CN105403603B - 一种光电化学适配体传感电极的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于光电化学传感领域，涉及一种光电化学适配体传感电极的制备方法并将其应用于微囊藻毒素的检测。首先利用湿化学法制备了溴化氧铋‑氮杂石墨烯（BiOBr‑NG）纳米复合物。然后将其修饰在一种氧化铟锡（ITO）电极表面，进一步利用氮杂石墨烯与核酸适配体间π‑π堆叠作用固定适配体构建光电化学平台，进而将其应用于微囊藻毒素的检测。本发明旨在发明一种制备工艺简单，选择性好，灵敏度高、检测成本低的光电化学适配体传感电极的制备方法。

Description

一种光电化学适配体传感电极的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于光电化学传感领域，涉及一种光电化学适配体传感电极的制备方法，尤其涉及一种在氧化铟锡（俗称ITO）电极表面修饰溴化氧铋-氮杂石墨烯（BiOBr-NG）纳米复合物的基础上，进一步利用氮杂石墨烯与核酸适配体间π-π堆叠作用固定适配体构建光电化学检测平台的传感器的制备方法。
背景技术
日趋严重的水体富营养化导致的水华现象已成为全球性的环境问题。水华形成的主要原因是由于水体中藻类的过度繁殖,其中的产毒蓝藻产生的蓝藻毒素累积在水中,严重威胁人们的饮水安全。蓝藻毒素是由七个氨基酸组成的环肽类物质,一般称为微囊藻毒素(Microcystins,MCYST)。微囊藻毒素是一种由蓝藻释放的环七肽毒素,对肝结构和功能具有一定的破坏性。随着工业化的发展,水体中存在着大量含氮、磷的污染物,大量微囊藻毒素由于富营养化而存在，其中毒性最大的是Microcystin-LR（MC-LR）。微囊藻毒素成为水质控制和环境检测的一个很重要指标。世界卫生组织规定饮用水中微囊藻毒素的最高含量为1 μg/L。目前存在很多检测方法,常用的微囊藻毒素检测方法有高效液相（HPLC）、液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、薄层色谱法（TLC）等,但是这些检测方法需要大量的工作人员,操作复杂,费用高,所以我们急需要找到一种灵敏、操作简单的检测方法。光电化学（PEC）技术，作为一种新兴的电分析技术，具有很多在传统电化学平台上不能或者难以实现的优点，如背景信号低，灵敏度高等，已经在众多领域受到了广泛的关注。
发明内容
针对传统检测方法的仪器复杂、响应时间长、选择性和灵敏度低等缺点，本发明的目的是提供一种快速且灵敏度高的MC-LR光电化学传感电极的制备方法，并且将该光电化学传感电极应用于MC-LR的检测。
首先，采用湿化学法制备了BiOBr-NG纳米复合物，然后配制BiOBr-NG纳米复合物水分散液，备用；
其次，基于BiOBr-NG纳米复合物的光电化学活性，将纳米复合物修饰在氧化铟锡（ITO）电极表面与甘汞电极、铂电极构成三电极体系，接着将上述修饰电极进一步修饰上MC-LR适配体，并将其置于缓冲溶液中在可见光照射下构建光电化学传感器。最后，通过将传感器浸于不同浓度MC-LR溶液中温育一段时间采集PEC信号，建立MC-LR浓度与PEC信号强度之间的对应关系，绘制PEC方法灵敏检测MC-LR的标准曲线。
本发明中MC-LR检测传感器电极制备方法，包括以下几个步骤：
（1）BiOBr-NG纳米复合物的制备方法为：
首先，将五水合硝酸铋（Bi(NO3)3·5H2O）溶于去离子水中，用硝酸（HNO3）溶液将其pH值调至3，备用；
此外，将氮杂石墨烯（NG）分散于十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液中超声混合均匀；
然后，将Bi(NO3)3·5H2O酸溶液缓慢滴入NG和CTAB混合溶液中，将上述混合液转入圆底烧瓶中于60~120℃油浴反应3 h。反应完成后，将制备的沉淀物用乙醇和去离子水3次，80℃干燥。
其中，所用溶剂去离子水的体积用量为：每0.12 g Bi(NO3)3·5H2O用去离子水50mL，所述CTAB溶液的浓度为8×10-3 mol/L；
所述CTAB和Bi(NO3)3·5H2O的摩尔比为1:1，所述NG和Bi(NO3)3·5H2O质量比为：0.8~4.5 mg: 0.12 g，
所述超声混合时间为0.5 h。
所述BiOBr-NG纳米复合物水分散液的浓度为2 mg/mL；
（2）ITO电极表面预处理：
将ITO电极先用1 M氢氧化钠煮沸15~20分钟，再依次用丙酮、二次蒸馏水、乙醇超声清洗，氮气吹干备用。
（3）光电化学传感电极的制备过程：
用微量注射器移取步骤（1）制备的BiOBr-NG纳米复合物水分散液10~20 μL滴涂到1×0.5 cm2 步骤（2）制备的ITO电极表面，红外灯烘干，将其浸于5 μmol/L的MC-LR适配体溶液中8 h取出用二次蒸馏水淋洗，室温干燥后得到BiOBr-NG/MC-LR适配体修饰的ITO电极（MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO）。
（4）MC-LR浓度与PEC信号之间的对应关系：
将步骤（3）制备的MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO置于5 mL缓冲溶液中(pH=7~8)，施加偏压为0.0 V，以铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极采用i~t曲线法收集PEC信号；再将MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO依次浸入从小到大不同浓度的MC-LR温育0.5 h（1×10-12~5×10-7 mol/L）收集PEC信号，根据不同浓度的MC-LR对应的PEC信号强度建立标准曲线。
所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液（PBS）；
所述的MC-LR适配体的碱基序列为：
5′-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AATTAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCCCAT CTC CGC-3′。
本发明的有益效果：
（1）本发明利用BiOBr-NG纳米复合物为光电活性材料，构建光电化学平台，NG的引入为MC-LR的检测提供了信号放大的平台。
（2）本发明首次利用氮杂石墨烯与适配体分子间的物理作用成功制备了MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO电极，MC-LR核酸适配体和氮杂石墨烯的引入成功构建了一种新型的用于检测MC-LR的光电化学适配体传感器，具有制备工艺简单、选择性高、灵敏度高、检出限低、检测成本低等优点。
附图说明
图1为实施例2的BiOBr-NG纳米复合物的透射电镜图；
图2为实施例2的（A）为MC-LR浓度与光电化学信号强度之间的对应关系图，（B）为检测MC-LR的标准曲线；
具体实施方式：
实施例1：
（1）BiOBr-NG纳米复合物的制备方法为，将0.12 g五水合硝酸铋（Bi(NO3)3·5H2O）溶于去离子水中，用硝酸（HNO3）溶液将其pH值调至3，此外，将0.8 mg NG分散于CTAB溶液中超声混合均匀。然后将Bi(NO3)3·5H2O溶液缓慢滴入NG和CTAB混合溶液中。将上述混合液转入圆底烧瓶中于60℃油浴反应3 h。反应完成后，将制备的沉淀物用乙醇和去离子水反复洗3次，80℃干燥备用。
其中，所用溶剂去离子水的体积为50 mL，CTAB和Bi(NO3)3·5H2O的摩尔比为1:1，超声混合时间为0.5 h，CTAB的浓度为8×10-3 mol/L。
（2）ITO电极表面预处理：将ITO电极先用1 M氢氧化钠煮沸15~20分钟，再依次用丙酮、二次蒸馏水、乙醇超声清洗，氮气吹干备用。
（3）光电化学传感电极的制备过程：用微量注射器移取2 mg/mL BiOBr-NG纳米复合物水分散液10 μL滴涂到1×0.5 cm2 ITO电极表面，红外灯烘干，将其浸于5 μmol/L的MC-LR适配体溶液中8 h取出用二次蒸馏水淋洗，室温干燥后得到BiOBr-NG/MC-LR适配体修饰的ITO电极（MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO）。
（4）MC-LR浓度与PEC信号之间的对应关系：将MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO置于5mL PBS缓冲溶液中(pH=7)，施加偏压为0.0 V，以铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极采用i~t曲线法收集PEC信号；再将MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO从小到大依次浸入不同浓度的MC-LR温育0.5 h，收集PEC信号，根据不同浓度的MC-LR对应的PEC信号强度建立标准曲线。
实施例2：
（1）BiOBr-NG纳米复合物的制备方法为，将0.12 g Bi(NO3)3·5H2O溶于去离子水中，用硝酸（HNO3）溶液将其pH值调至3，此外，将1.56 mg分散于CTAB溶液中超声混合均匀。然后将Bi(NO3)3·5H2O溶液缓慢滴入NG和CTAB混合溶液中。将上述混合液转入圆底烧瓶中于80℃油浴反应3 h。反应完成后，将制备的沉淀物用乙醇和去离子水反复洗3次，80℃干燥备用，图1为所合成的BiOBr-NG纳米复合物的透射电镜图，由图1可知，片状的BiOBr分散于NG石墨烯片层上。
其中，所用溶剂去离子水的体积为50 mL，CTAB和Bi(NO3)3·5H2O的摩尔比为1:1，超声混合时间为0.5 h，CTAB的浓度为8×10-3 mol/L。
（2）ITO电极表面预处理：将ITO电极先用1 M氢氧化钠煮沸15~20分钟，再依次用丙酮、二次蒸馏水、乙醇超声清洗，氮气吹干备用。
（3）光电化学传感电极的制备过程：用微量注射器移取2 mg/mL BiOBr-NG纳米复合物水分散液15 μL滴涂到1×0.5 cm2 ITO电极表面，红外灯烘干，将其浸于5 μmol/L的MC-LR适配体溶液中8 h取出用二次蒸馏水淋洗，室温干燥后得到BiOBr-NG/MC-LR适配体修饰的ITO电极（MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO）。
（4）MC-LR浓度与PEC信号之间的对应关系：将MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO置于5mL PBS缓冲溶液中(pH=7.4)，施加偏压为0.0 V，以铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极采用i~t曲线法收集PEC信号；再将MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO从小到大依次浸入不同浓度的MC-LR温育0.5 h （1×10-12~5×10-7 mol/L）收集PEC信号，根据不同浓度的MC-LR对应的PEC信号强度建立标准曲线，图2中（A）为MC-LR浓度与光电化学信号强度之间的对应关系，（B）为检测MC-LR的标准曲线，a~i分别为0 mol/L,1 pmol/L,5 pmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L,50 nmol/L和100 nmol/L。
实施例3：
（1）BiOBr-NG纳米复合物的制备方法为，将0.12 g Bi(NO3)3·5H2O溶于去离子水中，用硝酸（HNO3）溶液将其pH值调至3，此外，将4.5 mg NG分散于CTAB溶液中超声混合均匀。然后将Bi(NO3)3·5H2O溶液缓慢滴入NG和CTAB混合溶液中。将上述混合液转入圆底烧瓶中于120℃油浴反应3 h。反应完成后，将制备的沉淀物用乙醇和去离子水反复洗3次，80℃干燥备用。
其中，所用溶剂去离子水的体积为50 mL，CTAB和Bi(NO3)3·5H2O的摩尔比为1:1，NG，超声混合时间为0.5 h，CTAB的浓度为(8×10-3 mol/L)。
（2）ITO电极表面预处理：将ITO电极先用1 M氢氧化钠煮沸15~20分钟，再依次用丙酮、二次蒸馏水、乙醇超声清洗，氮气吹干备用。
（3）光电化学传感电极的制备过程：用微量注射器移取2 mg/mL BiOBr-NG纳米复合物水分散液20 μL滴涂到1×0.5 cm2 ITO电极表面，红外灯烘干，将其浸于5 μmol/L的MC-LR适配体溶液中8 h取出用二次蒸馏水淋洗，室温干燥后得到BiOBr-NG/MC-LR适配体修饰的ITO电极（MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO）。
（4）MC-LR浓度与PEC信号之间的对应关系：将MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO置于5mL PBS缓冲溶液中(pH=8)，施加偏压为0.0 V，以铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极采用i~t曲线法收集PEC信号；再将MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO从小到大依次浸入不同浓度的MC-LR温育0.5 h收集PEC信号，根据不同浓度的MC-LR对应的PEC信号强度建立标准曲线。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种光电化学适配体传感电极的制备方法及其应用
<130> 一种光电化学适配体传感电极的制备方法及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggcgccaaac aggaccacca tgacaattac ccataccacc tcattatgcc ccatctccgc 60

Claims (10)

1.一种光电化学适配体传感电极的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）采用湿化学法制备BiOBr-NG纳米复合物，然后配制BiOBr-NG纳米复合物水分散液，备用；
（2）ITO电极表面预处理：
将ITO电极先用1 M氢氧化钠煮沸15~20分钟，再依次用丙酮、二次蒸馏水、乙醇超声清洗，氮气吹干，备用；
（3）光电化学传感电极的制备过程：
将步骤（1）制备的BiOBr-NG纳米复合物水分散液涂覆到步骤（2）制得的ITO电极表面，红外灯烘干，然后浸于MC-LR适配体溶液中，取出后用二次蒸馏水淋洗，室温干燥，得到BiOBr-NG/MC-LR适配体修饰的ITO电极，即MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述湿化学法制备BiOBr-NG纳米复合物包括如下步骤：
首先，将五水合硝酸铋Bi(NO3)3·5H2O溶于去离子水中，用硝酸溶液将其pH值调至3，备用；
然后，将氮杂石墨烯NG分散于十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液中超声混合均匀；
最后，将Bi(NO3)3·5H2O酸溶液缓慢滴入NG和CTAB混合溶液中，将上述混合液转入圆底烧瓶中于60~120℃油浴反应3 h，反应完成后，将制备的沉淀物用乙醇和去离子水3次，80℃干燥。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所用溶剂去离子水的体积用量为：每0.12g Bi(NO3)3·5H2O用去离子水50 mL；所述CTAB溶液的浓度为8×10−3 mol/L；所述CTAB和Bi(NO3)3·5H2O的摩尔比为1:1，所述氮杂石墨烯NG和Bi(NO3)3·5H2O质量比为0.8~4.5mg: 0.12 g，所述超声混合时间为0.5 h。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述BiOBr-NG纳米复合物水分散液的浓度为2 mg/mL。
5.如权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，ITO电极表面涂覆BiOBr-NG纳米复合物水分散液的量为：将10~20 μL 的BiOBr-NG纳米复合物水分散液涂覆到1×0.5 cm2 的ITO电极表面。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述MC-LR适配体溶液的浓度为5 μmol/L，电极在MC-LR适配体溶液中浸泡时间为8 h。
7.如权利要求1所述的制备方法制备的MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO的应用，其特征在于，其应用于检测MC-LR。
8.如权利要求7所述的MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO的应用，其特征在于，具体步骤为：将MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO置于5 mL pH=7~8缓冲溶液中，施加偏压为0.0 V，以铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极采用i~t曲线法收集PEC信号；再将MC-LR适配体/BiOBr-NG/ITO依次浸入从小到大不同浓度的MC-LR温育0.5 h，收集PEC信号，根据不同浓度的MC-LR对应的PEC信号强度建立标准曲线。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，MC-LR的浓度为1×10-12~5×10-7 mol/L。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的MC-LR适配体的碱基序列为：
5′-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AATTAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CATCTC CGC-3′。
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CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180227

Termination date: 20191120

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