CN105407972B - 使用急性期蛋白在非人类哺乳动物中控制感染的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在非人类哺乳动物中控制感染、尤其是乳房内感染(IMIs)的组合物和方法。本发明尤其适于通过在干燥期期间改善乳腺退化而控制感染和增强非人类哺乳动物、优选牛的健康。本发明是基于急性期蛋白、更优选血清淀粉样蛋白A(SAA)、甚至更优选同种型3(SAA‑3)的用途。

Description

使用急性期蛋白在非人类哺乳动物中控制感染的组合物和 方法
本发明涉及用于在非人类哺乳动物中控制感染、尤其是乳房内感染(IMIs)的组合物和方法。本发明尤其适于通过在干燥期(dry off period)改善乳腺退化而控制感染和增强非人类哺乳动物、优选牛的健康（welfare）。本发明是基于急性期蛋白、更优选血清淀粉样蛋白A(SAA)、甚至更优选同种型3 (SAA-3)的用途。
引言
当非人类哺乳动物受孕达每次泌乳的时间的70%时，乳产量最大。在泌乳期之间，干乳期(dry period)对于更新乳腺的衰老上皮细胞和确保下一次泌乳的最佳的乳生产是必要的。因为在非人类哺乳动物和尤其是反刍动物例如牛中的妊娠状态所致的激素水平，乳腺退化比在其中退化与妊娠不并存的其它物种中更缓慢。这需要60天的长的干乳期，其显著地减少生产期的持续时间。干乳期的特征在于两个主要的细胞周转期：乳腺退化，特征在于急性细胞凋亡，和下次泌乳前的细胞再生。在停乳后头72小时内观察到细胞凋亡的峰值，在干乳期的剩余时间内一直持续，并伴有渐增的细胞增殖。生理学上，通过撤除对非人类哺乳动物挤奶而产生的乳汁淤积，以及蛋白和激素因子例如催乳激素下降，诱导活性腺体退化，并且反过来刺激实质收缩并停止泌乳。
乳腺组织是包括上皮分泌细胞和具有不同细胞类型(例如成纤维细胞和免疫细胞)的基质组织。这两类组织被基底膜分隔开，所述基底膜为影响乳腺的发育和生物学的一种胞外基质(ECM)。ECM直接建立和维持乳腺分化状态和阻止细胞凋亡。基底膜的蛋白水解破坏诱导细胞凋亡和乳腺退化。有若干蛋白酶参与胞外基质降解，但该过程中基本上基质金属蛋白酶(MMPs)是关键酶。此外，其它功能已经归因于MMPs，所述其它功能例如生长因子和细胞因子的释放，其反过来又调节干乳期的其它关键性方面，例如免疫系统激活和细胞生长。
所述非人类哺乳动物的乳腺在泌乳周期期间在感染的易感性方面经历极大变化，如在图1中示意性地说明，和超过60%的新的乳房内感染(IMIs)在干乳期早期被观察到。的确，乳汁淤积增加了乳腺内的压力，促使乳汁渗漏和对细菌感染的易感性。而且，乳汁对于细菌生长而言是富有营养的培养基。另外，乳产量高的动物更易患上乳房内感染，因为它们延迟了角蛋白塞的形成并增加乳头管阻塞的时间。干乳期期间患上的IMIs与增加下次泌乳的感染流行相已被关联起来，其导致乳产量损失并降低乳的品质。
因此，干乳期早期提供了通过明智使用治疗而控制IMIs的理想机会。的确，为了避免在该时期和随后的泌乳期期间的IMIs的高风险，将抗生素常规地输注到乳腺中。然而，这一实践与发展出针对在人类和动物中相同的抗微生物剂的耐药性的风险相关。在干乳期开始时对非人类哺乳动物免疫力的刺激可以不仅与在由逃避广谱抗生素的细菌引起的感染的情况下改善抗生素的功效有关，而且最终也能够在干乳期作为预防剂代替抗生素的使用。
发明概述
本发明提供用于在非人类动物中控制乳房内感染(IMIs)的新的组合物和方法。本发明更尤其是基于急性期蛋白、更优选血清淀粉样蛋白A (SAA)、甚至更优选同种型3(SAA-3)在非人类哺乳动物中控制IMI的用途。
因此本发明的目的在于用于在非人类哺乳动物中控制IMI的急性期蛋白、优选SAA-3蛋白，或包含急性期蛋白、优选SAA-3蛋白的组合物。本发明的进一步的目的是在非人类哺乳动物中控制IMI的方法，包括将有效量的急性期蛋白、优选SAA-3蛋白给予所述非人类哺乳动物。本发明的进一步的目的在于急性期蛋白在非人类哺乳动物中控制IMI的用途。本发明的组合物、方法或用途可以单独使用(即替代现有治疗)或与现有治疗(例如，抗生素、抗氧化剂、抗催乳激素、抗原或乳头密封剂)组合使用，以改善它们的功效。并且，本发明可以使用一种急性期蛋白(例如SAA-3蛋白)或组合使用若干不同的急性期蛋白。
更具体地讲，本发明提供用于通过改善常规乳房内治疗的功效在非人类哺乳动物中控制IMIs的基于急性期蛋白的组合物和方法，所述治疗优选抗生素、抗催乳激素、和/或乳头密封剂。
甚至更具体地讲，本发明提供用于通过替代抗生素的使用在非人类哺乳动物中控制IMIs的基于SAA-3的组合物和方法。
本发明尤其适合和有效用于在干乳期期间治疗非人类哺乳动物，从而在干乳期期间和/或在随后的泌乳期中控制IMI。本发明的一个特别的目的涉及在干乳期期间和/或在随后的泌乳期中控制IMIs的新的基于急性期蛋白的组合物和方法。优选地，在干乳期期间、更优选在干乳期开始时给予急性期蛋白组合物。
本发明的进一步的更特别的目的涉及用于控制乳房炎的包含急性期蛋白、优选SAA-3蛋白的新的组合物和方法。
本发明的另一目的涉及包含急性期蛋白、更优选血清淀粉样蛋白A(SAA)、甚至更优选同种型3 (SAA-3)的新的组合物和方法，其用于通过改善乳腺退化而增强非人类哺乳动物的健康。
更具体地讲，本发明提供基于急性期蛋白的组合物和方法，其用于通过改善乳腺退化而增强乳房健康。
甚至更具体地讲，本发明提供基于急性期蛋白的组合物和方法，其用于通过改善乳腺退化而增强乳房炎症。
用于本发明的急性期蛋白优选地是呈纯形式或与一种或若干制药上可接受的赋形剂或载体联合。
本发明的进一步的目的涉及将包含急性期蛋白的组合物单独或与以下组合给予(一起或分开、同时或序贯)非人类哺乳动物的方法：其它急性期蛋白、抗生素、抗氧化剂、乳头密封剂、抗原或抗催乳激素化合物、优选地多巴胺受体激动剂、更优选麦角林-衍生的多巴胺和甚至更优选卡麦角林。本发明也涉及对于牛的组合治疗，其包含SAA-3蛋白和抗催乳激素化合物。
本发明可用于任何非人类哺乳动物、优选任何有蹄动物或反刍动物，例如牛、羊(ovine)、马、绵羊或山羊。
本发明的组合物和方法尤其可有效用于在非人类哺乳动物中控制乳房内感染(IMIs)、改善乳房健康和增强天然免疫系统。本发明尤其可有效用于抵抗或预防由金黄色葡萄球菌(S aureus)所致的乳房内感染。本发明在干乳期期间，尤其是干乳期的早期阶段期间更尤其有效。本发明尤其通过单独给予SAA-3或将SAA-3与常规治疗例如抗生素或乳头密封剂组合给予可有效用于控制IMIs和/或共同感染或增强健康。
附图说明
图1:泌乳周期期间的乳房内感染频率示意性说明。
图2:干乳期早期期间的金属蛋白酶(MMP)活性。金属蛋白酶活性表示为INT*mm2± SEM的根。数据得自在干奶(dry off)后3天期间针对MMP-9 (a)和MMP-2 (b)使用Quantity One软件对酶谱法凝胶的条带定量。带星号的治疗有差异(P < 0.05)。
图3:干乳期早期期间的体细胞计数(SCC)、脂肪和蛋白含量。SCC (a)表示为SCC/ml ± SEM (转换数据)。在干奶(dry off)后3天期间的脂肪(b)和蛋白(c)浓度(数据表示为% ± SEM)。带星号的治疗有差异(P < 0.05)和t (P < 0.1)。
图4:原代乳腺培养物。含有泛细胞角蛋白的原代乳腺培养物的免疫荧光。HeLa细胞(a)作为阳性对照，THP-1巨噬细胞(b)作为阴性对照，以及乳腺培养物(c)。图表示IL-8的基因表达(a)和内化的金黄色葡萄球菌的活细胞计数(b)。柱代表平均值±SEM。带星号的柱差异显著(P < 0.05)。
图5:乳腺SAA3影响树突细胞中的基因表达。IL-8 (a)、INFγ (b)、TNFα (c)、CCR7(d)、CD80 (e)和iNOS (f)的基因表达。柱代表不同的治疗的平均值± SEM。带星号的柱差异显著(P < 0.05)和t (P < 0.1)。
图6: pNZ8148质粒的限制图。
图7:在pNZ8148中的saa3基因扩增的PCR结果。
图8.针对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中产生的M-SAA3的蛋白质印迹(A)。用Quantity One软件(B)进行的蛋白质印迹条带的定量。
发明详述
本发明在于急性期蛋白、更优选血清淀粉样蛋白A (SAA)、甚至更优选同种型3(SAA-3)在非人类动物、优选牛中作为活性成分用于控制乳房内感染(IMIs)和/或用于增强健康和/或强化或刺激天然免疫力的用途。
本发明首次提出这类蛋白、尤其是SAA-3蛋白在非人类哺乳动物中作为免疫剂，并活化乳腺退化的用途。
本发明出乎意料地证明了急性期蛋白、尤其是SAA-3蛋白具有以下能力：增加免疫细胞的募集(单核细胞分离，分化为树突细胞和白介素8表达模式)，通过增强金属蛋白酶活性而刺激乳腺退化，改变体细胞计数以及乳脂和蛋白含量，并且抑制细菌迁移例如乳腺原代培养物中的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
急性期蛋白
哺乳动物通过执行一系列复杂的生物反应响应组织损伤、创伤或感染，试图防止进一步组织破坏，启动受破坏组织的修复，并且隔离和摧毁感染性生物。该过程称为炎性反应。炎性反应的早期和中期称为急性期反应并涉及各种各样的蛋白介质，包括细胞因子、白介素和肿瘤坏死因子，其综述参见Steel & Whitehead (Immunology Today 15: 81-87,1994)。
术语“急性期蛋白”在本发明的上下文中是指一组血浆蛋白，其血浆浓度在非人类哺乳动物中的响应于组织损伤、急性感染、烧伤、或慢性炎症而增加或降低。该组包括，更具体地讲，血清淀粉样蛋白A (SAA)蛋白、α-1酸性糖蛋白、α-1抗胰蛋白酶、触珠蛋白、纤维蛋白原、C-反应蛋白、铁蛋白、血浆铜蓝蛋白和补体因子。用于本发明的最优选的急性期蛋白是SAA蛋白。
血清淀粉样蛋白A (SAA)蛋白是小的急性期蛋白，其在炎性反应的急性期期间积累并与高密度脂蛋白3 (HDL3)快速缔合。该急性期蛋白家族在迄今为止所调查的所有脊椎动物中都产生，根据物种的不同，已经鉴定了编码SAA的3或4个基因座。编码SAA同种型的这些SAA基因在肝内(hepatically)和/或肝外(extra hepatically)差异表达。三种主要同种型已被表征，SAA-1、SAA-2、和SAA-3。SAA-3是用于本发明的最优选的SAA蛋白。
分离的和纯化的牛初乳相关的SAA-3蛋白已被描述于US7,214,512。根据该专利，SAA-3蛋白和更尤其是存在于N-末端区基序中的其TFLK高度保守区，已经显示出在肠道中刺激粘蛋白的产生，更尤其是MUC3的产生。
已自乳中纯化出与初乳相关的SAA-3蛋白具有97%同源性的牛乳腺SAA-3同种型(M-SAA3)，据报道其在动物中具有不同活性，例如免疫细胞趋化性或细胞因子调节。
然而，迄今为止尚未报道或提出急性期蛋白质例如SAA3对免疫细胞的募集(单核细胞分离，分化为树突细胞和白介素8表达模式)或对乳腺退化(例如，增强金属蛋白酶活性，改变体细胞计数以及乳脂和蛋白含量)或对乳腺中的细菌迁移的抑制(例如金黄色葡萄球菌)的作用。
在本发明的上下文中，术语“SAA-3”或“M-SAA3”是指包含以下的蛋白或肽：(i)SEQ ID NO: 2的整个氨基酸序列，或(ii) 具有SEQ ID NO: 2的至少20个连续氨基酸、优选具有SEQ ID NO: 2的至少25、30、35、40或至少50个连续氨基酸的SEQ ID NO: 2片段，或(iii) 与SEQ ID NO: 2具有至少80%同一性、优选与SEQ ID NO: 2具有至少85%、90%、95%或97%序列同一性的序列。该术语可互换使用并且包括但不限于本文公开的序列、它们的保守修饰的变体(无论来源)以及保留SAA-3或M-SAA3的生物学性质的任何其它变体。
优选地，术语SAA-3是指以上定义的蛋白或肽，其具有以下能力：刺激乳腺细胞中的白介素-8 (IL-8)产生，或增加乳腺中的体细胞计数，或使由金黄色葡萄球菌所致的乳腺上皮细胞的体外感染降低至少15%。
优选使用衍生自打算治疗的物种的急性期蛋白。
术语“序列同一性”当用于核酸或蛋白序列时，是指使用标准化算法对所比对的至少两个序列之间的核苷酸或氨基酸残基匹配的定量(通常是百分率)，所述算法例如Smith-Waterman alignment (Smith和Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-197)、CLUSTALW(Thompson 等人 (1994) Nucleic Acids Res 22:4673-4680)，或BLAST2 (Altschul 等人(1997) Nucleic Acids Res 25:3389-3402)。BLAST2可以标准化的和可重现的方式用于在序列之一中插入空位，以便优化比对和实现它们之间的更有意义的比较。
急性期蛋白可以是天然来源的分离的蛋白、合成蛋白或重组蛋白。
术语“蛋白”或“肽”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的多聚体。该术语用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸多聚体，以及用于天然存在的氨基酸多聚体。这类天然存在的氨基酸的类似物的基本特性是，当并入蛋白时，该蛋白与被相同的但完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白所诱导出的抗体特异性反应(The essential nature of such analogues of naturally occurring aminoacids is that, when incorporated into a protein that protein is specificallyreactive to antibodies elicited to the same protein but consisting entirelyof naturally occurring amino acids.)。
所述蛋白可以被修饰，例如糖基化，和/或可包含修饰的和/或非天然的氨基酸。术语“修饰的”也包括但不限于以下修饰：磷酸化、糖基化、脂质连接、磺化(sulfatation)、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化。可以理解，正如众所周知的和如上所述的，该蛋白并非完全线状。例如，蛋白可作为泛素化的结果而为分枝状，并且它们可以是环状，有或无分枝，通常是作为翻译后事件的结果，所述翻译后事件包括天然加工事件和天然不会发生的而由人工操纵所致的事件。环状、分枝和分枝环状蛋白可以通过非翻译天然过程以及也通过完全合成方法来合成。
术语“重组”包括涉及细胞或载体，其已通过引入异源核酸而被修饰或所述细胞源自经如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内不存在相同形式的基因，或表达因人为故意干预而被另外异常表达，表达不足或完全未表达的天然基因。本文使用的术语“重组”不包括通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)所导致的细胞或载体的改变，例如在无故意人为干预时发生的那些。重组蛋白或肽是可得自重组细胞的蛋白或肽。
术语“载体”包括这样的复制子(例如质粒、噬菌体、粘粒或病毒)，其中可操作性地插入另一核酸区段以便使得所述区段复制或表达。
用于本发明的蛋白或肽(例如，SAA-3蛋白或肽)可以呈分离或纯化形式，优选不含其它蛋白，优选至少90%、95%、96%、97%、98%或更高纯度。在一个具体实施方案中，用于本发明的蛋白或肽或组合物不含脂多糖(LPS)，即不含或含有痕量的LPS。本发明提供新的方法，其允许重组产生完全不含LPS的SAA3-蛋白。这样的蛋白，当用于本发明时，使内毒素反应最小化或避免内毒素反应。
在这一点上，在具体的实施方案中，本发明也提供产生SAA-3蛋白的方法，其包括在允许编码所述SAA-3蛋白的重组核酸表达的条件下培养含有所述核酸的细胞，和回收SAA-3，其中所述细胞缺乏功能性LPS-产生途径。在具体的实施方案中，所述细胞是乳球菌，优选乳酸乳球菌(例如，菌株NZ900)。所述细菌不产生LPS。在替代实施方案中，所述细胞是具有修饰的LPS途径的细菌，其不产生LPS而产生修饰的不触发内毒素反应的代谢物。已知LPS的酰基链是引起NF-κB活化和促炎细胞因子产生的触发物。两个次级酰基链的缺失导致修饰的脂质(称为脂质IVA)，其不触发内毒素反应。这类细菌的实例例如是ClearColi™BL21 (DE3)。此外，为了进一步改善生产水平，本发明也描述了优化的SAA3-编码核酸，具有为在乳球菌中表达而优化的密码子。该序列示于SEQ ID NO: 3，并表示本发明的进一步的目标。更具体地讲，本发明也涉及包含SEQ ID NO: 3的核苷酸3-467或其互补序列的核酸，以及涉及包含所述核酸的任何载体或细胞，及其用途。
给予模式
可按照本领域众所周知的并适合受治疗的非人类哺乳动物和疾病的多种给予方式给予本发明的药物组合物或蛋白。优选地将它们经皮、口服、胃肠外或经输注给予。它们呈所选给予模式的合适形式。它们可以因此呈溶液剂或口服或注射用混悬液形式，或呈固体或半固体形式，呈粉剂形式，胶囊剂、粒剂、糖衣片剂、软胶囊剂、喷雾剂、胶囊形片剂、丸剂、片剂或贴剂。
有利的是，急性期蛋白或包含急性期蛋白的药物组合物经乳房内输注给予。
在进一步优选的实施方案中，所述组合物呈粘性贴剂形式。
本发明的组合物和方法通常含有或使用“有效量”的急性期蛋白、优选SAA-3蛋白，例如，所述蛋白的量在体内和/或体外对于免疫细胞的募集(例如，单核细胞分离，分化为树突细胞和/或白介素8表达模式)、对乳腺退化的刺激(通过例如，增强金属蛋白酶活性，或改变体细胞计数，或增加乳脂和/或蛋白含量)，或对乳腺原代培养物中的细菌迁移的抑制(例如金黄色葡萄球菌)足以引起统计学上的作用。
根据制剂和蛋白的不同，药物组合物可以进一步包含常规制药上可接受的成分，用于制备待经皮、口服、胃肠外或输注给予的液体或固体制剂。此外，在口服制剂的情况下，可将这些直接给予非人类哺乳动物或可将这些混入食物中。
此外，根据制剂类型，本发明的组合物可包含溶剂、流化剂（flowing agent）、润滑剂和任何合适的浆状体赋形剂例如乳糖、纤维素或淀粉。作为润滑剂，可以使用硬脂酸、硬脂酸镁、L-亮氨酸或例如三山萮酸甘油酯(glyceryl tribehenate)。作为崩解剂，可以使用羧甲基淀粉钠、或网状羧甲基淀粉钠。作为流化剂，可以使用纯硅或胶态二氧化硅。口服固体形式可以呈覆有包衣的片剂形式。
本发明的合适的组合物通过如下制备：将有效治疗量的至少一种如前述的抗催乳素化合物（anti prolactinic compound）与溶剂、pH调节剂、缓冲剂、悬浮剂、增溶剂、稳定剂、张力剂和/或防腐剂混合，并通过用传统方法转化所述混合物，用于注射或输注。溶剂的实例是油性溶剂，例如C8-C10的中链甘油三酯，或癸酸、辛酸和甘油三酯的混合物，例如以商品名Mygliol812销售的那些。注射用制剂可以是按照传统方法冻干的。
悬浮剂的实例包括甲基纤维素、聚山梨酸酯80、羟乙基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素钠、聚乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯(sorbitane monolaureate polyethylene)。增溶剂的实例包括用聚氧乙烯固化的蓖麻油、聚山梨酸酯80、烟酰胺、聚乙氧基化失水山梨糖醇单月桂酸酯(sorbitane monolaureate polyethoxylated)、大颗粒凝胶（macrogol）和脂肪蓖麻酸乙酯(ester ethyl fatty ricin acid)。此外，稳定剂包括硫酸钠、焦亚硫酸钠（sodium metasulfate）和酯，而防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯甲醇、苯酚、甲酚和氯甲酚。张力剂的一个实例是甘露醇。在溶液剂和注射用混悬剂的制备期间，最好确保它们与血液等张。
有利的是，本发明的药物组合物可以与IMIs的标准治疗联合给予。IMIs的标准护理或预防性组合物的实例是乳房的局部消毒剂、乳头密封剂、抗生素例如M组青霉素，头孢菌素、庆大霉素或粘杆菌素或甚至酶例如溶菌酶或胞壁酸酶、抗催乳激素化合物例如麦角-衍生的多巴胺受体激动剂和更具体的是卡麦角林。
控制乳房内感染(IMIs)
本发明的组合物和方法尤其适合和有效用于在非人类哺乳动物中控制IMIs。如实验部分所示，所述组合物和方法在体外和体内都有效阻断或减少乳腺中的细菌感染。本发明出乎意料地证明了SAA-3蛋白具有抑制细菌迁移的能力，所述细菌迁移例如乳腺中的金黄色葡萄球菌。
所述组合物和方法尤其有效用于在干乳期期间或干乳期前的短期内的治疗。
对环境病原体的暴露有可能在整个干乳期都持续。这些生物体主要是通过肥料和草垫所致的乳房污染而感染。随着干乳期的进展，不同环境物质导致不同的乳房内感染(IMIs)率和这些病原体物质的分布型在农场之间和在全球不同地区会是不同的。然而，通常可以预期革兰氏阳性细菌是在非人类哺乳动物、尤其是具有较高的散装乳(bulk milk)体细胞计数(SCC)的牛中起到更重要的作用的传染性IMIs病原体，而在低散装乳SCC中，环境病原体、且尤其是革兰氏阴性细菌更有影响力。例如，由环境中的链球菌、克雷伯氏菌和肠杆菌所致的感染在干乳期早期发生得更频繁。另一方面，大肠杆菌感染倾向于在产犊前后随即发生。通常，牛IMIs的主要病原生物体是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)和凝固酶阴性葡萄球菌。
作为先前泌乳的持续感染的结果或作为干乳期期间获得的新感染的结果，存在于产犊期的乳房内感染可发生。存在于干乳期晚期的绝大部分感染都是新获得的，而非从干奶期(drying off)持续感染而来。尽管持续感染通常罕见，但革兰氏阳性菌比其革兰氏阴性菌更有可能在整个干乳期内持续。
干乳期期间的新感染尤为重要并已显示出比起泌乳期期间的新感染的比率高出至多10倍。在低散装乳SCC畜群(<250 000细胞/mL)中，大肠杆菌和乳房链球菌通常是新感染的最常见原因并且研究表明超过60%的新感染是由这些生物体所致。在泌乳的头100天中发生的所有临床乳房炎中有大约60%可归因于干乳期期间获得的IMIs，清楚地表明干乳期在随后的泌乳IMIs感染中的重要性和影响力。
的确，在干乳期期间控制IMIs的发展是有效控制在该时期和随后的泌乳期中发生的乳房炎以及其它感染的关键点。此外，控制IMIs通过减少例如乳房疼痛，也参与了非人类哺乳动物的健康。
本发明的一个特别的目的因此在于在非人类哺乳动物中在干乳期期间控制IMI的组合物或方法，所述组合物或方法使用急性期蛋白、优选SAA蛋白、更优选SAA3蛋白。本发明的另一具体目的在于在干乳期期间控制新的细菌感染的组合物或方法，所述组合物或方法使用急性期蛋白、优选SAA蛋白、更优选SAA3蛋白。
在本发明的上下文中，术语“控制”与感染相关时，是指降低所述感染或感染性疾病的发生率或严重程度，和/或是指至少降低感染的可能性、风险、易感性、严重性、进展或结果。
对IMI的控制尤其是指对IMI的预防，例如，病原体(例如细菌)所致的感染或侵袭或迁移的任何降低，优选任何降低至少15%、20%或更高。
在已暴露于感染物质的非人类哺乳动物中控制感染，是指至少减少感染物质和/或感染物质的任何疾病或症状或结果的发展。
强化天然免疫力
在本发明的上下文中，“强化天然免疫力”是指对非人类哺乳动物的免疫系统的任何改善或刺激，一般为了改善所述哺乳动物针对疾病的抵抗或防御。
优选地，术语“强化天然免疫力”是指增加免疫细胞的募集的能力例如单核细胞，或分化为树突细胞，或白介素8的分泌。本发明出乎意料地证明了SAA-3蛋白具有增加免疫细胞募集的能力(单核细胞分离，分化为树突细胞和白介素8表达模式)和因此强化非人类哺乳动物的天然免疫力。
非人类哺乳动物的健康
集约化的乳生产对乳房健康管理具有特别要求，因为良好的乳房健康有助于例如奶农节约成本，在乳质量、产量和盈利能力方面获取更多。只有具有健康乳房的健康的非人类哺乳动物才能产生有保证的无病原体和残留物的乳汁，并确保消费者的食品安全。因此，控制乳房健康可以是经济上有利的方式，其也有助于减少非人类哺乳动物的疼痛和因此有助于其健康。对于农场动物可用的用于治疗疼痛和炎症的药物的数量和种类以及它们的有效性的信息是有限的。
本发明出乎意料地证明了SAA-3蛋白具有以下能力：通过增强金属蛋白酶活性而刺激乳腺退化，改变SCC以及乳脂和蛋白含量，并因此对乳房健康具有有益作用。
本发明的进一步的方面和优势会在以下实验部分公开，所述部分说明了本发明。
实施例
实施例1: SAA-3蛋白的制备
1.1. 在大肠杆菌中生产
将EcUR206菌株(含有山羊M-SAA3序列的大肠杆菌BL21 Star (DE3)-pET101/D-TOPO载体)用于重组蛋白产生。该方法在别处有解释(Domènech等人, 2012)。简而言之，让BL21/pURAD1在400 ml LB-Amp培养基中生长，起始OD600为0.05，直到达到对数期。通过IPTG 0.1 mM诱导重组表达1小时20分钟。在6000g离心10分钟得到细胞沉淀物，并冷冻于-80ºC备用。在室温下在30分钟内，将细胞沉淀物在20 mM Na2HPO4 /NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 7.4缓冲液中重悬至OD600=100，所述缓冲液含有溶菌酶(0.2 mg/ml)、DNase I和RNaseA (20 μg/ml)、蛋白酶的混合抑制剂(1 mM)和MgCl2 (1 mM)。将悬液与预称重的0.1 mm玻璃珠(范围为26-36 mg/ml样品) (Biospec Product, Inc, Bartlesville, USA)混合。在MiniBead Beater (Biospec Product, Inc, Bartlesville, USA)中进行3次循环击打，每次循环内：击打45秒，在冰上1分钟。将破碎的细胞悬液在20,000g在4ºC离心15分钟，上清液被认为是含有重组蛋白的可溶部分。按照制造商说明书用市售His Spin Trap柱(GEHealthcare, Uppsala, Sweden)纯化重组蛋白。将纯化的蛋白在4ºC针对PBS透析并用分光光度法对其进一步定量((A280×分子量)/消光系数; mg/ml)。洗脱部分中的脂多糖(LPS)痕量通过endoLISA内毒素测定法(Hyglos)定量。最终LPS水平相当于0.08 ng LPS/µg重组蛋白。该水平类似于在重组的市售Apo-SAA中观察到的痕量(ProSci incorporated, 内毒素水平小于0.1 ng/µg 蛋白)。
1.2无LPS的生产方法
本实施例公开了SAA-3的无LPS生产方法。该方法使用乳酸乳球菌作为具有优化的SAA-3编码序列的细菌宿主。具体地讲，用乳酸乳球菌的密码子使用密码来优化SAA-3蛋白的编码序列并作为合成基因产生。将优化的saa3基因作为SEQ ID NO: 3在下面提供。编码域是核苷酸3-467。
经选择用于在乳酸乳球菌中表达SAA-3的表达质粒是pNZ8148 (图6)。
将saa3基因克隆入质粒pNZ8148之后，按如下将其电穿孔入乳酸乳球菌NZ900：将100微升的感受态细胞在2500 V/ 200 Ω/ 2.5uF下进行电穿孔并与M17肉汤+ 0.5%葡萄糖一起在30ºC维持2h。将全部转化物都接种在含5ug/ml氯霉素的M17肉汤琼脂+0.5%葡萄糖中。9个阳性菌落通过PCR核查作为可能的阳性克隆。对克隆1、6、7和8测序，结果表明克隆1对于优化的M-SAA3序列是阳性的(图7)。
在添加了5%葡萄糖和5ug/ml氯霉素的M17培养基中过夜培养乳酸乳球菌NZ900-pNZ8148-SAA3。在OD600nm=0.1时进行新鲜的再次接种并在OD600nm=0.97、1.5或1.7时用1、5、50或500ng/ml 乳链球菌肽(Nisine)诱导3小时。诱导后，将1ml各培养物在4ºC在6000g离心15min，弃去上清液。沉淀物按如下破碎：用4次循环的45’’的FastPrep，用100mg玻璃珠(0.1mm)和1ml裂解缓冲液[NaH2PO4/Na2HPO4 20mM, NaCl 0.5M, pH 7.4，其补充有溶菌酶(0.2mg/ml)、DNase I (20 µg/ml)、RNase A (20 µg/ml)、MgCl2 1mM和2ul/ml蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)]。在20000 xg离心10分钟后，将20µl各上清液(可溶部分)上样到SDS-Page/蛋白质印迹，并用单克隆抗his抗体(Sigma Aldrich)作为第一抗体和与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG第二抗体(Sigma)进行免疫检测。使用QuantityONE软件(BioRad)对所得条带(图8)进行定量。
这些结果显示M-SAA3蛋白可以在乳酸乳球菌中作为可溶性蛋白而有效生产出来。制备物不含LPS。
实施例2: 通过在乳腺输注之后测量对体细胞计数(SCC)、金属蛋白酶活性和脂肪和蛋白含量的作用研究SAA-3蛋白对牛健康的功效
用乳房插管，对9头母牛的四分之二(Two quarters of nine cows)乳房内输注1mg M-SAA3和80 ng大肠杆菌LPS (Sigma) (=对照)，以重现在纯化的重组SAA-3部分中LPS痕量的可能影响。在各自的对照的四分之一(前四分之一或后四分之一)中输注同样体积(10 ml)的盐水溶液。治疗之后，立即将所有四分之一用常规抗生素(Orbenin extra drycow, Pfizer)乳房内治疗。统计学上独立地治疗前四分之一和后四分之一。在乳房内输注前在第一天上午8点采集乳样品(T=0)并且在连续3天的每一天的上午8点采集乳样品(T=1,T=2和T=3)。将10 ml乳冷冻用于金属蛋白酶分析，并针对体细胞计数(SCC)、脂肪和蛋白分析新鲜乳。让新鲜乳样品在ALLIC (Laboratori interprofessional lleter deCatalunya, Cabrils, Spain)中处理。
统计学分析：在混合效应模型(mixed-effects model)中分析与SCC、脂肪、蛋白、金属蛋白酶和基因表达活性的有关数据。有必要时事先转换数据。结果表示为非转化数据的平均值± SEM(除非另有说明)。
A.金属蛋白酶活性
将冷冻乳融化并在2,700g离心10分钟，以获得脱脂乳。将1:20稀释的脱脂乳与上样缓冲液(0.125M Tris pH=6.8，含有0.005% 溴酚蓝、20%甘油、4% SDS) 1:1混合并在含有1 mg/ml猪明胶的10%聚丙烯酰胺凝胶中跑胶。在150V下在运行缓冲液(192mM Gly, 25mMTris, 0.1% SDS)中让样品跑胶1小时。跑胶后，用2.5% Triton X-100溶液在室温下洗涤凝胶，温和振荡30分钟。然后，将凝胶与显色缓冲液(50mM Tris pH 7.6，含有0.2M NaCl、5mMCaCl2、0.02% Brij)一起孵育30分钟，并在新鲜显色缓冲液中在37ºC再次孵育48小时，不振荡。凝胶用考马斯蓝R-250 (Bio-Rad)染色30分钟。使用脱色缓冲液(50%甲醇、10%乙酸)使金属蛋白酶所对应的条带显现出来。将凝胶数字化并用Quantity One软件分析条带大小和强度。
通过酶谱凝胶定量评价乳金属蛋白酶活性。MMP-9和MMP-2酶分别作为在92 KDa和72 KDa处的清楚条带被观察到。观察到显著的M-SAA3治疗效果(P < 0.0001) (图2)。相比盐水溶液，M-SAA3在实验的3天期间增加了(P < 0.0001) MMP-9的活性。相比LPS，M-SAA3也增加了(P < 0.001) MMP-9活性水平(图 2a)。相比之下，LPS和它们的阴性对照之间没有差异。另一方面，MMP-2活性在用M-SAA3或LPS治疗后保持不变(图2b)。
在早期干奶期(early dry off)期间，M-SAA3明显地增加了乳中的MMP-9活性。MMP-9的活性水平(图2a)在输注后24小时之后更大，并在所有实验期间都保持超出基础水平。LPS或内毒素是革兰氏阴性细胞壁的主要成分，并且高度激活免疫应答。在M-SAA3生产期间，在最终洗脱的蛋白中检测到残余的LPS痕量。因此，必须评价LPS痕量，因为牛乳腺对低剂量的LPS高度敏感。痕量的LPS不增加MMP-9活性，观察到水平与其相应的阴性对照类似。另一方面，MMP-2活性在所有实验期间保持不变(图2b)。
已知金属蛋白酶在早期退化起始期间起关键作用，因为促进乳腺基底膜的降解和因此可以被认为是乳腺退化活性的关键标志物。的确，MMP-9已经被描述为在母牛乳腺退化过程中最具活性的金属蛋白酶并且MMP-9的主要来源被认为是嗜中性粒细胞部分。已经描述了MMP-2在乳腺发育期间以及也在晚期退化期间增加它们的水平，其中在牛中的主要MMP-2生产者是内皮细胞。
B. 体细胞计数(SCC)
在实验的第二天期间，在积存的四分之一(funded quarters)中在M-SAA3中(图3a)观察到在SCC计数的数值上的增加。
相反，LPS痕量对SCC的影响是不同的。仅在实验的第一天观察到较低的数值增加。体细胞计数代表对乳中存在的免疫应答细胞的定量，所述免疫应答细胞主要是指嗜中性粒细胞、巨噬细胞和诸如上皮细胞等其它细胞类型。正如科学文献所述，SCC在退化过程期间正常增加，因为免疫应答介质从血管中被吸引。免疫应答介质的增加会有助于保护乳腺免遭感染，并且也有助于增加MMP-9的活性。
C.乳脂和蛋白含量
在干乳期早期在M-SAA3治疗下，脂肪和乳蛋白浓度(图3b、c)都增加了。的确，对于脂肪含量，观察到了治疗效果(P<0.05)(图3b)。相比相应的阴性对照，M-SAA3增加了(P<0.01)脂肪水平。另外，相比其阴性对照，通过LPS处理不增加脂肪含量。对于蛋白含量，观察到了治疗效果的趋势(P=0.051) (图3c)。相比其阴性对照，M-SAA3在实验的3天期间增加了(P<0.01)乳中的蛋白浓度。
在M-SAA3治疗的四分之一中的蛋白含量倾向于(P=0.06)大于LPS的四分之一，而LPS的蛋白含量同其阴性对照无差异。
在干乳期早期在M-SAA3治疗下，脂肪和乳蛋白浓度(图3b、c)都增加了。总蛋白浓度在退化早期增加了，部分因为从分泌物中的水分的再吸收和部分因为乳铁蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的浓度增加，尽管乳-特异性蛋白质例如酪蛋白的表达减少了。乳脂肪浓度在干乳期的头2-3周期间缓慢下降，但在干乳期早期样品中我们仍有可能检测到脂肪积累，所述脂肪积累可通过增强水的再吸收在M-SAA3四分之一中较高。
在乳腺输注之后对体细胞计数(SCC)、金属蛋白酶活性和脂肪以及蛋白含量的这些研究指出了M-SAA3在乳腺退化期间的作用。
实施例3: 通过测量乳腺原代培养中的金黄色葡萄球菌迁移的抑制和IL-8表达来研究SAA-3蛋白对IMIs的功效
乳腺原代培养
在屠宰场获取乳腺组织并在含有100 µg/ml链霉素、100 U/ml青霉素和2.5 µ/ml两性霉素B的冷的PBS中运输。在实验室中，将组织切割成小片并在37ºC在10%CO2中以150rpm在含有0.1 mM EDTA和0.1 mM DTT的汉克斯平衡盐溶液中孵育30分钟。然后，移除上清液和加入含有0.05 %胶原酶的RPMI 1640培养基并孵育30分钟。培养基含有上皮细胞，将其在800g离心5分钟。重复该过程3次。将最终的细胞沉淀物重悬于F-12培养基，所述F-12培养基含有8 µg/ml牛胰岛素、10 µg/ml庆大霉素、50 µg/ml氢化可的松、100 µg/ml链霉素、100U/ml青霉素和2.5 µg/ml两性霉素。通过血球计数器计数对细胞定量并以80.000个细胞/cm2在瓶中孵育，直到分化。如先前在文献(Hashim等人, 2004)所述，通过对抗细胞角蛋白抗体(Sigma)免疫荧光染色来确认上皮细胞表型。让乳腺原代细胞在盖玻片上生长并用4%低聚甲醛(稀释于PBS中)固定。SK-BR3用作阳性对照，巨噬细胞分化的THP-1细胞用作阴性对照。将盖玻片用含有山羊血清(0.05 % v/v)和triton 0.2%的150 µl PBS在室温下封闭30分钟。将第一抗体(在小鼠中产生的单克隆抗细胞角蛋白泛抗体, Sigma, 1:500稀释)在封闭缓冲液中在室温下孵育2小时。用PBS洗涤3次后，将第二抗体(抗小鼠-FITC, Sigma,1:1000)在室温下孵育1小时。最后，洗涤细胞并让盖玻片干燥，使用Fluoroprep封片在盖玻片上，并在荧光显微镜下观察。
A. 金黄色葡萄球菌迁移
金黄色葡萄球菌分离
致病性金黄色葡萄球菌是自乳腺炎乳中分离出来，是由ALLIC (Laboratoriinterprofessional lleter de Catalunya, Cabrils, Spain)友好提供。让金黄色葡萄球菌在营养培养基中生长并接种到甘露醇盐琼脂上。在37ºC在静置条件下让单菌落在10ml营养培养基中过夜生长。在4ºC在6000g离心10分钟得到细胞沉淀物。通过分光光度计法定量来计算细菌浓度(DO600= 0.4相当于10E7 CFU/ml)。通过用不含抗生素的相应培养基重悬和稀释细胞沉淀物而获得细菌感染剂量。
乳腺原代培养物的金黄色葡萄球菌感染
以44.0000细胞/孔将乳腺上皮细胞接种在24-孔板中。将细胞与30 ug/ml重组M-SAA3一起预孵育1小时。预孵育后，将乳腺细胞用10E6 CFU/ml的金黄色葡萄球菌感染2小时。细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)充分洗涤并用Triton 0.1%将内化的金黄色葡萄球菌从细胞中释放出来。将细菌连续稀释并接种在甘露醇盐琼脂上。在37ºC生长后对菌落计数。
通过用单克隆抗泛细胞角蛋白(Sigma)免疫荧光染色证明了培养的细胞的上皮起源(图4a-c)。与或不与M-SAA3预孵育的乳腺原代培养物，用分离自乳房炎乳汁的致病性金黄色葡萄球菌菌株攻击。M-SAA3使细菌迁移降低(P<0.05)多至25%(数据表示为CFU/ml)(图4e)。
M-SAA3降低了25%的用金黄色葡萄球菌攻击原代乳腺培养物所致的细菌感染，所述金黄色葡萄球菌是分离自乳房炎乳汁的致病性菌株。
IMIs和尤其是乳房炎是乳牛场的经济损失的主要原因，在美国每年超过20亿美元。另外，金黄色葡萄球菌感染是主要产生乳房炎的感染之一和最难以通过抗生素治疗而控制的感染之一。
B. IL-8表达
在来自母牛乳腺的上皮原代培养物上评价了M-SAA3对作为募集嗜中性粒细胞的主要细胞因子的IL-8表达的影响。通过用单克隆抗泛细胞角蛋白(Sigma)免疫荧光染色证明了培养的细胞的上皮起源(图4a-c)。在与M-SAA3一起孵育3小时后观察到IL-8表达增加15倍(P<0.0001) (图4d)。
在实验的第二天内数值上的SCC的增加(图3a)表明M-SAA3能够促进细胞趋化性。这与先前的数据是一致，所述先前的数据表明肝SAA形成了单核细胞和多形核细胞(polimorphonuclear cell)向炎症部位的活性迁移。这种趋化性吸引能够被IL-8所介导，IL-8的主要功能涉及免疫应答介质的吸引。为了证实该假说，获得来自牛乳腺组织的原代培养物并将其与SSA-3蛋白一起孵育。乳腺上皮细胞极大地增加了IL-8的表达，表明在M-SAA3暴露后，乳腺上皮细胞能够释放趋化性细胞因子。在科学文献中也已描述了其它细胞类型例如单核细胞和嗜中性粒细胞，响应于SAA家族成员产生IL-8。
对在乳腺原代培养物中的金黄色葡萄球菌迁移和IL-8表达的这些研究指出了M-SAA3在控制IMIs和尤其是乳房炎中的关键作用。
实施例4: 通过测量IL-8表达的活化和树突细胞(DC)成熟来研究SAA-3蛋白对免疫应答强化的功效
牛树突细胞分离
在屠宰场获取含肝素钠50UI/ml（作为抗凝剂）的牛血。将血液用PBS-2%胎牛血清(FCS)在室温下1:1稀释。将稀释的血液以1:2比例(histopaque/稀释的血液)铺在Histopaque-1077 (Sigma)上并在室温在600g (刹车（brakes off）)离心30分钟。外周血单核细胞(PBMCs)分离自分界面，用培养基洗涤并在200g离心10分钟。将细胞沉淀物重悬并与10 ml红细胞裂解缓冲液(Sigma)一起孵育并在室温下孵育10分钟。在250 g离心5分钟后，重复该过程，直到观察到无红细胞沉淀物。将PBMCs重悬于补充培养基(RPMI-10% FCS、50 µM β-巯基乙醇、1% 青霉素/链霉素)中并用血球计数器定量。以10E6细胞/cm2的比例，将PBMCs细胞孵育于75 cm2 Falcon中并在5% CO2在37ºC孵育1.5小时。孵育后，将粘附的单核细胞用PBS洗涤一次并与含有白介素4 (IL-4)和粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子(GM-CSF)细胞因子(牛树突细胞生长试剂盒, Bionova, 1:20 稀释)的补充培养基一起孵育。在第3天更换培养基并在第6天通过显微术观察总细胞分化。实验当天，刮取细胞并定量。按4·105树突细胞/孔的量接种在24-孔板中，与无抗生素的补充RPMI一起孵育。
对牛树突细胞的M-SAA3治疗
将来自原代培养物的乳腺上皮细胞(44.000细胞/孔)和树突细胞(4·10E5细胞/孔)接种在24-孔板中。将细胞与不含抗生素、含或不含30 µg/ml重组M-SAA3的相应培养基一起孵育3小时。用PBS洗涤后，将细胞重悬于0.5 ml Trizol (invitrogen)和冷冻于-80ºC，直到通过定量RT-PCR进行基因表达分析。
定量RT-PCR
按照制造商的说明书使用Trizol (Invitrogen)，自上皮乳腺细胞和树突细胞中提取总RNA。使用IScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad, California, USA)将1微克RNA逆转录为cDNA。使用特异性引物进行定量RT-PCR(表1)。将每一引物组单独优化。通过在预期分子量处鉴定单一条带和在融解曲线中的单一峰（pick）而评价扩增的特异性。通过扩增各基因扩增子的连续1/10稀释物而计算效率。绘制Ct与对数浓度的标准曲线以获得效率，其是使用公式101/斜率计算，可接受范围为1.8-2.2。使用20μl的总反应体积，其含有50 ng cDNA、10 µl SYBER Green Fluorescent(Bio-Rad)和针对每个基因的优化的引物浓度(表1)。qPCR反应按如下循环：95℃ 10分钟的起始变性步骤；接着40循环：95℃ 10秒，每个基因的最佳退火温度15秒，72℃ 30秒；在72℃ 10分钟的最后延伸。用ACTB作为参考基因对照用2∆Ct方法计算相对基因表达。
在有或无M-SAA3的情况下孵育树突细胞。评价活化和成熟相关的一组基因(图5a-f)。
用M-SAA3治疗后IL-8水平增加了(P<0.0001) 2倍。用M-SAA3治疗后INFγ被高度上调(P< 0.0001)，得到28倍高的水平。用M-SAA3治疗后TNFα水平增加了(P<0.0001) 7倍。用M-SAA3治疗后CCR7标志物增加了(P < 0.01) 2.5倍。用M-SAA3治疗后CD80标志物倾向于(P= 0.053)增加3倍。最后，用M-SAA3治疗后iNOS表达倾向于(P=0.054)增加3倍。树突细胞(DC)是专门的抗原呈递细胞，在适应性免疫应答的起始中起关键作用。DC可以是能够活化纯真T细胞（naïve T cell）的唯一细胞类型。在血流中的循环不成熟DC进入组织，在这里变为驻留细胞。在乳腺中，在小泡、上皮和小泡间组织中已经鉴定出DC群体。不成熟DC显示了高的噬菌活性并且负责抗原摄取。在其它刺激物中，通过细菌识别而达到成熟。（Maturation is reached, among other stimulus, by bacterial recognition.）成熟DC稍微降低了噬菌活性和增强了其它特征，例如抗原呈递和向次级淋巴结迁移的能力。可通过相关分子例如CD80和CCR7的增加来检测成熟。CD80是一种重要的共刺激分子，其与主要组织相容性复合物II (MHCII)一起参与抗原呈递。CCR7是有助于成熟DC迁移的受体。输注的M-SAA3增加了与DC活化、迁移和抗原呈递相关的若干成熟标志物(图5a-f)。
促炎细胞因子例如IL-8、INFγ和TNFα被上调。也增加了CCR7和CD80标志物。最终，在M-SAA3治疗下也增加了酶一氧化氮合酶(oxid nitric synthase) (iNOS)的表达。
这些结果表明SAA-3治疗增加了巨噬细胞中的一氧化氮，一氧化氮是参与抗击病原体的一种介质并且它是由iNOS产生。
对DC成熟的这些研究指出了M-SAA3通过增强免疫应答升高而对参与抗击病原体的介质的关键作用。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表1 用于qPCR的引物的序列、退火温度(At)、浓度(µM)和扩增子(bp)。
序列
SEQ ID NO: 1: M-SAA3 mRNA序列
Figure DEST_PATH_IMAGE004
SEQ ID NO: 2: M-SSA3蛋白序列
Figure DEST_PATH_IMAGE006
SEQ ID NO: 3: 用于表达乳酸乳球菌的经优化的M-SSA3基因序列
Figure DEST_PATH_IMAGE008
Figure IDA0000867476770000011
Figure IDA0000867476770000021
Figure IDA0000867476770000031
Figure IDA0000867476770000041
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Claims (14)

1.急性期蛋白或包含急性期蛋白的组合物在制备用于改善非人类哺乳动物的乳腺退化的药物中的用途，其中所述急性期蛋白是血清淀粉样蛋白A蛋白。
2.权利要求1的用途，其中所述药物用于增强乳房健康。
3.权利要求1或2的用途，其中所述血清淀粉样蛋白A蛋白是SAA-3蛋白。
4.权利要求3的用途，其中所述SAA-3蛋白包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列。
5.权利要求3的用途，所述SAA-3蛋白包含与SEQ ID NO: 2具有至少85%、90%、95%或97%序列同一性的氨基酸序列。
6.权利要求1-2和4-5中任一项的用途，其中所述急性期蛋白不含LPS。
7.权利要求1-2和4-5中任一项的用途，其中所述急性期蛋白经乳房内输注而给予。
8.权利要求1-2和4-5中任一项的用途，其中所述急性期蛋白在干奶期期间给予。
9.权利要求1-2和4-5中任一项的用途，其中所述药物还进一步包括至少一种额外活性剂。
10.权利要求9的用途，其中所述至少一种额外活性剂选自抗生素、抗氧化剂、抗催乳激素、抗原和/或乳头密封剂。
11.权利要求10的用途，其中所述至少一种额外活性剂选自苄基青霉素、氯唑西林、乙氧萘青霉素、头孢烯、氨基糖苷类、庆大霉素、卡那霉素、二氢链霉素、红霉素、泰乐菌素、土霉素、苄基青霉素、二氢链霉素、甲氧西林、林可霉素、克林霉素、氯霉素、氟苯尼考、维吉霉素、替米考星和乳链球菌肽。
12.权利要求1-2、4-5和10-11中任一项的用途，其中所述非人类哺乳动物是反刍动物。
13.权利要求1-2、4-5和10-11中任一项的用途，其中所述非人类哺乳动物是牛。
14.权利要求1-2、4-5和10-11中任一项的用途，其中所述非人类哺乳动物是母牛。
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