合物中的氨基酸组合的出现频率。根据在左边指明的位置处氨基酸的存在对与CR6261具有改善的结合的序列进行分组，并且每个组合的频度被计算为占显示改善的CR6261结合的集合1序列的总数目的百分比。对更优势的组合进行加框。A.对融合肽区域中组合序列的分析B.对B-环区域的分析。
图8.在显示与CR6261的改善结合的集合2序列中的指明位置处的氨基酸观察到的和期望的出现频率。值被表示为占显示改善的CR6261结合的集合2序列的总数目的百分比。期望值被计算为100％除以包括在该集合中的每个位置处的可变氨基酸的数目。
图9.在来自集合2的改善的CR6261结合物中的氨基酸组合的出现频率。根据在左边指明的位置处氨基酸的存在对与CR6261具有改善的结合的序列进行分组，并且每个组合的频度被计算为占显示改善的CR6261结合的集合2序列的总数目的百分比。对更优势的组合进行加框。在位置402处的变化未包括在该分析中，因为所有改善的结合序列在此位置包含Met，而对于位置352仅考虑了包含Phe或Tyr的序列。A.对融合肽区域中组合序列的分析B.对B-环区域的分析。
定义
以下给出如本发明中所用的术语的定义。
根据本发明的氨基酸可以是二十种天然存在(或‘标准’氨基酸)的任一种或其变体，比如例如D-脯氨酸(脯氨酸的D-对映体)或在蛋白质中未天然发现的任何变体，比如例如正亮氨酸。这些标准氨基酸可以基于其性质分成若干群组。重要因素是电荷、亲水性或疏水性、尺寸以及官能团。这些性质对于蛋白质结构和蛋白质-蛋白质相互作用来说是重要的。一些氨基酸具有特殊的性质，例如可以与其他半胱氨酸残基形成共价二硫键(或二硫桥键)的半胱氨酸，形成到多肽主链的环的脯氨酸，以及比其他氨基酸更灵活的甘氨酸。表2展示这些标准氨基酸的缩写和性质。
术语“氨基酸序列一致性”是指一对对齐的氨基酸序列之间的一致性或相似性程度，通常表示为百分比。百分比同一性是以下候选序列中的氨基酸残基百分比，该候选序列与在比对序列并且引入缺口(如果必要的话，以实现最大序列同源性百分比)之后该肽中的对应氨基酸残基是相同的(即，比对中在给出位置处的氨基酸残基是相同的残基)或相似的(即，比对中在给出位置处的氨基酸取代是保守性取代，如以下讨论的)。序列同源性包括序列一致性以及相似性的百分比是使用本领域中熟知的序列比对技术确定的，诸如通过目测以及数学计算，或更优选地，该比较是通过使用计算机程序比较序列信息进行的。一种示例性的优选计算机程序是遗传学计算机组(GCG；麦迪逊(Madison)，威斯康星州(Wis.))威斯康星州程序包版本10.0程序，‘GAP’(德弗罗(Devereux)等人(1984))。
“保守性取代”是指一类的氨基酸被相同类的另一个氨基酸替代。在具体的实施例中，保守性取代不改变多肽的结构或功能，或两者。用于保守性取代目的的氨基酸类别包括疏水的(例如Met，Ala，Val，Leu)、中性亲水(例如Cys，Ser，Thr)、酸性(例如Asp，Glu)、碱性(例如Asn，Gln，His，Lys，Arg)、构象打断者(例如Gly，Pro)以及芳香族的(例如Trp，Tyr，Phe)。
如此处使用的，术语“疾病”以及“障碍”可互换地使用，以指代受试者中的病况。在一些实施例中，该病况是病毒感染，特别是流行性感冒病毒感染。在特定实施例中，术语“疾病”是指由于病毒在细胞或受试者中的存在、或通过该病毒对细胞或受试者的侵染导致的病理状态。在某些实施例中，该病况是受试者中的疾病，其严重性通过给予免疫原性组合物来诱导该受试者中的免疫应答而被降低。
如此处使用的，在向受试者给予治疗的背景下术语“有效量”是指具有一个或多个预防和/或治疗效果的治疗的量。在某些实施例中，在向受试者给予治疗的背景下术语“有效量”是指足够实现如下的治疗量：流行性感冒病毒感染、与其相关的疾病或症状的严重性的降低或改善，诸如但不限于流行性感冒病毒感染、与其相关的疾病或症状的持续时间减少，对流行性感冒病毒感染、与其相关的疾病或症状的进展的预防，对流行性感冒病毒感染、与其相关的疾病或症状的发展或发作或复发的预防，流行性感冒病毒从一个受试者传播至另一个受试者的情况的预防或减少，受试者住院和/或住院时间长短的减少，患有流行性感冒病毒感染或与其相关的疾病的受试者的存活率的增加，流行性感冒病毒感染或与其相关的疾病的消除，流行性感冒病毒复制的抑制或减少，流行性感冒病毒滴度的减少；和/或另一种治疗的一个或多个预防或治疗作用的增强和/或改善。在某些实施例中，该有效量不导致免受流行性感冒病毒疾病的完全保护，但比较于未治疗的受试者导致更低的滴度或减少数目的流行性感冒病毒。流行性感冒病毒的滴度、数目或总负担上的减少的益处包括但不限于该感染的严重症状更少，该感染的症状更少，并且与该感染关联的疾病的时间长短上减少。
如在此所用，术语“宿主”意欲指已经引入了载体(诸如克隆载体或表达载体)的生物体或细胞。生物体或细胞可以是原核或真核的。优选地，宿主包括被分离的宿主细胞，例如培养物中的宿主细胞。术语“宿主细胞”仅意味着这些细胞被修饰以(过度)-表达本发明的多肽。应理解，术语宿主意欲不仅指具体主题生物体或细胞，而且还指此类生物体或细胞的子代。因为某些修饰可以由于或者突变或者环境影响而在后代中发生，所以此类子代可以实际上与亲本生物体或细胞不相同，但仍包括在如在此所用的术语“宿主”的范围内。
如在此所用，术语“包括(included)”或“包括着(including)”被视为后面有措辞“无限制”。
如此处使用的，术语“感染”意指通过病毒在细胞或受试者中的扩增和/或存在进行的侵染。在一个实施例中，感染是“活性”感染，即其中病毒在细胞或受试者中复制的一种感染。这样的感染是通过该病毒从最初被该病毒感染的细胞、组织、和/或器官传播至其他细胞、组织、和/或器官来表征。感染也可以是潜伏感染，即其中该病毒未复制的一种感染。在某些实施例中，感染是指由于病毒在细胞或受试者中的存在、或通过该病毒对细胞或受试者的侵染导致的病理状态。
流行性感冒病毒被分类为流行性感冒病毒类型：甲型、乙型和丙型。如此处使用的术语“流行性感冒病毒亚型”是指甲型流行性感冒病毒变体，其通过血球凝集素(H)以及神经氨酸酶(N)病毒表面蛋白的组合来表征。根据本发明，流行性感冒病毒亚型可以通过其H数目被称为诸如，如“包括H3亚型的HA的流行性感冒病毒”、“H3亚型的流行性感冒病毒”或“H3流行性感冒”，或通过H数目以及N数目的组合被称为诸如，如“流行性感冒病毒亚型H3N2”或“H3N2”。术语“亚型”确切地包括每个亚型内的所有个体“株”，其通常从突变产生并且显示不同病原谱，包括天然分离体连同人工突变体或重配体等。此类株也可称为病毒亚型的不同“分离体”。因此，如在此所用，术语“株”和“分离体”能可互换地使用。人流行性感冒病毒株或分离体的当前命名法包括病毒的类型(属)，即甲型、乙型或丙型，第一次分离的地理定位，株编号以及分离年份，通常在括号中给出HA以及NA的抗原说明，例如A/莫斯科/10/00(H3N2)。在该命名法中非人株也包括起源宿主。甲型流行性感冒病毒亚型可通过参照其系统发育组进一步分类。系统发育分析已证实血球凝集素细分为两个主要的组：尤其在系统发育组1(“组1”流行性感冒病毒)中的H1、H2、H5以及H9亚型，以及尤其系统发育组2(“组2”流行性感冒病毒)中的H3、H4、H7以及H10亚型。
如此处使用的，术语“流行性感冒病毒疾病”是指由于流行性感冒病毒(例如甲型或乙型流行性感冒病毒)在细胞或受试者中的存在或流行性感冒病毒对细胞或受试者的侵染导致的病理状态。在特定的实施例中，该术语是指由流行性感冒病毒引起的呼吸系统疾病。
如此处使用的，术语“核酸”旨在包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)以及RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。该核酸可以是单链或双链。核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或可以含有非天然或衍生化的核苷酸碱基，如本领域的技术人员将容易了解。此类修饰包括例如标记；甲基化；用一种类似物取代天然存在的核苷酸中的一者或多者；核苷酸间修饰，诸如不带电的键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)，带电的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)；侧位部分(例如多肽)；嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)；螯合剂；烷基化剂；以及被修饰的键(例如α异头核酸等)。除非另外规定，否则对核酸序列的提及涵盖其互补序列。因此，对具有具体序列的核酸分子的提及应理解为涵盖其互补链与其互补序列。互补链还可用于例如反义疗法、杂交探针以及PCR引物。
如此处使用的，在某些实施例中，HA中氨基酸的编号是基于野生型流行性感冒病毒的HA0中氨基酸的编号，例如H1N1流行性感冒株A/布里斯班/59/2007(SEQIDNO:1)的氨基酸的编号。如在本发明中所使用，措辞“在HA中位置“x”处的氨基酸”因此意指与具体野生型流行性感冒病毒(例如A/布里斯班/59/2007)(SEQIDNO:1，其中HA2域的氨基酸已经以斜体指示)的HA0中位置x处的氨基酸相对应的氨基酸。技术人员会理解，其他流行性感冒病毒株和/或亚型中的等价氨基酸可以通过多重序列比对确定。注意，在本申请中所使用的编号系统中，1是指未成熟HA0蛋白质的N-末端氨基酸(SEQIDNO:1)。该成熟序列起始于例如SEQIDNO:1的位置18。本领域的普通技术人员会理解，在生产过程中指导蛋白(例如对应于SEQIDNO:1的氨基酸1-17)的转运的前导序列(或信号序列)通常不存在于例如在疫苗中使用的最终多肽中。在某些实施例中，根据本发明的多肽因此包括不具有前导序列的氨基酸序列，即该氨基酸序列是基于HA0的不具有信号序列的氨基酸序列。
如本领域的普通技术人员已知的，“多肽”是指通过酰胺键连接的氨基酸的多聚体。如此处使用的，该术语可以是指通过共价酰胺键连接的单个多肽链。术语也可以是指通过非共价相互作用诸如离子接触、氢键、范德瓦尔斯接触以及疏水接触相关联的多个多肽链。本领域的普通技术人员会意识到，该术语包括已被修饰的多肽，例如通过翻译后加工诸如信号肽切割、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的以及O-连接的糖基化)、蛋白酶切割以及脂质修饰(例如S-棕榈酰化)来修饰。
“主干域多肽”是指包括组成天然存在的(或野生型)血球凝集素(HA)的主干域的一个或多个多肽链的多肽。典型地，主干域多肽是单个多肽链(即对应于血球凝集素HA0多肽的主干域)或两个多肽链(即对应于与血球凝集素HA2多肽相关的血球凝集素HA1多肽的主干域)。根据本发明，与野生型HA分子比较，主干域多肽包括一个或多个突变，具体而言野生型HA的一个或多个氨基酸残基可能已被其他在具体野生型HA中对应位置上非天然存在的氨基酸取代。根据本发明的主干域多肽可另外包括一个或多个连接序列，如下所述。
术语“载体”表示可以插入第二核酸分子以便引入到宿主中的核酸分子，在该宿主中它将被复制并且在一些情况下被表达。换句话说，载体能够输送它所已经连接的核酸分子。如在此所用，术语“载体”涵盖克隆以及表达载体。载体包括但不限于质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)以及来源于细菌噬菌体或植物或动物(包括人类)病毒的载体。载体包含由所提议的宿主识别的复制起点，并且在表达载体情况下是启动子；和由宿主识别的其他调节区。某些载体能够在它们被引入到其中的宿主中自主复制(例如具有细菌复制起点的载体可以在细菌中复制)。其他载体可以在被引入到宿主中后被整合到宿主的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。如此处使用的，在病毒的背景下术语“野生型”是指流行的、天然流行的并且产生典型的疾病爆发的流行性感冒病毒。
详细说明
流行性感冒病毒对全球公共健康具有显著影响，每年引起数百万例严重疾病、数千例死亡、以及相当大的经济损失。当前三价流行性感冒疫苗引发对疫苗株以及紧密相关的分离体的强力中和抗体应答，但很少扩大到一个亚型内更发散的株或扩大到其他亚型。此外，选择适合的疫苗株呈现许多挑战并且经常导致次佳保护。另外，目前不可以预测下一个大流行病毒的亚型，包括它将会出现的时间和地点。
血球凝集素(HA)是来自甲型流行性感冒病毒的主要包膜糖蛋白，其是中和抗体的主要靶标。血球凝集素在进入过程中具有两个主要功能。第一，血球凝集素通过与唾液酸受体的相互作用介导病毒附接至靶细胞的表面。第二，病毒的内吞作用之后，血球凝集素随后触发病毒和内涵体膜的融合以将其基因组释放至靶细胞的细胞质中。HA包括约500个氨基酸的大的胞外域，其被宿主衍生的酶切割以产生通过二硫键保持连接的2个多肽。N-末端片段(HA1，320-330个氨基酸)的大多数形成膜远端球状域，该膜远端球状域包含受体-结合位点以及由病毒-中和抗体识别的大部分决定簇。较小的C-末端部分(HA2，约180个氨基酸)形成茎状结构，该茎状结构将该球状域锚定至细胞膜或病毒膜。在HA1多肽(亚型之间34％-59％同源性)中亚型之间的序列同源性的程度小于在HA2多肽中的(51％-80％同源性)。大部分保守区是切割位点附近的序列，具体地HA2N-末端23个氨基酸，其在所有甲型流行性感冒病毒亚型中是保守的(洛瑞尤(Lorieau)等人，2010)。此区域的部分在HA前体分子(HA0)中作为表面环暴露，但当HA0被切割为HA1和HA2时变得不可及。
大部分中和抗体结合到围绕该受体结合位点的环，并干扰受体结合以及附接。由于这些环是高度可变的，靶向这些区域的大部分抗体是株-特异性的，解释了为什么当前疫苗引发这种受限的、株-特异性的免疫。然而，近来，产生了针对流行性感冒病毒血球凝集素的具有广泛的交叉中和效力的完全人类单克隆抗体。功能性以及结构性分析已经揭示，这些抗体干扰膜融合过程，并且是针对流行性感冒HA蛋白的主干域中的高度保守的表位(斯罗索比(Throsby)等人，2008；艾基尔特(Ekiert)等人2009，WO2008/028946，WO2010/130636，WO2013/007770)。
稳定呈现这些抗体的表位的主干域多肽描述于共同未决专利申请PCT/EP2012/073706中。至少一些此处描述的主干域多肽稳定地呈现CR6261和/或CR9114的表位，并且在小鼠中是免疫原性的。至少一些此处描述的主干域多肽稳定地呈现CR8020的表位，并且在小鼠中是免疫原性的。
根据本发明，已经设计了呈现这些表位的新的HA主干域多肽。这些多肽可用于建立通用的基于表位的疫苗，该疫苗诱导针对广范围的流行性感冒株的保护。像在之前所述的主干域多肽中一样，该高度可变的和免疫显性的部分(即头部域)被首先从该全长HA分子去除以建立主干域多肽，也称为迷你-HA，从而将免疫应答向着广泛中和抗体的表位所处的主干域重定向。以上提到的广泛中和抗体用于探查新建立的分子的正确折叠，并且证实中和表位的存在。
相比于那些抗体与前面所述的主干多肽的结合(PCT/EP2012/073706)，本发明的新的主干域多肽显示抗体(具体为CR6261和/或CR9114)的增加的结合。
在不存在优势表位(存在于膜远端头部域中)的情况下，本发明的主干域多肽能够将膜近端主干域HA分子的保守表位呈现给免疫系统。为此，构成该头部域的HA0蛋白的一级序列的部分被去除，并且直接地或在一些实施例中通过引入短的柔性连接序列(‘接头’)再连接以恢复多肽链的连续性。所得到的多肽序列通过引入特定突变被进一步修饰，这些特定突变稳定了该HA0分子的剩下部分的天然3-维结构。
本发明因此提供包括以下项的多肽：(a)流行性感冒血球凝集素HA1域，该HA1域包括HA1N-末端主干区段，该HA1N-末端主干区段通过具有0-50个氨基酸残基的连接序列共价连接至HA1C-末端主干区段，以及(b)流行性感冒血球凝集素HA2域，其中该血球凝集素主干域多肽对在HA1和HA之间的接合点处的蛋白酶切割具有抗性，并且其中HA1和HA2域中的一个或多个氨基酸已经突变。相比于该HA主干域多肽基于的野生型流行性感冒血球凝集素的HA1和HA2域，在本发明的多肽中，HA1和HA2域因此包括一个或多个突变。
根据本发明，这些主干域多肽是基于流行性感冒病毒的HA，包括H1亚型的HA。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置337、340、352或353、或其他流行性感冒病毒中的等价位置上的一个或多个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置352上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置353上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置337上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置340上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括将螺旋A的C-末端残基连接至螺旋CD的N-末端残基的HA2氨基酸序列中的一个或多个突变，如图1中指出的。
在某些实施例中，位置402、406、409、413以及416(编号是指SEQIDNO:1)上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的氨基酸中的一个或多个。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置402上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置406上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置409上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置413上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置416上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
本发明的多肽不包括全长HA1。
在某些实施例中，这些免疫原性多肽实质上比HA0小，优选地缺少所有或基本上所有的HA球状头部。优选地，这些免疫原性多肽长度上不超过360，优选地不超过350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275、或270个氨基酸。在某些实施例中，这些免疫原性多肽长度上是从约250至约350，优选地从约260至约340，优选地从约270至约330，优选地从约270至约330个氨基酸。
在某些实施例中，相比于衍生该HA1和HA2域的HA的氨基酸序列，这些多肽进一步在该HA1和/或HA2域中包括一个或多个另外的突变。因此，这些主干多肽的稳定性进一步增加。
根据本发明，该“HA1N-末端区段”是指对应于流行性感冒血球凝集素(HA)分子的HA1域的氨基-末端部分的多肽区段。在某些实施例中，该HA1N-末端多肽区段包括从该HA1域的位置1至位置x的氨基酸，其中位置x上的氨基酸是HA1内的氨基酸残基。术语“HA1C-末端区段”是指对应于流行性感冒血球凝集素HA1域的羧基-末端部分的多肽区段。在某些实施例中，该HA1C-末端多肽区段包括从该HA1域的位置y的氨基酸至C-末端氨基酸并且包括C-末端氨基酸，其中位置y上的氨基酸是HA1内的氨基酸残基。根据本发明，y是大于x，因此该HA1N-末端区段和该HA1C-末端区段之间，即HA1的位置x上的氨基酸和位置y上的氨基酸之间的HA1域的区段已经缺失，并且在一些实施例中，由连接序列替代。
在某些实施例中，该HA1N-末端主干区段包括HA1的氨基酸1-x，并且该HA1C-末端主干区段包括HA1的氨基酸y-端。因此，在某些实施例中，该HA1区段中的缺失包括从在位置x+1处的氨基酸直至在位置y-1处的氨基酸并且包括在位置y-1处的氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施例中，这些多肽不包括信号序列。因此在某些实施例中，该HA1N-末端区段包括HA1的氨基酸p-x，其中p是该成熟HA分子的第一氨基酸(例如在SEQIDNO:1的情况下p＝18)。技术人员将能够制备此处所述的不具有信号肽(例如SEQIDNO:1的氨基酸1-17)的多肽。
在某些实施例中，本发明的多肽包含HA的细胞内序列以及跨膜域。在其他实施例中，本发明的多肽不包括HA的细胞内序列以及跨膜域。在某些实施例中，该细胞内序列以及跨膜序列，例如从该HA2域的位置519、520、521、522、523、524、525、526、527、526、528、529、或530(或等价位置)至该HA2域的C-末端的氨基酸序列已被去除。
根据本发明，这些血球凝集素主干域多肽对HA1和HA2之间的接合点处的蛋白酶切割具有抗性。本领域的普通技术人员已知，跨越HA1和HA2的Arg(R)-Gly(G)序列是胰蛋白酶和胰蛋白酶样蛋白酶的识别位点，并且典型地被切割用于血球凝集素激活。由于此处描述的这些HA主干域多肽不应该被激活，本发明的流行性感冒血球凝集素主干域多肽对蛋白酶切割具有抗性。因此根据本发明，该蛋白酶切割位点被去除或跨越HA1和HA2的蛋白酶位点突变为对蛋白酶切割具有抗性的序列。
在某些实施例中，该HA1C-末端主干区段的C-末端氨基酸残基是除了精氨酸(R)或赖氨酸(K)的任何氨基酸。在某些实施例中，该HA1C-末端氨基酸是谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)。在某些实施例中，该HA1C-末端主干区段的C-末端氨基酸残基是谷氨酰胺(Q)。
在某些实施例中，这些多肽是糖基化的。
根据本发明，这些流行性感冒血球凝集素主干域多肽是基于H1亚型的流行性感冒病毒的HA。用“基于”意指，该HA1域和/或该HA2域的N-末端区段和/或C-末端区段与本领域的技术人员已知的或后来发现的H1、H3和/或H5亚型的任何天然存在的流行性感冒血球凝集素的HA1和/或HA2域的对应N-末端和/或C-末端区段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸序列一致性。在某些实施例中，这些流行性感冒血球凝集素主干域多肽是基于组1甲型流行性感冒病毒的流行性感冒血球凝集素。
根据本发明，这些多肽是基于H1HA，即包括来自H1亚型的流行性感冒病毒的氨基酸序列的HA。在具体实施例中，这些多肽包括血球凝集素主干域，该血球凝集素主干域来自或基于甲型流行性感冒病毒的HA，包括H1亚型的HA，诸如来自甲型流行性感冒病毒/布里斯班/59/2007(H1N1)(SEQIDNO:1)，如下所述。技术人员会理解，根据本发明也可使用其他包括H1亚型的HA的甲型流行性感冒病毒。在某些实施例中，这些多肽包括基于选自表3的甲型流行性感冒H1病毒的HA的血球凝集素主干域。
在某些实施例中，这些多肽包括HA1N-末端多肽区段，该区段包括从该H1HA1域的位置1至位置x的氨基酸，其中x是位置46上氨基酸和位置60上氨基酸之间的任何氨基酸，诸如位置47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、或59上的氨基酸，优选地其中x是52、53、55或59。优选地，这些多肽包括不具有信号序列的HA1N-末端区段，即包括以下氨基酸的HA1N-末端区段：从该HA1域的位置18(例如对于H1HA，诸如SEQIDNO:1)、或其他H1流行性感冒病毒株(参见例如表3)中的等价位置至位置x的氨基酸。在某些实施例中，该HA1N-末端区段因此包括从该HA1域的位置p(其中对于在SEQIDNO:1中的H1HA，p＝18，或其他H1HA上的等价位置)至位置x的氨基酸。
在某些实施例中，该HA1C-末端多肽区段包括从该H1HA1域的位置y的氨基酸至C-末端氨基酸并且包括C-末端氨基酸，其中y是H1HA1的位置290上的氨基酸和位置325上的氨基酸之间的任何氨基酸，优选地其中y是291、303、318、或321。
在某些实施例中，x是52并且y是321。
根据本发明，相比于对应的野生型流行性感冒病毒HA1和/或HA2域(即这些主干多肽基于的流行性感冒病毒)的氨基酸序列，这些主干多肽在该HA1域和/或该HA2域中包括一个或多个突变，即氨基酸取代。
在某些实施例中，接近于HA0切割位点(SEQIDNO:1中残基343)的一个或多个氨基酸残基已经突变。在某些实施例中，SEQIDNO:1的位置337、340、352、或353上、或其他流行性感冒病毒中的等价位置上的一个或多个氨基酸残基已经突变，即被在该主干多肽基于的野生型流行性感冒病毒的HA的氨基酸序列中的对应位置处不存在的氨基酸取代。表7显示天然存在的氨基酸变化。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置352上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置353上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置337上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，本发明的多肽包括SEQIDNO:1的位置340上、或其他流行性感冒病毒的等价位置上的至少一个突变。
在某些实施例中，这些多肽包括如在表1中表明的一个或多个突变。
在某些实施例中，位置337上的突变氨基酸残基(HA1域)是选自下组，该组由以下各项组成：I、E、K、V、A、以及T。
在某些实施例中，位置340上的突变氨基酸残基(HA1域)是选自下组，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y。
在某些实施例中，位置352上的突变氨基酸残基(HA2域)是选自下组，该组由以下各项组成：D、V、Y、A、I、N、S、以及T。
在某些实施例中，位置353上的突变氨基酸残基(HA2域)是选自下组，该组由以下各项组成：K、R、T、E、G、以及V。
在某些实施例中，该突变的氨基酸在该序列中引入共有N-糖基化，例如N-X-T/S(此处X是任何天然存在的氨基酸，除了P)，如同例如对于I340N在SEQIDNO:6中的情况。
在某些实施例中，该突变的氨基酸是相同亚型的序列中不会天然存在的氨基酸。
再次指出，氨基酸的编号是基于H1HA0中氨基酸的编号，具体而言H1N1甲型流行性感冒株/布里斯班/59/2007(SEQIDNO:1)的氨基酸的编号。普通技术人员将能够确定其他流行性感冒病毒的HA中的等价氨基酸，并且因此将能够确定等价突变，参见例如表3的不同H1流行性感冒病毒的序列比对。
在某些实施例中，该HA2域包括将螺旋A的C-末端残基连接至螺旋CD的N-末端残基的HA2氨基酸序列中的一个或多个突变(图1)。连接螺旋A的C-末端残基和螺旋CD的N-末端残基的H1HA2氨基酸序列包括如下氨基酸序列，其包括流行性感冒HA(根据SEQIDNO:1编号)的残基402-418，包括氨基酸序列MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQIDNO:8)。
在某些实施例中，将螺旋A的C-末端残基连接到螺旋CD的N-末端残基的氨基酸序列，即包括血清型H1的流行性感冒HA的氨基酸残基402-418(根据SEQIDNO:1编号)的区域，包括以下氨基酸序列
X1NTQX2TAX3GKEX4N(H/K)X5E(K/R)(SEQIDNO:52)。
在某些实施例中，这些多肽在H1HA2域中包括如在表1中表明的一个或多个突变。
在某些实施例中，位置402、406、409、413以及416(编号参考SEQIDNO:1)上的一个或多个氨基酸，即氨基酸X1、X2、X3、X4以及X5中一个或多个已经突变，即包括在该主干多肽基于的野生型流行性感冒病毒中的那些位置处不存在的氨基酸。
在某些实施例中，位置402上的突变氨基酸，即X1，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：M、E、K、V、R以及T。
在某些实施例中，位置406上的突变氨基酸，即X2，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、T、H、L以及Y，优选I、L或Y。
在某些实施例中，位置409上的突变氨基酸，即X3，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：V、A、G、I、R、F以及S，优选A、I或F。
在某些实施例中，位置413上的突变氨基酸，即X4，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、E、K、M、以及V，优选I、Y、M或V。
在某些实施例中，位置416上的突变氨基酸，即X5，是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：L、H、I、N、R，优选I。
这些突变的组合也是可能的。
在某些实施例中，该HA1N-末端主干区段包括HA1的氨基酸残基1-52，优选地HA1的氨基酸残基18-52，并且该HA1C-末端主干区段包括HA1的氨基酸残基321-343，其中位置343上的氨基酸即R343已经突变，并且是非R的氨基酸，优选谷氨酰胺(Q)。在某些实施例中，该HA1N-末端主干区段由HA1的氨基酸残基1-52、优选地HA1的氨基酸残基18-52组成，并且该HA1C-末端主干区段由HA1的氨基酸残基321-343组成。
在某些实施例中，这些多肽选择性地结合到抗体CR6261和/或CR9114。在一个实施例中，该多肽不结合到抗体CR8057。在一个实施例中，CR6261包括含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的轻链可变区；CR9114包括包括SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施例中，CR8057包括含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
如上所述的，这些多肽包括流行性感冒血球凝集素HA1域，其包括通过具有0-50个氨基酸残基的连接序列共价连接至HA1C-末端主干区段的HA1N-末端主干区段。该连接序列不存在于天然存在的或野生型HA中。在某些实施例中，该接头是肽，该肽包括一个氨基酸残基、两个或更少的氨基酸残基、三个或更少的氨基酸残基、四个或更少的氨基酸残基、五个或更少的氨基酸残基、十个或更少的氨基酸残基、15个或更少的氨基酸残基、或20个或更少的氨基酸残基，或30个或更少的氨基酸残基，或40个或更少的氨基酸残基，或50个或更少的氨基酸残基。在一个特定实施例中，该连接序列是选自下组的序列，该组由以下各项组成：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、GSAGSAG、以及GSGSGSG。
在某些实施例中，该HA1N-末端区段直接连接至HA1C-末端区段，即这些多肽不包括连接序列。
根据本发明，HA1和HA2之间的切割位点的去除可以通过使在P1位置(SEQIDNO:1中位置343)的R(在少数情况下为K)突变为Q来实现(参见例如孙(Sun)等人，2010，切割位点的命名法解释)。突变为Q是优选的，而S、T、N、D或E是替代方案。
根据本发明，一个或多个二硫桥键被引入这些主干域多肽中，优选地在H1A/布里斯班/59/2007(SEQIDNO:1)中位置324和436(或等价位置)的氨基酸之间。在某些实施例中，这些多肽因此进一步包括该HA1域中的突变R324C以及该HA2域中的T436C。本领域的普通技术人员可以使用适合的算法诸如Clustal、Muscle等，通过比对序列容易地确定等价位置。工程化的二硫桥键是通过使至少一个(如果另一个已经是半胱氨酸)、但通常是空间上接近的两个残基突变为半胱氨酸来建立的，该突变将自发地或通过活性氧化在这些残基的硫原子之间形成共价键。
处于其天然形式的流行性感冒HA在细胞或病毒膜上作为三聚体存在。在某些实施例中，该细胞内和跨膜序列被去除以使得在细胞中表达后产生分泌的(可溶的)多肽。已经描述表达以及纯化HA的分泌胞外域的方法(参见例如多普海德(Dopheide)等人2009；艾基尔特(Ekiert)等人2009，2011；史蒂文斯(Stevens)等人2004，2006；威尔逊(Wilson)等人1981)。本领域的普通技术人员会理解，这些方法也可直接应用到本发明的主干域多肽以实现分泌(可溶的)多肽的表达。因此这些多肽也包括在本发明中。
在某些实施例中，本发明的多肽包含HA的细胞内序列以及跨膜域。在其他实施例中，这些细胞内序列以及跨膜序列，例如从该HA2域的位置519、520、521、522、523、524、525、526、527、526、528、529、或530(或等价位置)至该HA2域的C-末端的氨基酸序列(根据SEQIDNO:1编号)已被去除以在细胞中表达之后产生可溶的多肽。
在某些实施例中，本发明的可溶的多肽可以通过从残基514(或等价物)至C-末端(根据SEQIDNO:1编号)的多肽序列的缺失来建立。可替代地，另外的残基可以包括在本发明的多肽中，例如通过使从残基515、516、517、518、519、520、521、522、523的序列缺失。任选地，可添加his-标签序列(HHHHHH(SEQIDNO:20)或HHHHHHH(SEQIDNO:21))用于纯化目的，任选地通过接头连接。任选地该接头可包含蛋白分解切割位点以在纯化之后酶促地去除该his-标签。
在某些实施例中，本发明的可溶的多肽可以通过从残基524、525、526、527、528、529、530、531或532(或等价物)(根据SEQIDNO:1编号)的多肽序列的缺失来建立。任选地，可添加his-标签序列(HHHHHH(SEQIDNO:20)或HHHHHHH(SEQIDNO:21))用于纯化目的，任选地通过接头连接。任选地该接头可包含蛋白分解切割位点以在纯化之后去除该his-标签。
这些可溶的多肽可以通过引入已知形成三聚体结构的序列，诸如福尔顿(foldon)序列(例如，如此处所述的)而进一步稳定化。如上所述获得的多肽也包括在本发明中。
该天然HA在细胞表面上作为三聚体存在。将三聚体保持在一起的个体单体之间的相互作用的大部分处于头部域，而在主干域中，三聚体化是通过三聚体叠螺旋基序的形成介导的。去除该头部之后，该三级结构去稳定并且因此需要修饰以增加蛋白稳定性。通过加强该螺旋CD的螺旋倾向，可以建立更稳定的蛋白。在某些实施例中，在位置419-433(或等价位置)处引入序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQIDNO:5)，该序列源自于GCN4并且也已知会三聚体化。
在某些实施例中，通过在HA2的C-末端处引入已知会形成三聚体结构的序列，即GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQIDNO:3)，任选地通过接头连接，这些多肽进一步稳定化。该接头可任选地包含切割位点用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。为了促进该可溶形式的纯化，可添加标签序列，例如his标签(HHHHHHH(SEQIDNO:20)或HHHHHH(SEQIDNO:21))或FLAG标签(DYKDDDDK)(SEQIDNO:22)或这些的组合，任选地通过短接头连接。该接头可任选地包含(部分的)蛋白分解切割位点，例如RSLVPR(SEQIDNO:23)(凝血酶)或IEGR(SEQIDNO:24)(因子X)，用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。加工的蛋白也包括在本发明中。
在某些实施例中，该HA2域的C-末端部分从位置520-565已经缺失(根据SEQIDNO:1编号)并且被以下替代：SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQIDNO:4)。
申请人之前已经鉴定了从来自接种疫苗的个体的初级人B-细胞分离的广泛中和抗体，它们中的一些对于组1是特异性的(例如CR6261，如WO2008/028946中所述)，并且它们中的一些对于组2流行性感冒病毒是特异性的(例如CR8020，如WO2010/130636中所述)。这些单克隆抗体的表位的详细分析已经揭示了这些特异抗体缺少交叉反应性的原因。在两种情况下，组1或组2HA分子中不同位置上聚醣的存在至少部分地解释了以下事实：这些抗体是组特异性的。在鉴别与许多组1和2HA分子交叉反应的Cr9114样抗体的情况下，如下所述的，变得明了的是人免疫系统可能针对流行性感冒病毒引发非常广泛的中和抗体。然而，在考虑对于年度疫苗接种方案的需要时，在亚型H1和/或H3的(季节性)流行性感冒病毒的感染或疫苗接种之后，这些抗体显然不会或仅非常低程度地被引发。
根据本发明，提供了以下多肽，这些多肽模拟CR6261和/或CR9114的特异表位，并且可被用作免疫原性多肽，例如当独自或与其他预防和/或治疗处理组合来体内给予时引发交叉中和抗体。对于“交叉中和抗体”，意指该抗体能够中和系统发育组1的甲型流行性感冒病毒的至少两个、优选至少三个、四个、或五个不同亚型，和/或系统发育组2的甲型流行性感冒病毒的至少两个、优选至少三个、四个、或五个不同亚型，和/或乙型流行性感冒病毒的至少两个不同亚型，特别是至少所有被CR6261和CR9114中和的病毒株。
本发明的多肽不包括全长HA1。在某些实施例中，这些免疫原性多肽实质上比HA0小，优选地缺少所有或基本上所有的HA球状头部。优选地，这些免疫原性多肽长度上不超过360，优选地不超过350、340、330、320、310、305、300、295、290、285、280、275、或270个氨基酸。在一个实施例中，该免疫原性多肽长度上是从约250至约350，优选地从约260至约340，优选地从约270至约330，优选地从约270至约330个氨基酸。
在某些实施例中，这些多肽选择性地结合到抗体CR6261和/或CR9114。在某些实施例中，该多肽不结合到抗体CR8057。CR6261包括含有SEQIDNO:9的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQIDNO:10的氨基酸序列的轻链可变区；CR9114包括含有SEQIDNO:11的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQIDNO:12的氨基酸序列的轻链可变区；CR8020包括含有SEQIDNO:17的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQIDNO:18的氨基酸序列的轻链可变区。CR8057包括含有SEQIDNO:13的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQIDNO:14的氨基酸序列的轻链可变区。
如上所述的，这些多肽包括流行性感冒血球凝集素HA1域，其包括通过具有0-50个氨基酸残基的连接序列共价连接至HA1C-末端主干区段的HA1N-末端主干区段。该连接序列(如果存在)不存在于天然存在的或野生型HA中。在某些实施例中，该接头是肽，该肽包括一个氨基酸残基、两个或更少的氨基酸残基、三个或更少的氨基酸残基、四个或更少的氨基酸残基、五个或更少的氨基酸残基、十个或更少的氨基酸残基、15个或更少的氨基酸残基、或20个或更少的氨基酸残基，或30个或更少的氨基酸残基，或40个或更少的氨基酸残基，或50个或更少的氨基酸残基。在一个特定实施例中，该连接序列是选自下组的序列，该组由以下各项组成：G、GS、GGG、GSG、GSA、GSGS、GSAG、GGGG、GSAGS、GSGSG、GSAGSA、GSAGSAG、以及GSGSGSG。
在某些实施例中，这些多肽包括以下氨基酸序列：DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQIDNO:53)，
其中X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、K、M、V、R、以及T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M、以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
在某些实施例中，这些多肽包括以下氨基酸序列：DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG(SEQIDNO:54)，
其中X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、K、M、V、R、以及T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M、以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
在某些实施例中，这些多肽包括以下氨基酸序列：DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG(SEQIDNO:70)，
其中X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、K、M、V、R、以及T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
在某些实施例中，这些多肽包括以下氨基酸序列：DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQIDNO:71)，
其中X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、K、M、V、R、以及T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
这些流行性感冒血球凝集素主干域多肽可以根据任何被认为适合技术人员的技术来制备，包括以下所述的技术。
因此，本发明的免疫原性多肽可通过本领域中已知的标准方法，使用适合的限制性内切酶以及本领域已知的方法被合成为DNA序列，并且被克隆并随后体外或体内表达。本发明因此也涉及编码上述多肽的核酸分子。本发明进一步涉及包括编码本发明的多肽的核酸的载体。在某些实施例中，根据本发明的核酸分子为载体(例如质粒)的一部分。这些载体可以通过本领域的普通技术人员众所周知的方法容易地操纵，并且可以例如被设计成能够在原核和/或真核细胞中复制。另外，许多载体可以直接或以从其分离的希望片段的形式用于真核细胞的转化并且将完全或部分地整合到这些细胞的基因组中，产生在其基因组中包含所需核酸的稳定的宿主细胞。所用的载体可以是适于克隆DNA并且可以用于感兴趣核酸的转录的任何载体。当使用宿主细胞时，优选的是该载体是整合型载体。可替代地，该载体可以是游离型复制载体。
本领域的普通技术人员能够选择适合的表达载体，并且以一种功能性方式插入本发明的核酸序列。为了获得编码多肽的核酸序列的表达，本领域的普通技术人员熟知能够驱动表达的序列可以功能性地连接至编码该多肽的核酸序列，得到可表达形式的编码蛋白或多肽的重组核酸分子。总的来说，该启动子序列被放置在应该表达的序列的上游。许多表达载体在本领域中可获得，例如英杰公司的pcDNA和pEF载体系列、碧迪科学公司(BDSciences)的pMSCV和pTK-Hyg、来自斯曲杰公司(Stratagene)的pCMV-Script等，它们可以用于获得适合的启动子和/或转录终止子序列、polyA序列等等。参照控制编码多肽的转录和翻译的序列，在适当插入编码感兴趣多肽的序列的情况下，得到的表达盒可用于产生感兴趣多肽，称为表达。驱动表达的序列可包括启动子、增强子等，以及其组合。这些应能够在宿主细胞中起作用，从而驱动与它们功能性连接的核酸序列的表达。本领域的普通技术人员知道不同的启动子可以用于获得宿主细胞中一种基因的表达。启动子可以是组成型的或调节型的，并且可以从不同的来源中，包括病毒、原核或真核来源获得，或是人工设计的。感兴趣的核酸的表达可来自天然启动子或其衍生物或来自完全异源的启动子(考夫曼(Kaufman)，2000)。一些熟知的并且多用于在真核细胞中表达的启动子包括源自于病毒(诸如腺病毒)的启动子(例如E1A启动子)、源自于巨细胞病毒(CMV)的启动子(诸如CMV即刻早期(IE)启动子(此处称为CMV启动子)(例如可从pcDNA，英杰公司(Invitrogen)获得))、源自于猴病毒40(SV40)的启动子(达斯(Das)等人，1985)等。适合的启动子也可源自于真核细胞，诸如金属硫蛋白(MT)启动子、延长因子1α(EF-1α)启动子(吉尔(Gill)等人，2001)、泛素C或UB6启动子(吉尔(Gill)等人，2001)、肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。对启动子功能和启动子强度进行测试是本领域的普通技术人员的例行途径，并且总的来说可例如包括克隆该启动子序列后的测试基因(诸如lacZ、荧光素酶、GFP等)，并且对该测试基因的表达进行测试。当然，启动子可通过其中的序列的缺失、添加、突变而被改变，并且针对功能性进行测试以找到新的、减毒的、或改善的启动子序列。根据本发明，在所选择的真核细胞中给出高转录水平的强启动子是优选的。
使用本领域的普通技术人员熟知的方法，这些构建体可被转染到真核细胞(例如植物、真菌、酵母或动物细胞)或适合的原核生物表达系统像大肠杆菌中。在一些情况下，可将适合的‘标签’序列(例如，如但不限于his-、myc-、strep-、或flag-标签)或完全蛋白(例如，如但不限于麦芽糖结合蛋白或谷胱甘肽S转移酶)添加到本发明的序列中以允许从这些细胞或上清液纯化和/或鉴定这些多肽。任选地，可以包括包含特异蛋白分解位点的序列以在之后通过蛋白分解消化去除该标签。
纯化多肽可以通过本领域中已知的光谱法(例如圆二色谱法、傅里叶变换红外光谱法以及NMR光谱法或X射线晶体分析法)进行分析以调查所希望的结构像螺旋以及β片层的存在。ELISA、Octet以及FACS等可用于调查本发明的多肽与之前所述的广泛中和抗体(CR6261、CR9114、CR8057)的结合。因此，可以选择根据本发明的具有正确构象的多肽。
本发明进一步涉及免疫原性组合物，其包括治疗有效量的本发明的多肽和/或核酸中的至少一个。在某些实施例中，这些组合物包括如下多肽，这些多肽包括血球凝集素主干域，这些主干域来自(或基于)一个流行性感冒亚型的HA，例如基于包括HA的流行性感冒病毒(例如H1或H3亚型的)的HA。在某些实施例中，这些组合物包括如下多肽，这些多肽包括基于两个或更多个不同流行性感冒亚型的HA的血球凝集素主干域，例如包含如下项的组合物：含有基于H1亚型的HA的血球凝集素主干域的多肽以及含有基于H3亚型的HA的血球凝集素主干域的多肽两者。
这些免疫原性组合物优选地进一步包括一种药学上可接受的载体。在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的”意思指载体在所用剂量和浓度下不会在给予它们的受试者中造成不希望有的或有害的影响。这些医药学上可接受的载剂和赋形剂是本领域中熟知的(参见雷明登氏制药科学(Remington’sPharmaceuticalSciences)，第18版，A.R.热纳罗(Gennaro)编，马克出版社(MackPublishingCompany)[1990]；肽和蛋白质的医药配制品发展(PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins)，S.弗罗加尔(Frokjaer)和L.霍夫高(Hovgaard)编，泰勒弗朗西斯集团(Taylor&Francis)[2000]；以及医药赋形剂手册(HandbookofPharmaceuticalExcipients)，第3版，A.凯博(Kibbe)编，医药出版社(PharmaceuticalPress)[2000])。术语“载体”是指与组合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液可以例如用作液体载体，特别是对于可注射溶液而言。精确的配制品可适应给予模型。这些多肽和/或核酸分子优选地呈无菌溶液形式被配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液可接着被冻干或填充到药物剂量容器中。溶液的pH通常在pH3.0到9.5、例如pH5.0到7.5范围内。
本发明也涉及如上所述的流行性感冒HA主干域多肽、核酸分子和/或载体以用于诱导针对流行性感冒HA蛋白的免疫应答。本发明也涉及在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予如上所述的多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物。根据本发明的受试者优选地是能够被引起传染病的药剂(具体而言流行性感冒病毒)感染的哺乳动物，或另外可以从免疫应答的诱导受益，此类受试者例如是啮齿动物，例如小鼠、白鼬、或家畜或农畜，或非人的灵长类，或人。优选地，该受试者为一个人类受试者。本发明因此提供了利用此处描述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物，用于在受试者中诱导对具体地组1和/或组2甲型流行性感冒病毒(诸如包括H1、H2、H3、H4、H5、H7和/或H10亚型的HA的流行性感冒病毒)和/或乙型流行性感冒病毒的流行性感冒病毒血球凝集素(HA)的免疫应答的方法。在一些实施例中，诱导的免疫应答有效于预防和/或治疗组1和/或组2甲型流行性感冒病毒亚型和/或乙型流行性感冒病毒引起的流行性感冒病毒感染。在一些实施例中，由此处描述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物诱导的免疫应答有效于预防和/或治疗由甲型和/或乙型流行性感冒病毒的两个、三个、四个、五个或六个亚型引起的甲型和/或乙型流行性感冒病毒感染。
由于熟知的是小蛋白和/或核酸分子不会总是有效地诱导强力的免疫应答，可能必要的是通过添加佐剂增加这些多肽和/或核酸分子的免疫原性。在某些实施例中，此处描述的免疫原性组合物包括佐剂或与佐剂组合给予。用于与此处描述的组合物组合给予的佐剂可在给予所述组合物之前、伴随、或之后给予。适合的佐剂的实例包括铝盐，诸如氢氧化铝和/或磷酸铝；油-乳剂组合物(或水包油组合物)，包括鲨烯-水乳液，诸如MF59(参见例如WO90/14837)；皂苷配制品，诸如，如QS21和免疫刺激复合物(ISCOMS)(参见例如US5,057,540；WO90/03184、WO96/11711、WO2004/004762、WO2005/002620)；细菌或微生物衍生物，它们的实例是脂质A(MPL)、3-O-脱酰的MPL(3dMPL)、包含寡核苷酸的CpG-基序、ADP-核糖基化细菌毒素或其突变体，诸如大肠杆菌不耐热肠毒素LT、霍乱毒素CT、百日咳毒素PT、或破伤风类毒素TT，基质M(伊斯康诺瓦(Isconova))。此外，可以使用已知的免疫增强技术，诸如将本发明的多肽融合至本领域中已知的蛋白以增强免疫应答(例如破伤风类毒素、CRM197、rCTB、细菌鞭毛蛋白或其他的)或包括病毒体中的多肽，或其组合。可使用的其他非限制实例是例如科夫曼(Coffman)等人(2010)披露的。
在一个实施例中，本发明的流行性感冒血球凝集素主干域多肽结合至病毒样颗粒(VLP)载体。VLP通常包括典型地源自于病毒的一种或多种结构蛋白质的一种或多种病毒多肽。优选地，这些VLP不能够复制。在某些实施例中，这些VLP可缺少病毒的完全基因组或包括病毒的基因组的部分。在一些实施例中，这些VLP不能够感染细胞。在一些实施例中，这些VLP表达其表面上的本领域普通技术人员已知的一个或多个病毒(例如，病毒表面糖蛋白)或非病毒(例如，抗体或蛋白)靶向部分。
在一个特定实施例中，本发明的多肽结合至病毒体中。可使用本领域的普通技术人员已知的技术产生包含根据本发明的多肽的病毒体。例如，可通过如下产生病毒体：破坏纯化病毒、提取基因组、并且用病毒蛋白(例如，流行性感冒血球凝集素主干域多肽)以及脂质重新装配颗粒以形成包含病毒蛋白的脂质颗粒。
本发明也涉及用于在受试者中诱导针对流行性感冒HA的免疫应答，具体而言用于用作疫苗的上述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。此处描述的流行性感冒血球凝集素主干域多肽、编码此类多肽的核酸、或包括此类核酸或多肽的载体因此可被用于引发针对流行性感冒病毒，例如针对流行性感冒病毒血球凝集素的主干区的中和抗体。本发明具体而言涉及如上所述的用于在预防和/或治疗由系统发育组1和/或系统发育组2的甲型流行性感冒病毒和/或乙型流行性感冒病毒引起的疾病或病况中用作疫苗的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。在一个实施例中，该疫苗可被用于预防和/或治疗由系统发育组1和/或2的两个、三个、四个、五个、六个或更多个不同亚型和/或乙型流行性感冒病毒引起的疾病。本发明的多肽可在合成之后在体外或在适合的细胞表达系统(包括细菌和真核细胞)中使用，或可替代地，可在需要其的受试者中体内表达，通过表达编码免疫原性多肽的核酸。此类核酸疫苗可采取任何形式，包括裸DNA、质粒、或病毒载体(包括腺病毒载体)。
根据本发明的多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物的给予可以使用标准给予途径执行。非限制性实例包括肠胃外给予，诸如静脉内、皮内、经皮、肌肉内、皮下等或粘膜给予，例如鼻内、经口等等。本领域的普通技术人员能够确定给予根据本发明的多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物以诱导免疫应答的不同可能性。在某些实施例中，超过一次给予该多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物(或疫苗)，即所谓的同源初免-加强免疫接种方案。在某些实施例中，其中超过一次给予多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物，给予第二剂量可以在例如给予第一剂量之后一周或更长时间、给予第一剂量之后两周或更长时间、给予第一剂量之后三周或更长时间、给予第一剂量之后一个月或更长时间、给予第一剂量之后六周或更长时间、给予第一剂量之后两个月或更长时间、给予第一剂量之后3个月或更长时间、给予第一剂量之后4个月或更长时间等等直至给予第一剂量的多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物之后若干年的时间间隔之后进行。也可能超过两次，例如三次、四次等给予该疫苗，以使得第一次初免给药随后为超过一次的加强给药。在其他实施例中，仅一次给予根据本发明的多肽、核酸分子、和/或免疫原性组合物。
多肽、核酸分子和/或免疫原性组合物还可以在一种异源初免-加强方案中作为初免或者作为加强来给予。
本发明进一步提供了在受试者中利用此处描述的多肽、核酸和/或组合物预防和/或治疗流行性感冒病毒疾病的方法。在一个特定实施例中，用于在受试者中预防和/或治疗流行性感冒病毒疾病的方法包括向有需要的受试者给予有效量的如上所述的多肽、核酸和/或免疫原性组合物。治疗有效量是指如此处定义的多肽、核酸或组合物有效用于预防、缓解和/或治疗由被组1或2甲型流行性感冒病毒和/或乙型流行性感冒病毒感染所引起的疾病或病况的量。预防涵盖抑制或减少流行性感冒病毒的传播或抑制或减少与被流行性感冒病毒感染有关的一种或多种症状的发作、发展或进展。如在此使用的缓解可以指减少可见或可察觉的疾病症状、病毒血症或任何其他可测量的流行性感冒感染表现。
需要治疗的那些包括已经患上由组1或组2甲型流行性感冒病毒或乙型流行性感冒病毒感染引起的病况的那些以及其中流行性感冒病毒感染有待预防的那些。本发明的多肽、核酸和/或组合物因此可被给予至一个初试受试者，即不具有由流行性感冒病毒感染引起的疾病或尚未被感染以及当前未被流行性感冒病毒感染的受试者，或给予至已经被流行性感冒病毒感染的和/或已经感染过流行性感冒病毒的受试者。
在一个实施例中，预防和/或治疗可以靶向易受流行性感冒病毒感染的患者群组。这些患者群组包括但不限于例如老年人(例如≥50岁、≥60岁以及优选地≥65岁)、幼童(例如≤5岁、≤1岁)、就医患者以及已经用一种抗病毒化合物治疗但已经展示一种不足的抗病毒反应的患者。
在另一个实施例中，这些多肽、核酸和/或免疫原性组合物可与一种或多种其他活性剂诸如现存的或未来的流行性感冒疫苗、单克隆抗体和/或抗病毒剂、和/或抗细菌剂和/或免疫调节剂组合给予至受试者。这一种或多种其他活性剂可有益于治疗和/或预防流行性感冒病毒疾病或可缓解与流行性感冒病毒疾病关联的症状或病况。在一些实施例中，这一种或多种其他活性剂是止痛药、退烧药物治疗、或缓解或协助呼吸的疗法。
可以调节本发明的多肽和/或核酸分子的剂量方案以提供最优的所希望的反应(例如治疗反应)。一种适合的剂量范围可以是例如0.1-100mg/kg体重，优选1-50mg/kg体重，优选0.5-15mg/kg体重。采用的多肽和/或核酸分子的精确剂量将例如取决于给药途径和该感染及由其引起的疾病的严重性，并且应当根据执业医师的判断和每一受试者的情况来决定。例如，有效剂量依赖靶位点、该患者的生理学状态(包括年龄、体重、健康)、以及治疗是预防性的还是治疗性的而变化。通常，该患者是人，但也可治疗非人哺乳动物(包括转基因的哺乳动物)。治疗剂量最佳地用滴定法测量以优化安全性和有效性。
本发明的多肽也可用于证实鉴定为潜在的治疗候选者的单克隆抗体的结合。另外，本发明的多肽可以用作诊断工具，例如以通过确定一名个体的血清中是否存在能够结合于本发明多肽的抗体来测试该个体的免疫状态。本发明因此还涉及了一种用于检测患者中流行性感冒感染的存在的体外诊断方法，所述方法包括以下步骤：a)使从所述患者中获得的生物样品与根据本发明的多肽接触；并且b)检测抗体-抗原复合物的存在。
本发明的多肽也可用于鉴定新的结合分子或改善现存的结合分子，诸如单克隆抗体以及抗病毒剂。
在以下实例和图式中进一步展示本发明。这些实例并不意在以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1：制备新颖的主干基多肽
PCT/EP2012/073706披露了流行性感冒血球凝集素主干域多肽、组合物和疫苗以及在预防和/或治疗流行性感冒的领域中使用它们的方法。此处我们描述了另外的源自于H1N1A/布里斯班/59/2007(SEQIDNO:1)的全长HA的主干域多肽的序列。新颖的主干域多肽是通过H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQIDNO:2)的定向突变获得，并且呈现CR6261的广泛流行性感冒中和表位(斯罗索比(Throsby)等人，2009；艾基尔特(Ekiert)等人2010)和/或CR9114。
H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQIDNO:2)是源自于H1N1A/布里斯班/59/2007(SEQIDNO:1)的全长HA，采取以下步骤：
1.去除HA0中的切割位点。在此位点对野生型HA的切割得到HA1和HA2。该去除可以通过使在P1位置(SEQIDNO:1中位置343)的R突变为Q来实现(参见例如孙(Sun)等人，2010，切割位点的命名法解释)。
2.通过使氨基酸53至320从SEQIDNO:1缺失而去除头部域。通过四残基柔性接头GGGG连接该序列剩下的N-以及C-末端部分。
3.增加由H1A/布里斯班/59/2007(SEQIDNO:1)中的残基402至418(或等价物)形成的环(A-螺旋以及CD螺旋之间)的溶解度以增加融合前构象的稳定性并且使修饰的HA的融合后构象两者去稳定化。在H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQIDNO:2)中引入突变F406S、V409T、F413G和L416S(编号参照SEQIDNO:1)
4.在H1A/布里斯班/59/2007中的位置324和436处的氨基酸之间引入二硫桥键；这是通过引入突变R324C和Y436C实现的。(编号参照SEQIDNO:1)
5.在位置419-433处(编号参照SEQIDNO:1)引入已知会三聚体化的GCN4衍生的序列MKQIEDKIEEIESKQ(SEQIDNO:5)。
在某些实施例中，本发明的多肽包含HA的细胞内序列以及跨膜域。在其他实施例中，跨膜和胞内域的序列已从HA2的位置519、520、521、522、523、524、525、526、526、527、528、529、或530(或其等价位置，如从序列比对测定的)至HA2的C-末端(根据SEQIDNO:1编号)缺失，以使得在细胞中表达之后产生分泌的(可溶的)多肽。该可溶的多肽可以通过引入已知形成三聚体结构的序列，即福尔顿序列AYVRKDGEWVLL(SEQIDNO:3)而进一步稳定化，任选地通过短接头连接，如上所述。该接头可任选地包含切割位点用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。为了促进该可溶形式的纯化和检测，可以任选地添加标签序列，例如组氨酸标签(HHHHHHH(SEQIDNO:20)或HHHHHH(SEQIDNO:21)或FLAG标签(DYKDDDDK；SEQIDNO:22)或这些的组合，任选地通过短接头连接。该接头可任选地包含(部分的)蛋白分解切割位点，例如LVPRGS(SEQIDNO:23)(凝血酶)或IEGR(SEQIDNO:24)(因子X)，用于之后根据本领域的普通技术人员熟知的方案进行加工。加工的蛋白也包括在本发明中。
这样的组合了FLAG-标签、凝血酶切割位点、福尔顿、以及His序列的C-末端序列的实例是SEQIDNO:4FLAG-凝血酶-福尔顿-His。将此序列与可溶形式的H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQIDNO:2)序列组合以建立亲本序列(SEQIDNO:6)，该序列被用于通过诱变建立本发明的新颖多肽。此序列不包含对应于SEQIDNO:1和2的氨基酸1-17的前导序列。
这些主干域多肽是通过以下方式来建立的：使编码该分子头部域的该血球凝集素序列的部分缺失，并且通过如描述于PCT/2012/073706以及上述的接头在该缺失的任一侧上重连接该序列的N-和C-末端部分。去除该头部域留下了之前从暴露的水性溶剂屏蔽的分子的部分，潜在地去稳定化本发明的多肽的结构。出于此原因，使用亲本序列SEQIDNO:6作为起始点，B-环(具体而言氨基酸残基406(SEQIDNO:1和2中分别是F和S)、409(V和T)413(F和G)以及416(L和S))中的残基以不同组合突变。SEQIDNO:6是通过去除前导序列并且用Flag-凝血酶-福尔顿--his序列(SEQIDNO:4)替代残基520-565而从H1-mini2-簇1+5+6-GCN4(SEQIDNO:2)建立。
类似地，在该融合肽周围的区域中，数个疏水残基被暴露于该溶剂，这是由以下事实引起的，不像天然全长HA，本发明的多肽不能被切割，并且经受相关的构象变化，该构象变化将该疏水融合肽隐藏在该蛋白的内部。为了解决此问题，SEQIDNO:2中残基I337、I340、F352以及I353中的一些或所有也突变。
HA的螺旋A是CR6261、CR9114以及FI6.v3的广泛中和表位的表位的重要部分。氨基酸残基M402(编号参照SEQIDNO:1)位于此螺旋的C-末端，并且为了进一步稳定化该螺旋结构，此残基也被靶向以建立本发明的多肽。突变体多肽的两个不同集合披露于表1中。
表1：SEQIDNO:6中建立的突变。也表明了SEQIDNO:1(全长，wtHA)和SEQIDNO:6中的对应氨基酸。
集合1
集合2
实例2.检测多肽表达并且结合到广泛中和抗体
使用本领域的普通技术人员熟知的方案，编码本发明的多肽的DNA序列被转化到巴斯德毕赤酵母中或被转染到HEK293F细胞中。用于在哺乳动物细胞中表达的构建体包含HA前导序列(SEQIDNO:1和2中的残基1-17)，而在用于在毕赤酵母中表达的构建体中，该HA前导序列被酵母α因子前导序列(SEQIDNO:7)替代。以此方式，表达的蛋白向着该细胞培养基定向，从而允许待测定的本发明的多肽的结合和表达而不用进一步纯化。所有序列包含FLAG-福尔顿-HISC-末端序列(SEQIDNO:4)。
单克隆抗体与本发明的多肽的结合(CR6261、CR9114、CR8020)是通过ELISA确定的。为此，将ELISA板用2μg/ml单克隆抗体溶液(20μl/孔)在4℃处理过夜。在去除该抗体溶液之后，在室温下将剩下的表面用脱脂奶粉于PBS中的4％溶液封闭最少1h。在洗涤这些板之后，将20μl的细胞培养基(未搀水的或稀释的)添加到每个孔并且在室温下孵育至少1h。然后洗涤ELISA板并且添加20μl的抗-FLAG-HRP抗体溶液(西格玛A8952，在PBS-Tween中4％脱脂奶粉稀释2000倍)。孵育(在室温下1h)之后，将各板进行再一次洗涤，并且添加20μl发光底物(赛默飞世尔科技公司(Thermoscientific)C#34078)以使该信号显影。可替代地，可使用比色检测方法以使该信号显影。
从均相时间分辨荧光测定来测定本发明的多肽的表达(关于概述，参见例如德歌斯(Degorce)等人，当前化学基因组学(Curr.Chem.Genomics))20093:22-32)。为此，通过将210.5μl抗-FLAG-TB(储备液26μg/ml)以及1.68ml的抗-HIS-488(储备液50μg/ml)添加至培养基和50mMHEPES+0.1％BSA的80ml的1比1混合物中制备铽(Tb)标记的抗-FLAG单克隆抗体(供体)和Alexa488标记的抗-His单克隆抗体(受体)(HTRF溶液)的混合物。将19μl的HTRF溶液添加到ELISA板的每个孔中，并且添加1μl的培养基。在激发时并且在允许起源于其他化合物(蛋白，培养基组分等)的干扰性短期背景信号衰退的一个延迟之后，测定在520和665nm的荧光发射的比率。这是对样品中总蛋白含量的测量，并且用于归一化不同实验之间的mAb结合信号。
遵循本领域的普通技术人员熟知的方案，在表4和5中列出的本发明的多肽表达于毕赤酵母。收集培养基并且使其结合到CR6261，如上所述测定这些主干域多肽的结合和表达。由于结合测定标度随着表达蛋白浓度进行响应，通过比较结合信号与针对每个表达序列的HTRF测定中的信号的比率，将ELISA结合信号针对蛋白表达进行归一化。相比于SEQIDNO:6的亲本序列，所有表达蛋白展现CR626结合与HTRF信号的更高的比率。
遵循本领域的普通技术人员熟知的方案，在表6中列出的本发明的多肽表达于HEK293F细胞中。收集培养基并且使其结合到CR6261，如上所述测定这些主干域多肽的结合和表达。计算CR6261结合与HTRF信号的比率，并且与针对亲本序列SEQIDNO:6计算的比率进行比较。结果列在表6中。所有表达蛋白展现更高比率，表明本发明的主干多肽显示增加的CR6261结合。
实例3：本发明的多肽的纯化以及表征
为了进一步表征本发明的多肽，培养免疫原127H1(SEQIDNO:55)、86B4(SEQIDNO:56)、74H9(SEQIDNO:57)、6E12(SEQIDNO:58)以及55G7(SEQIDNO:59)并且纯化至同质。为了获得本发明的多肽的高度纯的制剂，将HEK293F细胞用包含编码可溶形式的127H1(SEQIDNO:55)、86B4(SEQIDNO:56)、74H9(SEQIDNO:57)、6E12(SEQIDNO:58)以及55G7(SEQIDNO:59)的基因的表达载体pcDNA2004转染。在此情况下，可溶形式是通过用序列RSLVPRGSPGHHHHHH(SEQIDNO:69)替代残基519-565(编号参照SEQIDNO:1)来建立的。本领域的普通技术人员会理解，在生产过程中指导蛋白(对应于SEQIDNO:1的氨基酸1-17)的转运的前导序列(或信号序列)不会存在于分泌的最终多肽中。可溶的分泌蛋白的氨基酸序列给出为SEQIDNO:65至69。
为了产生本发明的多肽，通过在300g向下自旋HEK293F细胞(英杰公司(Invitrogen))5min并且重悬于300mL预加温的FreestyleTM培养基/SF1000烧瓶中来种植1.0*106vc/mL。将此培养物在多极(multitron)孵育器中在37℃，10％CO2，110rpm下孵育1小时。1小时之后，将质粒DNA吸移在9.9mLOptimem培养基中达到在300mL培养体积1.0μg/mL的浓度。平行地将440μL吸移在9.9mLOptimem培养基中并且在室温下孵育5分钟。5分钟之后，将质粒DNA/Optimem混合物添加到/Optimem混合物中，并且在室温下孵育20分钟。孵育之后，将质粒DNA/混合物逐滴添加至该细胞悬液中。将转染的培养物在多极(multitron)孵育器中在37℃，10％CO2，和110rpm下孵育。在第7天，通过离心(在3000g30分钟)从该培养基分离细胞，而将包含本发明的可溶多肽的上清液经0.2μm瓶顶过滤器过滤以用于进一步加工。
为了纯化的目的，来自用编码本发明的可溶形式的(如上所述的)多肽127H1(SEQIDNO:55)、86B4(SEQIDNO:56)、74H9(SEQIDNO:57)、6E12(SEQIDNO:58)或55G7(SEQIDNO:59)的基因转染的细胞的约1400ml培养上清液施加到24mlNiSepharoseHP柱，在洗涤缓冲液(20mMTRIS，500mMNaCl，pH7.8)中预平衡。用在洗涤缓冲液中的10mMImidaze进行的洗涤步骤之后，将本发明的结合多肽以在洗涤缓冲液中300mM咪唑的分步梯度进行洗脱。将各洗脱峰进行收集，缓冲液交换，浓缩，并且施加至尺寸排阻柱以进一步纯化(Superdex200)。在洗脱过程中收集级分并且通过SDS-PAGE以及蛋白质印迹(使用对组氨酸-标签特异的单克隆抗体)分析蛋白含量。收集包含本发明的纯化多肽的级分并且将其用于进一步分析。通过尺寸排阻色谱确定纯度并且在所有情况下超过90％。这些纯化程序的特征列于表8中。
为了分析本发明的多肽之间的结合反应并且证实CR6261和CR9114的构象表位的存在，通过生物膜层干涉技术(OctetRed384，福特生物公司(ForteBio))研究这些抗体与该纯化蛋白的复合。为此，将生物素酰化的CR6261、CR9114固定于链霉亲和素涂覆的传感器上，随后将其首先暴露于本发明的纯化多肽的溶液以测量缔合率并且然后暴露于洗涤溶液以测量解离率。固定的CR6261和CR9114两者识别本发明的多肽，如通过在暴露于本发明的可溶形式的多肽之后的明显响应证明的。为了估计结合相互作用的解离常数，使用2倍稀释系列进行滴定。将包含固定的CR6261的传感器暴露于包含本发明的可溶多肽的溶液(在分别为750、375、163、81、40、20以及10nM的浓度)，除了纯化的s55G7(SEQIDNO:68)的情况(其中使用了2000、1000、500、250、125、63以及31nM的浓度范围)。类似地，将包含固定的CR9114的传感器在分别为300、150、75、38、19、9以及5nM的浓度暴露于包含本发明的可溶多肽的溶液。在所有情况下，记录4000秒之后的最终响应，绘图为多肽浓度的函数，并且拟合到稳态1:1结合模型以计算表观解离常数Kd(参见图2A至E)。以此方式测定的值列于表8中。
通过与多角度光散射(SEC-MALS)组合的分析性尺寸排阻色谱研究本发明的多肽s127H1(SEQIDNO:66)、s86B4(SEQIDNO:67)、s74H9(SEQIDNO:65)、s6E12(SEQIDNO:69)和s55G7(SEQIDNO:68)与CR6261、CR9114和作为对照的CR8020的Fab片段之间的结合。此技术允许同时分离和估计不同分子种类和/或复合体的分子尺寸。这些结果示于图3A至E，并且总结在表9中。该数据表明，本发明的多肽是单体的并且与CR6261和CR9114(而不是CR8020)的Fab片段形成一种1:1复合体。这与这些Fab片段的结合反应的特异性一致，由于CR6261和CR9114结合到源自组1的HA，而CR8020不会。
总之，我们已显示了可以产生本发明的可溶形式的多肽127H1(SEQIDNO:55)、86B4(SEQIDNO:56)、74H9(SEQIDNO:57)、6E12(SEQIDNO:581)以及55G7(SEQIDNO:59)并且纯化至同质。本发明的纯化的可溶多肽能够以高亲和力结合广泛中和单克隆抗体CR6261和CR9114，证实了这些主干域多肽中对应的中和表位的存在。
实例4：在致命的流行性感冒激发模型中对本发明的多肽的保护效力的评价
为了在致命的流行性感冒激发模型中评价本发明的多肽的保护效力，将具有10只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)的组以3周间隔用30μg的佐有10μg基质-M的纯化s86B4(SEQIDNO:67)以及s74H9(SEQIDNO:65)免疫3次。在激发之前1天肌肉内(i.m.)给予激发模型CR6261(15mg/kg)的阳性对照，而用PBS进行免疫则充当阴性对照。在最后一次免疫后四周，将小鼠用25xLD50异源激发病毒(H1N1A/NL/602/09)激发并且每天监测(存活率，重量，临床得分)持续3周。在ELISA测定中针对结合到用于免疫的本发明的多肽(以证实正确的免疫)、结合到可溶的全长HA形式H1N1A/布里斯班/59/07、并且与广泛中和抗体单克隆抗体CR9114竞争结合到全长HA(以确定诱导的抗体是否极为贴近地结合广泛中和CR9114表位)，测试激发前血清。这些结果示于图4A和B中。
这些结果显示，该实验是有效的，由于PBS对照组中的所有小鼠在激发后第8天或之前屈从于感染，而阳性对照组(15mg/kgCR6261，激发前1天)被全面保护。与PBS处理的小鼠相对照，用本发明的多肽s86B4(SEQIDNO:67)或s74H9(SEQIDNO:65)免疫的小鼠中10分之4幸存于该致命激发。这导致比较于PBS对照组，用本发明的多肽免疫的组的增加的存活时间和减少的临床得分。
使用同源抗原(即s86B4或s74H9)或全长HA作为抗原的ELISA数据(参见图4B)表明本发明的多肽s74H9和s86B4两者是免疫原性的并且诱导能够识别全长HA的抗体。
为了进一步理解对免疫的免疫学应答，进行竞争结合ELISA。为此，将板结合的全长HA用连续稀释的血清样品孵育，之后在预定的浓度添加CR9114-生物素。在进一步孵育之后，对结合的CR9114-生物素的量进行定量。使用OD对log稀释度的线性回归来分析数据，表示为‘斜率OD’(ΔOD/10倍稀释)。该数据显示，通过用本发明的多肽进行的免疫诱导能够与广泛中和抗体CR9114竞争结合的抗体。作为比较，在独立的图中指明了通过未标记的CR9114(即自我竞争)和非结合单克隆抗体CR8020(两者都从5μg/ml起始浓度连续稀释)诱导的水平。
总之，这些数据显示，用本发明的多肽s86B4(SEQIDNO:67)或s74H9(SEQIDNO:65)进行的免疫可保护小鼠对抗流行性感冒的致命感染。两种多肽都是免疫原性的，诱导可结合到全长HA的抗体，并且这些抗体的至少部分结合单克隆抗体CR9114的广泛中和表位的表位或接近该表位。
实例5：在致命的流行性感冒激发模型中对本发明的另一种多肽的保护效力的评价
为了评价本发明的另一种多肽s127H1(SEQIDNO:66)在致命的流行性感冒激发模型中的保护效力，将具有10只雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)的组以3周间隔用10μg的佐有10μg基质-M的纯化s127H1免疫3次。作为该激发模型的阳性对照，在激发之前1天肌肉内给予广泛中和抗体单克隆抗体CR6261(15mg/kg)，而用PBS进行免疫则充当阴性对照。在最后一次免疫后四周，将小鼠用25xLD50异源激发病毒(H1N1A/波多黎各/8/34)激发并且每天监测(存活率，重量，临床得分)持续3周。在ELISA测定中针对结合到用于免疫的本发明的多肽s127H1(以证实正确的免疫)、结合到可溶的H1N1A/布里斯班/59/07全长HA、并且与广泛中和抗体单克隆抗体CR9114竞争结合到全长HA(以确定诱导的抗体是否极为贴近地结合广泛中和CR9114表位)，测试激发前血清。这些结果示于图5A和B中。
这些结果显示，该实验是有效的，由于PBS对照组中的所有小鼠在激发后第7天屈从于感染，而阳性对照组(15mg/kgCR6261，激发前1天)被全面保护。与PBS处理的小鼠相对照，用本发明的多肽s127H1(SEQIDNO:66)免疫的小鼠中10分之7幸存于该致命激发。这导致比较于PBS对照组，用本发明的多肽s127H1免疫的组的增加的存活比、增加的存活时间和减少的临床得分。
使用s127H1或可溶的全长HA作为抗原的ELISA数据表明本发明的多肽s127H1是免疫原性的并且诱导能够识别全长HA的抗体(参见图5B)。为了进一步理解对免疫的免疫学应答，进行竞争结合ELISA。为此，将板结合的全长HA用连续稀释的血清样品孵育，之后在预定的滴定浓度添加CR9114-生物素。进一步孵育之后，遵循本领域中熟知的方案，使用链霉亲和素-轭合的辣根过氧化物酶对结合的CR9114-生物素的量进行定量。使用OD对log稀释度的线性回归来分析数据，表示为‘斜率OD’(ΔOD/10倍稀释)。该数据显示，通过用本发明的多肽进行的免疫诱导能够与广泛中和抗体CR9114竞争结合的抗体，如通过在图5B中观察到的竞争水平的提升表明的。作为比较，在独立的图中指明了通过未标记的CR9114(即自我竞争)和非结合单克隆抗体CR8020(两者都从5μg/ml起始浓度连续稀释)诱导的水平。
总之，我们显示了用本发明的多肽s127H1(SEQIDNO:66)进行的免疫可保护小鼠对抗流行性感冒的致命感染。该多肽是免疫原性的，诱导可结合到全长HA的抗体，并且这些抗体的至少部分结合单克隆抗体CR9114的广泛中和表位的表位或接近该表位。
实例6：来自集合1以及集合2的改善的CR6261结合物的分析。
为了进一步理解相比于亲体序列SEQIDNO:6，哪些序列可导致增加的CR6261结合，进一步分析表4以及5中列出的序列。为此，对于每个靶向位置，计算存在于改善的结合物的集合中的可变氨基酸中的每个的相对频度并且与期望频度进行比较，如果对可变氨基酸中任一项没有偏好的话(参见图6以及8，对应的集合1和2的序列)。该数据显示，一些氨基酸在显示改善的CR6261结合的序列中的某些位置处更常存在。
在集合1和2两者中，对于在具有改善的结合的序列中位置402(编号参照SEQIDNO:1)处的Met观察到高存在率，尽管在一些情况下在集合1中Val也观察到。类似地，在两个集合中在位置352观察到芳香族氨基酸Phe和Tyr的高存在率，在位置416观察到Ser的增加的存在率(尽管在集合1中没有那么强)，并且对位置337观察到Lys的增加的存在率。应注意在位置416处的Ser在Asn414处引入推定的N-糖基化位点。另外，在集合2中，在位置340，Asn在改善的CR6261结合物中是高度存在的，而在集合1中Thr是更常存在的；两个突变在位置340引入推定的糖基化位点：Asn导致推定的N-糖基化位点，而Thr导致推定的O-糖基化位点。在位置353，Thr在来自集合1的改善的结合物中是高度存在的，而在来自集合2的改善的结合物中，Val是最常存在的氨基酸。在位置406和409，在改善的CR6261结合物中最常存在的氨基酸是疏水的：在位置406，Ile和Phe(集合1)以及Phe和Leu(集合2)是最常存在的，在位置409，Ile和Val(集合1)以及Phe和Ile(集合2)是最常存在的。最终，在来自集合1的改善的CR6261结合物中，在位置413，Phe是最常存在的氨基酸，而在来自集合2的改善的结合物中Glu是最常存在的。
进一步分析改善的CR6261结合物的序列以确定在改善的CR6261结合物中氨基酸的一些组合是否比其他的更常存在。为此，对包含特定氨基酸组合的改善的结合物序列的数目进行计数，并且如图7A、B(来自集合1的改善的结合物)以及图9A、B(集合2)所示绘图。根据位于多肽的突变体集合中的不同区域，即该融合肽的区域(残基号337、340、352以及353；图7A以及9A，分别来自集合1和2的改善的结合物)以及B-环(残基号406、409、413以及416；图7B以及9B)而将数据组织化。鉴于Met在位置402非常高的存在率，此位置不包括在检测频繁存在的组合的分析中，因为几乎其他位置与位置402的所有组合都包含Met。
在来自集合1的改善的CR6261结合物中，在位置352处的Phe或Tyr与在位置353处的Ile或Thr的组合是最常存在的(在图7A中加框的区域)。相对于B-环区域中的氨基酸的组合，与在位置413处的Phe或Tyr(即芳香族氨基酸)组合的在位置406处的Ile以及与在位置413处的N组合的在位置406的Tyr在改善的CR6261结合物中显示增加的存在率(在图7B中加框的区域)。
为了在来自集合2的多肽中聚焦于该融合肽区域分析改善的CR6261结合物的序列，仅考虑了在位置352处包含Phe或Tyr的序列。在位置352处具有Phe或Tyr的改善的CR6261结合物中最常存在的是在位置340处具有Asn的序列(参见在图9A中加框的区域)。对于B-环区域序列，其中在位置406处具有Phe、Leu或Tyr的，与在位置413处的Glu、Met或Val组合(在图9B中加框的区域)，在改善的CR6261结合物中是最常存在的。总之，该分析显示，在该融合肽区域中在位置353引入Thr，具体而言与位置352的芳香族残基(Phe或Tyr)组合，可改善CR6261与本发明的可溶多肽的结合。另外，在位置337的Lys或通过在位置340引入Asn而引入推定N-糖基化位点也可促成改善的CR6261结合。在B-环区域中，大的疏水残基(Phe、Tyr、Leu或Ile)可促成改善的CR6261结合。具体而言，在位置406处的Phe、Leu、或Tyr，与在位置413处的Glu、Met、或Val组合，可改善CR6261结合。包括在所述位置处的这些残基的本发明的多肽是本发明的优选实施例。
表2.标准氨基酸、缩写以及特性
| 氨基酸 | 3字母 | 1字母 | 侧链极性 | 侧链电荷(pH 7.4) |
| 丙氨酸 | Ala | A | 非极性 | 中性 |
| 精氨酸 | Arg | R | 极性 | 正性 |
| 天冬酰胺 | Asn | N | 极性 | 中性 |
| 天冬氨酸 | Asp | D | 极性 | 负性 |
| 半胱氨酸 | Cys | C | 非极性 | 中性 |
| 谷氨酸 | Glu | E | 极性 | 负性 |
| 谷氨酰胺 | Gln | Q | 极性 | 中性 |
| 甘氨酸 | Gly | G | 非极性 | 中性 |
| 组氨酸 | His | H | 极性 | 正性(10％)中性(90％) |
| 异亮氨酸 | Ile | I | 非极性 | 中性29 --> |
| 亮氨酸 | Leu | L | 非极性 | 中性 |
| 赖氨酸 | Lys | K | 极性 | 正性 |
| 甲硫氨酸 | Met | M | 非极性 | 中性 |
| 苯丙氨酸 | Phe | F | 非极性 | 中性 |
| 脯氨酸 | Pro | P | 非极性 | 中性 |
| 丝氨酸 | Ser | S | 极性 | 中性 |
| 苏氨酸 | Thr | T | 极性 | 中性 |
| 色氨酸 | Trp | W | 非极性 | 中性 |
| 酪氨酸 | Tyr | Y | 极性 | 中性 |
| 缬氨酸 | Val | V | 非极性 | 中性 |
表3.根据本发明的具体实施例的H1序列的序列比对
表4.毕赤酵母中表达的多肽。
如所述的测定表达和CR6261结合，并且计算结合和表达信号的比率。
表5.毕赤酵母中表达的多肽。
如所述的测定表达和CR6261结合，并且计算结合和表达信号的比率。
表6.HEK293F中表达的多肽。
如所述的测定表达和CR6261结合，并且计算结合和表达信号的比率。每个克隆中包括的突变表明于表4以及5中。
表7.针对每个亚型以序列总数目的％计的在指示位置天然发生的序列变化
表8.本发明的多肽的mAb结合的纯化以及强度
表9.如通过SEC-MALS针对本发明的多肽及其与CR6261和CR9114的Fab片段的复合体确定的分子量。基于本发明的多肽的序列(假设单体)以及来自附接聚醣的大约10kDa的额外贡献来估计理论(theor)值。还通过SEC-MALS确定CR6261、CR9114以及CR8020的Fab片段的分子量，并且分别是48、49以及47kDa。
参考文献
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序列
SEQIDNO1：H1全长(A/布里斯班/59/2007)
SEQIDNO:2:H1-mini2-簇1+5+6-GCN4
SEQIDNO:3：福尔顿
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQIDNO:4：FLAG-凝血酶-福尔顿-HIS
SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH
SEQIDNO:5：
MKQIEDKIEEIESKQ
SEQIDNO:6：H1-mini2-簇1+5+6-GCN4，不具有前导序列并且具有FLAG-凝血酶-福尔顿-HIS
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNIPSIQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQSTATGKEGNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH
SEQIDNO:7：
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA
SEQIDNO8：H1共有序列残基402-418(根据SEQIDNO:1编号)
402MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)418
>SC09-114VH蛋白(SEQIDNO:11)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGGTSNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGISPIFGSTAYAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS
>SC09-114VL蛋白(SEQIDNO:12)
SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSVVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL
>CR6261VH蛋白(SEQIDNO:9)
>CR6261VL蛋白(SEQIDNO:10)
>SC08-057VH蛋白(SEQIDNO:13)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTDSVIFMSWVRQAPGKGLECVSIIYIDDSTYYADSVKGRFTISRHNSMGTVFLEMNSLRPDDTAVYYCATESGDFGDQTGPYHYYAMDV
>SC08-057VL蛋白(SEQIDNO:14)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSGDIGGYNAVSWYQHHPGKAPKLMIYEVTSRPSGVSDRFSASRSGDTASLTVSGLQAEDEAHYYCCSFADSNILI
>SC08-020VH蛋白(SEQIDNO:17)
QVQLQQSGAEVKTPGASVKVSCKASGYTFTRFGVSWIRQAPGQGLEWIGWISAYNGDTYYAQKFQ
ARVTMTTDTSTTTAYMEMRSLRSDDTAVYYCAREPPLFYSSWSLDN
>SC08-020VL蛋白(SEQIDNO:18)
EIVXTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMNYLAWFQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRISGSGSGTDFTLTISRLEPADFAVYYCQQYGTSPRT
SEQIDNO：55：127H1
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENKYVCSAKLRMVTGLRNPSQSQGLFGAIAGEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKNTQTAGKENKERIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：56：86B4
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENKYVCSAKLRMVTGLRNPSQSQGLFGAIAGEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKNTQTAGKENKERIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：59：55G7
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENKYVCSAKLRMVTGLRNPSQSQGLFGAIAGEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKNTQTAGKENKERIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：57：74H9
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：60：115A1
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：61：71H2
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSERIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：62：181H9
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSKQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKNERIWCYNAELLVLLENERTLDPHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：58：6E12
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：63：220C9
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSTQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTATGKEYNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：64：113E7
MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTATGKEINKHERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQIDNO：65：s74H9
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQIDNO：66：s127H1
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQIDNO：67：s86B4
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQIDNO：68：s55G7
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQIDNO：69：s6E12
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH
SEQIDNO：72：s74H9-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQIDNO：73：s127H1-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQIDNO：74：s86B4-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQIDNO：75：s55G7-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
SEQIDNO：76：s6E12-长
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG
Claims (17)
1.一种流行性感冒血球凝集素(HA)主干域多肽，该多肽包括(a)流行性感冒血球凝集素HA1域，该HA1域包括HA1N-末端主干区段，该HA1N-末端主干区段包括从该HA1域的位置1至位置x、优选地从位置p至位置x的氨基酸，并通过具有0-50个氨基酸残基的连接序列共价连接至HA1C-末端主干区段，该HA1C-末端主干区段包括从该HA1域的位置y的氨基酸至C-末端氨基酸并且包括该C-末端氨基酸，以及(b)流行性感冒血球凝集素HA2域，其中该血球凝集素主干域多肽对在HA1和HA2之间的接合点处的蛋白酶切割具有抗性，并且其中相比于野生型流行性感冒HA中的对应位置，在位置337、340、352、353、402、406、409、413和/或416处的一个或多个氨基酸已经突变。
2.根据权利要求1所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中该HA1和HA2域是源自于A/布里斯班/59/2007(SEQIDNO:1)。
3.根据权利要求1或2所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中x是52，y＝321，并且p＝18。
4.根据以上权利要求1-3中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中从该HA2域的位置519、520、521、522、523、524、525、526、527、526、528、529、或530(或等价位置)至该HA2域的C-末端的氨基酸序列已被去除。
5.根据以上权利要求中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中
位置337上的突变氨基酸是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
位置340上的突变氨基酸是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
位置352上的突变氨基酸是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、V、Y、A、I、N、S、以及T；
位置353上的突变氨基酸是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：K、R、T、E、G以及V；
位置402上的突变氨基酸是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、K、M、V、R、以及T；
位置406上的突变氨基酸是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
位置409上的突变氨基酸是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
位置413上的突变氨基酸是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、以及V；并且
位置416上的突变氨基酸是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
6.根据以上权利要求中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中这些多肽包括以下氨基酸序列：
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQIDNO:53)，
其中X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、K、M、V、R、以及T；X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
7.根据以上权利要求1-5中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中这些多肽包括以下氨基酸序列：
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG(SEQIDNO:54)，
其中
X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、K、M、V、R、以及T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M、以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
8.根据以上权利要求1-5中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中这些多肽包括以下氨基酸序列：
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG(SEQIDNO:70)，
其中
X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、K、M、V、R、以及T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
9.根据以上权利要求1-5中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中这些多肽包括以下氨基酸序列：
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5NTQX6TAX7GKEX8NKX9ERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQIDNO:71)，
其中
X1是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、I、K、V、A、以及T；
X2是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、F、N、S以及Y；
X3是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：D、F、V、Y、A、I、N、S、以及T；
X4是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：I、K、R、T、E、G以及V；
X5是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：E、K、M、V、R、以及T；
X6是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、H、以及L；
X7是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：A、G、I、R、T、V、F、以及S；
X8是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：F、I、N、S、T、Y、G、E、K、M以及V；并且
X9是选自下组的氨基酸，该组由以下各项组成：H、I、L、N、R、以及S。
10.根据以上权利要求中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中这些多肽包括选自下组的氨基酸序列，该组由SEQIDNO:55-76组成。
11.根据以上权利要求中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽，其中这些多肽包括选自下组的氨基酸序列，该组由SEQIDNO:55、SEQIDNO:66和SEQIDNO:73组成。
12.一种核酸分子，该核酸分子编码根据权利要求1至11中任一项所述的多肽。
13.一种载体，该载体包括如权利要求12所述的核酸分子。
14.一种组合物，该组合物包括如权利要求1至11中任一项所述的多肽，和/或根据权利要求12所述的核酸分子和/或根据权利要求13所述的载体。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽、根据权利要求12所述的核酸、和/或根据权利要求14所述的组合物，用于用作药剂，特别是用作疫苗。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽、根据权利要求12所述的核酸分子、和/或根据权利要求14所述的组合物，用于诱导针对流行性感冒HA蛋白的免疫应答。
17.根据权利要求1-11中任一项所述的流行性感冒HA主干域多肽、根据权利要求12所述的核酸分子、和/或根据权利要求14所述的组合物，用于流行性感冒感染的预防和/或治疗。
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