CN105392886B - 用于抑制切昆贡亚病毒的RNAi剂 - Google Patents

用于抑制切昆贡亚病毒的RNAi剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于抑制切昆贡亚病毒的RNAi剂。本发明提供特别是通过靶向切昆贡亚病毒的E2基因和nsP1基因或二者来抑制切昆贡亚病毒的RNAi剂；RNAi剂包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的整个核苷酸序列或其组合；或包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示的15个或更多连续的核苷酸或其组合及添加来自E2和nsP1靶基因的连续的区的核苷酸。本发明还提供用于减少切昆贡亚病毒的E2蛋白和nsP1蛋白水平和抑制切昆贡亚病毒复制的RNAi组合物。RNAi剂的组合提供用于治疗切昆贡亚病毒感染的优良的治疗组合物。

Description

用于抑制切昆贡亚病毒的RNAi剂
【技术领域】
本发明涉及RNA干涉(RNAi)剂和其用于在哺乳动物中抑制切昆贡亚病毒的用途。本发明还涉及用于控制切昆贡亚病毒感染的基于RNAi的治疗性策略。
【背景技术】
甲病毒含有大致11.8kb的线性，正义，单链RNA基因组。它们的RNA基因组由封头的5’非-编码区(NCR)和3’多聚腺苷酸化的NCR组成。病毒复制需要非-结构蛋白即nsP1，nsP2，nsP3和nsP4，然而结构蛋白即E1，E2，E3和6K形成壳体和包膜的部分。鉴于切昆贡亚病毒基因组结构与其他甲病毒基因组结构的相似性，预期切昆贡亚病毒编码病毒粒子表面上的刺突，其各由3个E1-E2异源二聚体形成；其中E1糖蛋白介导融合，和E2糖蛋白与宿主受体相互作用。这些结构和非-结构蛋白对于甲病毒进入宿主细胞和甲病毒在宿主细胞中倍增关键，由此代表抗病毒治疗的合理的靶。
RNA干涉(RNAi)是真核生物(Eukaryotes)中序列特异性转录后基因剪切(PTGS)的过程。在RNAi中，长的dsRNA和miRNA前体被RNA酶-III-样酶Dicer加工成小干扰RNA(siRNA)/微RNA双联体。由此形成的siRNA/miRNA双联体然后与细胞中的其他组分结合而形成被称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的核酸-蛋白复合物。活化的RISC由碱基配对靶向同源mRNA，导致mRNA的切割和降解，抑制细胞-特异性基因表达。在真核生物中，RNAi不仅调控基因表达，而且发挥针对侵入物包括病毒如脊髓灰质炎病毒，HIV，肝炎，切昆贡亚等的细胞防御机理的作用。近年来，由RNAi的特异性基因抑制被证明是针对病毒感染的潜在治疗策略。例如，已为几种RNA病毒包括几种重要人病原体诸如HIV，肝炎，流感病毒等报道由直接向细胞导入RNAi剂的病毒复制和基因表达的抑制。也已显示，甲病毒诸如Selmiki森林病毒，委内瑞拉马科动物脑炎易受RNAi作用。
切昆贡亚病毒是属于披膜病毒科(Togaviridae)的蚊传播的甲病毒。切昆贡亚病毒负责由高发热，关节痛，肌痛，头痛，疹等表征的急性感染。尽管巨大医疗重要性，尚无有效疫苗或特定治疗可利用。
[Dash等人'RNA interference mediated inhibition of Chikungunya virusreplication in mammalian cells'；Biochemical and Biophysical ResearchCommunications；2008年9月]展示了外源siRNA的导入可体外抑制切昆贡亚病毒的复制。但是，此研究的成功有限，由于针对切昆贡亚病毒的ns3和E1基因使用的siRNA显示感染后48h减少复制65％，及未体内评价。而且，[Lam等人'Expression of Plasmid-Based shRNAagainst the E1and nsP1Genes Effectively Silenced Chikungunya virusreplication'；PLOS ONE；2012年10月]展示了针对切昆贡亚病毒感染，使用shRNA靶向E1和nsP1基因的有效体外和体内抗病毒策略。
这些结果指示使用针对甲病毒的结构和非结构蛋白的RNAi的新策略的潜在用途。因此，E2和nsP1基因在切昆贡亚病毒株中高度保守，及对于进入宿主细胞和在宿主细胞中倍增重要，代表抗病毒治疗即抑制切昆贡亚病毒的合理的靶。
【发明囝的】
本发明因此旨在开发用于体外和/或体内抑制切昆贡亚病毒的RNAi剂。
本发明还旨在开发用于抑制切昆贡亚病毒的E2基因和nsP1基因的RNAi剂。
本发明的另一目的是开发用于抑制切昆贡亚病毒的E2和nsP1基因，导致切昆贡亚病毒的病毒蛋白，病毒mRNA或病毒滴度的水平降低的RNAi剂。
本发明的仍另一目的是开发用于制备用于抑制切昆贡亚病毒的E2基因和nsP1基因的组合物的RNAi剂。
本发明的仍另一目的是开发用于在使用RNAi抑制切昆贡亚病毒的方法中使用的RNAi剂。
【发明概述】
根据本发明，提供靶向切昆贡亚病毒的结构和非-结构蛋白的用于抑制所述蛋白的新siRNA。本发明涉及siRNA在切昆贡亚病毒的序列特异性基因的沉默，由此辅助用于控制切昆贡亚病毒感染和传播的新治疗性策略的设计的潜在用途。更具体而言，发明涉及个别再次靶向E2和nsP1基因及组合的siRNA在体外和体内抑制切昆贡亚病毒复制中有效使用。
【附图说明】
【图1】切昆贡亚病毒基因组中8个siRNA靶序列的位点的示意表示。
【图2】不同siRNA对切昆贡亚病毒产生的效应。
【图3】siRNA浓度的优化：
(A)不同siRNA在体外减少切昆贡亚病毒复制中的效率。
(B)siRNA对登革热病毒-2生长的效应。
(C)siRNA处理后的细胞活力(MTT测定)。
【图4】针对切昆贡亚病毒E2和nsP1的siRNA的评估：
(A)使用实时PCR的细胞内和细胞外切昆贡亚病毒RNA拷贝的定量分析。
(B)使用免疫-荧光显微镜检在Vero E6细胞中检测切昆贡亚病毒。
【图5】在用切昆贡亚病毒感染的瑞士白化和C57BL/6小鼠中，在注射siRNA NIVsi-1和NIVsi-5之后，每ml血清中切昆贡亚病毒拷贝的剂量依赖性减少：将瑞士白化和C57BL/6小鼠用切昆贡亚病毒静脉内感染(1×106PFU切昆贡亚病毒；100μl的107pfu/ml)。在感染后72h之后，给瑞士白化小鼠静脉内接种(A)ncsiRNA(针对钱迪普拉病毒的siRNA)，250μg，500μg和1mg/kg体重NIVsi-1siRNA(n＝3，在各治疗和时间点)，(B)ncsiRNA，250μg，500μg和1mg/kg体重NIVsi-5siRNA(n＝3，在各治疗和时间点)。在感染后72h之后，给C57BL/6小鼠静脉内接种(C)ncsiRNA，250μg，500μg干旱1mg/kg体重NIVsi-1siRNA(n＝3，在各治疗和时间点)，(D)ncsiRNA，250μg，500μg和1mg/kg体重NIVsi-5siRNA(n＝3，在各治疗和时间点)。在siRNA注射之后指示的时间，自眼收集血，从血清分离RNA。通过使用实时RT-PCR定量切昆贡亚病毒E3RNA拷贝。值以log10RNA拷贝/ml血清表示。
【图6】在感染切昆贡亚病毒的瑞士白化小鼠中在注射siRNA NIVsi-1和NIVsi-5之后切昆贡亚病毒拷贝/ml血清的减少：
(A)ncsiRNA 1mg/kg体重，
(B)1mg/kg体重NIVsi-1(n＝3)，
(C)1mg/kg体重NIVsi-5(n＝3)，及
(D)NIVsi-1和NIVsi-5的组合(n＝3)各1mg/kg体重。
【图7】在用切昆贡亚病毒感染的C57BU6小鼠中，在注射siRNA NIVsi-1和NIVsi-5之后每ml血清切昆贡亚病毒拷贝的减少；将C57BL/6小鼠(n＝15)用切昆贡亚病毒静脉内感染(1×106PFU切昆贡亚病毒；100μl的107pfu/ml)，和在血清和肌肉组织中检查病毒RNA拷贝。在感染后72h之后，给小鼠静脉内接种1mg/kg体重ncsiRNA(图7A,7B)，1mg/kg体重NIVsi-1(n＝15)(图7C和7D)，1mg/kg体重NIVsi-5(n＝15)(图7E和7F)和各1mg/kg体重的NIVsi-1和NIVsi-5的组合(n＝15)(图7G和7H)，和在注射之后指示的时间在血清和肌肉组织中检查病毒RNA拷贝。通过使用实时RT-PCR定量切昆贡亚病毒E3RNA。值以log10RNA拷贝/ml血清和Log10RNA拷贝/mg组织给出。显著Dunnett氏测试：*p<0.05；**p<0.01。
【图8】在切昆贡亚感染和siRNA治疗之后使用免疫荧光测定小鼠肌肉组织中切昆贡亚的检测；将C57BL/6小鼠用切昆贡亚病毒静脉内感染(l×106PFU切昆贡亚病毒：100μl的107pfu/ml)。PBS，ncsiRNA，E2siRNA和ns1siRNA注射的小鼠在第4和第7PID显示切昆贡亚抗原的缺失(A,B,C,D,E和F)。切昆贡亚病毒感染的肌肉显示切昆贡亚抗原的存在(G和H)，ncsiRNA治疗的切昆贡亚病毒感染的肌肉显示切昆贡亚抗原的存在(I和J)，然而siRNA治疗的切昆贡亚病毒感染的小鼠肌肉组织显示切昆贡亚抗原的微弱染色(K,L,M,N,O和P)(放大率×200)。
【图9】在切昆贡亚感染和siRNA治疗之后小鼠肌肉组织中的组织病理学变化；将C57BL/6小鼠用切昆贡亚病毒静脉内感染(1×106PFU切昆贡亚病毒；100μl的107pfu/ml)。筛选苏木素/伊红-染色的组织切片，以研究siRNA治疗的病理学效应。PBS注射的小鼠显示正常细胞组织(A和B)。E2siRNA治疗的小鼠(C和D)和nsP1siRNA治疗的小鼠(E和F)中观察到无显著细胞变化。切昆贡亚病毒感染的肌肉显示显著的单核细胞/巨噬细胞浸润，坏死和水肿(G和H)，ncsiRNA治疗的切昆贡亚病毒感染的肌肉显示显著的单核细胞/巨噬细胞浸润，坏死和水肿(I和J)，然而siRNA治疗的切昆贡亚病毒感染的小鼠肌肉组织显示在治疗后再生(K,L,M,N,O和P)(放大率×400)。
【发明详述】
由此，根据本发明，提供用于在哺乳动物中抑制切昆贡亚病毒的RNAi剂。本文所用的"RNA剂"是未修饰的RNA，修饰的RNA或核苷替代品，全部这些在本文所述或在RNA合成领域熟知。尽管描述了多种修饰的RNA和核苷替代品，优选的例包括相比未修饰的RNA对核酸酶降解具有更大抗性的那些。
本文所用的"RNAi剂"("RNA干扰剂"的缩写)是可下调靶基因，例如，切昆贡亚病毒基因的表达的RNA剂。尽管不受理论束缚，RNAi剂可由1个或更多许多机理发挥作用，包括靶mRNA的转录后切割，有时在本领域称为RNAi，或转录后或翻译前机理。RNAi剂可为双链(ds)RNAi剂。本文所述的RNAi可为微RNA(miRNA)，短发夹RNA(shRNA)，或小干扰RNA(siRNA)。
本文所用的"受试者"是动物，更优选哺乳动物，其经历由切昆贡亚病毒感染介导的病症的治疗。受试者可为任何哺乳动物例如灵长类动物，猴，小鼠，人等。
本文所用的"细胞或细胞系"是可用切昆贡亚病毒感染的哺乳动物细胞系。细胞系的例包括Vero E6细胞系。
本文所用的"治疗"指称任何由病毒感染介导的生物学或病理学状况的改善或存在的病毒基因产物减少。
本文所用的MTT测定是用于测量还原四唑染料，MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物,黄四唑)的细胞酶的活性的比色测定。四唑染料测定用于测量潜在药剂和毒性物质的细胞毒性(活细胞的损失)或细胞生长抑制性活性(自增殖切换为静止状态)。
本文所用的噬斑测定是用于关于感染性剂量测定病毒浓度的标准方法。病毒噬斑测定法测定病毒样品中噬斑形成单位(pfu)的数，其是病毒量的1个量度。此测定基于在平皿或多-孔板中进行的微生物方法。
本文所用的免疫荧光(IFA)是用于光学显微镜的技术，荧光显微镜主要在微生物样品上使用。此技术使用抗体对它们的抗原的特异性而使荧光染料靶向细胞内的特定生物分子靶，由此允许通过样品的靶分子的分布的可视化。IFA是免疫染色的广泛使用的例，及是免疫组织化学的特定例，其利用荧光团可视化抗体的位置。IFA可在组织切片，培养的细胞系，或个体细胞上使用，及可用于分析蛋白，聚糖和小生物学和非-生物学分子的分布。
【RNAi剂的设计和选择】
本发明基于施用RNAi剂后体外以及体内切昆贡亚病毒基因的靶向的基因沉默的展示，导致切昆贡亚病毒的减少的滴度和切昆贡亚病毒感染的治疗。
根据描述的实施方式，全部切昆贡亚病毒全基因型序列自GenBank NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索，用于RNAi剂的设计。需要的序列信息自NCBI检索。全部序列首先通过使用MUSCLE软件比对，和衍生共有序列，其还用于设计RNAi剂。RNAi剂即siRNA通过使用HP Onguard siRNA设计来设计。合成RNAi剂即siRNA(Qiagen,德国)，及使用非-冗余序列数据库和同源性分析工具检查与基因组的全部其他序列的同源性。在本文所述的全部RNAi实验中，将与已知道的哺乳动物基因无显著同源性的RNAi剂或siRNA即阴性对照siRNA(ncsiRNA)用作非沉默对照。
在一实施方式中，为抑制切昆贡亚病毒的E2基因，根据以上描述的过程设计及合成RNAi剂[表1，图1，SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4]。
在其他实施方式中，为抑制切昆贡亚病毒的nsP1基因，根据以上描述的过程设计及合成RNAi剂[表1，图1，SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8]。
基于这些结果，本发明特别提供可用于治疗切昆贡亚病毒感染的以分离的形式或作为以下描述的药物组合物的RNAi剂。该剂会包括正义链，其具有互补于切昆贡亚病毒基因的至少15个或更多连续的核苷酸序列，和反义链，其具有互补于正义链的至少15个或更多连续的核苷酸。特别有用的是由来自表1中提供的切昆贡亚病毒的E2和nsP1基因的部分核苷酸序列组成，基本上由其组成或包含其的RNAi剂。
本发明的RNAi剂基于及包含来自表1中显示的RNAi剂之一的至少15个或更多连续的核苷酸。在该剂中，基本上由表中提供的整个序列组成或包含表中提供的整个序列，或可包含表1中提供的15个或更多连续的核苷酸及来自靶基因的连续的区的另外的核苷酸。
RNAi剂可基于序列信息及期望的特征和表1中提供的信息合理地设计。RNAi剂可根据表中提供的剂的序列以及考虑到靶基因的整个编码序列设计。
因此，本发明提供RNAi剂，其包含正义链和反义链，各包含与，如上定义，来自切昆贡亚病毒的部分基因，特别是切昆贡亚病毒的E2或nsP1基因基本上同一的至少15，16，17，18，19，20，21，22或23个核苷酸的序列。例示的RNAi剂包括包含来自表1中提供的剂之一的15个或更多连续的核苷酸的那些。RNAi剂的双链部分可等于或至少15～23个核苷酸bp长。
表1中提供的剂是21个核苷酸长。RNAi剂含有19个核苷酸双链区，在各3’区有2个核苷酸悬伸。这些剂可如本文所述修饰，以获得包含至少部分这些序列(15个或更多连续的核苷酸)及或对寡核苷酸碱基或连接的修饰的相当的剂。
通常，本发明的RNAi剂包括与病毒基因例如切昆贡亚病毒的E2或nsP1基因足够互补的区，及具有足够的核苷酸长度，该RNAi剂，或其片段，可介导特定病毒基因的下调。本发明的RNAi剂的反义链优选与病毒基因(在本文是切昆贡亚病毒的E2和nsP1蛋白)的mRNA序列完全互补。但是，RNAi剂和靶之间可不完美互补，但必需足够对应致使RNAi剂或其切割产物，以例如由切昆贡亚病毒mRNA的RNAi切割指导序列特定沉默。
因此，本发明的RNAi剂包括剂，其包含正义链和反义链，各包含与如下定义病毒基因，特别是切昆贡亚病毒的E2和nsP1基因，诸如表1中提供的那些的序列之一基本上同一的至少15，16，17，18或19个核苷酸的序列，除了每链分别不多于1，2或3个核苷酸，已被其他核苷酸取代(例如腺苷被尿嘧啶取代)，而基本上取代干扰培养的哺乳动物细胞中切昆贡亚病毒基因表达的能力，如本文定义之外。这些剂因此可随与切昆贡亚病毒的靶向的mRNA序列之一同一的15个或更多核苷酸具有1，2或3个错配的核苷酸。
特别在反义链中与靶向病毒mRNA序列错配，通常在末端区和如果存在优选在末端区，更优选在5’及或3’末端的6，5，4或3个核苷酸之内，最优选在正义链的5’末端或反义链的3’端的6，5，4或3个核苷酸之内耐受。正义链仅需与反义链足够互补，以维持分子的总体双链表征。siRNA剂可在RNAi剂的1端或两端具有1～4个核苷酸长的单链悬伸，优选3’悬伸。这些悬伸在RNAi剂的稳定性中重要，和其二级结构如此在本发明中根据序列dA或dT用于悬伸区。
优选的是，选择正义链和反义链，使RNAi剂在分子的1端或两端包括单链或未配对的区，诸如表1中例示的那些。由此，RNAi剂含有正义和反义链，优选配对而含有悬伸，例如2～3个核苷酸的5'或3'悬伸，优选3’悬伸。
双联区的优选的长度在15至30之间，更优选18，19，20，21或22个核苷酸长，最优选21个核苷酸长。提供需要的双链区，及优选3’悬伸的发夹和其他RNA分子也在本发明的范围之内。
表1：为切昆贡亚病毒基因设计的siRNA的核苷酸序列
【包含RNAi剂的组合物】
本文所述的RNAi剂，可为向受试者施用，优选向哺乳动物经肠胃外或任何其他适合的途径施用而配制。递送剂可根据RNAi剂的施用途径定制。
在一实施方式中，将RNAi剂即NIVsi-1和NIVsi-5个别及以组合与Hiperfect转染试剂混合而形式组合物，其用于抑制哺乳动物模型中的切昆贡亚病毒。
配制的RNAi剂可与任何其他适合的递送剂组合施用，例如，递送剂可为治疗剂或稳定化RNAi剂的任何其他剂，例如，与RNAi剂复合而形成iRNP的蛋白。RNAi剂可通过将其与无菌水混合而配制成液体组合物。递送剂可为适合于在人中施用的药学可接受的载体和赋形剂。RNAi递送剂也可为本领域知道的任何适合的转染剂，例如可商购的Hiperfect转染试剂盒。
RNAi剂制剂可含有1种或多于1种靶向病毒的相同的基因或不同基因的不同靶位点的RNAi剂。不同RNAi剂也可靶向1种或更多病毒的不同基因。
【RNAi剂的评估和优化】
可就其下调靶基因表达的能力评定RNAi剂的有效性。评估可通过使RNAi剂接触已用或会用目标病毒例如含有靶基因的病毒感染的细胞(例如，哺乳动物细胞)来进行。可在RNA，蛋白或病毒滴度水平使RNAi剂与细胞接触之前及之后之间，关于靶基因表达的水平，进行比较。靶向病毒RNA或病毒蛋白的水平可由本领域知道的任何知道的期望的方法评定。例如，靶mRNA水平可通过RNA印迹分析，RT-PCR等测定。蛋白印迹分析，IFA等可用于测定蛋白水平，和病毒滴度可由噬斑形成测定检测。
如描述于一实施方式，就它们在哺乳动物细胞系中抑制切昆贡亚病毒产生的能力测试以上设计的RNAi剂。为了研究以上设计的RNAi剂的效应，Vero E6细胞系接种于6孔板，及用切昆贡亚病毒感染。在感染后2小时之后，将这些细胞用不同siRNA转染。在病毒感染之后24小时分离总RNA。由RT-PCR测量E3RNA拷贝而检测切昆贡亚病毒产生。相比其他RNAi剂，RNAi剂NIVsi-1和NIVsi-5显示实质上更强切昆贡亚病毒的抑制，分别阻遏切昆贡亚病毒5log10(p<0.001)及～2.5log10(p<0.05)RNA拷贝[图2]。
RNAi剂浓度可通过测试在感染的细胞系中，在不同浓度它们的效应来优化。在一实施方式中，将切昆贡亚病毒感染的Vero E6细胞系用NIVsi-1和NIVsi-5RNAi剂个别及以组合，以不同浓度即10，50，100，150，200pmol转染。在感染之后24小时分离总RNA，和通过由RT-PCR测量E3RNA拷贝来检测切昆贡亚病毒。以10pmol浓度的RNAi剂NIVsi-1和NIVsi-5治疗未能减小切昆贡亚病毒滴度，然而全部其他浓度显示病毒滴度的显著减小[图3A]。由NIVsi-1和NIVsi-5的切昆贡亚病毒拷贝的减少以100+pmol浓度达到平台期区[图3A]。也由MTT检定测量由于向RNAi剂添加Hiperfect转染试剂所致的细胞活力[图3B]。
【测试(体外和体内)】
鉴定的RNAi剂可由体外和体内方法，就通过使RNAi剂接触期望的细胞或动物抑制靶向的基因来进行测试。
例如，体外测试通常在用期望的病毒感染的细胞或细胞系(例如vero E6细胞系)上，通过施用靶向病毒基因的RNAi剂来实施。
在一实施方式中，使用的细胞系是哺乳动物细胞系即vero E6细胞系。使用Amaxanuleofector装置实施以100pmol浓度的RNAi剂即NIVsi-1和NIVsi-5(个别及以组合)的评估。在24，36和48小时，使用MTT测定评价结果。
体内测试可通过用靶向期望的病毒基因的RNAi剂施用病毒感染的动物来进行。RNAi剂基于稳定性，生物分布和其抑制病毒基因例如切昆贡亚病毒基因或减小病毒滴度的能力评价。向感染的动物的RNAi剂可由任何本领域知道的药物递送途径施用。RNAi剂可直接施用到靶组织，诸如通过注射或由任何其他适合的途径。RNAi剂可由药物施用的系统性或局部途径，作为治疗病毒感染的手段施用于动物。
RNAi剂的评估可通过测定在所测试的细胞，细胞系或动物中下调的病毒基因表达来进行。病毒基因表达水平可，例如由定量RT-PCR，本领域知道的IFA测定或任何其他组织病理学测试测量。噬斑测定可用于测定病毒滴度。
在其他实施方式中，使用的动物模型是哺乳动物即瑞士白化小鼠和C57BL/6小鼠。对切昆贡亚病毒感染的瑞士白化和C57BL/6小鼠，通过注射个别以及以组合含有NIVsi-1和NIVsi-5的组合物评价RNAi剂。结果(图5A,B,C,D)显示切昆贡亚病毒拷贝的显著减少。
在特定环境下，RNAi剂或siRNA可诱导干扰素(IFN)通路及引发发炎。已推荐规范siRNA双联体是哺乳动物先天性免疫系统的有力的活化物，辅助细胞摄取的递送媒质中的合成siRNA可在哺乳动物中系统性施用之后诱导高水平的炎性细胞因子和干扰素。为了区分由siRNA提供的保护模式，测定不同小鼠组的肌肉组织中干扰素α，β和γ干扰素基因的表达水平(表3)。相比病毒感染的小鼠，RNAi剂单独未诱导干扰素基因的显著诱导。这些观察揭示，切昆贡亚病毒的抑制主要因为RNAi剂的特征性活性。
一般而言，实施向受试者递送RNAi剂，以达到RNAi剂向感染位点的递送。在可优选的一实施方式中，递送手段是通过向局部组织注射来施用。
【剂量】
RNAi剂可以约1mg/kg的体重或少于200pmol的剂量范围施用。剂量范围可为对于抑制靶向的病毒mRNA，病毒蛋白或病毒滴度有效的量。剂量范围可根据标准流程标准化，以由任何本领域技术人员研究靶分子的效应。剂量可在0.1mg～2mg/kg体重的范围或可在10～200pmol的范围。单位剂量，例如可通过注射或由与靶向的分子直接接触来施用。一例中的剂量范围是约1mg/kg动物体重。在另一例中，剂量范围是约
在一实施方式中，使用含有RNAi剂即SEQ ID NO:1的组合物实施E2基因表达的抑制，所述组合物随Hiperfect转染试剂被转染/注射进切昆贡亚病毒感染的哺乳动物细胞系(Vero E6细胞系)或哺乳动物(例：小鼠)而用于抑制切昆贡亚病毒的E2基因。
在另一实施方式中，使用含有RNAi剂即SEQ ID NO:5的组合物实施nsP1基因表达的抑制，所述组合物随Hiperfect转染试剂被转染/注射进切昆贡亚病毒感染的哺乳动物细胞系(Vero E6细胞系)或哺乳动物(例：小鼠)而用于抑制切昆贡亚病毒的nsP1基因。
在仍另一实施方式中，使用含有RNAi剂即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的组合物实施E2和nsP1基因表达的抑制或切昆贡亚病毒病毒滴度的减少，所述组合物随Hiperfect转染试剂被转染/注射进切昆贡亚病毒感染的哺乳动物细胞系(Vero E6细胞系)或哺乳动物(例：小鼠)而用于抑制切昆贡亚病毒的E2基因或nsP1基因或病毒滴度。也描述使用以上RNAi剂抑制E2和nsP1基因表达的方法。抑制方法包括哺乳动物细胞或哺乳动物中病毒蛋白，病毒mRNA或病毒滴度的减少。
本发明还由下列实施例例证，其不应被解释为进一步限制。
【实施例】
【实施例1：siRNA的设计】
自GenBank NCBI数据库检索全部切昆贡亚病毒全基因型序列。通过使用MUSCLE软件比对全部序列。将自这些序列获得的共有序列用于siRNA的设计。通过使用HP OnGuardsiRNA设计来设计全部siRNA。设计及合成各靶向E2和nsP1基因的4种siRNA(Qiagen,德国)。然后使用非-冗余序列数据库和同源性分析工具检查siRNA与基因组的全部其他序列的同源性。
根据以上方法设计的靶向E2和切昆贡亚病毒的nsP1基因的siRNA在表1中随其他相关的数据给出。
【实施例2：体外评估】
【体外测定和体外感染】
为比较设计的siRNA的抗病毒活性的，将Vero E6细胞用切昆贡亚病毒(MOI 5；株号634029,非洲基因型)转染。感染后2小时，将细胞用靶向E2基因的siRNA(即NIVsi-1，NIVsi-2，NIVsi-3，NIVsi-4)和nsP1基因(即NIVsi-5，NIVsi-6，NIVsi-7，NIVsi-8)个别和对照，使用Amaxa Nucleofector装置II(Amaxa Biosystems)转染。在电穿孔之后，将Vero E6细胞于37℃温育，直到就切昆贡亚病毒复制的抑制进行分析。在感染后24，36和48小时收获细胞，和通过使用定量RT-PCR(qRT-PCR)，噬斑测定和IF A测定测定切昆贡亚病毒复制的抑制。
【siRNA浓度的优化】
在用切昆贡亚病毒感染后2小时，将Vero E6细胞用NIVsi-1，NIVsi-5个别以及二者组合(即NIVsi-1和NIVsi-5)，以不同浓度(即10，50，100，150和200pmol)转染。在转染后24h之后，从组织培养上清液和细胞分离总RNA。实施一步qRT-PCR，以评价siRNA的抑制性效应。
【MTT测定】
用Vero E6细胞，使用体外毒理学测定试剂盒(TOX-1,Sigma)，基于甲基噻唑基四唑(MTT)的活性减小，实施细胞毒性测试。在转染之前24小时，将5×103细胞接种于96-孔板。通过使用Hiperfect转染试剂，根据生产商的使用说明实施转染。细胞分为4组：
(1)对照组(No Hiperfect和siRNA)；
(2)Hiperfect组；
(3)nsP1siRNA组；以及
(4)E2siRNA组。
次日进行siRNA的转染，如在体外测定和体外感染部分早先描述。在转染后24和48小时，用非-转染的或siRNA转染的(100pmol)细胞进行实验。在siRNA转染之后24小时，使适当的组的细胞经历MTT测定(TOX-1,Sigma)。将通过向孔中添加MTT增溶溶液而溶解的由活细胞产生的蓝甲在ELISA读取器(Biorad,USA)上，在570nm处，在减去在650nm处的背景读数之后定量。数据表示为siRNA处理的及未处理的对照孔中活细胞数的百分率。
【定量RT-PCR】
通过分别使用QIAmp病毒RNA小型试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)和Trizol(Invitrogen USA)法，根据生产商的使用说明自Vero E6细胞，血清和小鼠组织提取RNA。在25μl的含有5μl RNA，12.5μl TaqMan一步RT-PCR 2×Master Mix，1μl 40×(RT+RNAasin)(Applied Biosystems)各1μl正义(μΜ)，1μl反义(μΜ)引物和1μl TaqMan探针的反应混合物中实施一步RT-PCR。引物选自E3结构蛋白区。以96-孔形式，使用7300实时PCR系统和SDS软件V 1.0.2(Applied Biosystems)实施实时一步RT-PCR。扩增程序包括：于48℃反转录30min，于95℃初始变性10min，及变性(95℃经15s)及退火及延伸(60℃经1min)的50个循环。在扩增之后，获取熔解曲线，以检查PCR产物的特异性。使用RNA合成转录物的系列稀释将信号标准化到标准曲线。根据ΔΔCt分析将标准化的数据用于测量感染的样品中RNA拷贝的数。病毒滴度表示为每ml血清或mg组织的RNA拷贝。实时PCR的检测限是每反应10拷贝。
【噬斑测定】
我们向单层Vero E6细胞添加了感染的及siRNA转染的细胞的组织培养上清液的十倍系列稀释，和将板于37℃温育1h。在温育之后，将培养基用覆盖培养基(2×MEM，2％CMC和10％FBS(Gibco,BRL))取代。将板于37℃温育72h；将细胞用酰胺黑染色，和对噬斑进行计数。
【IFA测定】
如由Sudeep等人在"In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal"(2009,9月)出版的'Establishment and characterization of a new Aedes aegypti(L.)(Diptera:Culicidae)cell line with special emphasis on virussusceptibility'中描述实施IFA测定，将Vero E6细胞用丙酮固定，及在磷酸盐缓冲液(pH7.4)中用2％BSA阻断1h。将细胞与(1:100)小鼠抗切昆贡亚病毒抗体温育，之后与缀合了FITC的兔抗-小鼠(1:500)抗体(Invitrogen,USA)温育。将细胞用Evan氏蓝复染1分钟。将载玻片通过使用荧光显微镜(Nikon遮蔽T2000S和Q捕获pro 5.0软件)可视化。类似地处理阴性对照。
【统计学分析】
全部数据表示为平均值±标准偏差。为正态性的改善，将病毒载量对数-转化。通过Dunnet氏测试，使用ANOVA测定统计学意义。p<0.05的值被认为统计学地显著。通过使用单因素ANOVA比较倍数变化，为结果确认，组也由非参数Kruskal-Wallis测试比较。
【结果】
4种siRNA各设计为具有与E2和ns1RNA互补的反义链。序列和对应基因组位置分别显示于表1和图1。
【不同siRNA在体外减少切昆贡亚病毒复制中的效率】
为了初始比较不同siRNA的抗病毒活性，将Vero E6细胞用切昆贡亚病毒感染，及在感染后2h用不同siRNA(NlVsi-1～NIVsi-8)转染。NIVsi-1和NIVsi-5是最有效的siRNA，阻遏切昆贡亚病毒5log10(p<0.001)及～2.5log10(p<0.05)(图2)。由NIVsi-1和NIVsi-5的切昆贡亚病毒拷贝的减少起始于25pmol的siRNA浓度，及达到100pmol的平台期(图3A)。
【siRNA处理(MTT检定)后的细胞活力】
相比未处理的细胞，在转染后24小时，E2siRNA(97.5±16.3)，nsP1siRNA(92.83±13.49)和Hiperfect试剂(95.88±11.47)显示体外百分率活细胞数的小减少(图3B)。在48小时类似地，E2siRNA(76.3±9.24)，nsP1siRNA(75.79±16.69)和Hiperfect试剂(83.44±23.38)的转染对于细胞是欠毒性的(图3B)。
【NIVsi-1和NIVsi-5siRNA对感染切昆贡亚病毒产生的效应】
图4A描绘在不同时间点NIVsi-1，NIVsi-5和Comb-siRNA(即Chik-1和NIVsi-5)对切昆贡亚病毒产生的效应。在感染后24小时，NIVsi-1，NIVsi-5和Comb-siRNA的治疗分别导致5log10，3log10和5log10切昆贡亚病毒RNA拷贝的减少(图4A)。在感染后36小时，在组织培养上清液中观察到，NIVsi-1，NIVsi-5和Comb-siRNA的治疗显示切昆贡亚病毒RNA拷贝3log10，2log10和3log10减少，然而在用Comb-siRNA的细胞中记录到2log10减少(图4A)。在感染后48小时，在细胞和上清液中注意到切昆贡亚病毒RNA拷贝无显著减少。
总之，相比针对ns1区的siRNA(即NIVsi-5)，针对E2基因的siRNA(即NIVsi-1)在抑制切昆贡亚病毒产生中更有效。我们还评价了用Comb-siRNA治疗的加和性优势。在上清液中，当与病毒感染的对照比较时，在24，36和48小时分别观察到切昆贡亚病毒拷贝的5log10(p<0.001)，2.5log10(p<0.05)和2.5log10(ANOVA Dunnet氏测试p<0.05)减少。在细胞中，在24，36和48小时分别获得4.5log10(p<0.001)，3log10(p<0.05)和2log10(p<0.05)减少。重要的是，相比个体siRNA，Comb-siRNA可延长抑制性效应(图4A)。NIVsi-1和NIVsi-5显示序列依赖性抑制及显示Vero-E6细胞中钱迪普拉病毒复制无减少(数据未显示)。
当噬斑测定被用作切昆贡亚病毒复制的量度时，NIVsi-1siRNA在48小时感染后产生5log10的减少(表2)。NIVsi-5减少3log10，和Combo-siRNA显示病毒滴度3log10的减少。在感染后24和36小时，在处理的培养物中未观察到致细胞病变效应，然而自感染后24小时起，在未处理的对照中观察到致细胞病变效应的开始，展示siRNA的抑制性效应。与我们的实时RT-PCR结果和噬斑测定结果一致，IFA也显示在NIVsi-1和NIVsi-5siRNA治疗的细胞中病毒抗原的减少(图4B)。
表2：显示在48h在Vero E6细胞系中siRNA对切昆贡亚病毒(CHIKV)复制的抑制性效应的噬斑测定。
物质 病毒滴度(pfu/ml) 相比病毒对照的病毒抑制
未处理的 4×10<sup>7</sup> Nil
CHIKV+NIVsi-1siRNA 2×10<sup>2</sup> &gt;5log<sub>10</sub>**
CHIKV+NIVsi-5siRNA 4×10<sup>4</sup> 3log<sub>10</sub>*
CHIKV+Comb-siRNA 7.5×10<sup>4</sup> ～3log<sub>10</sub>*
CHIKV+ncsiRNA 4×10<sup>7</sup> Nil
值以平均值pfu/ml给出。
显著性ANOVA，Dunnett氏测试：*p<0.05；**p<0.01。
【实施例3：体内评估】
【使用NIVsi-1和NIVsi-5siRNA的切昆贡亚病毒的抑制】
将瑞士白化和C57BL/6小鼠(4～6周)用大致1×106PFU的切昆贡亚病毒(100μl的107pfu/ml；～4.5×108RNA拷贝/ml)静脉内感染，和每天在血和肌肉中由一步qRT-PCR检查RNA拷贝7天。将siRNA与HiPerfectTM(QIAGEN,Valencia CA)根据生产商的使用说明复合，和在感染后72h之后，一次静脉内施用～25μg/小鼠(1mg/Kg体重)。将NIVsi-1siRNA，NIVsi-5siRNA和NIVsi-1和NIVsi-5siRNA的组合(Comb-siRNA)用于不同小鼠组。在治疗后0，1，2，3和4天，自siRNA，ncsiRNA或盐水注射的小鼠组收集血(～200μl)。自血清使用qRT-PCR定量切昆贡亚病毒E3RNA。在C57BL/6小鼠中，仅选择72小时时间点用于siRNA治疗。在siRNA注射后0，1，2，3和4天自C57BL/6小鼠收获血和后肢肌肉组织。将组织解剖，称重，压碎及在液氮中使用研钵研杵浸软，及还用于RNA分离。
【定量RT-PCR】
通过分别使用QIAmp病毒RNA小型试剂盒(QIAGEN,Valencia,CA)和Trizol(Invitrogen USA)法，根据生产商的使用说明，自Vero E6细胞，血清和小鼠组织提取RNA。在25μl的含有5μl RNA，12.5μl TaqMan一步RT-PCR 2×Master Mix，1μl 40×(RT+RNAasin)(Applied Biosystems)，各1μl正义(μΜ)，1μl反义(μΜ)引物和1μl TaqMan探针的反应混合物中实施一步RT-PCR。引物选自E3结构蛋白区。以96-孔形式，使用7300实时PCR系统和SDS软件V 1.0.2(Applied Biosystems)实施实时一步RT-PCR。扩增程序包括：于48℃反转录30min，于95℃初始变性10min，及变性(95℃经15s)及退火及延伸(60℃经1min)的50个循环。在扩增之后，获取熔解曲线，以检查PCR产物的特异性。将信号使用RNA合成转录物的系列稀释标准化到标准曲线。根据ΔΔCt分析，将标准化的数据用于测量感染的样品中RNA拷贝的数。病毒滴度表示为每ml血清或mg组织的RNA拷贝。实时PCR的检测限是每反应10拷贝。
【噬斑测定】
我们向单层Vero E6细胞添加了感染的及siRNA转染的细胞的组织培养上清液的十倍系列稀释，和将板于37℃温育1h。在温育之后，将培养基用覆盖培养基(2×MEM，2％CMC和10％FBS(Gibco,BRL))取代。将板于37℃温育72h；将细胞用酰胺黑染色，和对噬斑进行计数。
【IFA测定】
如由Sudeep等人[29]描述实施IFA，将Vero E6细胞用丙酮固定，及在磷酸盐缓冲液(pH7.4)中用2％BSA阻断1h。将细胞与(1:100)小鼠抗切昆贡亚病毒抗体温育，之后与缀合了FITC的兔抗-小鼠(1:500)抗体(Invitrogen,USA)温育。将细胞用Evan氏蓝复染1分钟。将载玻片通过使用荧光显微镜(Nikon遮蔽T2000S和Q捕获pro 5.0软件)可视化。类似地处理阴性对照。
【组织病理学】
将后肢组织，不包括股骨，在4％甲醛中固定，及嵌入石蜡，和制备8μm切片。将组织用苏木素和伊红染色。在来自对照(盐水注射的,ncsiRNA)，切昆贡亚感染的(4,5,6和7天感染后)，处理组(NIVsi-1siRNA,NIVsi-5siRNA和Comb-siRNA)的后腿的肌肉组织上实施组织病理学评估。在第3PID给出siRNA治疗，和在4，5，6和7PID收获组织，及就坏死，发炎，再生，矿化，纤维化和水肿进行评价。类似地，IFA实施，以检查切昆贡亚病毒的存在。如由Sudeep等人描述实施IFA，将载玻片与(1:100)小鼠抗切昆贡亚病毒抗体温育，之后与缀合了Alexa粉546的兔抗-小鼠(1:200)抗体(InvitrogenUSA)温育。将细胞用DAPI复染10s。将载玻片通过使用荧光显微镜(Nikon遮蔽T2000S和Q捕获pro 5.0软件)可视化。类似地处理阴性对照。
【采用实时PCR的干扰素基因表达分析】
为实时反转录RT-PCR分析，将后肢肌肉组织在液氮中压碎。通过使用Trizol试剂(Invitrogen)，根据生产商的使用说明提取RNA。通过使用Quantitect SYBR Green RT PCR试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)实施一步RT-PCR。实时PCR分析使用了以下核苷酸引物：
5'-GGCCGAGGACTTTGATTGCACATT-3'、及
5'-AGGATGGCAAGGGACTTCCTGTAA-3'用于肌动蛋白β，
5'-AGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGT-3'、及
5'-TCCTCATCCCAAGCAGCAGATGAA-3'用于干扰素α(INF-α)，
5'-TGTGGCAATTGAATGGGAGGCTTG-3'、及
5'-TCTCATAGATGGTCAATGCGGCGT-3'用于干扰素β(IFN-β),及
5'-AGCGGCTGACTGAACTCAGATTGT-3'、及
5'-ACTGCTTTCTTTCAGGGACAGCCT-3'用于干扰素γ(IFN-γ)。
25μl扩增反应混合物含有500ng总RNA，0.5μΜ各引物对，0.25的反转录酶和12.5μl的2×SYBR绿qPCR超混剂(Qiagen)。
循环条件如下：50℃经30min的1个循环及95℃经15min的1个循环，之后是94℃经15s，57℃经30s，72℃经30s和68℃经15s的45个循环。通过使用Rotor-Gene 3000PCR机实施实时PCR。用Rotor-Gene实时分析软件分析数据。将各样品以一式两份分析，及标准化到肌动蛋白βmRNA。通过使用实时PCR分析研究切昆贡亚感染的组，切昆贡亚感染的小鼠的NIVsi-1，NIVsi-5和Comb-siRNA处理组，及用NIVsi-1，NIVsi-5和Comb-siRNA处理的对照小鼠中的干扰素α，β和γ基因的表达变化。将小鼠用切昆贡亚病毒模拟-感染，及在第3天用siRNA治疗，然后在第4，5，6和7天测定基因表达。为各治疗和时间点使用3只小鼠。
【统计学分析】
全部数据表示为平均值±标准偏差。为正态性的改善，将病毒载量对数-转化。通过Dunnet氏测试，使用ANOVA测定统计学意义。p<0.05的值被认为统计学地显著。通过使用单因素ANOVA比较倍数变化，为结果确认，也将组由非参数Kruskal-Wallis测试比较。
【结果】
【瑞士白化和C57BL/6小鼠允许切昆贡亚病毒感染】
用1×106PFU切昆贡亚病毒(100μl的107pfu/ml)感染成年瑞士白化和C57BL/6小鼠。由静脉内途径的切昆贡亚病毒未导致死亡率或临床症状。但是，观察到病毒复制的确定的证据。自1PID直到7PID在小鼠血清中检测到切昆贡亚病毒RNA拷贝。静脉内接种的小鼠中的病毒血症接种后(dpi)3天达到峰，具有跨7×105～5×107viral RNA拷贝/ml的病毒载量(图5)。
【siRNA抑制瑞士白化小鼠中切昆贡亚病毒复制】
为了评定是否siRNA可保护小鼠免于切昆贡亚病毒感染，在感染后72小时对切昆贡亚病毒感染的小鼠(1×106PFU切昆贡亚病毒；100μl的107pfu/ml)组施用NIVsi-1和NIVsi-5siRNA。用E2或nsP1siRNA以250μg/kg体重(～6μg/小鼠)治疗的瑞士白化小鼠显示切昆贡亚病毒的～31og10抑制，500μg/kg体重(～12μg/小鼠)显示切昆贡亚病毒的31og10抑制，然而以1mg/kg体重(～25μg/小鼠)siRNA导致切昆贡亚病毒拷贝的71og10减少(图5A&B)。在C57BL/6小鼠中获得类似结果(图5C&D)。我们因此在随后实验中施用了1mg/kg体重(～25μg/小鼠)siRNA。对于全部体内实验，Hiperfect试剂用于递送siRNA。在感染后72h施用NIVsi-1，NIVsi-5和Comb-siRNA提供血清病毒载量的显著减少，如由实时PCR评定(图6)。在siRNA注射后48h，相比0h和ncsiRNA，用NIVsi-1和NIVsi-5的减少是约2.5log10(ANOVADunnet氏测试p<0.05)，然而用Comb-siRNA观察到100％抑制(7log10)(ANOVA Dunnet氏测试p<0.01)。在病毒感染后72h，NIVsi-1，NIVsi-5和Comb-siRNA的施用显示完全抑制(71og10ANOVA Dunnet氏测试p<0.01)。
【在siRNA治疗之后C57BL/6小鼠中切昆贡亚病毒复制的抑制】
切昆贡亚病毒感染(1×106PFU切昆贡亚病毒；100μl的107pfu/ml)后72h施用的NIVsi-1，NIVsi-5和Comb-siRNA提供血清病毒载量的显著减少，如每天由实时PGR评定(图7)。在siRNA处理后24h和48h，相比ncsiRNA，对于全部siRNA记载2.5log10和3.5log10(ANOVADunnet氏测试p<0.05)减少。在治疗后72h，用siRNA NIVsi-1，及NIVsi-5的减少是约3.5log10(ANOVA Dunnet氏测试p<0.05)，而Comb-siRNA显示100％抑制(7log10,ANOVADunnet氏测试p<0.01)。重要的是，相比个体siRNA，Comb-siRNA产生延长的抑制性效应。在肌肉组织中，切昆贡亚病毒RNA感染后第3天达到峰(PID)，病毒载量跨1×104～7×105病毒RNA拷贝/mg组织(图7)。在siRNA处理后24h，相比ncsiRNA对照，用全部3种siRNA观察到切昆贡亚病毒RNA的～2.5log10减少。在72h，全部siRNA产生切昆贡亚病毒RNA的4log10减少(100％抑制,ANOVA Dunnet氏测试p<0.01)。当IFA用于评价肌肉组织中siRNA对切昆贡亚病毒复制的效应时见到类似结果，用基于实时PCR的数据确证(图8)。
【在切昆贡亚病毒感染和siRNA治疗后小鼠肌肉组织的组织病理学评估】
展示了NIVsi-1和NIVsi-5siRNA治疗显著地减少血清和肌肉组织中的切昆贡亚病毒滴度，实施组织病理学分析，以测定切昆贡亚感染的及siRNA治疗的组织中的发炎和浸润。切昆贡亚病毒感染的小鼠(1×106PFU切昆贡亚病毒；100μl的10pfu/ml)的组织病理学检查显示病理学变化，诸如扩大的坏死，发炎，显著的单核细胞/巨噬细胞浸润及水肿(图9)。该组织病理学变化通过用NIVsi-1，NIVsi-5个别或以Comb-siRNA系统性处理预防。在4PID，切昆贡亚感染的小鼠肌肉组织显示淋巴细胞和单核细胞的中等发炎，病灶水肿和病灶坏死，然而siRNA治疗的小鼠肌肉组织显示仅弱发炎。在7PID，在切昆贡亚病毒感染的及ncsiRNA治疗小鼠中观察到具有淋巴细胞和单核细胞的密发炎的扩大的肌肉坏死。另一方面，siRNA治疗保存具有再生的肌肉组织的形态学完整性(图9)。来自用盐水感染的对照小鼠的肌肉组织显示无病理学变化，诸如多态型的坏死，水肿，发炎和浸润(图9)。
【在siRNA处理后干扰素基因的表达水平】
我们测试了是否小鼠中切昆贡亚病毒复制的抑制的确是序列依赖性的，且不是因为非特异性抗病毒干扰素应答。在切昆贡亚病毒缺失下，NIVsi-1，NIVsi-5和Comb-siRNA处理未显著地诱导α，β和γ干扰素mRNA表达(表3；Kruksal Wallis p>0.05)。类似地，切昆贡亚病毒-感染的小鼠的siRNA处理未显示α，β和γ干扰素基因表达的显著升高(表3；KruksalWallis p>0.05)。这些结果提示，切昆贡亚病毒复制的siRNA介导的减少是序列特异性的，对宿主无任何有害的效应。
总之，此第1体内实验明显揭示，siRNA处理通过减少攻击-感染的动物中的临床症状而体内有效，和能显著地减少血清和肌肉中的病毒复制。
表3：在用siRNA处理之后C57BL/6小鼠中的干扰素应答
将小鼠用siRNA处理，和在注射后24h，48h，72h和96h监测到干扰素α，β和γ的基因表达变化。以2-ΔΔCT表示的结果以平均值±标准偏差报道，及通过使用Kruksal Wallis测试分析。
*p<0.05相比相应时间点的切昆贡亚感染的小鼠显著地不同的基因表达变化。
【本发明的优势】
(1)RNAi剂即NIVsi-1和NIVsi-5siRNA当个别施用时能抑制切昆贡亚病毒的E2和nsP1基因；由此在病毒接种后72h之后在病毒-感染的小鼠中抑制切昆贡亚病毒复制。
(2)Comb-siRNA(即NIVsi-1和NIVsi-5siRNA)提供优良的切昆贡亚病治疗剂。
(3)siRNA的单静脉内接种，在切昆贡亚病毒感染后72h可完全抑制切昆贡亚病毒复制，如由肌肉和血清中病毒RNA的缺失证明。

Claims (5)

1.尤其是通过靶向切昆贡亚病毒的E2基因或nsP1基因来抑制切昆贡亚病毒的RNAi剂，其包含：
(i)用于抑制切昆贡亚病毒的E2基因的正义链或反义链：
(a)SEQ ID NO:1所示的正义链，或
(b)SEQ ID NO:9所示的与所述正义链互补的反义链；或者
(ii)下列之组合：
用于抑制切昆贡亚病毒的E2基因的正义链或反义链：
(a)SEQ ID NO:1所示的正义链，或
(b)SEQ ID NO:9所示的与所述正义链互补的反义链；及
用于抑制切昆贡亚病毒的nsP1基因的正义链或反义链：
(a)SEQ ID NO:5所示的正义链，或
(b)SEQ ID NO:13所示的与所述正义链互补的反义链。
2.权利要求1的RNAi剂，其中所述剂是siRNA。
3.组合物，其包含：
(a)权利要求1的RNAi剂或权利要求1中定义的RNAi剂的组合；及
(b)药学可接受的载体。
4.单独或同时减少细胞或组织或病毒滴度中切昆贡亚病毒的E2蛋白或nsP1蛋白的水平的体外方法，包括使所述的细胞或组织接触权利要求3的RNAi组合物。
5.权利要求1的RNAi剂或权利要求1中定义的RNAi剂的组合用于制备治疗切昆贡亚病毒感染的药物的用途。
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Title
Administration of E2 and NS1 siRNAs inhibit Chikungunya virus replication in vitro and protects mice iinfected with the virus;DEEPTI等;《PLOS NEGLECTED TROPICAL DISEASES》;20130905;第7卷(第9期);摘要 *
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RNA interference mediated inhibition of Chikungunya virus replication in mammalian cells;Paban等;《Biochemical and Biophysical research communications》;20080919;摘要，表1 *

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