CN105420227A - 一种造礁石珊瑚总rna提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种造礁石珊瑚总RNA提取方法。它是将超低温保存的新鲜采集的造礁石珊瑚样本利用无菌海水冲洗其体表去除体表附着的其他生物，经液氮研磨后用异硫氰酸胍裂解液裂解，使得造礁石珊瑚的RNA释放游离于异硫氰酸胍裂解液中，然后再提取造礁石珊瑚总RNA；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的酸性水饱和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为RNase-free水。本发明方法实现了对造礁石珊瑚总RNA的高质量提取，最大限度的减少造礁石珊瑚RNA量的降解，可用于造礁石珊瑚基因克隆、差异显示分析、分子杂交等各种分子生物学研究。

Description

一种造礁石珊瑚总RNA提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种造礁石珊瑚总RNA提取方法。
背景技术
珊瑚礁是地球上的生物多样性最高生态系统之一，珊瑚礁生态系统不仅为人类的生产和生活提供各种生物资源，而且具有巨大的生态功能和生态价值，对保障生物多样性、生物生产力和生态平衡具有重要作用。然而近年来，世界范围内的珊瑚白化死亡现象日益频繁，严重时导致珊瑚礁的退化。研究珊瑚白化机理不仅要了解珊瑚外在生理响应，更要深入认识引起这些变化的内在分子机制。造礁石珊瑚的种类繁多，有七十多属。获取高质量的造礁石珊瑚总RNA是进行分子机制研究的首要条件。RNA的质量好坏决定着可被反转录为cDNA的最大序列信息，特别是对于体内生活着大量微生物及虫黄藻的复杂造礁石珊瑚共生体。要获得大量完整、纯度高的总RNA，首先要清除珊瑚体内的虫黄藻、微生物等的影响，其次要对造礁石珊瑚组织进行充分完全地破碎，还要抑制RNA酶的降解作用，从而获得高质量的总RNA。
目前常用的RNA提取方法多用于植物、动物组织的提取，并非适用于造礁石珊瑚，且这些方法通常存在RNA得率和纯度较低的问题，难以进行下一步的分析。
目前，尚无造礁石珊瑚总RNA提取方法的专利及其他文献资料。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术中没有适用于造礁石珊瑚的RNA提取方法的问题，提供一种造礁石珊瑚总RNA提取方法；利用该方法提取的造礁石珊瑚RNA纯度高、质量好，极大的减少了造礁石珊瑚RNA损耗和降低了DNA污染，能适用于后续RT-PCR等分子生物学实验的要求。
本发明的造礁石珊瑚总RNA提取方法，包括造礁石珊瑚的采集和预处理、用裂解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA、添加氯仿沉降再取水相，然后在水相中加入异丙醇沉淀RNA，弃上清，在余下溶液中加入乙醇沉淀RNA，得到造礁石珊瑚总RNA，其特征在于，
所述的造礁石珊瑚的采集和预处理是用无菌海水将造礁石珊瑚冲洗干净并将其表面的水吸干，然后在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；
所述的用裂解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA是将造礁石珊瑚粉末用异硫氰酸胍裂解液裂解释放出RNA；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的水饱和酚(酸性水饱和酚，可以从试剂公司直接购买)、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为无RNA酶的水(RNase-free水)。
所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其具体步骤为：
a、用无菌海水将造礁石珊瑚冲洗干净并将其表面的水吸干，在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；
b、将造礁石珊瑚粉末用异硫氰酸胍裂解液裂解，振荡混合，室温放置5min，4℃、12000g离心5min，取上清液；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的酸性水饱和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为RNase-free水；
c、按步骤b的上清液与氯仿体积比为5:1的量在步骤b的上清液中加入氯仿，摇荡混合，室温放置5min，4℃、12000g离心15-20min；离心后溶液分3层，取出上层水相，按取出的水相与异丙醇的体积比为2:1的量加入异丙醇，室温沉淀10min后12000g离心10min；弃上清，加入余下溶液等体积的无水乙醇，混匀，4℃、7500g离心5min；弃上清，干燥5-10min，得到造礁石珊瑚总RNA，将该RNA溶于RNase-freewater中-70～-80℃保存。
优选，所述的造礁石珊瑚为鹿角杯形珊瑚、丛生盔形珊瑚、霜鹿角珊瑚或澄黄滨珊瑚。
优选，所述的步骤a的无菌海水是经高温灭菌且经0.22μ微孔滤膜过滤的海水。用无菌海水冲洗造礁石珊瑚体表，是为了去除珊瑚体表的其它附着的生物对造礁石珊瑚RNA提取的影响。
优选，所述的步骤b的造礁石珊瑚粉末与异硫氰酸胍裂解液用量比为3g:1ml；此比例下提取效果最佳，造礁石珊瑚过少会导致RNA浓度过低；造礁石珊瑚过多会导致裂解不完全，内源性酶降解RNA严重。
优选，所述的步骤b和c的振荡混合为剧烈振荡15s。
优选，还包括以下步骤：在步骤c的按步骤b的上清液与氯仿体积比为5:1的量在步骤b的上清液中加入氯仿，摇荡混合，室温放置5min，4℃、12000g离心15-20min后，再重复该操作2-3次；这样处理后沉淀去除蛋白质的效果更好。
用于RNA提取的造礁石珊瑚使用前优选在低于-80℃环境下超低温保存，更优选的，用干冰或液氮保存。这样保存效果更好、时间更长，RNA不易降解。材料的新鲜程度与RNA提取的质量和得率有很大的关系，因此，在采样时要保证材料能够迅速超低温冻存，采样时要尽可能带上液氮或干冰以保存材料。
本发明所用异硫氰酸胍裂解液对液氮研磨的粉末状造礁石珊瑚组织具有较好的裂解效果，能够将造礁石珊瑚组织内含物充分破碎，使细胞在裂解液中充分裂解，减少由于研磨不充分造成RNA产量的损耗。
利用本发明方法可以实现提取高质量的造礁石珊瑚RNA，并最大限度的减少造礁石珊瑚RNA量的损耗和降低DNA污染；提取的RNA经RT-PCR后，可扩增出目的基因条带，且条带清晰可见，大小与预想一致，测序结果与GenBank收录的序列相同，进一步证实了用该方法提取的RNA质量和产量均达到了RT-PCR要求，可用于基因克隆、差异显示分析、分子杂交等各种分子生物学研究。
附图说明
图1为造礁石珊瑚RNA电泳图。
图2为造礁石珊瑚RNA反转录后得到的核糖体rRNA基因序列扩增产物电泳图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
2011年7月在三亚湾海域潜水采集鹿角杯形珊瑚、丛生盔形珊瑚和澄黄滨珊瑚样本，海水深度为1-5m，采样时使用液氮保存样品，以保证材料能够迅速超低温冻存。上述三种造礁石珊瑚种类由中国科学院南海海洋研究所黄晖研究员鉴定。
用经高温灭菌且经0.22μ微孔滤膜过滤的海水冲洗鹿角杯形珊瑚2-3次，以去除鹿角杯形珊瑚体表的其它附着的生物；将研钵预冷，将鹿角杯形珊瑚表面的水吸干后，称取3g左右的鹿角杯形珊瑚组织，在盛有液氮的研钵中磨成粉末。将研磨破碎的鹿角杯形珊瑚组织粉末转移到干净的EP管，然后加入1mL异硫氰酸胍裂解液，剧烈振荡，室温放置5min，4℃、12000g离心5min，取上清液。按上清液与氯仿体积比为5:1的量在上清液中加入氯仿，剧烈摇荡15s，室温放置5min，4℃、12000g离心15min。离心后溶液分3层，取上层水相转入新的EP管，按取出的水相与异丙醇的体积比为2:1的量加入异丙醇，室温沉淀10min后12000g离心10min。弃上清，根据EP管中余下溶液等体积加入无水乙醇，混匀，4℃、7500g离心5min。弃上清，干燥5-10min，得到鹿角杯形珊瑚总RNA。将该RNA溶于RNase-freewater，得到鹿角杯形珊瑚总RNA溶液，保存于-70℃。所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的酸性水饱和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为RNase-free水。
取1μL鹿角杯形珊瑚总RNA溶液在1％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为l×TAE，120V(电压)25min，紫外灯下观测和拍照，检测所提取RNA样品的质量。鹿角杯形珊瑚总RNA电泳结果如图1所示，可以看出，琼脂糖凝胶电泳板上鹿角杯形珊瑚总RNA谱带清晰，边缘锐利，亮度较大，无降解，表明提取的RNA含量较高，并且28S条带亮度约为18S带的两倍，符合RNA分子完整、无明显降解的标准，说明此方法能够抑制鹿角杯形珊瑚细胞内多酚类物质的氧化和多糖物质对总RNA提取的影响。
鹿角杯形珊瑚总RNA的反转录(RT)反应参照RTreagentKit(Dalian,China)说明书进行。由此得到鹿角杯形珊瑚cDNA。
丛生盔形珊瑚和澄黄滨珊瑚的总RNA提取方法与本实施例中鹿角杯形珊瑚的总RNA提取方法相同，经电泳检测，提取得到的RNA分子完整、无明显降解。丛生盔形珊瑚和澄黄滨珊瑚的RNA反转录方法也与本实施例中鹿角杯形珊瑚的反转录方法相同，由此得到丛生盔形珊瑚cDNA和澄黄滨珊瑚cDNA。
根据GenBank中已发表的造礁石珊瑚(鹿角杯形珊瑚、丛生盔形珊瑚和澄黄滨珊瑚)核糖体基因序列，用Primer5.0设计引物，如表1所示。
表1造礁石珊瑚核糖体rRNA引物序列
PCR反应液体积为25μl，其组分为：1×Buffer，引物(表1中对应的引物对)各为0.3μM，200μMdNTPs，2μMMgCl2，0.5U的Taq酶，25ng的造礁石珊瑚(对应为鹿角杯形珊瑚、丛生盔形珊瑚或澄黄滨珊瑚)cDNA为模板，最后用ddH2O补加至25μl；PCR条件为：94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃30S，34个循环；72℃8min。由此分别得到各引物对对应的PCR产物。
所得PCR产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，均产生预计大小的条带(图2)。PCR产物送至Invitrogen公司测序，结果均为相应造礁石珊瑚的核糖体rRNA基因序列。结果证实了用该方法提取的造礁石珊瑚总RNA质量和产量均达到了RT-PCR要求，可用于基因克隆、差异显示分析、分子杂交等各种分子生物学后续研究。
实施例2：
2011年7月在大亚湾及三亚湾海域潜水采集霜鹿角珊瑚、澄黄滨珊瑚样本，海水深度为1-5m，采样时使用干冰保存样品，较长时间的保存需冰冻于-80℃超低温冰箱。上述两种造礁石珊瑚种类由中国科学院南海海洋研究所黄晖研究员鉴定。
用经高温灭菌且经0.22μ微孔滤膜过滤的海水反复冲洗霜鹿角珊瑚，以去除霜鹿角珊瑚体表的其它附着的生物；将研钵预冷，将霜鹿角珊瑚表面的水吸干后，称取3g左右的霜鹿角珊瑚组织，在盛有液氮的研钵中磨成粉末。将研磨破碎的霜鹿角珊瑚组织粉末转移到干净的EP管，然后加入1mL异硫氰酸胍裂解液，剧烈振荡15s，室温放置5min，4℃、12000g离心5min，取上清液。按上清液与氯仿体积比为5:1的量在上清液中加入氯仿，剧烈摇荡15s，室温放置5min，4℃、12000g离心20min。离心后溶液分3层(若中间层较多，则可再加入相同量的氯仿，剧烈摇荡15s，室温放置5min，4℃、12000g离心20min，如此重复该步骤2-3次；沉淀去除蛋白质的效果更好)，取上层水相转入新的EP管，按取出的水相与异丙醇的体积比为2:1的量加入异丙醇，室温沉淀10min后12000g离心10min。弃上清，根据EP管中余下溶液等体积加入无水乙醇，混匀，4℃、7500g离心5min。弃上清，干燥5-10min，得到霜鹿角珊瑚总RNA。将该RNA溶于RNase-freewater，保存于-80℃。所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的酸性水饱和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为RNase-free水。
澄黄滨珊瑚总RNA的提取方法与本实施例的霜鹿角珊瑚总RNA提取方法相同，由此得到澄黄滨珊瑚总RNA。
用1％的琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计检测所提取霜鹿角珊瑚RNA和澄黄滨珊瑚RNA样品的质量和纯度，确保后续使用的是高质量RNA，结果表明所提取的RNA质量和产量均达到RT-PCR和用于后续分析的要求。以此RNA样品为模板，再参照RTreagentKit(Dalian,China)说明书进行反转录反应，得到霜鹿角珊瑚cDNA和澄黄滨珊瑚cDNA。根据GenBank中已发表的其它相近物种的序列，用Primer5.0设计通用引物，设计β-actin基因引物用于从霜鹿角珊瑚cDNA中扩增霜鹿角珊瑚β-actin基因，设计ferritin基因引物用于从澄黄滨珊瑚cDNA中扩增澄黄滨珊瑚ferritin基因(表2)。
表2造礁石珊瑚β-actin和ferritin基因引物序列
PCR反应液体积为25μl，其组分为：1×Buffer，引物(β-actin基因或ferritin基因引物对)各为0.3μM，200μMdNTPs，2μMMgCl2，0.5U的Taq酶，25ng的造礁石珊瑚(对应为霜鹿角珊瑚或澄黄滨珊瑚)cDNA模板，最后用ddH2O补加至25μl；PCR条件为：94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃30s，30个循环；72℃8min。由此得到PCR产物。
将所得PCR产物送至Invitrogen公司测序，获得霜鹿角珊瑚的β-actin基因序列230bp，将其提交至NCBI并获得登陆序列号为JQ305793；获得澄黄滨珊瑚的ferritin基因序列254bp，并获得登陆序列号为JQ305796。从结果上看，本实施例中提取的RNA经RT-PCR后，可扩增出目的基因条带，且获得了相应的功能基因序列，进一步证实了用该方法提取的RNA质量和产量均达到了RT-PCR要求，可用于基因克隆、差异显示分析、分子杂交等各种分子生物学研究。

Claims (9)

1.一种造礁石珊瑚总RNA提取方法，包括造礁石珊瑚的采集和预处理、用裂解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA、添加氯仿沉降再取水相，然后在水相中加入异丙醇沉淀RNA，弃上清，在余下溶液中加入乙醇沉淀RNA，得到造礁石珊瑚总RNA，其特征在于，
所述的造礁石珊瑚的采集和预处理是用无菌海水将造礁石珊瑚冲洗干净并将其表面的水吸干，然后在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；
所述的用裂解液裂解造礁石珊瑚释放出RNA是将造礁石珊瑚粉末用异硫氰酸胍裂解液裂解释放出RNA；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的酸性水饱和酚、0.8M硫
氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为无RNA酶的水。
2.根据权利要求1所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其特征在于，其具体步骤为：
a、用无菌海水将造礁石珊瑚冲洗干净并将其表面的水吸干，在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；
b、将造礁石珊瑚粉末用异硫氰酸胍裂解液裂解，振荡混合，室温放置5min，4℃、12000g离心5min，取上清液；所述的异硫氰酸胍裂解液含有体积分数为38％的酸性水饱和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸钠和体积分数为5％的甘油，其余为RNase-free水；
c、按步骤b的上清液与氯仿体积比为5:1的量在步骤b的上清液中加入氯仿，摇荡混合，室温放置5min，4℃、12000g离心15-20min；离心后溶液分3层，取出上层水相，按取出的水相与异丙醇的体积比为2:1的量加入异丙醇，室温沉淀10min后12000g离心10min；弃上清，加入余下溶液等体积的无水乙醇，混匀，4℃、7500g离心5min；弃上清，干燥5-10min，得到造礁石珊瑚总RNA，将该RNA溶于RNase-freewater中-70～-80℃保存。
3.根据权利要求1所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其特征在于，所述的造礁石珊瑚为鹿角杯形珊瑚、丛生盔形珊瑚、霜鹿角珊瑚或澄黄滨珊瑚。
4.根据权利要求1所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其特征在于，所述的步骤a的无菌海水是经高温灭菌且经0.22μ微孔滤膜过滤的海水。
5.根据权利要求1所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其特征在于，所述的步骤b的造礁石珊瑚粉末与异硫氰酸胍裂解液用量比为3g:1ml。
6.根据权利要求1所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其特征在于，所述的步骤b和c的振荡混合为剧烈振荡15s。
7.根据权利要求1所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其特征在于，还包括以下步骤：在步骤c的按步骤b的上清液与氯仿体积比为5:1的量在步骤b的上清液中加入氯仿，摇荡混合，室温放置5min，4℃、12000g离心15-20min后，再重复该操作2-3次。
8.根据权利要求1所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其特征在于，所述的用于RNA提取的造礁石珊瑚使用前在低于-80℃环境下超低温保存。
9.根据权利要求1所述的造礁石珊瑚总RNA提取方法，其特征在于，所述的用于RNA提取的造礁石珊瑚使用前用干冰或液氮保存。
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