CN105400700A - 一种甲砜甲苯降解菌棘孢木霉的制备及对工业废水的处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种棘孢木霉的制备方法，所述的制备方法为利用固态发酵的方法制备棘孢木霉，先将秸秆粉和水、氮源充分混合，并搅拌均匀，然后接入棘孢木霉1285，将菌种与固体基质混合均匀；室温下自然发酵，发酵基质温度超过50℃时进行翻动并通气降温；当基质中甲砜甲苯降解酶活力不再增加时即发酵结束，所得含有棘孢木霉1285和甲砜甲苯降解酶的基质即为用于工业废水处理的棘孢木霉菌。所述的处理工业废水的方法为在工业废水中棘孢木霉的添加量为废水量的0.1%-5%（W/V)；所述的工业废水调节pH为3.0-6.0，控制处理温度为20-50℃，处理时间为2-10h。

Description

一种甲砜甲苯降解菌棘孢木霉的制备及对工业废水的处理方法

技术领域

本发明涉及环境保护和生物化工领域，尤其涉及一种甲砜甲苯降解棘孢木霉菌的制备及对工业废水的处理方法。

背景技术

甲砜甲苯具有以下所示的结构：

甲砜甲苯是医药、染料、兽药以及有机合成的中间体，主要用于玉米除草剂甲基磺草酮的中间体。甲砜甲苯属于香族化合物，因其含有苯环结构，具有较大的生物毒性和致癌、致突变作用，且其化学性质稳定，污染物在介质中滞留时间长，环境中的甲砜甲苯易于通过食物链传递给动物和人，对人体健康造成严重危害。甲砜甲苯会刺激呼吸系统和皮肤，对眼睛有严重伤害，而且吞食有害。

甲砜甲苯可通过工业废水进入环境，由于它毒性大、难降解等特点，在环境中大量残留，造成环境污染，当它通过呼吸道或人体皮肤进入人体，对人体造成伤害。

现有工业废水中的甲砜甲苯处理方法包括：利用活性炭、树脂、磺化煤等吸附介质，实现工业废水中对甲苯磺酸的吸附，达到工业废水净化的目的。该方法处理效果好，能够实现了达标排放，但吸附饱和的活性炭无法再生，只能采用焚烧处理的办法，处理费用较高。使用树脂、磺化煤等吸附介质同样存在吸附介质的再生问题及再生液的后处理问题。利用其它化学、光化学及物理化学手段来解决对甲苯磺酸的污染，但这会引起二次污染或仅仅使污染物从一种环境系统转移到另一种，比如光解及化学氧化时，由于光能及化学能对中间产物的激发作用，使得中间产物有时毒性比处理前还大。

发明内容

本发明针对上述问题提供了一种能降解甲砜甲苯的棘孢木霉菌以及用该棘孢木霉菌处理含甲砜甲苯工业废水的方法。

本发明所述的一种棘孢木霉的制备方法为：它利用固态发酵的方法制备棘孢木霉，先将秸秆粉和水、氮源等充分混合，并搅拌均匀，然后接入棘孢木霉1285，将菌种与固体基质混合均匀；室温下自然发酵，发酵基质温度超过50℃时进行翻动并通气降温。当基质中甲砜甲苯降解酶活力不再增加时即发酵结束，所得含有棘孢木霉1285和甲砜甲苯降解酶的基质即为用于工业废水处理的棘孢木霉菌；然后将发酵基质加入到工业废水中，通过控制转化过程的温度、pH等，达到对废水中甲砜甲苯生物降解的目的。

所述秸秆包括水稻秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆、油菜秸秆含木质纤维的农业秸秆中的至少一种；秸秆需要经过粉碎处理，粉碎后材料经过孔径为5mm-5cm的筛板，所得秸秆粉即为发酵主要基质。

所述用水量为添加秸秆质量的2-4倍；

所述氮源指的是各种含氮有机化合物或无机化合物，包括硝酸氨、尿素、氨基酸、豆粕，上述氮源单独使用或是将不同氮源进行组合使用，氮源添加量根据秸秆种类和发酵条件不同进行调节，要求保持总C/N为15-40之间；

所述室温下自然发酵指的是发酵处于室温的自然条件下，要求环境温度在15-40℃之间，温度低于15℃时需要加热启动发酵，温度高于40℃时需要降温，否则发酵不能正常进行；

所述的控制发酵温度不高于50℃，指的是通过利用翻堆或通气的措施降低体系的温度；

所述甲砜甲苯降解酶活力通过如下方法测定：把1g上述发酵基质加入100mL预冷的磷酸缓冲液（pH5）过滤，滤液于1000rpm下离心20min，上清液即为甲砜甲苯降解酶粗提液。0.5mL粗酶液（可以是经过适当稀释的酶液），加入4mL0.1mol/L磷酸缓冲液（pH5)，加入0.5mL0.5mmol/L甲砜甲苯以启动反应，28℃下保温反应5min，加入2mL三氯醋酸终止反应。用HPLC测定甲砜甲苯的含量变化。酶的活力单位(U)定义为每分钟催化1μmol甲砜甲苯降解的酶液体积数为1个酶活单位。

所述棘孢木霉处理工业废水的方法为：在工业废水中棘孢木霉的添加量为废水量的0.1%-5%（W/V)；所述的工业废水调节pH为3.0-6.0，控制处理温度为20-50℃，处理时间为2-10h，通过检测废水中甲砜甲苯的含量确定处理时间。

本发明的优点是：通过所述的棘孢木霉能对工业废水中的甲砜甲苯进行充分降解，达到工业废水的排放要求，有效地减少对环境的污染。

说明书附图

图1为菌株1285的菌落平板特征。

图2为菌株1285的菌落显微特征。

图3为菌株1285的ITS区DNA进化树。

图4为pH对棘孢木霉降解甲砜甲苯降解率的影响。

图5为棘孢木霉菌种添加量对降解甲砜甲苯降解率的影响。

图6为温度对棘孢木霉降解甲砜甲苯降解率的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明所述的一种能降解甲砜甲苯的棘孢木霉菌为丝状真菌菌株，命名为棘孢木霉（Trichodermaasperellum）1285，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏日期为2015年6月27日，保藏编号为CCTCCM2015413。该菌株为从秸秆中分离、筛选得到的，经鉴定为棘孢木霉（Trichodermaasperellum）。

棘孢木霉（Trichodermaasperellum）1285的生理生化特性为：

该菌株生长发育温度为10~35℃，最适温度为25~38℃；在pH值3-8时，均能生长，最适pH值为5-6；能有效地利用各种碳、氮源，碳源以糊精、甘露醇、D-山梨醇最好，氮源以甘氨酸最适。

菌落形态如图1所示，显微形态如图2所示。

本发明所述的一种棘孢木霉的制备方法为：它利用固态发酵的方法制备棘孢木霉，先将秸秆粉和水、氮源等充分混合，并搅拌均匀，然后接入棘孢木霉1285，将菌种与固体基质混合均匀；室温下自然发酵，发酵基质温度超过50℃时进行翻动并通气降温。当基质中甲砜甲苯降解酶活力不再增加时即发酵结束，所得含有棘孢木霉1285和甲砜甲苯降解酶的基质即为用于工业废水处理的棘孢木霉菌；然后将发酵基质加入到工业废水中，通过控制转化过程的温度、pH等，达到对废水中甲砜甲苯生物降解的目的。

所述秸秆包括水稻秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆、油菜秸秆含木质纤维的农业秸秆中的至少一种；秸秆需要经过粉碎处理，粉碎后材料经过孔径为5mm-5cm的筛板，所得秸秆粉即为发酵主要基质。

所述用水量为添加秸秆质量的2-4倍；

所述氮源指的是各种含氮有机化合物或无机化合物，包括硝酸氨、尿素、氨基酸、豆粕，上述氮源单独使用或是将不同氮源进行组合使用，氮源添加量根据秸秆种类和发酵条件不同进行调节，要求保持总C/N为15-40之间；

所述室温下自然发酵指的是发酵处于室温的自然条件下，要求环境温度在15-40℃之间，温度低于15℃时需要加热启动发酵，温度高于40℃时需要降温，否则发酵不能正常进行；

所述的控制发酵温度不高于50℃，指的是通过利用翻堆或通气的措施降低体系的温度；

所述甲砜甲苯降解酶活力通过如下方法测定：把1g上述发酵基质加入100mL预冷的磷酸缓冲液（pH5）过滤，滤液于1000rpm下离心20min，上清液即为甲砜甲苯降解酶粗提液。0.5mL粗酶液（可以是经过适当稀释的酶液），加入4mL0.1mol/L磷酸缓冲液（pH5)，加入0.5mL0.5mmol/L甲砜甲苯以启动反应，28℃下保温反应5min，加入2mL三氯醋酸终止反应。用HPLC测定甲砜甲苯的含量变化。酶的活力单位(U)定义为每分钟催化1μmol甲砜甲苯降解的酶液体积数为1个酶活单位。

所述棘孢木霉处理工业废水的方法为：在工业废水中棘孢木霉的添加量为废水量的0.1%-5%（W/V)；所述的工业废水调节pH为3.0-6.0，控制处理温度为20-50℃，处理时间为2-10h，通过检测废水中甲砜甲苯的含量确定处理时间。

本发明所述的棘孢木霉1228的分离与鉴定方法为：

将各种环境样品溶于蒸馏水中，并进行梯度稀释，得到不同浓度的菌悬液；将菌悬液涂布在含愈创木酚的PDA无菌平板上。将平板倒置于恒温培养箱中培养，直到长出具有红色变色圈的菌落，将菌落挑取于PDA培养基上纯化。

将初筛得到的菌进行比较后，确定菌株1285在含愈创木酚的PDA无菌平板上的变色能力最强。

菌株在PDA培养基平板上，30℃下培养3天，肉眼观察菌株1285的菌落形态（如图1所示）：落形成同心环，在同心环上产生稠密的分生孢子，接近中央的分生孢子暗绿色，边缘的分生孢子才刚刚形成，气生菌丝缺。分生孢子梗形成垫状至半球形丛束，散布在整个菌落或聚集成2-3个同心圆环，暗绿色。菌落背面不变色。菌株1285的纤维形态（如图2所示）：分生孢子梗细长、弯曲，次级分枝对生。瓶梗安瓶形，3个一组轮生。分生孢子球形、近球形，壁有细刺。

将菌株1285的ITS序列在NCBI数据库中进行比对分析，发现菌株1285ITSDNA与数据库中Trichodermaasperellum有99%的相似度。用MEGA软件采用邻位相连法构建进化树，结果如图3所示。通过进化树分析发现，菌株1285与TrichodermaasperellumRHg在同一分支上，二者相似度高达99%。根据菌株1285的形态特征，并结合分子生物学鉴定，菌株1285属于棘孢木霉（Trichodermaasperellum）。

本发明所述的棘孢木霉1285的具体的发酵培养方法为：

取当年新鲜的水稻秸秆，用粉碎机进行粉碎过筛，筛孔直径1cm。称取2000g水稻秸秆粉于发酵桶中，加60g硝酸铵、5400ml水，充分搅拌均匀，接种菌株1285，使菌种充分充分与秸秆接触，于自然条件下发酵（环境温度20-28℃）。经检测，培养8天后体系中漆酶活力达到3000IU，此后不再增加。停止发酵，此时的发酵基质即为工业废水处理用的棘孢木霉菌。

本发明所述的棘孢木霉1285降解工业废水中甲砜甲苯方法如下：

取甲砜甲苯含量为2‰的甲砜甲苯工业废水100ml，装于500ml锥形瓶中，按照5%菌种添加量添加菌种，分别调节pH值至3、4、5、6、7，28℃下恒温振荡反应5h。HPLC测定降解前后的甲砜甲苯含量，并计算甲砜甲苯降解率。pH值为5时，甲砜甲苯降解率最大达到95.8%。

本发明可以通过调节棘孢木霉1285菌种量来调节对工业废水中甲砜甲苯的降解率。做法是

取甲砜甲苯含量为2‰的甲砜甲苯工业废水100ml，装于500ml锥形瓶中，分别按照1%、2%、3%、4%、5%菌种添加量添加菌种，调节pH值至5，28℃下恒温振荡反应5h。HPLC测定降解前后的甲砜甲苯含量，并计算甲砜甲苯降解率。

本发明可以通过改变温度来调节所述的棘孢木霉1285对工业废水中的降解率。在温度28℃时，降解率最好。做法是：

取甲砜甲苯含量为2‰的甲砜甲苯工业废水100ml，装于500ml锥形瓶中，按照5%菌种添加量添加菌种，调节pH值至5，28℃下恒温振荡反应5h。HPLC测定降解前后的甲砜甲苯含量，并计算甲砜甲苯降解率。

Claims (3)

1.一种棘孢木霉的制备方法，其特征在于所述的制备方法为利用固态发酵的方法制备棘孢木霉，先将秸秆粉和水、氮源充分混合，并搅拌均匀，然后接入棘孢木霉1285，将菌种与固体基质混合均匀；室温下自然发酵，发酵基质温度超过50℃时进行翻动并通气降温；当基质中甲砜甲苯降解酶活力不再增加时即发酵结束，所得含有棘孢木霉1285和甲砜甲苯降解酶的基质即为用于工业废水处理的棘孢木霉菌；

所述秸秆包括水稻秸秆、小麦秸秆、棉花秸秆、油菜秸秆含木质纤维的农业秸秆中的至少一种；秸秆需要经过粉碎处理，粉碎后材料经过孔径为5mm-5cm的筛板，所得秸秆粉即为发酵主要基质；

所述用水量为添加秸秆质量的2-4倍；

所述氮源指的是各种含氮有机化合物或无机化合物，包括硝酸氨、尿素、氨基酸、豆粕，上述氮源单独使用或是将不同氮源进行组合使用，氮源添加量根据秸秆种类和发酵条件不同进行调节，要求保持总C/N为15-40之间；

所述室温下自然发酵指的是发酵处于室温的自然条件下，要求环境温度在15-40℃之间，温度低于15℃时需要加热启动发酵，温度高于40℃时需要降温；

所述的控制发酵温度不高于50℃，指的是通过利用翻堆或通气的措施降低体系的温度。

2.根据权利要求1所述的一种棘孢木霉的制备方法，其特征在于所述的甲砜甲苯降解酶活力通过如下方法测定：把1g上述发酵基质加入100mL预冷的pH5磷酸缓冲液过滤，滤液于1000rpm下离心20min，上清液即为甲砜甲苯降解酶粗提液；0.5mL粗酶液，加入4mL0.1mol/LpH5磷酸缓冲液，加入0.5mL0.5mmol/L甲砜甲苯以启动反应，28℃下保温反应5min，加入2mL三氯醋酸终止反应；用HPLC测定甲砜甲苯的含量变化；酶的活力单位定义为每分钟催化1μmol甲砜甲苯降解的酶液体积数为1个酶活单位。

3.一种棘孢木霉处理工业废水的方法，其特征在于所述的方法为：在工业废水中棘孢木霉的添加量为废水量的0.1%-5%（W/V)；所述的工业废水调节pH为3.0-6.0，控制处理温度为20-50℃，处理时间为2-10h，通过检测废水中甲砜甲苯的含量确定处理时间。