CN105408491B - 葡萄糖制造方法以及通过该方法制造的葡萄糖 - Google Patents

葡萄糖制造方法以及通过该方法制造的葡萄糖 Download PDF

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Abstract

本发明的课题的目的在于提供葡萄糖收率优异的葡萄糖制造方法以及通过该方法制造的葡萄糖。解决的手段是提供一种葡萄糖制造方法，其特征在于，将纤维素原料C使用纤维素分解酶与唾液或来源于生物唾液的活性助剂的混合物来分解，以及提供通过该方法制造的葡萄糖。

Description

葡萄糖制造方法以及通过该方法制造的葡萄糖
技术领域
本发明涉及能够提高从纤维素原料的葡萄糖收率的葡萄糖制造方法以及通过该方法制造的葡萄糖。
背景技术
近年来，葡萄糖作为石油燃料的替代燃料的生物乙醇的原材料、作为高分子素材的原材料，更多地用于工业用用途中。
以往，工业用葡萄糖是如专利文献1中所记载那样，由土豆类以及玉米、小麦、大麦、黑麦、黑小麦或大米等谷类，或者如甘蔗、甜菜那样的食糖原料用的植物来制造，但由于在工业用用途中的利用加速化，作为粮食用来交易的谷类、食糖原料用的植物的交易价格会高涨，对家庭生活造成压力或对发展中国家的饥饿的影响令人担忧。
因此，希望由地球上的埋藏量庞大的木材、草、稻草等非食品的纤维素原料制造葡萄糖，而专利文献2中，记载了由这样的纤维素原料制造葡萄糖。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2011－915550号公报
专利文献2：日本特开2012－085544号公报
发明内容
发明所要解决的课题
然而，纤维素原料的晶质成分非常牢固，为了不用强酸来施加强制性的糖化处理而通过酶分解来得到葡萄糖，则一般如专利文献2所记载那样，作为预处理，施加纤维素原料的颗粒化工序、向碱溶液中的浸渍工序等，而即使施加了这些预处理，也难以使葡萄糖的收率飞跃性地提高。
因此，本发明的目的在于，提供一种葡萄糖的收率优异的葡萄糖制造方法以及通过该方法制造的葡萄糖。
用于解决课题的方法
在此，牛、驴、骆驼、绵羊、山羊等反刍动物通过将稻草(藁)等纤维素原料在体内糖化来获得能量。本发明人等关注以纤维素原料为食物的反刍动物的纤维素分解功能，发现该反刍动物的唾液是辅助酶分解的原因之一，以至完成本发明。
为了实现上述目的，本发明葡萄糖制造方法的第一方式的特征在于，使用纤维素分解酶与唾液或来源于生物唾液的活性助剂的混合物来分解纤维素。此外，本发明葡萄糖制造方法的第二方式的特征在于，所述唾液为进行反刍的动物的唾液，所述来源于生物唾液的活性助剂由进行反刍的动物的唾液提取而成。此外，进一步，本发明葡萄糖制造方法的第三方式的特征在于，所述进行反刍的动物的唾液为牛、驴、骆驼、绵羊、山羊的唾液。
在这样的、本发明葡萄糖制造方法的第一方式至第三方式中，能够使从纤维素原料的葡萄糖收率飞跃性地提高。
本发明的葡萄糖的特征在于，使用第一方式至第三方式中任一制造方法制造。
在这样的、本发明的葡萄糖中，通过以高收率从纤维素原料制造，能够向市场以低价提供。
发明的效果
根据本发明的葡萄糖制造方法，能够使从纤维素原料的葡萄糖收率飞跃性地提高。
进而，由于通过比较平稳的酶分解使纤维素原料糖化，因此能够实现制造厂的安全性管理的成本低价化，结果能够以低价提供葡萄糖。
此外，根据本发明的葡萄糖，通过以高收率从纤维素原料制造，能够向市场以低价提供。
附图说明
图1为表示本发明葡萄糖制造方法的实施方式中的制造工序流程图。
图2为表示在本发明葡萄糖制造方法的实施例1中各样品的葡萄糖收集量的条线图。
图3为表示本发明葡萄糖制造方法的实施例2中各样品的葡萄糖收集量的条线图。
图4为表示本发明葡萄糖制造方法的实施例3中各样品的葡萄糖收集量的条线图。
图5为表示本发明葡萄糖制造方法的实施例4中各样品的葡萄糖收集量的条线图。
图6为表示本发明葡萄糖制造方法的实施例5中各样品的葡萄糖收集量的条线图。
图7为表示本发明葡萄糖制造方法的实施例6中各样品的葡萄糖收集量的条线图。
图8为表示本发明葡萄糖制造方法的实施例7中各样品的葡萄糖收集量的条线图。
图9为表示本发明葡萄糖制造方法的实施例8中各样品的葡萄糖收集量的条线图。
图10为施加了分子尺寸分级的各溶出液的银染图像。
图11为表示本发明葡萄糖制造方法的实施例9中各样品的葡萄糖收集量的条线图。
具体实施方式
以下，使用图1至图4，详细地说明本发明的葡萄糖制造方法的具体实施方式。
本发明的葡萄糖制造方法是使用纤维素分解酶与唾液或来源于生物唾液的活性助剂的混合物来分解木材、草、稻草等纤维素原料，获得葡萄糖的方法。
作为纤维素分解酶，可使用含有如下三种酶的纤维素酶：无规律地切断纤维素的非晶区以降低纤维素的聚合度的内切葡聚糖酶、从纤维素的结晶区末端以纤维二糖单位分解的纤维二糖水解酶以及将纤维二糖分解成葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。
该纤维素酶为市售的纤维素酶、从细菌或植物等提取的纤维素酶等，对其种类没有特别限定，但通过使用来源于纤维素分解优异的木霉属(トリコデルマ)的纤维素酶，能够提高葡萄糖的收率。
唾液或来源于生物唾液的活性助剂，可使用进行反刍的动物的唾液，或者从该唾液提取的活性助剂。作为进行反刍的动物，可举出例如牛、驴、骆驼、绵羊、山羊等。尤其，当工业性地实施本发明的葡萄糖制造方法时，通过适用牛，能够稳定地供给规定量的唾液。
此外，作为来源于生物唾液的活性助剂，可使用生物唾液中的有机化合物。
在这样的、本发明葡萄糖制造方法的具体实施方式中，如图1所示，进行下述工序：粉碎纤维素原料C直至规定粒径的粉碎工序S1、通过纤维素分解酶与唾液或来源于生物唾液的活性助剂的混合物对粉碎后的粉碎纤维素Cf进行酶分解的酶分解工序S2、将在酶分解工序S2中生成的葡萄糖精制的葡萄糖精制工序S3。
尤其，在粉碎工序S1中，所得到的粉碎纤维素原料Cf的粒径越小越优选，通过使纤维素中的非晶成分露出，由纤维素分解酶进行的酶分解变得容易，从而能够更加提高葡萄糖的收率。
另外，在纤维素原料C的粒径足够细的情况下，可以省略粉碎工序S1。
此外，除了以上工序以外，也可以采用例如在离子液体中溶解、在乙二胺等碱性溶剂中溶解等对纤维素赋予流动性的液状化工序等。
根据这样的、本发明的葡萄糖制造方法，是通过酶分解由纤维素原料C制造葡萄糖的方法，在酶分解工序S2中，通过使用纤维素分解酶与唾液或来源于生物唾液的活性助剂的混合物来进行酶分解，能够促进利用纤维素分解酶的纤维素原料C的分解，使从纤维素原料C的葡萄糖收率飞跃性地提高。
进而，由于通过比较平稳的酶分解使纤维素原料糖化，因此能够实现制造厂的对安全性管理的成本低价化，作为结果，能够以低价提供制得的葡萄糖。
以下，说明本发明的葡萄糖制造方法的具体实施例。
实施例1
实施例1中，使用牛的唾液作为生物的唾液进行葡萄糖的生成。
本实施例中，使用微晶性纤维素的Avicel(Merck公司制)作为纤维素原料，将1％浓度的Avicel添加至50mM的缓冲液，制成10μg/mL基质悬浮液。关于纤维素分解酶，使用纤维素酶(绿色木霉(Trichoderma Viride)西格玛奥德里奇公司制)，相对于50mM的缓冲液1mL中，悬浮500μg的纤维素酶，进而用该缓冲液稀释成5倍，制成100μg/mL酶溶液。关于牛的唾液，使用通过缓冲液将从牛口内采取的原液稀释50倍的物质。另外，作为缓冲液，均使用pH4.0的乙酸钠水溶液。
本实施例中的葡萄糖制造方法中，首先，对作为纤维素原料C的10μg/mL的基质悬浮液120μL，添加100μg/mL酶溶液15μL和牛唾液15μL，在50℃条件下培育24小时(以下将该样品称为样品A)。
为了研究本发明的葡萄糖制造方法中的葡萄糖生成量，对10μg/mL的基质悬浮液120μL仅添加100μg/mL的酶溶液15μL，用缓冲液制成总量150μL的样品B，对10μg/mL的基质悬浮液120μL仅添加牛唾液15μL，用缓冲液制成总量150μL的样品C，并仅将10μg/mL的基质悬浮液120μL用缓冲液制成总量150μL的样品D，对所述样品，也分别在50℃条件下培育24小时。
培育后，利用Somogyi-Nelson法算出还原糖浓度，将该结果示于图2。
关于本实施例，如图2所示，基于使用本发明的葡萄糖制造方法的样品A检测出0.32mg/mL的还原糖，基于对纤维素原料C仅添加纤维素酶的样品B检测出0.06mg/mL的还原糖、基于对纤维素原料C仅添加牛唾液的样品C检测出0.02mg/mL的还原糖，基于仅有纤维素原料C的样品D检测出0.02mg/mL的还原糖。另外，图2所示的值是三个样品的平均值，其标准偏差作为误差棒示出。
由该结果表明，使用了本发明的葡萄糖制造方法的样品A与对纤维素原料C仅添加纤维素酶的样品B相比，检测出约5倍的还原糖，通过添加牛唾液，纤维素酶的酶活性飞跃性地提高。此外，从对纤维素原料C仅添加牛唾液的样品C和仅有纤维素原料的样品D检测出同等的还原糖，由此可知，仅用牛唾液的情况下没有将纤维素原料C分解成葡萄糖。
根据上述实施例1，通过使用本发明的葡萄糖制造方法，能够使从葡萄糖原料的葡萄糖收率提高到约5倍，作为结果，能够实现向市场以低价提供葡萄糖。
实施例2
实施例2中，作为来源于生物唾液的活性助剂，使用从牛唾液中提取有机化合物而得的活性助剂溶液，进行葡萄糖的生成。
在此，对从牛唾液提取有机化合物的方法进行说明。
首先，对牛唾液10ml施加10分钟的沸煮处理，使唾液中的蛋白质成分热改性，吸附于固相萃取柱(OasisHLB12cc(500mg)LP Extraction Cartridge、W aters公司制)。并且，对固相萃取柱添加100％甲醇水溶液，萃取含有有机化合物的溶液，并通过氮气流蒸干，得到固形物。将所得到的固形物溶解于缓冲液以成为1mg/mL，调制助剂溶液。将该助剂溶液200μL作为溶出溶剂，使用甲醇水溶液，随着时间的推移使甲醇浓度从0增加至100％，通过高速液态色谱法精制，每5分钟进行40分钟的馏分分取，得到含有极性不同的有机化合物的活性助剂溶液共8种。
使用从牛唾液精制的共8种活性助剂溶液，通过在实施例1中详述的本发明的葡萄糖制造方法，使用活性助剂溶液代替牛唾液来进行葡萄糖的生成。另外，本实施例中，样品1为在甲醇浓度约5％的情况下、样品2为在甲醇浓度约21％的情况下、样品3为在甲醇浓度约37％的情况下、样品4为在甲醇浓度约53％的情况下、样品5为在甲醇浓度约68％的情况下、样品6为在甲醇浓度约84％的情况下、样品7为在甲醇浓度约100％的情况下、样品8为在甲醇浓度100％(水0％)的情况下分别量取的活性助剂溶液。此外，葡萄糖原料和纤维素分解酶也使用了实施例1中所记载的物质。
图3中示出使用样品1至样品8进行的葡萄糖生成的结果、以及作为比较的、用实施例1中样品B的步骤制作的样品9的葡萄糖生成结果。
本实施例中，如图3所示，基于甲醇浓度约5％的样品1检测出0.05mg/mL的还原糖，基于甲醇浓度约21％的样品2检测出0.06mg/mL的还原糖，基于甲醇浓度约37％的样品3检测出0.04mg/mL的还原糖，基于甲醇浓度约53％的样品4检测出0.05mg/mL的还原糖，基于甲醇浓度约68％的样品5检测出0.07mg/mL的还原糖，基于甲醇浓度约84％的样品6检测出0.28mg/mL的还原糖，基于甲醇浓度约100％的样品7检测出0.31mg/mL的还原糖，基于甲醇浓度100％(水0％)的样品8检测出0.09mg/mL的还原糖，基于对纤维素原料仅添加纤维素酶的样品9检测出0.03mg/mL的还原糖。另外，图3所示的值是三个样品的平均值，其标准偏差作为误差棒示出。
尤其，甲醇浓度约84％的样品6和甲醇浓度约100％的样品7表示出极高的还原糖浓度，由该结果可明确，甲醇浓度为84％以上的情况下溶出的含有有机化合物的活性助剂溶液促进酶活性。
实施例3
实施例3中，使用驴唾液作为生物的唾液，进行葡萄糖的生成。另外，作为比较，在相同的条件下，还用牛唾液进行葡萄糖的生成。
纤维素原料和纤维素分解酶使用实施例1中记载的物质。另外，本实施例中，相对于50mM的缓冲液1mL中，悬浮500μg的纤维素酶，进而用该缓冲液稀释10倍，制成50μg/mL酶溶液来使用。
各样品的详细内容如下：样品a1，对10μg/mL基质悬浮液120μL添加50μg/mL酶溶液15μL和牛唾液15μL而得，样品a2，对10μg/mL基质悬浮液120μL仅添加牛唾液15μL，用缓冲液使总量为150μL而得，样品b1，对10μg/mL基质悬浮液120μL添加50μg/mL酶溶液15μL和驴唾液15μL而得，样品b2，对10μg/mL基质悬浮液120μL仅添加驴唾液15μL，用缓冲液使总量为150μL而得，以及样品c，对仅10μg/mL基质悬浮液120μL用缓冲液使总量为150μL而得；对各样品，分别在50℃条件下培育24小时，将所得到的还原糖的算出结果示于图4。
本实施例中，如图4所示，基于添加有使用本发明葡萄糖制造方法的50μg/mL酶溶液和牛唾液15μL的样品a1检测出0.09mg/mL的还原糖，基于仅添加有牛唾液15μL的样品a2检测出0.03mg/mL的还原糖，基于添加有50μg/mL酶溶液和驴唾液15μL的样品b1检测出0.09mg/mL的还原糖，基于仅添加有驴唾液15μL的样品b2检测出0.03mg/mL的还原糖，基于仅10μg/mL基质悬浮液的样品c检测出0.02mg/mL的还原糖。另外，图4所示的值是三个样品的平均值，其标准偏差作为误差棒示出。
由该结果可明确，使用本发明葡萄糖制造方法的样品a1和样品b1与对纤维素原料C仅添加纤维素酶的样品a2和样品b2相比，检测出约3倍的还原糖，与牛唾液和驴唾液一起使纤维素酶的酶活性飞跃性地提高。
实施例4
在实施例4中，为了研究牛唾液的浓度和葡萄糖收集量的关系，以牛唾液的原液为100％的情况下对0～10％浓度的牛唾液进行葡萄糖的生成。
纤维素原料和纤维素分解酶，使用实施例1所记载的物质。牛唾液通过所述缓冲液将原液分别稀释成0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％来使用。
本实施例中的葡萄糖制造方法为，首先，对作为纤维素原料C的10μg/mL的基质悬浮液160μL，添加100μg/mL的酶溶液20μL和牛唾液20μL，在50℃条件下培育24小时。培育后，使用Somogyi-Nelson法算出还原糖浓度，将该结果示于图5。
在本实施例中，如图5所示，直至唾液浓度2％，葡萄糖的收集量急剧增加，在唾液浓度2％～10％呈几乎同等的葡萄糖收集量。
根据该结果，通过将牛唾液浓度设为2％以上，能够从同量的纤维素原料收集更多的葡萄糖。
实施例5
在实施例5中，为了研究培育时间和葡萄糖收集量的关系，使培育时间在0～72小时之间变化，进行葡萄糖的生成。
纤维素原料、纤维素分解酶和牛唾液使用实施例1中所记载的物质。并且，作为比较用的样品，对作为基质的纤维素原料仅添加纤维素分解酶，进行葡萄糖的生成。
本实施例中的葡萄糖制造方法为，首先，对作为纤维素原料C的10μg/mL的基质悬浮液160μL，添加100μg/mL的酶溶液20μL和牛唾液20μL，在50℃条件下分别以0小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时和72小时的培育时间，进行培育。培育后，使用Somogyi-Nelson法算出还原糖浓度，将该结果示于图6。另外，对向纤维素原料仅添加纤维素分解酶时的样品，也同样地分别以0小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时和72小时的培育时间进行培育，进行葡萄糖的生成。
在本实施例中，如图6所示，就用方形标记表示的使用本发明葡萄糖制造方法的样品而言，随着培育时间的增加，葡萄糖收集量增加。另一方面，就用菱形标记表示的仅添加纤维素分解酶的样品而言，没有确认到葡萄糖收集量的培育时间依赖性。尤其，就培育时间72小时而言，与仅添加纤维素分解酶的样品相比，使用本发明葡萄糖制造方法的样品的葡萄糖收集量为约30倍。
由该结果可知，本发明的葡萄糖制造方法中，通过除了纤维素分解酶之外添加牛唾液且增加培育时间，能够使葡萄糖生成量飞跃性地增加。
实施例6
在实施例6中，为了研究对水溶性的纤维素原料应用本发明葡萄糖制造方法时的葡萄糖生成量，使用羧基甲基纤维素(CMC，Nacalai Tesque公司制)作为纤维素原料，进行葡萄糖的生成。
纤维素分解酶和牛唾液使用实施例1中所记载的物质。并且，作为比较用样品，对作为基质的纤维素原料仅添加纤维素分解酶，进行葡萄糖的生成。
本实施例中的葡萄糖制造方法为，首先，对作为纤维素原料C的10μg/mL的基质悬浮液160μL，添加100μg/mL的酶溶液20μL和牛唾液20μL，在50℃条件下培育30分钟。培育后，使用Somogyi-Nelson法算出还原糖浓度，将该结果示于图7。另外，对向纤维素原料仅添加纤维素分解酶时的样品，也通过同样的生成方法进行葡萄糖的生成。
在本实施例中，如图7所示，基于使用本发明葡萄糖制造方法，添加牛唾液的样品得到0.17mg/mL的葡萄糖，基于仅添加纤维素分解酶，没有添加牛唾液的样品得到0.0075mg/mL的葡萄糖。
由该结果可明确，通过应用本发明的葡萄糖制造方法，对水溶性的纤维素原料也能够增加葡萄糖的生成量。
实施例7
在实施例7中，对牛唾液的具体的作用效果进行说明。另外，作为预备实验，本发明人等研究了牛唾液对纤维素原料的结晶形的影响，结果明确了牛唾液对纤维素原料的结晶形没有影响。进而，测定了牛唾液的静态表面张力，明确了牛唾液具有表面活性作用。
在本实施例中，为了明确牛唾液所作用的对象，对添加牛唾液的时间点不同的样品(甲)～(丙)进行研究。首先，关于样品(甲)，对纤维素原料添加牛唾液，在50℃条件下培育1小时后，添加纤维素分解酶，在50℃条件下培育24小时，进行葡萄糖的生成。关于样品(乙)，对纤维素原料添加纤维素分解酶，在50℃条件下培育1小时后，添加牛唾液，在50℃条件下培育24小时，进行葡萄糖的生成。并且，关于样品(丙)，对纤维素分解酶添加牛唾液，在50℃条件下培育1小时后，添加纤维素原料，在50℃条件下培育24小时，进行葡萄糖的生成。另外，在本实施例中，以作为纤维素原料C的10μg/mL基质悬浮液160μL、100μg/mL酶溶液20μL以及牛唾液20μL的分量进行葡萄糖的生成。培育后，使用Somogyi-Nelson法算出还原糖浓度，将该结果示于图8。
在本实施例中，如图8所示，基于对纤维素原料添加牛唾液之后添加纤维素分解酶的样品(甲)得到0.24mg/mL的葡萄糖，基于对纤维素原料添加纤维素分解酶之后添加牛唾液的样品(乙)得到0.067mg/mL的葡萄糖，基于对纤维素分解酶添加牛唾液后添加纤维素原料的样品(丙)得到0.00071mg/mL的葡萄糖。
根据该结果，牛唾液虽然对纤维素原料的结晶形没有影响，但由于样品(甲)的葡萄糖收集量最多，因此可知它吸附于纤维素原料表面，提高在后续工序中添加的纤维素分解酶对纤维素原料的作用。由此表明，就本发明的葡萄糖制造方法而言，优选的是，经对纤维素原料添加牛唾液使牛唾液吸附在纤维素原料表面的工序后，进行添加纤维素分解酶分解纤维素而生成葡萄糖的工序的制造方法。
实施例8
在实施例8中，为了更详细地研究来源于生物唾液的活性助剂的特性，使用对牛唾液进行改性和分子量分级而得的物质作为活性助剂溶液，进行葡萄糖的生成。
本实施例中，首先，为了使牛唾液中具有活性的酶改性且非活性化，对牛唾液5mL添加99.5％浓度的乙醇15mL后，在20分钟、15000rpm、4℃的条件下进行高速离心分离，对所得上清液，使用蒸发器进行溶剂去除，添加使用密理博公司制的超纯水装置制作的超纯水5mL，得到乙醇改性活性助剂溶液(样品A)。
此外，为了进行牛唾液的分子量分级，利用使用了分级分子量截留值为100K的超滤膜的离心式过滤器(UFC910024，Millipore公司制)，对2mL的样品A在3000rpm、4℃的条件下进行15分钟的高速离心分离，进行分子量分级，得到分子量100K以下的活性助剂溶液(样品B)。
同样地，利用使用了分级分子量截留值为30K的超滤膜的离心式过滤器(UFC903008，Millipore公司制)，对2mL的样品B在3000rpm、4℃的条件下进行15分钟的高速离心分离，进行分子量分级，得到分子量30K以下的活性助剂溶液(样品C)。进而，利用使用了分级分子量截留值为3K的超滤膜的离心式过滤器(UFC900308，Millipore公司制)，对2mL的样品C在3000rpm、4℃的条件下进行15分钟的高速离心分离，进行分子量分级，得到分子量3K以下的活性助剂溶液(样品D)。
本实施例中的葡萄糖的制造方法为，首先，对作为纤维素原料C的10μg/mL的基质悬浮液160μL，添加作为纤维素分解酶的100μg/mL的酶溶液20μL和作为样品A的乙醇改性活性助剂溶液20μL，在50℃条件下培育24小时。培育后，使用Somogyi-Nelson法算出还原糖浓度。另外，纤维素原料C和纤维素分解酶使用实施例1中所记载的物质。
同样地，将样品A分别变更成样品B～D，将所得到的结果示于图9。另外，图9中，为了研究各样品A～D的效果，示出使用未处理的牛唾液同样地进行葡萄糖生成并算出还原糖浓度的结果作为“牛唾液”，示出未使用牛唾液而进行葡萄糖生成并算出还原糖浓度的结果作为“无牛唾液”。
本实施例中，如图9所示，基于使用了未处理牛唾液的试样检测出0.26mg/mL的还原糖，基于使用了样品A作为乙醇改性活性助剂的试样检测出0.27mg/mL的还原糖，基于使用了样品B作为分子量100K以下的活性助剂溶液的试样检测出0.25mg/mL的还原糖，基于使用了样品C作为分子量30K以下的活性助剂溶液的试样检测出0.08mg/mL的还原糖，基于使用了样品D作为分子量3K以下的活性助剂溶液的试样检测出0.01mg/mL的还原糖，并且，基于无牛唾液的试样检测出0.02mg/mL的还原糖。另外，图9所示的值是三个试样的平均值，其标准偏差作为误差棒示出。
根据该结果，由于使用样品A作为乙醇改性活性助剂溶液时的还原糖浓度与使用了未处理牛唾液时的还原糖浓度相比，表示几乎同等的值，因此可知牛唾液所含有的具有活性的酶不是促进纤维素分解酶的酶活性的原因物质。此外，由于使用样品D作为分子量3K以下的活性助剂溶液时的还原糖浓度与无牛唾液时的还原糖浓度相比降低，因而可知，牛唾液所含有的分子量3K以下的有机高分子也不是促进纤维素分解酶的酶活性的原因物质。由以上结果可明确，来源于牛唾液的活性助剂是含有经改性的蛋白质的、分子量为3K以上的有机高分子。
实施例9
在实施例9中，为了确定来源于生物唾液的活性助剂的成分，使用对牛唾液通过凝胶过滤色谱进行分子尺寸分级的物质作为活性助剂溶液，进行葡萄糖的生成。
本实施例中，对4mL的牛唾液，使用液相色谱装置(AKTAprime，GE Healthcare公司制)进行分子尺寸分级。色谱条件如下。
试样：牛唾液
试样注入量：4mL
柱：HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grande(GE Healthcare公司制)
洗提液：150mM氯化钠水溶液
流速：1mL/min
溶出液分取：5mL×24根(馏分(Fraction)No.1～24)
另外，以下将分取的24根溶出液分别称为馏分No.1～24。
其次，对所得到的馏分No.1～24的溶出液，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(12.5％凝胶)后，使用SilverStainKANTOIII(关东化学株式会社制)对蛋白质施加银染，将该结果示于图10。
如图10所示，馏分No.1～24的溶出液中，对No.9～20的溶出液确认到蛋白质的存在。
并且，对除No.9和No.20的溶出液之外的No.10～No.19的溶出液，依次从每两个分别量取各2mL，作为样品A～E，并且，分别将No.10～No.19的溶出液取出各0.4mL进行混合，作为样品Mix，利用使用了分级分子量截留值为3K的超滤膜的离心式过滤器(UFC900308，Millipore公司制)进行浓缩，得到溶出浓缩液。
测定所得到的样品A～E和Mix的溶出浓缩液，进而测定唾液原液的蛋白质浓度，结果各样品的蛋白质浓度如下：样品A为201.μg/mL、样品B为174.5μg/mL、样品C为108.6μg/mL、样品D为795.7μg/mL、样品E为276.9μg/mL、样品Mix为366.2μg/mL、唾液原液为1214.2μg/mL。使用将这些各样品的溶出浓缩液和唾液原液用超纯水调制以使蛋白质浓度成为40μg/mL而得的溶出稀释液以及唾液溶液，进行纤维素分解酶的活性测定试验。
纤维素分解酶的活性促进试验，在下述条件下进行。
基质：2wt％基质/100mM乙酸钠缓冲液(pH＝4.0)
纤维素分解酶：100μg/mL的源自绿色木霉的纤维素酶(西格玛奥德里奇公司制)
唾液溶液：40μg/mL
溶出稀释液：蛋白质浓度40μg/mL的样品A～E以及样品Mix
量取基质80μL(最终基质浓度0.8wt％)、唾液溶液或溶出稀释液100μL(最终蛋白质浓度20μg/mL)以及纤维素分解酶20μL(最终酶浓度10μg/mL)，放入1.5mL的塑料管，在50℃条件下进行24小时的培育后，在15000rpm进行1分钟的离心分离，对所得到的上清液，使用LabAssay葡萄糖试剂盒(和光公司制)来进行葡萄糖浓度的定量，将所得到的结果示于图11。
如图11所示，使用样品A～E和样品Mix的溶出稀释液以及唾液溶液来进行葡萄糖生成时，与仅使用酶来进行葡萄糖生成时相比，表示高葡萄糖浓度，确认到通过添加各溶出稀释液和唾液，纤维素分解酶的活性被促进。由此明确，使纤维素分解酶的酶活性促进的、来源于生物唾液的活性助剂是蛋白质。此外，由于各溶出稀释液中得到的葡萄糖浓度中并没有确认到很大的差异，因此可明确，只要是该生物唾液所含有的蛋白质，不论其种类就能够得到促进活性的效果。
根据上述说明，本发明的葡萄糖制造方法涉及通过将纤维素原料C酶分解来生成葡萄糖的方法，通过除了纤维素分解酶以外，添加生物唾液或来源于生物唾液的活性助剂来进行酶分解，从而能够飞跃性地提高葡萄糖的收集量。此外，其结果是，能够将制得的葡萄糖向市场以低价提供。
本发明的葡萄糖制造方法不限于上述实施方式，可以在不损失发明特征的范围内进行各种变更，例如，可以使用纤维素分解酶、反刍动物的唾液和来源于生物唾液的活性助剂全部混合来对纤维素进行酶分解，通过将唾液和来源于生物唾液的活性助剂组合，能够进一步提高纤维素分解酶的活性。
符号说明
S1 粉碎工序
S2 酶分解工序
S3 葡萄糖精制工序
C 纤维素原料

Claims (1)

1.一种葡萄糖制造方法，其特征在于，使用纤维素分解酶与唾液或来源于生物唾液的活性助剂的混合物来分解纤维素，所述唾液为牛或驴的唾液，
所述来源于生物唾液的活性助剂由牛或驴的唾液提取而成，
所述活性助剂通过以下方法提取：对牛或驴的唾液施加沸煮处理，使唾液中的蛋白质成分热改性，吸附于固相萃取柱，并且对固相萃取柱添加甲醇水溶液，萃取含有有机化合物的溶液，并通过氮气流蒸干，得到作为固形物的活性助剂。
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