CN102382831B - 一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，公开了一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA及其应用。该shRNA以乙型脑炎病毒基因组中高度保守的序列作为其靶序列，所述的靶序列为：SEQ ID NO.10。该shRNA真核表达质粒是将所述的shRNA的模板与线性化的载体pGPU6/GFP/Neo连接得到分别针对乙型脑炎病毒E基因mRNA序列的shRNA真核表达质粒。本发明所提供的shRNA真核表达质粒能够在制备治疗和/或预防JEV感染的药物中应用，为治疗和预防JEV感染提供一种新的可选药物。
Description
分案说明
本案是申请号为201010507298.7，申请日为2010年10月14日，名称为一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA及其应用的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种能抑制JEV复制与感染的shRNA及其应用。
背景技术
乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种严重的人畜共患虫媒病毒性疾病。该病对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，广泛分布于亚洲，特别是远东一些国家和地区。近年来其流行分布范围不断扩大，流行频率也不断增强。
乙脑病毒属于黄病毒科黄病毒属。病毒粒子呈20面体对称，在核酸外面包有致密的脂蛋白囊膜。JEV基因组为单股正链RNA分子，本身具有传染性。其基因组编码产物为3个结构蛋白(C、prM、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。
乙脑属于自然疫源性疾病，蚊虫是该病的主要传播媒介。本病的发生与气候环境有着密切的关系，呈明显的季节性。我国一般流行高峰在7、8、9三个月。多种动物均可感染本病，感染后成为传染源。经检查发现，在流行病区，畜禽的隐性感染率均很高，特别是猪，其次是马和牛。病毒在感染动物血液内存留时间很短，主要存在于中枢神经系统及肿胀的睾丸内，但猪感染后病毒血症期维持时间长，血液中病毒滴度高，对乙脑的传播起重要作用。同时，猪是乙脑传播给人类最重要的宿主，一般情况下JEV的感染呈猪-蚊-人链状。猪感染乙脑时间的早晚和感染率的高低与人乙脑的流行密切相关。感染后，人、猴、马和驴出现明显的脑炎临诊症状，病死率较高。猪群不发生脑炎症状，怀孕母猪可表现高热、流产、死胎和木乃伊胎，死产胎儿出现脑缺损症状，公猪则出现睾丸炎，给养猪业发展带来巨大的损失。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA介导的序列特异的基因沉默现象。RNA干扰现象最初在植物和低等生物中被发现，随着研究的深入，近来在高等的真核生物中也被发现，并且证明是一种重要的进化保守现象。已证明短的双股干扰RNA(siRNA)是由dsRNA特异的核酸内切酶，Dicer酶，剪切而来。RNA诱导沉默复合物(RISC)是由siRNA和一种多酶复合物结合构成，它位于mRNA特定的部位，并且发挥核酸内切酶和外切酶的活性来作用mRNA。除了在转录水平的基因沉默(降解mRNA)，siRNA也被证明通过DNA甲基化沉默启动子而降低蛋白表达。短发卡RNA(shRNA)通常利用载体导入细胞，并且可被传递到子代细胞中去，从而使基因沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后按上述机制达到降解mRNA的目的。它最大的优点在于具有高度的有效性和特异性并且具有快速的防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显示出不可估量的价值，例如在抗艾滋病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)等病毒的研究中都发现RNAi对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的，更有效的途径。毫无疑问，随着对RNAi机制的深入了解以及技术的进一步完善，RNAi技术必将为生命科学研究和临床疾病的防治带来新的革命。
乙型脑炎的流行是世界性的公共卫生问题之一。目前对于乙脑尚无特效治疗手段，因此预防乙脑的发生尤为重要。而传统的疫苗生产不能满足人类日益发展的需要，因而，科研人员不断地寻求新的治疗方式。RNAi这项新兴技术即是其中颇有潜力的新途径。目前，国内外运用RNAi治疗乙脑还处在科研院所的理论研究中，并未大规模地投入到临床治疗中，但其研究结果显示出卓越的抑制病毒复制与感染的能力，在临床治疗中有着极大的潜力与良好的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种能快速、特异和显著抑制JEV在动物细胞与个体中复制和感染的shRNA及其应用。
本发明的另一目的是提供含有该shRNA的真核表达质粒及其应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA，以乙型脑炎病毒基因组中高度保守的序列SEQ ID NO.10作为其靶序列，该shRNA的正义链模板序列为SEQ ID NO.3，反义链模板序列为SEQ ID NO.4。
一种含所述的shRNA的shRNA真核表达质粒，该shRNA真核表达质粒是将所述的shRNA的模板与线性化的载体pGPU6/GFP/Neo连接得到针对乙型脑炎病毒E基因mRNA序列的shRNA真核表达质粒。
所述的shRNA真核表达质粒在制备抑制乙型脑炎病毒复制和/或感染的药物中的应用。
本发明的有益效果：
先向动物细胞中转染本发明的shRNA真核表达质粒，再用病毒攻击细胞进行一系列试验(图4～图8)，结果表明本发明的shRNA可有效地抑制JEV在细胞上的复制，对细胞有良好的保护作用。
先将本发明的shRNA真核表达质粒注入动物体内，再用不同剂量的病毒攻击动物机体(图10A、B)；或者将本发明的shRNA真核表达质粒与不同剂量的病毒同时注入动物体内(图10C、D)，结果表明本发明的shRNA均能有效地降低动物的发病率和死亡率，动物存活率达50％以上，显著高于无干扰作用组。可见，本发明的shRNA真核表达质粒在动物个体水平上既有良好的预防JEV感染的作用也有治疗JEV感染的功效。
综上所述，本发明所提供的shRNA以及shRNA真核表达质粒能够在制备治疗和/或预防JEV感染的药物中应用，为治疗和预防JEV感染提供一种新的可选药物。
附图说明
图1JEV基因组结构及本发明中所选取的保守区段示意图。箭头处为shRNA所选的靶基因位点。
图2pGPU6/GFP/Neo载体结构图。
图3shRNA真核表达质粒的酶切鉴定。M：lamda/Eco130I；A1-5和B1-5分别为pGP-E1与pGP-E2BbsI酶切结果；A’1-5和B’1-5分别为pGP-E1与pGP-E2BamHI酶切结果；C1-5和D1-5分别为pGP-NS3与pGP-NS4b BbsI酶切结果；C’1-5和D’1-5分别为pGP-NS3与pGP-NS4bBamHI酶切结果。
图4间接免疫荧光结果。A、B、C、D、E、F分别是pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b、pGP-NC和Mock组结果。
图5经shRNA作用后的细胞培养液的TCID50的测定结果。
图6流式细胞术结果。A、B、C、D、E、F分别是pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b、pGP-NC和Mock组结果。
图7Real time RT-PCR结果。mRNA的相对表达量是指经过shRNA干扰作用后JEV的目的基因3’段非编码区的表达量与阴性对照组目的基因表达量的比值。
图8Western blotting结果。泳道1～6分别为pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b、pGP-NC和Mock组结果。
图9免疫组化结果。A、B、C、D、E、F分别是pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b、Virus control和Mock组结果。
图10动物保护性实验结果。A、B分别为先注射shRNA真核表达质粒后攻毒20LD50和100LD50JEV(NJ2008)组；C、D分别为同时注射shRNA真核表达质粒和20LD50JEV(NJ2008)组，同时注射shRNA真核表达质粒和100LD50JEV(NJ2008)组。
具体实施方式
实施例1shRNA的制备
(1)寡核苷酸的设计与合成
以JEV的E、NS3、NS4b基因mRNA序列为靶序列(图1)，利用Ambion公司的siRNA设计软件，通过同源分析，分别针对JEV基因的1553～1571bp(E1)、1679～1697bp(E2)、6083～6101bp(NS3)和7350～7368bp(NS4b)设计合成4对shRNA寡核苷酸链。其loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构。正义链模板的5’端添加了CACC，与BbsI酶切后形成的粘端互补；反义链模板的5’端添加了GATC，与BamHI酶切后形成的粘端互补；如果shRNA的靶序列第一个碱基不是G，则在其模板链的CACC后补加一个G。所设计的四个shRNA的模板链序列如下：shRNA-E1：正义链模板SEQID NO.1，反义链模板SEQ ID NO.2；shRNA-E2：正义链模板SEQ ID NO.3，反义链模板SEQID NO.4；shRNA-NS3：正义链模板SEQ ID NO.5，反义链模板SEQ ID NO.6；shRNA-NS4b：正义链模板SEQ ID NO.7，反义链模板SEQ ID NO.8。上述序列合成委托上海吉玛制药技术有限公司进行。
(2)shRNA模板的退火
将shRNA模板单链分别用TE(pH8.0)溶解，浓度为100μM。取相应的正义链模板和反义链模板溶液，按照表1配比配置退火反应体系。
表1
| 组分 | 体积(μl) |
| 10XshDNA退火缓冲液 | 5 |
| 正义链模板(100μM) | 5 |
| 反义链模板(100μM) | 5 |
| ddH2O | 35 |
| 合计 | 50 |
在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min；85℃5min；75℃5min；70℃5min；4℃保存。退火处理后得到浓度为10μM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释500倍，终浓度为20nM，用于连接反应。
(3)pGPU6/GFP/Neo载体的线性化取2μgpGPU6/GFP/Neo载体(购自上海吉玛公司，见图2)，按照表2体系进行酶切处理：
表2
| 组分 | 体积(μl) |
| 10×Buffer G | 5 |
| Bbs I | 2 |
| BamH I | 2 |
| pGPU6/GFP/Neo | 2μg |
| ddH2O | 至50μl |
| 合计 | 50 |
37℃酶切1小时，琼脂糖电泳，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(TaKaRa)回收，电泳检测估算浓度，稀释浓度至50ng/μl。
(4)pGPHI/GFP/Neo-shRNA载体的构建
将复性之后的本发明shRNA模板分别与BbsI和BamHI双酶切线性化的pGPU6/GFP/Neo载体连接，转化大肠杆菌DH5α(购自TAKARA公司)，经质粒提取、酶切和测序鉴定筛选出阳性质粒，分别简称为pGP-E1(对应shRNA-E1)、pGP-E2(对应shRNA-E2)、pGP-NS3(对应shRNA-NS3)和pGP-NS4b(对应shRNA-NS4b)。选取与JEV和鼠基因组无任何同源序列的shNC(购自上海吉玛公司)，其正义链模板序列为SEQ ID NO.13，其反义链模板序列为SEQ ID NO.14；与pGPU6/GFP/Neo载体连接，该shNC表达质粒文中简称为pGP-NC，设为阴性对照。
a.按照表3体系进行载体的连接反应：
表3
| 组分 | 体积(μl) |
| 10×T4连接缓冲液 | 2 |
| pGPU6/GFP/Neo(BbsI+BamH I) | 1 |
| shRNA模板(20nM) | 1 |
| T4DNA连接酶(5weissU/μl) | 1 |
| ddH2O | 15 |
| 合计 | 20 |
22℃1hr，转化大肠杆菌DH5α。.
b.每个连接反应挑取5个菌落，接种到含50μg/ml卡那霉素的LB培养集中。
c.使用碱裂解法抽提质粒，所得质粒用BamH I，Pst I分别酶切鉴定(图3)。阳性重组载体应该可以被BamH I切开，而不能被Pst I切开。
2.shRNA在细胞水平上抑制JEV的复制
取相同量(96孔板0.2μg/孔，24孔板0.8μg/孔，6孔板4.0μg/孔)的本发明的pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b和pGP-NC表达质粒，用脂质体法(Lipfectin2000，InvitrogenGroup)分别转染BHK21细胞(购自上海细胞所)，24h后再分别接种100LD50的JEV(NJ2008，GeneBank：GQ918133)。病毒感染48h后分别进行间接免疫荧光试验、TCID50的测定、流式细胞术，Real time RT-PCR，Western Blotting。以上试验中用pGP-NC作用组为阴性对照，无干扰作用并未感染JEV的BHK21细胞组作为空白对照(Mock组)。
(1)间接免疫荧光：将待检测细胞用PBS洗涤3次，待干后用无水乙醇4℃固定1hr，然后依次与一抗(鼠抗JEV E单克隆抗体，农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室提供，下同)和二抗(羊抗鼠IgG-FITC，博士德生物公司，下同)37℃各作用1hr，期间用PBS洗涤3次，与二抗反应后再用PBS洗涤3次，直接于荧光显微镜下镜检(图4)。
结果表明，本发明的shRNA表达质粒作用组的荧光细胞数显著少于阴性对照组(pGP-NC组)，荧光强度也弱于阴性对照，其中pGP-E1、pGP-E2组肉眼几乎看不到荧光，可见其具有很强的抑制JEV复制能力。
(2)病毒滴度测定：将培养病毒的细胞冻融3次后，取100μl上清病毒液加入到900μl维持培养液中，混匀后取100μl加到下一管900μl营养液中，依此法对病毒液进行10倍倍比稀释；取出提前一天种植BHK21细胞的96孔细胞板，弃去板内营养液，然后由最高稀释度起，每孔100μl，每个稀释度8个重复；37℃5％CO2培养，每日观察CPE产生情况，根据Reed-Muench方法计算病毒的TCID50(图5)。
如图所示，经shRNA表达质粒作用后的病毒TCID50较于阴性对照组(pGP-NC组)下降103～104倍。
(3)流式细胞术：胰酶消化细胞成单个，倒入EP管，PBS洗2次，离心；3％BSA重悬细胞，4℃避光封闭1hr，离心；2％福尔马林4℃避光固定1hr，离心；0.2％Tween-20重悬细胞，37℃水浴15min，离心；然后依次与一抗(鼠抗JEV E单克隆抗体)和FITC标记的二抗(羊抗鼠IgG-FITC)37℃各作用0.5hr，期间用PBS洗涤3次，与二抗反应后再用PBS洗涤3次，离心，用500μlPBS重悬，避光，用流式细胞仪检测(图6)。
如图所示，pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3和pGP-NS4b组中发光细胞数占总细胞数的比值分别为8.3％、11.3％、26.5％、18.3％显著低于阴性对照组的99％。
(4)Real time RT-PCR：
a、取出24孔细胞板中的细胞培养物，用总RNA提取试剂盒(Qiagen)提RNA；
b、按照表4系统进cDNA合成：
表4
| 组分 | 体积(μl) |
| 5×PrimeScriptTM缓冲液 | 2 |
| PrimeScriptTM RTEnzyme Mix | 0.5 |
| 特异性引物SEQ IDNO.16 | 0.2 |
| 总RNA | 3 |
| RNase Free dH2O | 4.3 |
| 合计 | 10 |
反转录条件：42℃15min；85℃5sec。
cDNA合成所使用的特异性引物与SYBR Green实时PCR下游引物相同。
C、SYBR Green实时PCR：按照表5体系进行SYBR Green实时PCR。实时PCR数据通过ABI 7300software进行分析。体系所用引物针对于JEV的3’段非编码区。
表5
| 组分 | 体积(μl) |
| SYBRExTaq | 25 |
| 上游引物SEQIDNO.15 | 0.5 |
| 下游引物SEQIDNO.16 | 0.5 |
| RoxRDye | 1 |
| cDNA | 4 |
| dH2O | 19 |
| 合计 | 50 |
95℃30sec；95℃5sec，60℃31sec，40个循环；加熔解曲线。
结果如图7所示，pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b对JEV复制的抑制率可分别达97.3％、95.7％、80.9％和88.5％，即本发明的shRNA真核表达质粒对JEV复制的抑制率均达80％以上。
(5)Western Blotting。收集待检测细胞，经超声波裂解后，利用BCA试剂盒(PIERCE)测定各组总蛋白浓度，然后每组取相同量的总蛋白进行SDS-PAGE，经转膜，封闭后，添加一抗(鼠抗JEV E单克隆抗体)，内参组添加一抗(鼠抗β-actin单克隆抗体，博士德公司)，室温孵育2hr，PBS洗涤3次，然后分别加入二抗(羊抗小鼠IgG，博士德公司)，最后用ECL发光显色(PIERCE)。
结果如图8所示，在各组β-actin量基本一致的情况下，pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b组JEV E蛋白条带明显浅于pGP-NC组，表明经shRNA表达质粒作用后JEV E蛋白产生量明显减少。
3.shRNA在动物水平上防治JEV的感染
取体重接近的乳鼠(购自南京大学模式动物研究所)，分6组，分别为pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b、Virus control(只攻毒组，下同)和Mock(只注射PBS，下同)组，3只/组，做免疫组化分析；取体重相近、四周龄的BALB/c母鼠(南京大学模式动物研究所)，平行分4大组(A～D)，每大组再分5小组(1～5)，6只/小组，E组为Mock对照(6只/组)，做保护性实验。
(1)免疫组化。将本发明的shRNA表达质粒以100μg/只的剂量颅内腔注射乳鼠，24h后以100LD50的JEV(NJ2008)剂量同样颅内腔注射乳鼠，96h后取乳鼠鼠脑浸入福尔马林溶液中；根据免疫组化(LP法)操作步骤，制作组织石蜡切片，再分别与一抗(鼠抗JEV E单克隆抗体)，二抗(HRP-SPA，博士德生物公司)反应，DAB显色(购自博士德公司)；于显微镜中直接观察，拍照。
图9所示，DAB显色后组织的阳性表达位点为棕褐色，即动物组织中存在JEV颗粒即染成棕褐色，pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b组与Mock组染色程度基本一致，而Viruscontrol组染色较深，表明本发明的shRNA表达质粒可有效防治动物机体对JEV的感染。
(2)保护性试验。按照上文动物分组方法分组后，分别给A～D组中的1～5小组的BALB/c小鼠颅腔内注射pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b、PBS；24h后组A(1～5)，B(1～5)小鼠颅腔内分别注射20LD50和100LD50剂量的JEV(NJ2008)；组C(1～4)，D(1～4)分别将pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS3、pGP-NS4b与20LD50或100LD50剂量的JEV(NJ2008)同时颅内注射小鼠，C5和D5只攻毒；E组为Mock组；每天观察动物死亡情况，连续观察15天，结果见图10。
图10A、B结果显示，攻毒20LD50剂量的JEV，四组shRNA表达质粒作用后小鼠存活率均高于50％；攻毒100LD50剂量的JEV，pGP-E1、pGP-E2、pGP-NS4b组存活率仍然高于50％，表明本发明的shRNA表达质粒有良好的预防JEV感染的能力。
图10C、D结果显示，攻毒20LD50和100LD50剂量的JEV，pGP-E1、pGP-E2、组存活率均高于50％，pGP-NS4b组存活率均达33.3％，表明本发明的shRNA表达质粒有较好的治疗JEV感染的能力。
Claims (3)
1.一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA，其特征在于以乙型脑炎病毒基因组中高度保守的序列SEQ ID NO.10作为其靶序列，该shRNA的正义链模板序列为SEQ ID NO.3，反义链模板序列为SEQ ID NO.4。
2.一种含权利要求1所述的shRNA的shRNA真核表达质粒，其特征在于该shRNA真核表达质粒是将权利要求1所述的能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA的模板与线性化的载体pGPU6/GFP/Neo连接得到针对乙型脑炎病毒E基因mRNA序列的shRNA真核表达质粒。
3.权利要求2所述的shRNA真核表达质粒在制备抑制乙型脑炎病毒复制和/或感染的药物中的应用。
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