CN105385784A - 用于检测人乳头瘤病毒的遗传标记 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于从由患者提供的尿样品中鉴别检测高危型HPV的组合物和方法。具体地,本发明提供了特异性识别且结合在HPV的E1基因内的序列的引物和探针。高危型HPV的检测鉴定处于发展子宫颈癌的危险中或在子宫颈癌的早期阶段中的个体。
Description
本申请是申请号为“200980153183.8”,申请日为“2009年10月26日”,发明名称为“用于检测人乳头瘤病毒的遗传标记”的申请的分案申请。
相关申请
本申请要求于2008年10月31日提交的美国临时申请号61/197,850的优先权和利益。该申请的内容整体引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及医学和分子生物学领域。更具体而言,本发明涉及乳头瘤病毒基因组的E1基因片段作为用于鉴别诊断的特异性标记的用途,其通过对照低危配对物检测最常见的高危HPV基因型来实现。
发明背景
根据最近的全球估计,每年在女性中发生493,000个子宫颈癌新病例,并且每年274,000个女性死于该疾病(JacquesFerlay等人,2002,GLOBOCAN)。因为该疾病在多年期间进展,所以估计全世界140万女性伴随子宫颈癌生活,并且全世界2-5倍或最高达7百万女性可能具有需要鉴定且治疗的癌前状况(Ferlay等人2002,GLOBOCAN;Bosch等人2002,JClinPathol.55:244-265)。有效筛选和治疗策略的缺乏是与发达国家相比在发展中国家显著更高的子宫颈癌比率的主要原因。
筛选努力在很大程度上依赖于巴氏涂片(Papsmear),在20世纪四十年代开发的实验室测试,以检测异常子宫颈细胞。该测试已在提供定期、高品质筛选的工业化国家中达到巨大成功。但巴氏涂片程序是运行复杂且昂贵的,并且未能在其中健康系统和基础设施薄弱的发展中国家延伸至显著比例的女性。重要的是,在一些国家中,由于文化限制,女性不执行或不同意巴氏涂片程序。此外,存在与巴氏涂片测试相关的分析问题。巴氏涂片不检测子宫颈发育不良或恶化前的所有病例。对于指导医生作出医学建议的测试的假阴性的目前可接受比率是约5-10%,但近期研究暗示巴氏涂片的实际比率可能高得多(NandaK.等人,2000,AnnInternMed.132:810-819;KulasingamS.等人,2002,JAMA.288:1749-1757)。巴氏涂片将约7-8%病例定义为不明意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)。在另外20-30%病例中,由于炎症细胞的存在,巴氏涂片可能不足以解释。目前,为了克服与巴氏涂片测试相关的缺点,正在进行更多研究以用于开发分析上更可靠的新测定用于早期检测女性中的子宫颈恶化前状况。基于在子宫颈的一致HPV感染和侵袭性子宫颈癌发展之间普遍公认的联系的方法之一涉及病毒的检测。
发明概述
本发明提供了鉴别检测高危型HPV的组合物和方法。具体地,新近鉴定的HPV基因组片段用作标记用于高危型病毒的这种鉴别检测。靶向这种标记片段的寡核苷酸引物和探针组合物用于检测临床样品例如尿中的高危HPV。
具体地,本发明提供了包括关于人乳头瘤病毒(HPV)的分离的遗传标记的组合物,所述遗传标记包括由SEQIDNO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97编码的序列。可替代或另外地,本发明提供了包括SEQIDNO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97的互补序列的组合物。在优选方面,本发明提供了包括关于高危人乳头瘤病毒(HPV)的分离的遗传标记的组合物,所述遗传标记包含由SEQIDNO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85编码的序列。
本发明进一步提供了包括由SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的序列编码的寡核苷酸的组合物。可替代或另外地,本发明提供了包括SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的互补序列的组合物。
此外,本发明提供了包括关于人乳头瘤病毒(HPV)的分离的遗传标记的组合物,所述遗传标记包括与HPV的E1基因同源的序列。在一个方面,序列包括HPV的E1基因的核苷酸987–1135。在另一个方面,序列由SEQIDNO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97编码。本发明包含与HPV的E1基因至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或之间的任何百分比点等同的序列。在优选实施方案中,序列与HPV的E1基因至少70%等同。本发明包含与HPV的E1基因至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或之间的任何百分比点同源的序列。在优选实施方案中,序列与HPV的E1基因至少70%同源。
本发明提供了诊断患者中的人乳头瘤病毒(HPV)感染的方法,其包括步骤:(a)从所述患者中获得尿样品;和(b)检测所述尿样品中HPV的E1基因的一个或多个序列;其中检测出HPV的E1基因的一个或多个序列指示至少一种人乳头瘤病毒的存在,从而诊断患者中的HPV感染。根据这种方法,核酸是DNA或RNA。在这种方法的优选实施方案中,DNA是经肾(transrenal)DNA。这种方法检测包括经肾DNA的HPVDNA。可替代地,这种方法唯一地检测经肾DNA。
在这种方法的特定实施方案中,检测步骤包括选自下述的技术:杂交、聚合酶链反应(PCR);嵌套引物PCR;实时PCR;NA杂交;环状探针反应;单链构象多态性(SSCP);链置换扩增(STA);和限制性片段长度多态性(RFLP)。
检测步骤包括聚合酶链反应,其使用足够互补的引物对,以与HPV的E1基因中的序列杂交。此外,检测步骤包括聚合酶链反应,其使用足够互补的引物对,以与由SEQIDNO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97编码的序列杂交。可替代或另外地,检测步骤包括聚合酶链反应,其使用足够互补的引物对,以与由SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15编码的序列或其互补序列杂交。
当本文描述的方法使用基于聚合酶链反应(PCR)的方法检测HPV时,聚合酶链反应使用SEQIDNO:41和42的引物对。SEQIDNO:41和42的引物对鉴别检测高危型HPV。可替代地,聚合酶链反应使用下述由SEQIDNOs:43和55、44和56、45和30、46和57、47和58、48和33、49和34、50和36、51和59、52和38、53和39或54和40编码的引物对中的至少一个。在特定实施方案中,聚合酶链反应使用选自SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53和54的至少一个正向引物,和选自SEQIDNOs:55、56、30、57、58、33、34、35、36、59、38、39和40的至少一个反向引物。聚合酶链反应进一步使用下述由SEQIDNOs:43和55、44和56、45和30、46和57、48和33、50和36、51和59以及52和38编码的引物对中的至少一个。在特定方面,聚合酶链反应使用选自SEQIDNOs:43、44、45、46、47、48、49、50、51、52和54的至少一个正向引物,和选自SEQIDNOs:55、56、30、57、58、33、35、36、59、38和39的至少一个反向引物。
在本发明的特定实施方案中,将多个引物对添加到在单管中包含的PCR反应中。组PCR反应(groupPCRreaction)包括1-5、5-10、10-15、15-20、20-25个引物,或之间的任何数目。组PCR反应用于鉴定在生物或临床尿样品中存在的所有可能的HPV形式。例如,在单个PCR反应背景中,将表3、表4或表5中列出的引物应用于任何给定样品。
根据这种方法的特定方面,所述尿样品中的核酸降解减少。减少核酸降解包括通过增加的pH、增加的盐浓度、热灭活或通过用选自下述的化合物处理所述尿样品来抑制核酸酶活性:乙二胺四乙酸、盐酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰基肌氨酸和十二烷基硫酸钠。
这种方法的检测步骤进一步包括基本上分离所述尿样品中的所述核酸。分离通过沉淀或通过使用固体吸附剂材料来执行。
这种方法进一步包括使尿样品过滤,以去除污染物。在一个方面,过滤去除包括超过约1000个核苷酸的核酸。在另一个方面,过滤去除包括超过约300个核苷酸的核酸。
另外地,这种方法进一步包括定量所述核酸的步骤。定量通过本领域已知的方法来完成。
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。下文描述了合适方法和材料,尽管与本文描述的那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都整体引入作为参考。在冲突的情况下,以本说明书包括定义为准。另外,材料、方法和实施例仅是举例说明性的并且不意图是限制性的。
本发明的其他特点和优点由于下述详述和权利要求将是显而易见的。
附图简述
图1是HPV16的基因组中的可读框(ORFs)的示意图或图。
图2是描述个别HPV基因型的PCR产物的凝胶电泳分析照片,其使用基因定位到(mappedto)HPV的E1基因的引物进行扩增。
图3是描述个别HPV基因型的PCR产物的凝胶电泳分析照片,其使用基因定位到HPV的E1基因的单个引物对SEQID:41和SEQID:42进行扩增。
图4是描述对从具有子宫颈癌的患者中收集的尿DNA进行的HPVPCR测试的PCR产物的凝胶电泳分析照片,其使用基因定位到HPV的E1基因的单个引物对SEQID:41和SEQID:42进行扩增。
图5是描述个别HPV基因型的PCR产物的凝胶电泳分析照片,其使用基因定位到HPV的E1基因的所有高危特异性引物进行扩增(参见表4)。
图6是描述对从具有子宫颈癌的患者中收集的尿DNA进行的HPVPCR测试的PCR产物的凝胶电泳分析照片,其使用在单管PCR反应中的所有高危特异性引物的混合物进行扩增。引物基因定位到HPV的E1基因。
图7是描述个别HPV基因型的PCR产物的凝胶电泳分析照片,其使用基因定位到HPV的E1基因的高危特异性引物亚群(参见表5)。
详述
人乳头瘤病毒(HPVs)是与皮肤和粘膜上皮的良性和恶性损害相关的趋上皮病毒(图1关于病毒的遗传学图)。在HPV感染和子宫颈癌的后续发展之间存在充分证明的原因联系。还存在使HPV感染与头和颈癌、呼吸组织癌和乳腺癌相关的观察。(Braakhuis等人,2004,J.Natl.CancerInst.96(13):998-1006;Dahlstrand等人,2004,AnticancerRes.24(3b):1829-35;Daling等人,2004,Cancer101(2):270-80;Ha等人,2004,Crit.Rev.OralBiol.Med.15(4):188-96;Hafkamp等人,ActaOtolaryngol.124(4):520-6;Harwood等人,2004,Br.J.Dermatol.150(5):949-57;Rees等人,2004,Clin.Otolaryngol.29(4):301-6;Widschwendter等人,2004,J.Clin.Virol.31(4):292-7)。
迄今为止已鉴定了超过100种不同类型的HPV(Antonsson,A.等人,2000,J.Virol.74:11636-11641;Chan,S.Y.等人1995,J.Virol.69:3074-3083;deVilliers,E.M.等人2004,Virology324:17-27),其中40种已在肛殖感染中报道(deVilliersE-M.2001,PapillomavirusRep.12:57-63;VilliersEM等人,2004,Virology.Jun20;324(l):17-27)。基于HPV的流行病学分类,存在15种高危和5种低危病毒基因型(MunozN等人,2003,NEnglJMed.,348,518-527)。公认几乎100%的侵袭性子宫颈癌和高级别癌前上皮内瘤形成与由高危HPV感染的感染相关。这是关于使用高危HPV检测用于筛选女性和鉴定处于子宫颈癌后续发展的危险中的个体的基本原理。
因为HPV不能在体外培养并且血清学测定仍是无效的,所以HPV感染的诊断基于分子工具的使用。直接斑点检测(directdot-spotdetection)和原位杂交测定已得到描述(MelchersWJ等人,1988,JMedVirol25:11-16;MelchersWJ,1989,JClinMicrobiol,27:106-110),但这些方法是冗长的且看起来缺乏灵敏度和特异性。DNA扩增法例如聚合酶链反应(PCR)允许病毒DNA的更灵敏检测。除用于个别HPV基因型的类型特异性PCR引物外(BaayMF等人,1996,JClinMicrobiol,34:745-747;vandenBruleAJ等人,1989,JMedVirol,29:20-27),几种通用PCR引物组已得到开发,包括MY11/MY09(ManosMM等人,1989,CancerCells,7:209-214)、OBI/II(JenkinsA,等人1991,APMIS,99:667-673)、CPI/CPIIG(TiebenLM等人,1993,JVirolMethods,42:265-279)、GP5+/6+(deRodaHusmanAM等人,1995,JGenVirol,76:1057-1062)、SPF引物(KleterB等人,1998,AmJPathol.Dec;153(6):1731-9)和衍生自SPF引物的HP引物(PayanC等人,2007,JClinMicrobiol,45(3):897-901)。所有这些引物都旨在检测所有HPV亚型,伴随使用特异性探针的高危型与低危的后续鉴别。类似地,存在公开了用于检测临床样品中的HPV的引物和探针的众多授权的专利(6,583,278,2003年6月,Carter;N.M.(E6和E7);6,503,704,2003年1月,Mahony等人(L1);6,355,424,2002年3月,Lorincz,等人;6,228,577,2001年5月,Mahony,等人;6,218,104,2001年4月,Morris,等人;6,045,993,2000年4月,Mahony,等人;5,888,724,1999年3月,Silverstein,等人;5,783,412,1998年7月,Morris,等人;5,705,627,1998年1月,Manos,等人;5,639,871,1997年6月,Bauer,等人;5,527,898,1996年6月,Bauer,等人;5,447,839,1995年9月,Manos,等人;5,283,171,1994年2月,Manos,等人;5,182,377,1993年1月,Manos,等人;5,501,947,1996年3月,Emery,等人)。
本发明提供了所有形式的检测HPV的引物和探针:(i)仅使用核酸(NA)扩增或其他分析法直接检测最频繁的高危型,(ii)使用2步过程(NA扩增连同产物通过杂交的后续分析)直接检测最频繁的高危型,和(iii)在单一反应中扩增和分析高和低危HPV类型。本发明进一步提供了用于设计和使用对HPV的E1基因区域特异的寡核苷酸引物的方法。关键地,本发明的组合物和方法解决了用于检测、筛选和监控与HPV感染相关的疾病的长期需要。
用于HPV筛选的目前可用测试的缺点之一是DNA的来源,即子宫颈细胞。从患者中收集子宫颈细胞需要到医生办公室的就诊和至少受过训练的技术员但更可能地持有执照的医生执行样品收集。此外,该程序对于患者是侵袭性且不舒服的。暗示收集子宫颈细胞的前述障碍可以是美国约30%的女性在常规基础上无巴氏涂片检查的原因(AckermannSP等人,1992,MMWRCDCSurveillSumm,41:17-25;Anderson,LM,MayDS.1995,AmJPublicHealth,85:840-2)。进一步地,存在限制女性到妇科医生办公室的就诊用于子宫颈取样和一般阴道检查的宗教和其他文化原因。
本发明提供了解决关于子宫颈细胞收集的上述障碍的解决方案。本发明的方法使用不同来源的HPVDNA,其不需要子宫颈刮术。相反,本发明的组合物和方法检测得自患者的尿样品中的HPVDNA。HPVDNA在离心的尿(PayanC等人,2007,JClinMicrobiol,45(3):897-901;ForslundO,等人,1993,JClinMicrobiol,31(8):1975-9;SongES等人,2007,JKoreanMedScl,22(1):99-104)或全尿(50,51,52BrinkmanJA等人,2002,JClinMicrobiol,40(9):3155-61;SellorsJW等人,2000,CMAJ.163(5):513-8;SmitsPH等人,2005,JClinMicrobiol.2005,43(12):5936-9)的细胞沉淀中检测出。然而,先前公开的测试是基于PCR的。这些报道中的临床灵敏度是不令人满意的,这是由于范围为100–500个碱基对(bp)的扩增引物(amplimers)大小。
目前,本领域公认在尿中出现的NA来自2个来源,(i):从泌尿生殖道脱落到尿内的细胞,其NAs通常是高分子量的,和(ii)跨越肾屏障从血流到尿内的经肾NAs(Tr-DNA),其通常是低分子量片段。低分子量经肾NA大小范围为约20-150bp(ChanKC等人,2008,ClinCancerRes.,14(15):4809-13;SuYH,等人,2004,AnnNYAcadSci,1022:81-9;UmanskySR,TomeiLD.2006,ExpertRevMolDiagn.,6(2):153-63)。扩增子大小的减少使测试灵敏度增加10倍(MelkonyanHS等人,2008,Ann.N.Y.Acad.Sci.1137:73-81)。因此,本发明提供了用于设计和使用靶向非常短(约30–50bp)扩增子的寡核苷酸引物的方法。本发明的寡核苷酸引物组合物有效地检测尿中从脱落细胞释放的HPVDNA以及Tr-DNA。
关键地,本发明的寡核苷酸引物组合物靶向在HPV的E1基因中新近鉴定的高度特异性遗传标记(表1)。靶向E1基因内的这种标记允许设计PCR引物和探针用于特异性检测临床或生物学样品中的高危HPV基因型。本发明还提供了基因定位到E1基因区域的高危HPV特异性引物,其扩增非常短的DNA片段,以检测尿的Tr-DNA级分中存在的HPV基因组片段。
选自表1中指定的HPV的E1基因区域的寡核苷酸或互补序列用于生物学或临床样品中的HPV检测。此外,具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%同源性或同一性或之间的任何百分比点的寡核苷酸或互补序列用于生物学或临床样品中的HPV检测。使用下述示例性技术从生物学或临床样品中检测HPV,包括但不限于,聚合酶链反应(PCR)和这种方法的所有变形;实时PCR;NA杂交;环状探针反应;单链构象多态性(SSCP);链置换扩增(STA);限制性片段长度多态性(RFLP),和涉及纳米技术的NA分析技术。引物可以与结合位点杂交,所述结合位点在靶序列上彼此紧密相邻或略微重叠(在引物结合位点之间不具有间插序列)。
进一步地,选自HPV的E1基因区域的寡核苷酸(在表1中提供)通过逆转录PCR反应检测E1基因的特异性RNA转录物。本发明的生物学和临床样品包括但不限于在体内的任何流体,包括血液、尿、唾液、痰、眼泪、精液、乳或阴道分泌物。在本发明的优选实施方案中,生物学或临床样品是尿。
由本发明进一步包含的是用于检测HPV的诊断试剂盒,其包括:促进从尿中分离长度20-500个核苷酸的DNA的试剂;促进通过聚合酶链反应扩增长度20-500个核苷酸的DNA的试剂;热稳定的DNA聚合酶;和对于仅出现于HPV的E1基因中的标记序列特异的寡核苷酸。
对于本发明的实践有用的核酸操作技术在多种参考文献中描述,包括但不限于MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,第1-3卷,编辑Sambrook等人ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);和CurrentProtocolsinMolecularBiology,编辑Ausubel等人,GreenePublishingandWiley-Interscience:NewYork(1987)和定期更新。具体描述虽然不意图限制本发明的范围,但提供在实践本发明的特定方面中的指导。
DNA经历体液例如尿中存在的DNA酶的降解。本发明包含用于预防或减少DNA在尿中时的降解的几种方法,从而使得足够大的序列可用于通过已知DNA检测法的检测,例如下文描述的那些。在一个实施方案中,当尿已在膀胱中保留小于12小时时获取尿样品,在具体实施方案中,尿在膀胱中保留小于5小时、更优选小于2小时。在其已在膀胱中保留长时间段前收集且分析尿样品减少DNA对尿中存在的任何DNA酶的暴露。
在本发明的另一个实施方案中,在收集后,使用抑制DNA酶活性的一种或多种方法处理尿样品。抑制DNA酶活性的方法包括但不限于使用乙二胺四乙酸(EDTA)、盐酸胍、GITC(异硫氰酸胍)、N-月桂酰基肌氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、高盐浓度和DNA酶的热灭活。
在另外一个实施方案中,在收集后,用捕获DNA的吸附剂处理尿样品,这之后从样品中去除吸附剂,漂洗且处理以释放捕获的DNA用于检测和分析。这种方法不仅从尿样品中分离DNA,而且当与一些吸附剂一起使用时,还保护DNA不受DNA酶活性的降解,所述吸附剂包括但不限于HybondN膜(AmershamPharmaciaBiotechLtd.,Piscataway,NJ.)。
在某些情况下,尿样品中的DNA量是有限的。因此,对于特定应用,本发明包含其中检测灵敏度通过本领域已知的任何一种或多种方法得到增加的实施方案,包括但不限于下述方法中的一种或多种。
当DNA以微小量存在于尿中时,可以收集较大的尿样品且其后通过任何方法进行浓缩,所述任何方法不影响样品中存在的DNA的检测。一些例子在不限制本发明的宽度的情况下包括,通过丁醇浓缩或使用SephadexG-25(PharmaciaBiotech,Inc.,PiscatawayN.J.)的浓缩减少样品中存在的液体。
嵌套式PCR可以用于使灵敏度改善几个数量级。因为嵌套式PCR易由于DNA污染而产生不准确结果的弱点,所以在本发明的一个实施方案中,要小心避免样品的DNA污染。例如但不限制本发明,在将PCR试剂添加到测试DNA样品中前,人们可以用在靶序列内切割的一种或多种限制性核酸内切酶处理PCR试剂。
在一个实施方案中,本发明包含在检测前从样品中基本上纯化或分离核酸。核酸分子可以使用许多程序中的任何一种从尿中分离,所述程序是本领域众所周知的。促进靶核酸检测的用于分离的任何方法都是可接受的。例如,DNA可以通过沉淀进行分离,如由Ishizawa等人,NucleicAcidsRes.19,5972(1991)描述的。当大体积样品包含低浓度DNA时,正如尿的情况一样,包含分离DNA的优选方法。在这种方法中,用吸附剂处理样品,所述吸附剂作用于使DNA浓缩。例如,样品可以用将吸附DNA的固体材料进行处理,例如但不限于DEAESephadexA-25(PharmaciaBiotech,Inc.,PiscatawayN.J.)、DNA滤器和/或玻璃乳(glassmilk)。在其他组合物被洗掉后从吸附剂中洗脱样品DNA。
考虑到各种核酸分析技术例如PCR的灵敏度,本发明还包含减少尿样品中污染性核酸的存在的方法。尿样品由未跨越肾屏障的核酸序列的污染可以通过从尿道衬里脱落的细胞、通过性交、或在检测目的DNA序列前在尿样品处理过程中引入。不意图使本发明限制于任何机制,认为经过肾屏障且在尿中出现的DNA可能平均具有比由污染来源引入的DNA更短的长度,这是由于在体内凋亡细胞和坏死细胞中出现的断裂,与血液和尿中的DNA酶的作用组合。
过滤可以用于减少在检测前尿样品中的污染DNA水平,其通过选择较短序列的DNA来实现。在本发明的一个实施方案中,在检测前从样品中去除包含超过约1000个碱基对或当变性时1000个核苷酸的核酸。在本发明的具体实施方案中,在通过PCR扩增前使尿样品过滤,以去除包含超过300个碱基对、或当变性时300个核苷酸的基本上所有DNA。不使本发明限制于具体机制,提出此种过滤去除来自从尿道/膀胱壁脱落或在性交过程中引入尿道内的细胞的污染DNA。来自此种污染来源的大多数DNA可能包括超过300bp核苷酸,这是因为DNA在极大程度上不是由于凋亡细胞死亡的结果的核酸断裂的产物。核酸分子还可以通过凝胶电泳进行分离,由此根据分子量分离核酸片段。限制性片段长度多态性(RFLP)的技术应用电泳分离法,随后为核酸检测,从而使得能够通过来自特异性基因序列的2个或更多个等位基因的片段分子量进行比较。
上述纯化法意欲描述但不限制适合于在本发明中使用的方法。分离核酸的方法在本领域技术人员的能力内并且在此处不详细描述。
本发明进一步包含具有减少所述尿样品中的DNA降解的步骤的方法,其在一个实施方案中包含用选自下述的化合物的处理:乙二胺四乙酸、盐酸胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰基肌氨酸和十二烷基硫酸钠。DNA降解可以通过获取已在膀胱中保留小于12小时的尿样品进一步减少。在一个实施方案中,在就HPV核酸序列的存在测定尿前基本上分离所述核酸序列是有利的,所述HPV核酸序列已跨越肾屏障。在可替代实施方案中,核酸序列通过沉淀或通过用固体吸附剂材料处理而基本上分离。在另一个实施方案中,使尿样品过滤,以去除污染物,并且在具体实施方案中,过滤去除包括超过约1000个核苷酸的DNA。优选地,过滤去除包含超过约300个核苷酸的DNA。
与核酸序列有关的术语“检测”和“分析”指观察、确定或定量信号的任何方法的使用,所述信号指示样品中靶核酸序列的存在或样品中那种靶核酸序列的绝对或相对量。方法可以与核酸标记法组合,以通过例如下述提供信号:荧光、放射性、比色法、重量分析法、X射线衍射或吸附、磁力、酶促活性等。信号随后可以通过对于信号类型合适的方法进行检测和/或定量,以测定特异性目的DNA序列的存在或不存在。
与核酸序列有关的“定量”指研究特定核酸序列的量的任何方法的使用,包括但不限于,测定核酸序列拷贝数或测定随着时间过去核酸序列拷贝数量中的改变、或测定当与另一种序列比较时序列的相对浓度的方法。
为了帮助检测和分析,特异性DNA序列可以以许多方法进行“扩增”,包括但不限于循环探针反应(Bekkaoui,F.等人,BioTechniques20,240-248(1996)、聚合酶链反应(PCR)、嵌套式PCR、PCR-SSCP(单链构象多态性)、连接酶链反应(LCR)(F.BaranyProc.Natl.Acad.SciUSA88:189-93(1991))、克隆、链置换扩增(SDA)(G.K.TerranceWalker等人,NucleicAcidsRes.22:2670-77(1994)和变形例如等位基因特异性扩增(ASA)。
为了促进本发明的理解,下文定义了许多术语。
术语“基因”指包括RNA序列转录所必需的控制和编码序列的DNA序列。术语“基因组”指在真核生物的染色体组中包含的生物的完全基因互补体。
“野生型”基因或基因序列是在群体中最频繁观察到的那种,并且因此任意指定为“正常”或“野生型”形式的基因。相比之下,术语“修饰的”、“突变的”、“异常的”或“改变的”指当与野生型基因、序列或基因产物相比较时,展示出序列或功能性质(即改变的特征)中的修饰的基因、序列或基因产物。应当指出可以分离天然存在的突变体;这些通过当与野生型基因或基因产物相比较时它们具有改变的特征的事实进行鉴定。不使本发明限制于任何特异性异常类型的检测,突变可以采取多种形式,包括添加、添加-缺失、缺失、移码、错义、点、读框移位、反转、转换和颠换突变以及微卫星改变。
术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”和“聚合”核酸是可互换的,并且定义为包含2个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选超过3个且通常超过10个。确切大小将依赖于多种因素,这本身又依赖于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以以任何方式生成,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。
因为单核苷酸以这样的方式反应以制备寡核苷酸,从而使得一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸经由磷酸二酯键在一个方向中与其邻居的3'氧附着,所以寡核苷酸的末端被称为“5'末端”,如果它的5'磷酸不与单核苷酸戊糖环的3'氧连接的话,并且被称为“3'末端”,如果它的3'氧不与后续单核苷酸戊糖环的5'磷酸连接的话。如本文使用的,核酸序列即使对于较大寡核苷酸是内部的,也可以被说成具有5'和3'末端。
当2个不同的非重叠寡核苷酸与相同线性互补核酸序列的不同区域退火时,并且一个寡核苷酸的3'末端指向另一个的5'末端时,前者可以被称为“上游”寡核苷酸,并且后者被称为“下游”寡核苷酸。
术语“引物”指当置于其中起始引物延伸的条件下时,能够充当合成起始点的寡核苷酸。寡核苷酸“引物”可以如在纯化的限制酶切消化中天然出现或合成产生。
选择与模板的特异性序列链“基本上”互补的引物。引物必须足够互补,以与模板链杂交用于发生引物延伸。引物序列无需反映模板的确切序列。例如,非互补核苷酸片段可以与引物的5'末端附着,而引物序列的剩余部分与链基本上互补。非互补碱基或更长的序列可以散布在引物内,条件是引物序列与模板序列具有足够互补性,以杂交且从而形成模板引物复合物用于合成引物的延伸产物。
“靶”核酸是待通过杂交、扩增或分析核酸序列的任何其他方法评价的核酸序列,包括分析法的组合。
“杂交”法涉及互补序列与靶核酸(待分析的序列)的退火。包含互补序列的2个核酸聚合物发现彼此且通过碱基配对相互作用退火的能力是充分认识到的现象。“杂交”过程由Marmur和Lane,Proc.Natl.Acad.Sci.USA46:453(1960)和Doty等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA46:461(1960)最初观察,随之而来的是这个过程改进为现代生物学的必需工具。杂交包含但不限于狭线、斑点和印迹杂交技术。
对于一些诊断应用重要的是测定杂交是代表完全还是部分互补性。例如,当希望仅仅检测病原体DNA(例如来自病毒、细菌、真菌、支原体、原生动物)的存在或不存在时,重要的只是杂交法确保当相关序列存在时的杂交;可以选择部分互补探针和完全互补探针将在其中杂交的条件。然而,其他诊断应用可以要求杂交法区别部分和完全互补性。可能值得注意的是检测遗传多态性。
允许在部分以及完全互补性的情况下的相同杂交水平的方法一般不适合于此种应用;探针将与正常和变体靶序列杂交。本发明预期对于一些诊断目的,杂交可以与其他技术(例如限制酶分析)组合。无论使用的方法如何,杂交要求待分析序列(靶序列)和用于执行测试的DNA片段(探针)之间一定程度的互补性。(当然,人们可以获得结合而无任何互补性,但这种结合是非特异性的且应避免的)。
如本文使用的,核酸序列的互补体指当与核酸序列这样比对从而使得一个序列的5'末端与另一个的3'末端配对时,处于“反向平行结合”的寡核苷酸。在天然核酸中通常未发现的特定碱基可以包括在本发明的核酸中,并且包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。互补性无需是完美的;稳定双链体可以包含错配碱基对或不匹配碱基。核酸技术领域的技术人员可以凭经验考虑许多变量来确定双链体稳定性,包括例如寡核苷酸长度、碱基组成和寡核苷酸序列、离子强度和错配碱基对发生率。
如本文使用的,术语“Tm”关于“解链温度”使用。解链温度是在其下双链核酸分子群体变得一半解离成单链的温度。计算核酸Tm的等式是本领域众所周知的。如由标准参考文献指出的,Tm值的简单估计可以通过下述等式进行计算:Tm=81.5+0.41(%G+C),当核酸在1MNaCl的水溶液中时(参见例如,Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridisation,inNucleicAcidHybridisation(1985)。其他参考文献包括更复杂的计算,其考虑结构以及序列特征用于计算Tm。
如本文使用的,术语“探针”指无论是如在纯化的限制酶切消化中天然出现的还是合成产生的寡核苷酸(即核苷酸序列),其与另一种核酸中的序列构成双链体结构或其他复合物,这是由于探针中的至少一种序列与另一种核酸中的序列的互补性或再现性吸引相互作用的其他方法。探针在特定基因序列的检测、鉴定和分离中是有用的。预期在本发明中使用的任何探针将用任何“报道分子”进行标记,从而使得它在任何检测系统中是可检测的,包括但不限于酶(例如ELISA以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性和发光系统。进一步预期目的(即待检测的)寡核苷酸将用报道分子进行标记。还预期探针和目的寡核苷酸将进行标记。不意图本发明限制于任何特定检测系统或标记。
如本文使用的,术语“标记”指任何原子或分子,其可以用于提供可检测(优选可定量)信号,并且可以与核酸或蛋白质附着。标记提供可通过许多方法检测的信号,包括但不限于荧光、放射性、比色法、重量分析法、X射线衍射或吸收、磁力和酶促活性。
当关于核酸靶使用时,术语“基本上单链的”意指靶分子主要作为单条核酸链存在,与作为通过链间碱基配对相互作用保持在一起的2条核酸链存在的双链靶形成对比。
如本文使用的,术语“序列变异”指在2个核酸模板之间核酸序列中的差异。例如,野生型结构基因和这种野生型结构基因的突变形式可以通过单个碱基置换和/或一个或多个核苷酸的缺失或插入的存在而在序列方面不同。这2种形式的结构基因被说成在序列方面彼此不同。可以存在结构基因的第二种突变形式。这个第二种突变形式被称为在序列方面与野生型基因和基因的第一种突变形式不同。
术语“结构探测特征(signature)”、“杂交特征”和“杂交概况(profile)”在本文中可互换使用,以指示靶核酸和探针或探针组之间测量的复合物形成水平,当与涉及参考靶或探针的复合物形成水平相比较时,此种测量的水平是靶核酸的特征。
“与基因序列匹配或互补的寡核苷酸引物”指能够促进单或双链核酸的模板依赖性合成的寡核苷酸引物。与基因序列匹配或互补的寡核苷酸引物可以在PCRs、RT-PCRs等中使用。
如本文使用的,“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸,及其片段或部分,并且指基因组或合成起源的DNA或RNA,其可以是单或双链的,并且代表有义或反义链。
“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列中的改变,其中分别不存在一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列中的改变,与天然存在的序列相比较,其已分别导致一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加。
“置换”起因于一个或多个核苷酸或氨基酸分别由不同核苷酸或氨基酸的替换。
核酸序列中的“修饰”指对于核酸序列的任何改变,包括但不限于缺失、添加、添加-缺失、置换、插入、反转、颠换、点突变、微卫星改变、甲基化或核苷酸加合物形成。
如本文使用的,术语“纯化的”、“去污的”和“灭菌的”指从样品中去除一种或多种污染物。
如本文使用的,术语“基本上纯化的”和“基本上分离的”指核酸序列,其从其天然环境中取出、分离或分开,并且优选60%不含、更优选75%不含且最优选90%不含它们与之天然结合的其他组分。“分离的多核苷酸”因此是基本上纯化的多核苷酸。预期为了实践本发明的方法,多核苷酸可以但无需是基本上纯化的。用于检测未纯化形式的核酸序列的多种方法是本领域已知的。
“扩增”定义为核酸序列的另外拷贝的产生,并且一般使用聚合酶链反应或本领域众所周知的其他技术执行(例如,Dieffenbach和Dveksler,PCRPrimer,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.[1995])。如本文使用的,术语“聚合酶链反应”(“PCR”)指K.B.Mullis的方法(在此引入作为参考的美国专利号4,683,195和4,683,202),其描述用于增加基因组DNA混合物中的靶序列区段浓度的方法,无需克隆或纯化。用于扩增靶序列的这个过程由下述组成:将大量过量的2种寡核苷酸引物引入包含所需靶序列的DNA混合物中,随后为在DNA聚合酶的存在下精确顺序的热循环。2种引物与其双链靶序列的分别链互补。为了实现扩增,将混合物变性,并且引物随后与其在靶分子内的互补序列退火。在退火后,引物由聚合酶延伸,以便形成新互补链对。变性、引物退火和聚合酶延伸步骤可以重复多次(即变性、退火和延伸构成一个“循环”;可以存在众多“循环”),以获得高浓度的所需靶序列的扩增区段。所需靶序列的扩增区段长度通过引物就彼此而言的相对位置确定,并且因此这个长度是可控制的参数。由于过程的重复方面,该方法被称为“聚合酶链反应”(下文“PCR”)。因为靶序列的所需扩增区段变成混合物中的占优势序列(就浓度而言),所以它们被说成是“PCR扩增的”。
如本文使用的,术语“聚合酶”指适合于在目的核酸扩增中使用的任何酶。该术语意图包含此种DNA聚合酶如得自水生栖热菌(Thermusaquaticus)的TaqDNA聚合酶,尽管耐热和不耐热的其他聚合酶也由这个定义包含。用PCR可能使基因组DNA中的特异性靶序列的单个拷贝扩增至可以通过几种不同方法检测(例如染色,与标记的探针杂交;生物素化引物的掺入随后为抗生物素蛋白质-酶缀合物检测;32P标记的脱氧核苷酸三磷酸例如dCTP或dATP掺入扩增区段内)的水平。除基因组DNA外,任何寡核苷酸序列都可以用合适的引物分子组进行扩增。特别地,由PCR过程自身产生的扩增区段自身是用于后续PCR扩增的有效模板。扩增的靶序列可以用于获得DNA区段(例如基因)用于插入重组载体内。
如本文使用的,术语“PCR产物”和“扩增产物”指在变性、退火和延伸的PCR步骤的2个或更多个循环完成后,所得到的化合物混合物。这些术语包含其中已存在一种或多种靶序列的一个或多个区段扩增的情况。
如本文使用的,术语“限制性内切核酸酶”和“限制酶”指细菌酶,其各自在或接近特异性核苷酸序列切割双链DNA。
如本文使用的,术语“互补的”或“互补性”关于由碱基配对规则而关联的多核苷酸(即核苷酸序列)使用。例如,对于序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可以是“部分的”,其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配。或者,可以存在核酸之间的“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著作用。这在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测法中具有特别的重要性。
术语“同源性”指互补性程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即同一性)。部分互补的序列是至少部分抑制完全互补序列与靶核酸杂交的序列,使用功能术语“基本上同源的”提及。完全互补序列与靶序列杂交的抑制可以使用杂交测定(DNA印迹或RNA印迹、溶液杂交等)在低严格条件下进行检查。基本上同源的序列或探针将在低严格条件下竞争且抑制完全同源的序列与靶的结合(即杂交)。这不是说低严格条件是这样的,从而使得允许非特异性结合;低严格条件要求2个序列彼此的结合是特异性(即选择性)相互作用。非特异性结合的不存在可以通过使用第二种靶进行测试,所述第二种靶甚至缺乏部分程度的互补性(即,小于约30%同一性);在不存在非特异性结合的情况下,探针将不与第二种非互补靶杂交。
可以采用众多等价条件以包括低或高严格条件;考虑因素,例如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等)以及盐和其他组分(例如,甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)的浓度,并且可以改变杂交溶液,以生成与上文列出的条件不同但等价的低或高严格杂交条件。如本文使用的,术语“杂交”包括“通过其核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何过程”(Coombs,DictionaryofBiotechnology,StocktonPress,NewYorkN.Y.[1994]。
“严格”一般在约Tm-5℃(低于探针的Tm5℃)到低于Tm约20℃-25℃的范围中发生。如本领域技术人员将理解的,严格杂交可以用于鉴定或检测相同多核苷酸序列,或鉴定或检测相似或相关多核苷酸序列。
如本文使用的,术语“杂交复合物”指由于互补G和C碱基之间以及互补A和T碱基之间的氢键形成在2个核酸序列之间形成的复合物;这些氢键可以通过碱基堆积相互作用进一步稳定。2个互补核酸序列氢键处于反向平行构型。杂交复合物可以在溶液(例如COt或ROt分析)中或在溶液中存在的一个核酸序列和与固体支持体(例如,如DNA印迹和RNA印迹、斑点印迹中采用的尼龙膜或硝化纤维素滤器,或如原位杂交包括FISH[荧光原位杂交]中采用的载玻片)固定的另一个核酸序列之间形成。
如本文使用的,术语“反义”关于RNA序列使用,所述RNA序列与特异性RNA(例如mRNA)或DNA序列互补。反义RNA可以通过任何方法产生,包括通过以反向方向使一种或多种目的基因与病毒启动子剪接来合成,所述病毒启动子允许合成编码链。一旦引入细胞内,这个转录的链就与由细胞产生的天然mRNA组合,以形成双链体。这些双链体随后阻断mRNA的进一步转录或其翻译。以这种方式,可以生成突变表型。术语“反义链”关于核酸链使用,所述核酸链与“有义”链互补。标记(-)(即“负的”)有时关于反义链使用,而标记(+)有时关于有义(即“正的”)链使用。
如本文使用的,术语“样品”以其最广泛的含义使用。怀疑包含核酸的生物学样品可以包括但不限于基因组DNA(在溶液中或与固体支持体结合例如用于DNA印迹分析)、cDNA(在溶液中或与固体支持体结合)等。
如本文使用的,术语“泌尿道”指参与尿从身体分泌和消除的器官和导管。
如本文使用的,术语“经肾DNA”和“经肾核酸”指已跨越肾屏障的核酸。如本文使用的,经肾DNA不同于miRNA。具体地,经肾DNA包括在3'和5'末端中的随机性,这在miRNA中不存在。
本发明通过下述实施例在下文进一步描述。实施例还举例说明用于实践本发明的有用方法。这些实施例不限制本发明。
实施例
实施例1:尿总核酸的纯化
尿制备:
将尿样品收集到容器中,所述容器能够容纳至少100ml的体积。
在排尿前,使收集杯预装填足够EDTA,以当容器充满时达到50mM的最终浓度(例如当用尿稀释到最多100ml时,10ml0.5MEDTA=50mM)。将尿样品贮存于-80℃。冷冻尿在室温解冻。
Q-琼脂糖步骤
对于10ml尿(在稀释前)的标准分批大小,使用1.0mlQ-琼脂糖浆(Q-琼脂糖原液:来自GEHealthcare的25ml大小;250μL树脂)。
尿NA与Q-琼脂糖的结合在50mL管中在室温(20-25℃)伴随旋转执行30分钟。通过在室温离心(800-1000xg进行5分钟)收集树脂,并且转移到空的一次性柱内。树脂用至少1mL0.3MLiCl/10mMNaOAc(pH5)洗涤2次。用750μL2MLiCl/10mMNaOAc洗脱NA。
硅石纯化:
从750μl缓冲液中的Q-琼脂糖NA洗脱的DNA补加有2.25mL95%EtOH,并且应用于硅石柱(Qiagen或等价物)。如果使用柱延伸,那么一次装载使用整个混合物,否则执行几次装载。使柱在台式微量离心机(Eppendorf)中离心1分钟。可替代地,使用真空歧管。
通过以5000rpm离心1分钟用在70%EtOH中的500μL2MLiCl洗涤硅石柱。随后为用75mMKOAcpH5.0,80%EtOH的2次洗涤。用100μL1mMTris-HCl(pH8.0)/0.025mMEDTA(pH8.0)洗脱NA。
常规地5μl用于25μlPCR反应。
实施例2.使用基因定位到E1基因的特异性PCR引物用于扩
增HPV个别基因型
测试引物,其设计为对单一类型的高危HPV特异,并且在E1基因的公开片段中作图。这些引物在表3中列出。在PCR中,每个正向引物以500nM浓度与相应反向引物配对。每个PCR,MgCl2的最终浓度是2mM,并且JumpStartTaqDNA聚合酶的最终浓度是1.25U/反应。与高危HPV类型对应的个别寡核苷酸以1000个拷贝/反应用作模板(参见,表2)。PCR产物的预测大小是47个碱基对(bp)。
根据下述程序执行扩增:
1个循环
94℃-2分钟(酶激活)
5个循环
94℃-30秒
65℃-2分钟
5个循环
94℃-30秒
60℃-1分钟
35个循环
94℃-30秒
55℃-1分钟
1个循环
72℃-5分钟
4℃-永久
反应产物在图2中呈现,其中从1到13的泳道编号分别与下述高危HPV基因型对应:16;18;31;33;35;39;45;51;52;56;58;59;68。分子量标记(“M”)是25bp梯。
表3
SEQ ID | HPV | 引物类型 | 序列 |
16 | 16 | 正向 | CAGGCAGAAACAGAGACAG |
17 | 18 | 正向 | CAGGCAGAGCTAGAGACAG |
18 | 31 | 正向 | CAGGCAGAAGCAGAGACAG |
19 | 33 | 正向 | CAGGCAGACACAGAGGCAG |
20 | 39 | 正向 | CAGGCAGAGCGTGAGACAG |
21 | 45 | 正向 | CAGGCAGAGCAAGAGACAG |
22 | 51 | 正向 | CAGGCGGAACAGGAGACAG |
23 | 52 | 正向 | CAGGCAGAACATGAGGCAG |
24 | 56 | 正向 | CAGGCAGACGCAGAAACAG |
25 | 58 | 正向 | CAGGCAGAAGCAGAGGCAG |
26 | 59 | 正向 | CAGGCAGAGCGCGAGACAG |
27 | 68 | 正向 | CAGGCGGAACAAGAGACAG |
28 | 16 | 反向 | TGCTTCCTGTGCAGTAAACAACG |
29 | 18 | 反向 | GACCTCCTGCGCATGGAACAATG |
30 | 31 | 反向 | CGCTTCCTGTGCATGAAACAATG |
31 | 33 | 反向 | CCCTTCCTGTATATTAAACAATG |
32 | 35 | 反向 | CTCCTCCTGTGCATGAAATAATG |
33 | 39 | 反向 | GGCCTCTTGCATATGTAAAAGTAC |
34 | 45 | 反向 | AACTTCCTGCGCATGGAACAATG |
35 | 51 | 反向 | TAATTCTTGGGCCTGAAACAACG |
36 | 52 | 反向 | CCCTTCCTGTGCATTAAACAATG |
37 | 56 | 反向 | TGCTGTTTGTACTTCCAACAATTG |
38 | 58 | 反向 | CCCTTCCTGTACATTAAACAACG |
39 | 59 | 反向 | CGCTTCCTCCACATTAAACAAGG |
40 | 68 | 反向 | TGTTTCTTGGACCTGAAACAACG |
实施例3:使用单个PCR引物对用于检测所有13种高危HPV
基因型
这个实验的目的是使用基因定位到HPVE1基因的目的片段中的单个引物对用于特异性检测13种高危HPV毒株中的所有或大部分,其不与低危配对物反应。SEOID41:5′-CAGGCAGAATTAGAGRCAGC-3′用作正向引物,并且SEOID42:5′-tccaccacaWACTTTCGTTTTA-3′用作反向引物。反向引物中的小写字母核苷酸是随机选择的尾,以调整引物的解链温度(Tm)。
特异性产物的预期大小是97bp。在PCR中,正向引物以800nM的浓度与反向引物配对。在这个反应中,MgCl2的最终浓度是3mM,并且JumpStartTaqDNA聚合酶的最终浓度是1.25U/反应。与高和低危HPV类型对应的个别寡核苷酸以1000个拷贝/反应用作模板(参见,表2)。
根据下述程序执行扩增:
1个循环
94℃-2分钟(酶激活)
40个循环
94℃-30秒
50℃-30秒
72℃-30秒
1个循环
72℃-5分钟
4℃-永久
反应产物在图3中呈现,其中从1到13的泳道编号分别与下述高危HPV基因型对应:16;18;31;33;35;39;45;51;52;56;58;59;68,并且泳道14和15分别与低危基因型6和11对应。分子量标记(“M”)是25bp梯。
实施例4:使用单个PCR引物对分析来自具有子宫颈癌的患者
的尿样品
基因定位到HPVE1基因的目的片段中的单个引物对用于特异性检测高危HPV基因型的DNA。具体地,SEQID41:5'-CAGGCAGAATTAGAGRCAGC-3'用作正向引物,并且SEQID42:5'-tccaccacaWACTTTCGTTTTA-3'用作反向引物。反向引物中的小写字母核苷酸是随机选择的尾,以调整引物的Tm。在PCR中,正向引物以800nM的浓度与反向引物配对。在这个反应中,MgCl2的最终浓度是3mM,并且JumpStartTaqDNA聚合酶的最终浓度是1.25U/反应。
根据实施例1中描述的规程提取来自尿样品的DNA。请求患者捐献2个尿样品:在早晨自己收集的第一个样品,和同一天(在24小时时间段内)稍后在医生办公室收集的第二个样品。获取子宫颈样品用于Digene测试。在100μl洗脱缓冲液中提取来自10ml尿的DNA,其中5μl用于PCR。
根据下述程序执行扩增:
1个循环
94℃-2分钟(酶激活)
40个循环
94℃-30秒
50℃-30秒
72℃-30秒
1个循环
72℃-5分钟
4℃-永久
反应产物在图4中呈现,其中从1到18的泳道编号代表具有子宫颈癌的患者的尿样品。奇数泳道编号代表自己收集的早晨尿样品,而偶数泳道编号代表同一天稍后在医生办公室由患者捐献的尿样品。具体地,泳道19包含来自健康志愿者的尿样品。泳道20包含水作为用于尿DNA纯化的对照。泳道21包含HPV16基因组DNA作为阳性对照。泳道22包含人基因组DNA(20,000基因组等价物)。泳道23包含低危HPV6和11模板的含糊(equivocal)混合物。并且泳道24是不包含寡核苷酸或DNA模板的反应对照。
实施例5:在单管PCR中使用所有HPV高危特异性PCR引物
对用于检测病毒:
代表高危基因型的寡核苷酸模板(参见,表2)通过PCR用所有高危特异性引物对的混合物进行扩增。在每个反应中,包括总共25种PCR引物(参见,表4)。在PCR中,各以200nM浓度使用的正向引物各自与各以300nM浓度使用的反向引物组合。在这个反应中,MgCl2的最终浓度是2mM,并且AmpliTaqDNA聚合酶的最终浓度是1.25U/反应。与高和低危HPV类型对应的个别寡核苷酸以1000个拷贝/反应用作模板(表3)。
根据下述程序执行扩增:
1个循环
94℃-10分钟(酶激活)
40个循环
94℃-30秒
60℃-30秒
72℃-30秒
1个循环
72℃-2分钟
4℃-永久
产物的预测大小是62bp。靶的足迹(footprint)是51bp。结果在图5中描述,其中从1到13的泳道编号分别与下述高危HPV基因型对应:16;18;31;33;35;39;45;51;52;56;58;59;68,并且泳道15和16分别与低危基因型6和11对应。分子量标记(“M”)是25bp梯。
表4
SEQ ID | HPV | 引物类型 | 序列 |
43 | 16 | 正向 | caactccatctACACAGGCAGAAACAGAGACAG |
44 | 18 | 正向 | caactccatctGAACAGGCAGAGCTAGAGACAG |
45 | 31 | 正向 | caactccatctAATCAGGCAGAAGCAGAGACAG |
46 | 33 | 正向 | caactccatctATACAGGCAGACACAGAGGCAG |
47 | 35 | 正向 | caactccatctATACAGGCAGAAACAGAGACAG |
48 | 39 | 正向 | caactccatctGTACAGGCAGAGCGTGAGACAG |
49 | 45 | 正向 | caactccatctGAACAGGCAGAGCAAGAGACAG |
50 | 52 | 正向 | caactccatctGAACAGGCAGAACATGAGGCAG |
51 | 56 | 正向 | caactccatctATACAGGCAGACGCAGAAACAG |
52 | 58 | 正向 | caactccatctACACAGGCAGAAGCAGAGGCAG |
53 | 59 | 正向 | caactccatctGTACAGGCAGAGCGCGAGACAG |
54 | 68 | 正向 | caactccatctAGTCAGGCGGAACAAGAGACAG |
55 | 16 | 反向 | TGCTTCCTGTGCAGTAAACAACGCATG |
56 | 18 | 反向 | GACCTCCTGCGCATGGAACAATGC |
30 | 31 | 反向 | CGCTTCCTGTGCATGAAACAATG |
57 | 33 | 反向 | CCCTTCCTGTATATTAAACAATGCC |
58 | 35 | 反向 | CTCCTCCTGTGCATGAAATAATGCTTG |
33 | 39 | 反向 | GGCCTCTTCCATATGTAAAAGTAC |
34 | 45 | 反向 | AACTTCCTGCGCATGGAACAATG |
35 | 51 | 反向 | TAATTCTTGGGCCTGAAACAACG |
36 | 52 | 反向 | CCCTTCCTGTGCATTAAACAATG |
59 | 56 | 反向 | GTGCTGTTTGTACTTGCAACAATTG |
38 | 58 | 反向 | CCCTTCCTGTACATTAAACAACG |
39 | 59 | 反向 | GGCTTCCTGCACATTAAACAAGG |
40 | 68 | 反向 | TGTTTCTTGGACCTGAAACAACG |
实施例6:在单管PCR中使用所有HPV高危特异性PCR引物
对用于检测病毒:
使用所有高危特异性引物对的混合物测试来自具有子宫颈癌的患者的尿样品。因此,PCR在每个反应中包含总共25种PCR引物(参见,表4)。在PCR中,各以200nM浓度使用的正向引物与各以300nM浓度使用的反向引物组合。在这个反应中,MgCl2的最终浓度是2mM,并且AmpliTaqDNA聚合酶的最终浓度是1.25U/反应。根据实施例1中描述的规程提取来自尿样品的DNA。使用在到医生办公室的就诊时收集的尿样品(参见实施例5)。在100μl洗脱缓冲液中提取来自10ml尿的DNA,其中5μl用于PCR。
根据下述程序执行扩增:
1个循环
94℃-10分钟(酶激活)
40个循环
94℃-30秒
60℃-30秒
72℃-30秒
1个循环
72℃-2分钟
4℃-永久
产物的预测大小是62bp。结果在图6中描述,其中从1到10的泳道编号具有子宫颈癌的患者的尿。具体地,泳道11包含人基因组DNA(20,000基因组等价物)。泳道12包含HPV18基因组DNA作为阳性对照。泳道13代表不包含寡核苷酸或DNA模板的反应对照。
实施例7:在单管PCR中使用HPV高危特异性引物亚组用于
检测病毒:
代表高危HPV基因型的寡核苷酸(表3)通过PCR使用高危HP亚群进行扩增,各以200nM浓度使用的正向引物各自与各以300nM浓度使用的反向引物组合。在这个反应中,使用总共20种引物(表5)。在这个反应中,MgCl2的最终浓度是2mM,并且AmpliTaqDNA聚合酶的最终浓度是1.25U/反应。与高和低危HPV类型对应的个别寡核苷酸以1000个拷贝/反应使用(表2)。
根据下述程序执行扩增:
1个循环
94℃-10分钟(酶激活)
40个循环
94℃-30秒
62℃-30秒
1个循环
72℃-2分钟
4℃-永久
产物的预测大小是62bp。靶的足迹是51bp。结果在图7中描述,其中从1到13的泳道编号分别与下述高危HPV基因型对应:16;18;31;33;35;39;45;51;52;56;58;59;68,并且泳道15和16分别与低危基因型6和11对应。分子量标记(“M”)是25bp梯。
表5
SEQ ID | HPV | 引物类型 | 序列 |
43 | 16 | 正向 | caactccatctACACAGGCAGAAACAGAGACAG |
44 | 18 | 正向 | caactccatctGAACAGGCAGAGCTAGAGACAG |
46 | 33 | 正向 | caactccatctATACAGGCAGACACAGAGGCAG |
48 | 39 | 正向 | caactccatctGTACAGGCAGAGCGTGAGACAG |
49 | 45 | 正向 | caactccatctGAACAGGCAGAGCAAGAGACAG |
50 | 52 | 正向 | caactccatctGAACAGGCAGAACATGAGGCAG |
51 | 56 | 正向 | caactccatctATACAGGCAGACGCAGAAACAG |
52 | 58 | 正向 | caactccatctAGACAGGCAGAAGCAGAGGCAG |
54 | 68 | 正向 | caactccatctAGTCAGGCGGAACAAGAGACAG |
55 | 16 | 反向 | TGCTTCCTGTGCAGTAAACAACGCATG |
56 | 18 | 反向 | GACCTCCTGCGCATGGAACAATGC |
30 | 31 | 反向 | CGCTTCCTGTGCATGAAACAATG |
57 | 33 | 反向 | CCCTTCCTGTATATTAAACAATGCC |
58 | 35 | 反向 | CTCCTCCTGTGCATGAAATAATGCTTG |
33 | 39 | 反向 | GGCCTCTTGCATATGTAAAAGTAC |
35 | 51 | 反向 | TAATTCTTGGGCCTGAAACAACG |
36 | 52 | 反向 | CCCTTCCTGTGCATTAAACAATG |
59 | 56 | 反向 | GTGCTGTTTGTACTTGCAACAATTG |
38 | 58 | 反向 | CCCTTCCTGTACATTAAACAACG |
39 | 59 | 反向 | GGCTTCCTGCACATTAAACAAGG |
实施例8:用于检测在印度在高和低危群体的尿中的高危HPV
的改良分子筛选测试
Xenomics经肾DNA(Tr-DNA)技术基于来自遍及身体垂死的细胞的DNA片段。这种DNA在血流中出现并且排泄到尿内。将尿样品的分析应用于检测来自具有男性胎儿的女性的Y染色体特异性DNA序列、在结肠直肠癌患者中的突变K-ras、和在具有肺结核的患者中的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)。
在这个研究中使用的HPVDNA测试涉及从尿中分离DNA和特异性扩增HPVE1区域,以检测已与子宫颈癌相关的高危HPV类型的存在。这些高危类型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68。DNA通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增,其中使用FAM标记的正向引物和未标记的反向引物。这些引物生成93-96碱基对(bp)扩增子,如通过毛细管电泳(CE)测定的。对于低危HPV类型6和11未观察到交叉反应性。获得的数据证实这种测试的灵敏度和特异性等价于或优于在临床使用中基于子宫颈刮术的目前测定的那些。
方法
样品收集
通过SimbiosysBiowaresInc.和MetropolisInc.从印度的高和低危群体中收集样品,包括来自分期的癌症患者的那些。从东印度的WestBengal中的医院中的STD诊所或地区妓院召募高危受试者。具体地,在这个研究中使用来自这个群体的270个预筛选的样品;已知270个样品中的51个(18.9%)通过QIAGENhc2测试是阴性的。从Mumbai中的健康营地召募不具有对疾病的已知素因的50个低危受试者。50个尿样品得自来自印度的一般人口的孕妇。根据由独立伦理学委员会包括IndianCouncilofMedicalResearch审阅的规程获得细胞学样品和尿样品,并且具有受试者的知情同意书。在商购可得的收集杯中收集尿。使尿样品达到至少50mMEDTA,在干冰上运送且贮存于-80℃直至进一步使用。
巴氏涂片和hc2测试
通过SimbiosysBiowaresInc.和MetropolisInc.执行巴氏涂片和hc2测试。收集的子宫颈样品的部分立即用于制备涂片用于巴氏测试,并且剩余物转移至缓冲液溶液用于通过QIAGENhc2的HPV测试。根据制造商的说明书,使用HRHPV探针混合物执行且分析hc2测试。推荐的阳性阈值1pg/ml用作截止,并且具有1.00或更大的相对光单位/对照(RLU/CO)比率的所有样品视为阳性的。
DNA分离
使贮存于-80℃的尿样品解冻且通过轻轻倒置混合。根据先前描述的规程执行DNA分离(ShekhtmanE.M.等人ClinChem2009;55:723-729)。简言之,使1:1尿:水样品与Q-琼脂糖树脂浆(GEHealthcare,Piscataway,NJ)温育。使树脂沉淀并且弃去上清液。使沉淀的树脂重悬浮且转移至旋转柱。去除重悬浮缓冲液并且洗涤树脂。通过2MLiCl从树脂中洗脱DNA。将洗脱物带到70%乙醇中且应用于QIAquick柱(QIAGEN,Hilden,德国)。用2MLiCl/70%EtOH随后为75mMKOAc(pH5.0)/80%EtOH洗涤柱。用EB缓冲液(QIAGEN,Hilden,德国)洗脱DNA且贮存于-20℃。通过Picogreen测定(LifeTechnologies)定量分离的DNA样品。
PCR和检测
引物XEN-HPV-FAM-F和XEN-HPV-R(表6)在PCR测定中使用。在用UNG(LifeTechnologies)处理10分钟后,在25μL中用600nM每种引物,3mMMgCl2,1.25单位AmpliTaqGoldDNA聚合酶(LifeTechnologies),各200μMdATP、dCTP、dGTP;和400μMdUTP执行扩增进行40个循环。每个循环是在95℃15秒和在50℃60秒。通过GENEWIZ(SouthPlainfield,NJ)对反应产物实施毛细管电泳。
DNA测序
使用不同引物组(表6)用JumpStartTMTaqDNA聚合酶(Sigma-Aldrich)和各种MgCl2浓度(2mM用于MY09/MY11和GP5+/GP6+,3mM用于XEN-HPV-F/-R)执行PCR扩增。对于每个引物对,对反应混合物实施各种循环步骤:95℃30秒、55℃45秒、72℃20秒,37个扩增循环(MY09/MY11);95℃15秒、40℃30秒、72℃10秒,50个扩增循环(GP5+/GP6+);95℃15秒、50℃60秒,45个扩增循环(XEN-HPV-F/-R)。通过在10%聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)上的电泳来分析PCR产物。根据QIAEXIIGelExtractionKit说明书(QIAGEN)切割且纯化凝胶切片,并且由用于PCR扩增的引物之一测序。通过GENEWIZInc.(SouthPlainfield,NewJersey)执行DNA测序。通过NCBIBlastn算法分析原始PCR产物序列,以匹配特异性人乳头瘤病毒毒株。
统计学分析
使用标准列联表方法(Excel2003,MicrosoftCorp.)分析数据。为了表征我们方法的效用,我们计算它与hc2测试的一致性和/或测序和诊断灵敏度、特异性以及阳性和阴性预测值(PPV和NPV)(Altman,D.G.和Bland,J.M.BMJ1994;309:102)。通过JavaStat对于上述参数的每一个计算95%置信区间。通过McNemar氏检验(X2)评估被比较的分析法之间的临界同质性。<0.05的P值视为统计学上显著的。使用Cohensκ统计量(K)评估测试之间的一致。0.4-0.6之间的K值视为具有中等一致,并且0.61-0.8的值视为具有相当大的一致(Landis,JR;Koch,GG.Biometrics.1977;33:159-174.doi:10.2307/2529310)。
表6
结果
通过XenomicsCE测定分析总共320个尿样品,用于与hc2测定和巴氏测试的相应子宫颈样品结果相比较。与hc2的比较结果显示于表7中。一致性是248/320(77.5%)。在320个尿样品中,72个给出与匹配的子宫颈样品hc2测定的不一致结果,并且通过DNA测序进一步检查。
不一致的DNA测序
使用产生约450bp产物的引物MY09/MY11首先尝试可替代扩增和测序。如果不能获得或测序高危HPV产物,那么使用GP5+/GP6+引物尝试测序,以生成约150bp的片段。这两个引物对检查HPVL1区域,不依赖于通过CE测定用于HPV检测的那种的位点。在MY09/MY11和/或GP5+/GP6+引物仅生成低危HPV的序列或不生成特异性产物时的情况下,XEN-HPV-F/-R引物用于扩增E1基因的88bp足迹,这可以提供高危HPVDNA序列的证据,如果任何所述序列存在于样品中的话。
在通过CE为反应性的且通过hc2为非反应性的38个不一致样品中,高危HPV类型在18个(47.4%)样品中通过L1区域(MY09/MY11和/或GP5+/GP6+引物)的DNA测序加以证实。另外进一步的13个样品通过使用XEN-HPV-F/-R引物显示具有高危HPV,从而产生包含高危HPV的总共31/38(81.6%)(表8)。
在通过hc2为反应性的但通过CE为非反应性的34个不一致样品中,高危HPV类型在4个样品中通过L1区域(MY09/MY11和/或GP5+/GP6+引物)的DNA测序加以证实。另外6个样品通过使用XEN-HPV-F/-R引物显示具有高危HPV类型。后面这些引物通过CE未能检测出样品,但扩增产物用于测序,可能是由于HPV的低滴度。这可能是因为使用XEN-HPV-F/-R引物用于检测的PCR执行40个循环,与用于测序的45个循环比较。当使用MY09/11和/或GP5+/GP6+引物对扩增时,后面6个样品不获得HPV产物或低危类型。总之,通过hc2为反应性的但通过CE不是的34个样品中的10个(29.4%)显示包含高危HPV(表8)。
XEN-HPV-F/-R引物与测序结果结合使用指出hc2测定生成比CE测试更多的假阳性和假阴性结果(表8)。Xenomics和hc2测试与对于这组患者的测序结果的一致性分别为55/72(76.4%)和17/72(23.6%)。CE测定未检测出具有HPV16的5个样品、HPV18的1个、HPV33的1个、HPV35的1个、HPV51的1个、和包含多重高危HPV类型(16+33)的1个(表9)。然而,因为它检测出具有除HPV51外的每个类型的其他样品,所以这些假阴性可能是由于低滴度(表10)。我们在我们的患者样品组中未发现HPV51的其他例子,但应当指出HPV51仅通过使用XEN-HPV-F/-R引物进行扩增且测序。
相比之下,hc2测定未检测出具有HPV16的13个样品、HPV18的6个、HPV31的1个、HPV35的1个、HPV45的2个、HPV52的1个、HPV58的1个和HPV59的2个、和包含多重高危HPV类型(16+45、16+33、16+56和18+31)的4个(表10)。通过hc2测试为非反应性的38个样品中的31个(81.6%)包含高危HPV。表11列出了需要使用XEN-HPV-F/-R引物用于待揭示的高危类型的31个样品中的13个。用L1区域引物(MY09/MY11和/或GP5+/GP6+引物)的第二次测序不获得检测的HPV或低危类型。
低危样品
CE测定检测出比hc2测定更多的高危HPV阳性女性,包括许多标记为ASCUS和正常的(表10)。由Simbiosys提供的一些样品分类为对照,具有正常巴氏结果但没有可用的hc2结果。其他通过巴氏涂片标记为正常的并且通过hc2标记为非反应性的。来自这些组的样品得自高危群体,包括STD诊所和妓院。我们测试了由Metropolis指定为低危的50个样品,具有正常或非恶性的临床诊断。50个中的3个(6.0%)通过hc2是反应性的,并且6个(12.0%)通过CE是反应性的。在这后面6个样品中,4个通过测序包含高危HPV(类型16、18和31),并且2个不包含HPVDNA的证据。
为了进一步检查HPV感染在假定低危群体中的流行,我们测定了来自得自印度的一般人口的孕妇的50个尿样品。无法获得来自这些患者的巴氏和hc2结果。在50个中,1个通过XenomicsCE测定是反应性的。DNA测序证实这个样品包含高危HPV45。
表7.hc2高危HPVDNA测试(QIAGEN)与XenomicsCE测试比较的列联表。
a一致性77.5%(248/320;CI95%,72-81%;p=0.7),灵敏度75.0%(102/136;CI95%,68.2-79%),特异性79.3%(146/184;CI95%,75.2-83%),PPV72.9%(102/140;CI95%,67-77%),NPV81.1%(146/180;CI95%,76-84%),K=0.53。
表8.XenomicsCE/hc2不一致与DNA测序比较的列联表。
b一致性76.4%(55/72;CI95%,65-84%;p=0.6),灵敏度75.6%(31/41;CI95%,66-82%),特异性77.4%(24/31;CI95%,64-82%),PPV81.6%(31/38;CI95%,71-89%),NPV70.6%(24/34;CI95%,59-79%),K=0.52。
表9.关于通过XenomicsCE测试为非反应性的样品的测序、巴氏和癌症分期数据。
a高危靶基因型以粗体显示。括号中的数目指病例数目。
表10.关于通过XenomicsCE测试为反应性的且通过hc2测试为非反应性的样品的测序、巴氏和癌症分期数据。
a高危靶基因型以粗体显示。括号中的数目指病例数目。
表11.hc2测试为非反应性的、CE测试为反应性的且仅通过E1区域引物对XEN-HPV-F/R检测出的高危HPV样品的测序。
a测序使用引物Xen-HPV-F/R完成。高危靶基因型以粗体显示。b测序使用文献引物MY09/11和/或GP5+/6+完成。
检查使用尿作为样品基质用于检测高危HPV的可行性。XenomicsHPV测试因此可以提议为定量筛选测试,从而消除巴氏测试或其他分子测试用于筛选的需要。
当与hc2测试相比较时,xenomicsHPV测试的一致性是77.5%(248/320,K=0.5;p=0.7),其中总体灵敏度和特异性分别为75.0%(102/136)和79.3%(146/184)(表7)。0.5的κ系数指示2个测试之间的中等一致。在分析的320个尿样品中,72个给出与基于子宫颈样品的hc2测定不一致的结果,并且通过DNA测序进一步检查用于分辨。DNA测序用作黄金标准,CE测试更灵敏和特异,具有分别10/180(5.6%)和7/140(5.0%)的证实的假阴性和假阳性比率。相比之下,hc2测定具有分别31/184(16.8%)和24/136(17.6%)的假阴性和假阳性比率(表7和8)。
通过hc2测试为非反应性的且通过Xenomics测试为反应性的大多数样品通过巴氏测试为ASCUS或正常细胞学。HPV类型16、18和45占错过的样品的16/38(42%)、7/38(18.4%)和4/38(10.5%)。高危人乳头瘤病毒类型16/18感染在印度人口中具有正常细胞学的女性中的流行先前已得到报道(GuptaS.等人Cytopathology2008;doi:10.1111/j.1365-2303,2008.00611)。在那个研究中在细胞学正常女性中的总体HPV流行是16.6%。HPV16在10.1%的女性检测出,而HPV18在1%的女性中检测出。先前还报道的是下述发现:当与其他基于PCR的测试比较时,QIAGENhc2测试在具有正常或CIN1细胞学的超过30岁的女性中具有较低的高危HPV检测(StevensM.P.等人JClinMicrobiol2007;45:2130-2137。我们取样群体的超过80%也是超过30岁的。
通过巴氏测试正常且通过hc2测试为非反应性的但通过Xenomics测试为反应性的一些样品具有伴随高和低危HPV类型的混合感染。这加强了我们靶向HPV的E1区域的引物可以在目前在使用中的标准测试无法的条件下检测出高危HPV的看法。靶向L1区域的引物不能检测出特定高危HPV类型(HPV48、51、52、68)先前已得到报道(DepuydtCE.等人JCellMolMed2007;11:881-891)。这可以通过这些样品中L1区域中的缺失加以解释。可替代地,MY09/MY11和GP5+/GP6+引物对是非特异性的;因此,低危HPV类型的存在或丰度可以打乱测序任何潜在高危HPV的尝试。
XenomicsHPV测试不能检测出在通过DNA测序证实的10个hc2反应性的样品中的高危HPV类型(表9)。10个样品中的6个分期为CIN2和更高。一个可能解释是HPVE1区域的缺失(Arias-PulidoH.等人JClinMicrobiol2006;44:1755-1762)。在6个样品中的3个中,仅XEN-HPV-F/-R引物生成PCR产物,其在测序后包含高危HPV。XEN-HPV-F/-R引物证实高危HPV33在第4个样品中的存在。这指出E1区域因此未缺失。与检测相反,用于测序的PCR条件,包括JumpStartDNA聚合酶和循环数目,可以提供更灵敏的扩增系统。HPVDNACE测定平衡灵敏度和特异性,从而使得一些低滴度HPV样品可能不能检测出。结果是与商购可得的测定比较具有更少假阳性和假阴性结果的测定。
表12考虑了当hc2结果与DNA测序组合时的测定比较,其中使用2种文献引物(MY09/MY11和/或GP5+/GP6+引物)和XEN-HPV-F/-R引物,以分辨不一致样品。在这种情况下,一致性是94.7%(303/320,K=0.89,p=0.6)。测定灵敏度是93.0%(133/143);特异性是96.0%(170/177)。阳性和阴性预测值分别为95.0%(133/140)和94.4%(170/180)。0.89的κ值指示2种方法之间的极佳一致。因此,与使用靶向HPV基因组L1和E1区域的引物的测序结果组合的QIAGENhc2测试看起来等价于我们的CE测定(p=0.6)。
因此,基于尿的HPV测试的灵敏度类似于或优于目前使用的基于子宫颈细胞分析的hc2测试。与其他基于尿DNA的研究相比较,CE测试的更高灵敏度可以通过几个因素加以解释。首先,在我们的实验中,从全尿而不是细胞级分中分离DNA。这在HPVDNA的总体回收中是关键的。除来自垂死的子宫颈细胞的交换染色质片段外,HPVDNA序列还可以由经肾DNA(Tr-DNA)贡献(MelkonyanH.S.等人AnnNYAcadSci2008;1137:73-81)。这个陈述得到下述事实支持:在测序实验中,我们设计为扩增更短扩增子(88bp)的引物检测出比设计为扩增更大的450bp扩增子的MY09/MY11引物更多的高危HPV。这些结果还证实使用较短DNA靶用于PCR增加尿样品中HPV检测的灵敏度。其次,用于尿DNA的基于Q-树脂的技术对于分离短DNA片段比基于硅石的方法更有效。
一些高危HPV检测差异可以起因于尿和子宫颈细胞取样的比较。不幸的是,在这个研究中无法获得子宫颈细胞用于直接比较。一些样品通过CE测定为非反应性的一个可能假设可以是应用于医院患者的不同卫生学规定的结果。
比较hc2测定与其他分子测定的众多报道已得到公开,然而,所有这些测定都基于来自患者的子宫颈细胞。这是使用靶向HPV基因组的E1区域的引物检测出来自尿的HPVDNA的第一篇报道。这篇报道还提出了关于在印度和其他发展中国家的女性中筛选高危HPV的巴氏和hc2测试使用的问题。来自子宫颈癌的发病率和死亡率在这些国家中在很大程度上仍是不受控制的,主要是因为筛选程序的缺乏或无效。因为样品收集的非侵袭性和简单性对于筛选测试的接受是重要的,所以使用简单尿收集代替子宫颈细胞刮术可以增强在发达和发展中国家用于子宫颈癌的HPV筛选测试的实现。
表12.与CE测定结果相比较,DNA测序与hc2结果的组合:包括文献引物(MY09/MY11和/或GP5+/GP6+引物)和XEN-HPV-F/-R引物测序结果,以分辨CE/hc2不一致结果。
b一致性94.7%(303/320;CI95%,91.7-96.6%;p=0.6),灵敏度93.0%(133/143;CI95%,89.6-95%),特异性96.0%(170/177;CI95%,93.3-97.8%),PPV95.0%(133/140;CI95%,91.6-97%),NPV94.4%(170/180;CI95%,91.8-96%),K=0.89。
*证据由hc2反应性的结果和/或高危HPV的存在组成,如通过DNA测序证实的。
Claims (10)
1.一种组合物,其包括关于人乳头瘤病毒(HPV)的分离的遗传标记,所述遗传标记包括由SEQIDNO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97编码的序列。
2.一种组合物,其包括SEQIDNO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97的互补序列。
3.一种组合物,其包括关于高危人乳头瘤病毒(HPV)的分离的遗传标记,所述遗传标记包括由SEQIDNO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85编码的序列。
4.一种组合物,其包括由SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的序列编码的寡核苷酸。
5.一种组合物,其包括SEQIDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的互补序列。
6.一种组合物,其包括关于人乳头瘤病毒(HPV)的分离的遗传标记,所述遗传标记包括与HPV的E1基因同源的序列。
7.权利要求6的组合物,其中所述序列包括HPV的E1基因的核苷酸987–1135。
8.权利要求6的组合物,其中所述序列由SEQIDNO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96或97编码。
9.一种诊断患者中的人乳头瘤病毒(HPV)感染的方法,其包括:
(a)从所述患者中获得尿样品;和
(b)检测所述尿样品中HPV的E1基因的一个或多个序列;其中检测出HPV的E1基因的一个或多个序列指示至少一种人乳头瘤病毒的存在,从而诊断患者中的HPV感染。
10.权利要求9的方法,其中所述核酸是DNA。
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