CN105409882A - 一种筛选携带缺失型Tgf2转座子金鱼亲本以繁育高正品率后代的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选携带缺失型Tgf2转座子金鱼亲本以繁育高正品率后代的方法。本发明通过Southern？blot和反向PCR技术对9种金鱼品系的Tgf2转座子拷贝数和缺失分布进行了研究，研究结果表明，自然状况下，金鱼Tgf2转座子既存在完全转座子(Intact型)，也存在内部片段缺失型转座子(Del-I/-II/-III型)，金鱼Tgf2片段的缺失与金鱼正品率存在相关性。因此通过筛选携带Del-I/-II/-III型3种缺失型Tgf2转座子的金鱼作为亲本可以显著提高后代正品率。

Description

一种筛选携带缺失型Tgf2转座子金鱼亲本以繁育高正品率后代的方法

技术领域

本发明涉及金鱼的繁育方法，具体地说，涉及一种筛选携带缺失型Tgf2转座子金鱼亲本以繁育高正品率后代的方法。

背景技术

金鱼(Carassiusauratus)是世界著名三大观赏鱼类之一，发源于中国，至今已有1700多年历史，是淡水渔业的一个重要组成部分。据有关资料显示：至2000年底，全国除西藏外，各省市自治区均有金鱼生产性养殖。全国有大大小小金鱼场、企业、公司上万家，年产值近50亿元。然而，金鱼养殖产业却存在一个普遍问题：繁育的正品率通常低于20％，养殖过程中正品率仍不断降低。这将直接导致养殖效益下滑，严重影响养殖户的积极性。研究金鱼正品率的遗传机制将有助于提高金鱼繁育的准确度，减少人力、物力的浪费，提高金鱼养殖效益，具有重要的应用价值。然而目前还未见相关报道。

转座子(Transposon)又称跳跃因子，是基因组上的有一定重复的DNA序列，能在染色体内或染色体间进行“跳跃”，这种跳跃就形成了转座。转座子是物种形成和进化的重要推动因素之一。例如，玉米AC转座子的自主活性与其外在表现性状籽粒的颜色存在直接关系；青鳉(Oryziaslatipes)活性Tol2转座子在酪氨酸酶基因中的插入诱变与青鳉白化病性状存在直接关系。

通常，按照转座机制，转座子可分为反转录转座子和DNA转座子。Tgf2转座子是本申请人于2008年在金鱼中发现的，它是继青鳉Tol2转座子后发现的具有天然活性的脊椎动物转座子，它的出现丰富了hAT转座子家族。Tgf2转座子是一种DNA转座子，和其它DNA转座子一样，Tgf2转座子在自身编码的转座酶作用下以“剪切-粘贴”的方式进行转座。当前，关于Tgf2转座子的研究，我们已经对其基因序列进行了克隆并对其结构和可能编码的转座酶进行了解析。另外，对其转座活性，我们分别在金鱼和斑马鱼中进行了内源性自主转座和外源性转座的活性验证。此外，本实验室利用Tgf2转座子的重复的左右末端和转座酶编码区构建了具有自主知识产权的转基因系统和PB-Tgf2复合转座元件，并在草鱼、团头鲂和鲤鱼等养殖鱼类以及模式生物斑马鱼中相继开展了转基因研究。相关转基因研究发现，金鱼Tgf2转座元件有较高的插入或整合效率，表明Tgf2转座子可高效介导转座。进一步研究发现，通过原核表达分离得到的Tgf2转座子蛋白酶具有生物活性且能在团头鲂胚胎中高效介导转座。然而，虽然Tgf2转座子具有自主转座活性，自然状况下在不同个体中还存在缺失的Tgf2转座子。那么完全型转座子和缺失型转座子在金鱼不同品系中具有怎样的分布，又具有怎样的拷贝数，这些还不是很清楚。

进一步深入的了解Tgf2转座子，研究其与金鱼正品率之间的关系，将有利于金鱼繁育工作。而目前转座子与金鱼高正品率的相关研究国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种繁育高正品率金鱼后代的方法，所述的方法是以携带缺失型Tgf2转座子的金鱼作为亲本。

所述的缺失型Tgf2转座子选自下列中的任一种：

a)缺失I型：仅存在第一到第二外显子区域缺失的类型；

b)缺失II型：仅存在第二到第四外显子区域缺失的类型；

c)缺失III型：既存在第一到第二外显子区域缺失，同时又存在第二到第四外显子区域缺失的类型。

所述的金鱼为珍珠、蝶尾、鹤顶红、红狮、红琉金、花琉金、红龙睛、黑龙睛或草金品系。

本发明还提供了一种繁育高正品率开尾型鹤顶红金鱼后代的方法，所述的方法是以携带缺失型Tgf2转座子的鹤顶红金鱼作为亲本。

所述的缺失型Tgf2转座子选自下列中的任一种：

a)缺失I型：仅存在第一到第二外显子区域缺失的类型；

b)缺失II型：仅存在第二到第四外显子区域缺失的类型；

c)缺失III型：既存在第一到第二外显子区域缺失，同时又存在第二到第四外显子区域缺失的类型。

所述的“高正品率”指正品率不低于20％，较佳地，不低于50％，更佳地，不低于60％。

本发明优点在于：

本发明选取9种金鱼品系，通过Southernblot和反向PCR技术对Tgf2转座子拷贝数和缺失分布进行了研究。研究结果表明，金鱼Tgf2转座子在基因组中插入拷贝数2-6不等，在基因组中为随机插入，且拷贝数在品系和个体间存在差异。自然状况下，金鱼Tgf2转座子既存在完全转座子(Intact型)，也存在内部片段缺失型转座子(Del-I/-II/-III型)。统计发现在整个金鱼品系中，完整型占5.56％，半缺失I型占34.44％，半缺失II型占46.67％，完全缺失型占13.33％，绝大多数存在内部片段缺失。另外，整胚原位杂交显示，转座具有遗传效应。完全转座子具有自主转座活性，能够进行自主完全剪切或不完全剪切。本发明证实金鱼Tgf2片段的缺失与金鱼正品率存在相关性，因此通过筛选携带Del-I/-II/-III型3种缺失型Tgf2转座子的金鱼作为亲本可以显著提高后代正品率(从20％提高到60％)，减少人力、物力的浪费，提高金鱼养殖效益。

附图说明

图1.金鱼Tgf2转座子Southernblot图谱。1：蝶尾；2：蝶尾；3：蝶尾；4：花琉金；5：花琉金；6：花琉金。

图2.不同金鱼品系(A：蝶尾；B：花琉金)Tgf2转座子插入位点的5’和3’端侧翼序列。

图3.金鱼Tgf2转座子左末端(上)和右末端(下)扩增产物电泳图。M：D2000分子量标准；1-3：鹤顶红；4-6：红狮；7-9：红琉金；10-12：花琉金；13-15：红龙睛；16-18：黑龙睛；19-21：草金。

图4.金鱼Tgf2转座子不同缺失类型分析。M：D2000分子量标准。

图5.不同Tgf2转座子类型在金鱼各品系中的分布。

图6.不同Tgf2转座子类型在整个金鱼家族的比例。

图7.金鱼Tgf2mRNA在胚胎时期的整胚原位杂交结果。control：Tgf2对照正义探针原位杂交结果；A和B：Tgf2反义探针原位杂交结果。横向观察所有胚胎头部在左边。

图8.鹤顶红Del-I/-II/-III型3种缺失亲本繁殖后代正品率。家系1、2、6：Del-I型；家系3、4：Del-II型；家系5：Del-III型。家系1～6的亲本均是双尾(即开尾正品)，以及对照家系1～3的亲本也均是双尾(即开尾正品)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1材料与方法

1.1实验材料

珍珠、蝶尾、鹤顶红、红狮、红琉金、花琉金、红龙睛、黑龙睛和草金9个不同金鱼品系，均为1龄鱼，取自上海青浦永逸水族科技开发有限公司。每品系30尾，剪取鱼鳍，放入95％的酒精中，保存于-20℃备用。实验所用胚胎为鹤顶红金鱼人工授精所得，受精卵置于胚胎培养液ERS(embryorearingsolution)中培养，每隔3-4h换水1次。

1.2引物设计

根据在线数据库NCBI上GenBank中Tgf2转座子序列(HM146132.1)，设计引物Tgf2-1、Tgf2-2、Tgf2-L和Tgf2-R，分别用于扩增Tgf2转座子第一到第二外显子、第二到第四外显子上的序列和Tgf2转座子左右末端。根据探针序列特异性要求，依据Tgf2转座子序列设计Southernblot中所用杂交探针引物Tgf2-SB。另外，根据反向PCR技术要求，利用引物SplinkerL和SplinkerS合成splinkerette接头，后设计引物Splinker1、Splinker2、Tgf2-5’GSP1/Tgf2-5’GSP2和Tgf2-3’GSP1/Tgf2-3’GSP2，分别用于扩增Tgf2转座子的5’-端及3’-端侧翼序列。引物信息见表1。

表1引物序列

1.3基因组DNA的制备

参照北京天根生物科技有限公司生产的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)说明书介绍的方法提取样品基因组DNA。基因组DNA提取完成后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA质量和浓度，保存于-20℃备用。

1.4Tgf2转座子完整性检测

以提取的9个不同品系金鱼的基因组DNA为模板，采用引物Tgf2-1、Tgf2-2、Tgf2-L和Tgf2-R来分别扩增Tgf2转座子第一到第二外显子、第二到第四外显子上的序列和Tgf2转座子左右末端。反应体系25μL，包含12.5μL含染料的2×TaqPCRMasterMix(TaqDNAPolymerase：0.1U/μL；MgCl₂：4mM；dNTPseach：0.4mM)，上下游引物各2μL(10μmol/L)，2μL模板DNA(30-50ng)，8.5μLddH₂O。PCR反应在EppendorfMastercyclerepgradients型PCR仪上进行，反应程序为：94℃预变性5min，94℃30s，56-58℃(根据表1中各引物的退火温度进行调整)30s，72℃30s，30个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物经琼脂糖电泳分离，对不同大小的条带进行割胶回收、连接转化和重组子鉴定后，挑选阳性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果利用BioEdit生物学软件与已知序列进行比对。

1.5整胚原位杂交

提取检测含有完整转座子的金鱼性腺RNA，然后将其反转为cDNA备用。用表1中引物(Tgf2-Insitu)在Tgf2基因编码区扩增一段840bp目的片段，将目的片段与pGEM-T载体(Promega，美国)连接。限制性内切酶SacⅡ线性化后，经T7或者SP6RNA聚合酶(Promega，美国)体外转录生成正义或者反义RNA探针。用于原位杂交的胚胎(含有完整转座子的亲鱼所产的卵和完全缺失型的亲鱼所产的卵)先经4％多聚甲醛(PFA)4℃固定24h，除去4％PFA后用甲醇洗涤2次，最后用甲醇浸泡可长期于4℃保存。固定的胚胎经不同浓度PBST复水，蛋白酶K消化，4％PFA再固定，65℃预杂交及杂交后，回收探针，与抗体结合，清洗之后加入显色液(BCIP/NBT/TMNT，Roche，瑞士)。胚胎显色完全后在NikonSMZ1500荧光体视显微镜下进行拍照。

1.6基于Southernblot的Tgf2转座子拷贝数检测

将完整的金鱼基因组DNA用BglⅡ限制性内切酶酶切完全后，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶经转膜后进行Southernblot杂交。杂交反应的详细步骤参见Southern杂交试剂盒(Roche，瑞士)说明书。杂交所用探针是利用引物Tgf2-SB通过PCR反应，经克隆、连接转化、测序后得到的658bp的DNA产物。PCR反应在EppendorfMastercyclerepgradients型PCR仪上进行，反应程序为：94℃预变性5min，94℃30s，56℃30s，72℃45s，40个循环，最后72℃延伸7min。

1.7Tgf2转座子侧翼序列的获得和拷贝数的检测

首先，利用50μm/μl的SplinkerL和SplinkerS分别以50μl等体积混合后经95℃保温5min，然后以1℃/15s逐步降至4℃(PCR仪上操作)，形成splinkerette接头。然后，提取经鉴定包含完整Tgf2转座子的金鱼基因组DNA，用限制性内切酶Sau3A1对其进行37℃水浴酶切。接着，将酶切完全的DNA产物与splinkerette接头于16℃进行恒温连接。其次，以上一步连接产物为模板，分别以引物Tgf2-5’GSP1/Splinker1进行5’侧翼序列的第一轮扩增。接着以稀释50倍的第一轮扩增产物为模板以Tgf2-5’GSP2/Splinker2为扩增引物，进行5’侧翼序列的第二轮扩增。最后，对第二轮扩增产物进行琼脂糖凝电泳，割胶回收、连接、转化等分子克隆步骤后，挑取单菌落阳性克隆送往上海生工生物工程有限公司进行测序。3’侧翼序列的扩增操作同上。

2结果

2.1金鱼各品系Tgf2转座子自然拷贝数

利用引物Tgf2-SB通过PCR反应与PCR扩增标记，制备了目的片段为658bp的特异性探针，对具有完整型转座子的金鱼个体(蝶尾和花琉金品系金鱼)进行检测。通过一系列杂交操作后，最终得到了Southern杂交图谱。图谱显示，蝶尾和花琉金品系金鱼Tgf2转座子自然状况下存在多个拷贝，拷贝数2-6个不等(图1)，且拷贝数在个体间存在差异，在其它品系金鱼拷贝数的检测中也是类似结果。

2.2金鱼各品系Tgf2转座子侧翼序列分析

通过反向PCR和BioEdit软件的序列分析，我们得到Tgf2转座子在金鱼基因组插入区5’端和3’端的侧翼序列。结果显示，蝶尾和花琉金品系Tgf2转座子在金鱼基因组插入区5’侧翼序列均检测到4种，推测其拷贝数至少存有4个。我们发现Tgf2转座子在金鱼基因组插入区5’端和3’端的侧翼序列都不尽相同(图2)。即在同一基因组中，Tgf2转座子能够在基因组多个位点进行插入，且这种插入表现出一种随机性，且拷贝数在个体间存在差异(图2)。

2.3金鱼各品系Tgf2转座子完整/缺失检测

分别用Tgf2-1、Tgf2-2、Tgf2-L和Tgf2-R引物(表1)在9种金鱼品系基因组中进行PCR扩增，依次扩增了Tgf2转座子第一到第二外显子、第二到第四外显子上的序列和Tgf2转座子左右末端，四段序列涵盖了整个Tgf2转座子全长。以Tgf2-L和Tgf2-R为引物的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳和测序结果显示金鱼各品系中均含有完整的左右末端(图3)。

以Tgf2-1F/-R引物(图4中A)进行第一到第二外显子PCR扩增和序列分析，检测发现在金鱼品系中除了存在完整型1882bp序列外，还存在1564bp、832bp、746bp、361bp等4种缺失序列(图4中B-a,b)。以Tgf2-2F/-R引物(图4中A)进行第二和第四外显子PCR扩增和序列分析，检测发现在金鱼品系中除了存在完整型1447bp序列外(图4中B-c)，有些个体仅存在589bp，即有858bp的片段缺失(图4中B-d)。如图3中C所示，我们把四个外显子都不存在缺失的称为完整型(Intact)，仅存在第一到第二外显子区域缺失类型的称为缺失I型(Del-I)，把仅有第二到第四外显子区域缺失类型的称为缺失II型(Del-II)，把两大区域都缺失的类型称为缺失III型(Del-III)。

对红龙睛、红琉金、草金、黑龙睛、红狮、花琉金、鹤顶红7个不同金鱼品系(每个品系各30尾，共210尾)中Tgf2转座子4种完整/缺失类型做了统计分析，在黑龙睛和红狮中仅存在Del-I型缺失，在红龙睛、红琉金、草金和花流金中则存在Del-I、Del-II型2种缺失，而在鹤顶红中存在完整型(Intact型)及Del-I/-II/-III型3种缺失(图5)。统计发现在整个金鱼品系中，完整型占3.56％，缺失I型占34.44％，缺失II型占46.67％，完全缺失型占13.33％(图6)。

2.4Tgf2转座酶的遗传效应

通过整胚原位杂交，发现完整型转座子亲鱼杂交的胚胎(A)在尾部检测到Tgf2探针杂交信号，而完全缺失型亲鱼杂交的后代(B)在胚胎中未检测到任何信号(图7)。这一结果表明，Tgf2完整型(Intact型)转座子可以进行转座酶mRNA的转录，可进一步翻译出有活性的Tgf2转座酶；而Tgf2转座子Del-I/-II/-III型3种缺失型子代不能转录出转座酶mRNA，不能进一步翻译出有活性的Tgf2转座酶。

2.5携带金鱼缺失型Tgf2转座子可以显著提高后代正品率

不同金鱼品系中存在Del-I/-II/-III型3种缺失(图4)，这些Tgf2转座子的大片段缺失可导致转座酶功能失活(图7)。在珍珠、蝶尾、鹤顶红、红狮、红琉金、花琉金、红龙睛、黑龙睛和草金不同品系金鱼中，Del-I/-II/-III型3种缺失会导致金鱼正品率的提高，如在鹤顶红品系中，通过选育出Del-I/-II/-III型3种缺失亲本进行繁殖，开尾型正品后代比率可由不到20％提高到60％以上(图8)。

2.6高正品率金鱼家系生产应用情况

上海久逸水族科技开发有限公司2011年从上海海洋大学863课题组青浦鱼类育种试验站引进Del-I/-II/-III型3种缺失琉金金鱼87组、草金金鱼112组，2012年，繁殖获得的金鱼正品率由不到20％提高到60％以上，减少了人力物力的浪费，而且反映该批金鱼运输成活率较高。2012年，上海久逸水族科技开发有限公司扩大引进Del-I/-II/-III型3种缺失琉金金鱼400组、草金金鱼300组，2013年，以上两批金鱼实现了批量繁殖，繁殖获得的金鱼正品率提高到60％以上。上海聚金观赏鱼养殖专业合作社在2012年5月30-31日从上海海洋大学青浦鱼类育种试验站试引进Del-I/-II/-III型3种缺失金鱼突变体200尾(琉金和鹤顶红各100尾)，2013年春以金鱼突变体作为亲本繁殖获得鱼苗50万尾，经2个月饲养，金鱼突变体后代规格为20～30g，平均规格为15g，金鱼突变体鱼种阶段生长表现良好，成活率较高，尤其是正品率从小于20％提高到60％，大大节省了饵料、饲料和池塘养殖面积，节省了挑选次品的劳动力。

3讨论

本实验中，我们检测到金鱼基因组中既存在序列完全的完整型转座子，又存在不同程度片段缺失的非完整型转座子。但是，它们都含有完整的左右末端重复序列。完整型转座子个体中，我们除了检测到完全片段外，还检测到一些小的片段的缺失。对于含有完整Tgf2转座子的个体来说，由于其自身能够编码完整转座酶，所以能在自身转座酶的作用下进行完全转座；而检测到的小片段可能是转座酶的不完全剪切造成的。关于非完整型转座子，由于ORF区域片段的缺失，已经不能编码完整的转座酶，因此不具备转座活性，也就不存在自主剪切。从金鱼Tgf2转座子完整型仅占5.56％的比例来看，转座是一种进化的驱动力。这种有活性的完整型转座子也许是金鱼体色各异、形态多样的一个内在驱动力。基于本发明的实验结果，本领域技术人员可通过筛选Del-I/-II/-III型3种缺失型Tgf2转座子的金鱼作为亲本，达到显著提高后代正品率的目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种繁育高正品率金鱼后代的方法，其特征在于，所述的方法是以携带缺失型Tgf2转座子的金鱼作为亲本。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的缺失型Tgf2转座子选自下列中的任一种：

a)缺失I型：仅存在第一到第二外显子区域缺失的类型；

b)缺失II型：仅存在第二到第四外显子区域缺失的类型；

c)缺失III型：既存在第一到第二外显子区域缺失，同时又存在第二到第四外显子区域缺失的类型。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的金鱼为珍珠、蝶尾、鹤顶红、红狮、红琉金、花琉金、红龙睛、黑龙睛或草金品系。

4.一种繁育高正品率开尾型鹤顶红金鱼后代的方法，其特征在于，所述的方法是以携带缺失型Tgf2转座子的鹤顶红金鱼作为亲本。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的缺失型Tgf2转座子选自下列中的任一种：

a)缺失I型：仅存在第一到第二外显子区域缺失的类型；

b)缺失II型：仅存在第二到第四外显子区域缺失的类型；

c)缺失III型：既存在第一到第二外显子区域缺失，同时又存在第二到第四外显子区域缺失的类型。