CN105378112B - 用于将用MDM2拮抗剂进行患者癌症治疗个人化的基于mRNA的基因表达 - Google Patents

用于将用MDM2拮抗剂进行患者癌症治疗个人化的基于mRNA的基因表达 Download PDF

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Abstract

本申请公开了预测患有癌症的患者对于用本申请公开的式I、II和III的MDM2拮抗剂进行治疗的响应性的方法，所述方法包括测量作为预测响应的生物标记物的至少MDM2、优选为包括MDM2、XPC、BBC3和CDKN2A的四基因面板的mRNA表达水平。

Description

用于将用MDM2拮抗剂进行患者癌症治疗个人化的基于mRNA的 基因表达
背景技术
TP53基因编码肿瘤抑制蛋白，肿瘤抑制蛋白在癌症发展期间起到关键性的保护作用。P53在多细胞生物体中非常重要，其中P53调节细胞周期，由此用作参与预防癌症的肿瘤抑制物。此外，P53是转录因子，调节参与细胞控制(例如凋亡、DNA修复和衰老)的多个基因。
在非应激条件下，p53蛋白的水平是由MDM2(鼠双微染色体2)经由负反馈环控制，其中MDM2转录由p53驱动。MDM2蛋白结合于TP53蛋白并阻断其激活域。MDM2也可用作p53泛素连接酶，其对于泛素依赖性降解标记p53。
在过度表达MDM2的细胞中，P53是非活化的，导致无效的生长阻滞和凋亡。阻断P53--MDM2相互作用可恢复P53功能，可能是癌症治疗的新方法。用MDM2拮抗剂治疗肿瘤细胞应该能够使p53介导其下游功能，包括基因转录的激活以及细胞周期阻滞和凋亡的诱导。
TP53突变在急性髓细胞白血病(AML)中是罕见的，通常不认为其在这些恶性肿瘤的发展中是最重要的。但是，已经发现MDM2在AML中频繁过度表达，并且可通过废除p53功能而增强致瘤潜能和抗凋亡性。已经发现，AML细胞系和16个具有野生型p53的主要的aAML样品通过诱导产生p53-依赖性凋亡响应于MDM2拮抗剂(抑制剂)。这些发现支持了以下原理：以p53-MDM2相互作用为目标作为AML的治疗策略。
根据药物作用的推测机理，对于这类期待有效的药物，需要存在功能p53蛋白和有关途径效应分子。并非所有患者都将需要功能p53蛋白和有关途径效应分子。为了更好确定患者是否可以受益于治疗，需要研究预测分子试验，用于确定最可能对治疗有响应的患者。评价对MDM2拮抗剂的潜在响应的一种方法是是评价TP53基因是否突变。但是，以下事实会让这变得复杂：在癌症情况下，在TP53中可发现大量突变。并非所有这些突变都会干扰p53蛋白的活性，进一步使解释TP53突变试验变得复杂。而且，在野生型TP53细胞系和患者中，存在一系列对MDM2拮抗剂的响应。因此，由容易解释的诊断工具预测对MDM2拮抗剂的响应性的能力是MDM2拮抗剂的临床开发未满足的需求。为此，匹配p53途径活性的的基因表达标签的开发可提供选择最有可能对MDM2拮抗剂治疗响应的患者的方法。
发明内容
一方面，本发明涉及预测患癌症患者对治疗的响应的方法，其中所述患者治疗包括用担当MDM2-p53相互作用的抑制剂的化合物进行治疗，所述方法包括以下步骤：
a)测量从对象预获得的标本中的水平，从而得到代表该水平的一个或多个值；和
b)将来自步骤a)的一个或多个值与标准值或标准值组进行比较。
担当MDM2-p53相互作用的抑制剂(MDM2-抑制剂，MDM2-拮抗剂)的化合物是本领域公知的。MDM2-抑制剂及其制备方法公开于，例如，美国专利8,354,444B2，以及WO 2007/063013，WO 2010/031713和WO 2011/098398，其通过参考全部并入本申请。另外的MDM2-抑制剂公开于WO 2013/135648，其通过参考全部并入本申请。
美国专利8,354,444B2、以及WO 2010/031713、WO 2011/098398公开了，例如，式I、II和IIa的化合物
Figure BDA0000897694410000021
WO 2013/135648公开了，例如，式III的化合物
Figure BDA0000897694410000031
一方面，本发明涉及预测患有癌症的患者对于治疗的响应的方法，其中患者治疗包括用担当MDM2-p53相互作用的抑制剂、优选为MDM2-抑制剂的化合物进行治疗，该化合物特别公开于美国专利8,354,444B2的工作实施例，或WO 2007/063013、WO 2010/031713、WO2011/098398和WO 2013/135648。
另一方面，本发明涉及治疗有需患者的肿瘤病、癌症的方法，包括测量取自患者的标本中的水平以得到代表该水平的一个或多个值，和用如上定义的通式I化合物或其药用衍生物治疗对象。
基于MDM2响应是潜在可治疗的“肿瘤病”是癌症。在一种实施方式中，癌症选自乳癌，前列腺癌，子宫颈癌，卵巢癌，胃癌，结肠直肠癌(即，包括结肠癌和直肠癌)，胰腺癌，肝癌，脑癌，神经内分泌癌，肺癌，肾癌，血液恶性肿瘤，黑素瘤和肉瘤。在另一种实施方式中，癌症选自血液恶性肿瘤，前列腺癌，乳癌，子宫颈癌，卵巢癌，结肠直肠癌，黑素瘤和肺癌。再在另一种实施方式中，癌症是急性髓细胞白血病(AML)，或骨髓增生异常综合症(MDS)，或骨髓增生性肿瘤(MPN)。
再另一方面，本发明涉及预测对于如上限定化学式的化合物或其药学上可接受的衍生物的响应的成套用品，包括测量标本中水平所必需的试剂。更优选地，成套用品也包括比较器组件，该组件标准值或标准值组,将其与样品中的响应水平进行比较。成套用品也可以包括专属试剂(captive reagent)。
更优选地，成套用品包括MDM2抑制剂，优选为MDM2-抑制剂，如特别公开于美国专利8,354,444B2，或WO 2007/063013，WO 2010/031713，WO 2011/098398和WO 2013/135648；或根据式IIa或III的化合物；或本申请公开的特定的MDM2-抑制剂。
本发明基于体外和临床数据确定基因表达标签(mRNA)面板，所述数据确定最可能响应于MDM2拮抗剂治疗的患者。mRNA标签的特征在于上调至少三个基因，特别是MDM2、XPC(着色性干皮病，互补组C)、BBC3(BCL2结合组分(binding component)3)，以及下调CDKN2A(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A)。
本发明确定用于确认对于MDM2拮抗剂的响应的4-基因表达标签(mRNA)。
本发明也确定用于监测用MDM2拮抗剂治疗患者癌症的4-基因表达标签(mRNA)。
MDM2、BBC3、CDKN2A、和XPC的基线表达水平得到的综合得分可对有治疗抗性的细胞系和源于患者的临床样品进行分辨，并确定对治疗敏感(响应)的那些。
因此，本发明涉及用于确定对MDM2拮抗剂治疗的灵敏性的方法。此外，本发明涉及通过经由基因标签(mRNA)面板预先测试患者灵敏性来用MDM2拮抗剂治疗癌症患者的方法，更特别涉及包括MDM2的面板，更特别涉及4-基因表达系统。
本发明进一步提供利用mRNA值确定MDM2拮抗剂治疗对癌症(特别是AML)的有效性的预测性标签。
本发明涉及包含至少MDM2基因的基因面板作为预测机制的用途，用于确定当欲用MDM2拮抗剂治疗患者时，患者对于疾病、特别是癌症、更特别是急性髓细胞白血病(AML)的响应。
更特别地，本发明涉及使用四基因面板以便于确定当欲用MDM2拮抗剂治疗患者时患者对于疾病、特别是AML的响应。
附图说明
图1：这一大纲提供了构成本发明的工作顺序。
图2：MDM2拮抗剂体外响应mRNA标签。
上图：最敏感(IC50<＝1)和最耐受(IC50>＝10)的细胞系的与MDM2拮抗剂有关的四基因mRNAs(原始彩色版本的图中，绿色对应于较低的表达，红色对应于较高的表达)的响应的热图。对于最敏感的细胞系，MDM2、XPC和BBC3显示高表达，CDKN2A显示低表达。对于各细胞系，TP53突变特征在热图的上部(白色＝野生型)。自然log IC50值显示在下部。
下图：最敏感(IC50<＝1)和最耐受(IC50>＝10)的细胞系的4-基因mRNA标签得分的箱线图。
图3：MDM2拮抗剂在AML试验中响应mRNA标签。
上图：28个被评价患者的与MDM2拮抗剂有关的四基因mRNAs(在原始彩色版本中红色对应于较高的表达)响应的热图。对于每个患者，TP53突变特征在热图的上部(白色＝野生型)。临床效果组显示在下部。
下图：28个被评价患者的4-基因mRNA标签得分的箱线图。
图4A和4B：在AML试验中三种生物标记/生物标签的观测者操作特性(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)。四基因mRNA标签得分显示AUC 0.82，MDM2mRNA单生物标记物显示AUC0.5；P53突变状态生物标记物显示AUC 0.52。
具体实施方式
在一种实施方式中，用于本发明方法的MDM2-抑制剂是任何MDM2-抑制剂，优选MDM2-抑制剂，特别是公开于美国专利8,354,444B2，或WO 2007/063013，WO 2010/031713，WO 2011/098398和WO 2013/135648的那些。
在一种实施方式中，用于本发明方法的MDM2-抑制剂是式I的化合物及其药学上可接受的盐和酯
Figure BDA0000897694410000051
其中
X选自H，F，Cl，Br，I，氰基，硝基，乙炔基，环丙基，甲基，乙基，异丙基，乙烯基和甲氧基，
Y是独立选自以下的一至四个基团：H，F，Cl，Br，I，CN，OH，硝基，低级烷基，环烷基，低级烷氧基，低级烯基，环烯基，低级炔基，芳基，杂芳基，杂环，COOR’，OCOR’，CONR’R”，NR’COR”，NR”SO2R’，SO2NR’R”和NR’R”，其中
R’和R”独立选自H，低级烷基，取代的低级烷基，低级环烷基，取代的低级环烷基，低级烯基，取代的低级烯基，低级环烯基，取代的低级环烯基，芳基，取代的芳基，杂芳基，取代的杂芳基，杂环，或取代的杂环。
在R’和R”的情况下，它们可以独立地连接以形成选自以下的环状结构：取代或未取代的环烷基，取代或未取代的环烯基，取代或未取代的杂芳基或取代或未取代的杂环，
R1和R2之一选自低级烷基，取代的低级烷基，低级烯基，取代的低级烯基，芳基，取代的芳基，杂芳基，取代的杂芳基，杂环，取代的杂环，环烷基，取代的环烷基，环烯基，和取代的环烯基，另一个是氢或低级烷基，
R3是H或低级烷基，
R4和R5之一选自低级烷基，取代的低级烷基，低级烯基，取代的低级烯基，芳基，取代的芳基，杂芳基，取代的杂芳基，杂环，取代的杂环，环烷基，取代的环烷基，环烯基，和取代的环烯基，另一个是氢，
R6和R7选自(CH2)n-R’，(CH2)n-NR’R”，(CH2)n-NR’COR”，(CH2)n-NR’SO2R”，(CH2)n-COOH，(CH2)n-COOR’，(CH2)n-CONR’R”，(CH2)n-OR’，(CH2)n-SR’，(CH2)n-SOR’，(CH2)n-SO2R’，(CH2)n-COR’，(CH2)n-SO3H，(CH2)n-SONR’R”，(CH2)n-SO2NR’R”，(CH2CH2O)m-(CH2)n-R’，(CH2CH2O)m-(CH2)n-OH，(CH2CH2O)m-(CH2)n-OR’，(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’R”，(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’COR”，(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’SO2R”，(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOH，(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOR’，(CH2CH2O)m-(CH2)n-CONR’R”，(CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2R’，(CH2CH2O)m-(CH2)n-COR’，(CH2CH2O)m-(CH2)n-SONR’R”，(CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2NR’R”，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-R’，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-OH，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-OR’，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’R”，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’COR”，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-NR’SO2R”，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOH，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COOR’，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-CONR’R”，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2R’，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-COR’，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-SONR’R”，(CH2)p-(CH2CH2O)m-(CH2)n-SO2NR’R”，-COR’，-SOR’和SO2R’，其中R’和R”如上所述，
m、n和p独立地为0至6。
在该实施方式中，优选的式I化合物可以具有如式II所示的立体化学结构：
Figure BDA0000897694410000071
在一种实施方式中，用于本发明方法的MDM2-抑制剂是式IIa的化合物
Figure BDA0000897694410000072
其中
R6是-(CH2)n-R’，和
R’是环己基，或5至10元单环或双环芳族烃，其中1或2个碳原子可以由N、S或O替代，并且其中任何上述环己基或芳族烃可以由下述基团取代一次或两次，所述基团独立选自低级烷基，低级烯基，低级炔基，二氧代-低级亚烷基(形成例如苯并二氧基)，卤素，羟基，CN，CF3，NH2，N(H，低级烷基)，N(低级烷基)2，氨基羰基，羧基，NO2，低级烷氧基，硫代-低级烷氧基，低级烷基磺酰基，氨基磺酰基，低级烷基羰基，低级烷基羰基氧基，低级烷氧基羰基，低级烷基-羰基-NH，氟-低级烷基，氟-低级烷氧基，低级烷氧基-羰基-低级烷氧基，羧基-低级烷氧基，氨基甲酰基-低级烷氧基，羟基-低级烷氧基，NH2-低级烷氧基，N(H，低级烷基)-低级烷氧基，N(低级烷基)2-低级烷氧基，低级烷基-1-环氧乙烷基-低级烷氧基-低级烷基，2-氧代-吡咯烷-1-基，(1,1-二氧代)-2-异噻唑烷，3-低级烷基亚硫酰基，取代或未取代的杂环，取代或未取代的芳环，取代或未取代的杂芳环，三氟-低级烷基磺酰基氨基-芳基，低级烷基磺酰基氨基羰基，低级烷基磺酰基氨基羰基-芳基，羟基氨基甲酰基-苯基，苄氧基-低级烷氧基，单低级烷基或二低级烷基取代的氨基磺酰基，以及可任选取代有卤素、羟基、NH2、N(H，低级烷基)或N(低级烷基)2的低级烷基；和
n是0或1。
在该实施方式中，优选式IIa的化合物，其中
R6是-(CH2)n-R’，和
R’是苯基，吡啶基，吡嗪基或嘧啶基，它们各自可以是未取代的或由取代基取代一次或两次，所述取代基独立选自卤素，C1-6烷氧基，C1-6烷基，羟基羰基，羧基，羧基C1-6烷氧基，氧代和CN；和
n是0。
在另一种实施方式中，用于本发明方法是MDM2-抑制剂是式III的化合物或其药学上可接受的盐或酯
Figure BDA0000897694410000081
其中
X选自H，F，Cl，Br，I，氰基，硝基，乙炔基，环丙基，甲基，乙基，异丙基，乙烯基和甲氧基，
Y是1-4个独立选自以下的基团：H，F，Cl，Br，I，CN，OH，硝基，低级烷基，环烷基，低级烷氧基，低级烯基，环烯基，低级炔基，
Z是低级烷氧基，
R1选自低级烷基，取代的低级烷基，低级烯基，取代的低级烯基，芳基，取代的芳基，杂芳基，取代的杂芳基，杂环，取代杂环，环烷基，取代的环烷基，环烯基，和取代的环烯基，
R2是取代的苯基，选自：
Figure BDA0000897694410000091
W是F、Cl或Br，
V是H或F，
R3选自氢，低级烷基或取代的低级烷基，
R4选自：
Figure BDA0000897694410000092
R5选自低级烷基，取代的低级烷基，杂环，取代的杂环，环烷基，取代的环烷基，天然和非天然氨基酸，-(OCH2CH2)n-OH，-(OCH2CH2)n-OCH3，-(NCH2CH2)n-OH，-(NCH2CH2)n-OCH3和-(OCH2CH2)n-OP(O)(OR6)2，其中
n为3至60，优选为3至45，
R6是氢或苄基。
在该实施方式中，优选式III的化合物或其药学上可接受的盐，其中
X选自H、F或Cl，
Y选自H、F或Cl，
R1是低级烷基或取代的低级烷基，
R3是氢或低级烷基，
R5选自低级烷基，取代的低级烷基，天然和非天然氨基酸，-(OCH2CH2)n-OH，-(OCH2CH2)n-OCH3，-(NCH2CH2)n-OH，-(NCH2CH2)n-OCH3，-(OCH2CH2)n-OP(O)(OR6)2，其中
n为3至60，优选为3至45，和
R6是氢。
此外，在该实施方式中，优选式III的化合物或其药学上可接受的盐，其中
X选自H、F或Cl；
Y选自H、F或Cl；
Z是C1-6烷氧基；
R1是C1-6烷基；
R2是
Figure BDA0000897694410000101
其中
W是F、Cl或Br；
V是H或F；
R3是氢或C1-6烷基；
R4是-C(O)-R5；其中
R5选自-(OCH2CH2)n-OH；-(OCH2CH2)n-OCH3；和-(OCH2CH2)n-OP(O)(OR6)2，其中n为3至60，R6是氢。
更特别地，n是3至55，更优选地，n是3至45。在该实施方式中，其中R5是-(OCH2CH2)n-OCH3且n为40至60的化合物是特别优选的。
在说明书中，当指明时，各种基团可以由1-5个、或优选为1-3个独立选自以下的取代基取代：低级烷基，低级烯基，低级炔基，二氧代-低级亚烷基(形成例如苯并二氧基)，卤素，羟基，CN，CF3，NH2，N(H，低级烷基)，N(低级烷基)2，氨基羰基，羧基，NO2，低级烷氧基，硫代-低级烷氧基，低级烷基磺酰基，氨基磺酰基，低级烷基羰基，低级烷基羰基氧基，低级烷氧基羰基，低级烷基-羰基-NH，氟-低级烷基，氟-低级烷氧基，低级烷氧基-羰基-低级烷氧基，羧基-低级烷氧基，氨基甲酰基-低级烷氧基，羟基-低级烷氧基，NH2-低级烷氧基，N(H，低级烷基)-低级烷氧基，N(低级烷基)2-低级烷氧基，低级烷基-1-环氧乙烷基-低级烷氧基-低级烷基，2-氧代-吡咯烷-1-基，(1,1-二氧代)-2-异噻唑烷，3-低级烷基亚硫酰基，取代或未取代的杂环，取代或未取代的芳环，取代或未取代的杂芳环，三氟-低级烷基磺酰基氨基-芳基，低级烷基磺酰基氨基羰基，低级烷基磺酰基氨基羰基-芳基，羟基氨基甲酰基-苯基，苄氧基-低级烷氧基，单低级烷基或二低级烷基取代的氨基磺酰基，以及可以任选取代有卤素、羟基、NH2、N(H，低级烷基)或N(低级烷基)2的低级烷基。对于环烷基、环烯基、芳基、杂芳基和杂环，优选的取代基是卤素，低级烷氧基，低级烷基，羟基羰基，羧基，羧基低级烷氧基，氧代和CN。对于烷基，优选的取代基是烷氧基和N(低级烷基)2。
术语“烷基”是指具有1至约20个碳原子的直链或支链的饱和烃基，包括具有1至约7个碳原子的基团。在某些实施方式中，烷基取代基可以是低级烷基取代基。术语“低级烷基”是指具有1至6个碳原子、在某些实施方式中为1至4个碳原子的烷基。烷基的实例包括但不限于，甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，和仲戊基。
如本申请使用，“环烷基”意在表示任何稳定的单环或多环体系，其仅由碳原子组成，其任何环均为饱和的，术语“环烯基”意在表示任何稳定的单环或多环体系，其仅由碳原子组成，其至少一个环是部分不饱和的。环烷基的实例包括但不限于，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，金刚烷基，环辛基，二环烷基，包括二环辛烷例如[2.2.2]二环辛烷或[3.3.0]二环辛烷，二环壬烷例如[4.3.0]二环壬烷，和二环癸烷例如[4.4.0]二环癸烷(十氢化萘)，或螺环化合物。环烯基的实例包括但不限于，环戊烯基或环己烯基。
本申请使用的术语“烯基”表示不饱和的直链或支化的脂族烃基，其包含一个双键并且具有2至6个碳原子、优选为2至4个碳原子。这种“烯基”的实例是乙烯基，烯丙基，异丙烯基，1-丙烯基，2-甲基-1-丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，2-乙基-1-丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，4-甲基-3-戊烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基和5-己烯基。
本申请使用的术语“炔基”表示不饱和的直链或支化的脂族烃基，其包含一个三键并且具有2至6个碳原子、优选为2至4个碳原子。这种“炔基”的实例是乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，3-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，3-戊炔基，4-戊炔基，1-己炔基，2-己炔基，3-己炔基，4-己炔基和5-己炔基。
定义中使用的术语“卤素”表示氟，氯，溴，或碘，优选为氟和氯。
“芳基”表示一价的单环或双环的芳族碳环烃基，优选为6-10元芳环体系。优选的芳基包括但不限于苯基，萘基，甲苯基，和二甲苯基。当芳基是双环的时，优选的基团是1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-5-基。
“杂芳基"表示包含至多两个环的芳族杂环体系。优选的杂芳基包括但不限于，噻吩基，呋喃基，吲哚基，吡咯基，吡啶基，吡嗪基，
Figure BDA0000897694410000121
唑基，噻唑基(thiaxolyl)，喹啉基，嘧啶基，咪唑取代或未取代的三唑基，和取代或未取代的四唑基。
在芳基或杂芳基为双环的情况下，应该理解，一个环可以是芳基，而另一个环是杂芳基，并且两个都是取代或未取代的。
“杂环”表示取代或未取代的5至8元的单环或双环的非芳族烃，其中1至3个碳原子由杂原子替代，杂原子选自氮、氧或硫原子。实例包括吡咯烷-2-基；吡咯烷-3-基；哌啶基；吗啉-4-基等，其可以是取代的。“杂原子”表示选自N、O和S的原子。
“烷氧基或低级烷氧基”是指连接于氧原子的任何以上低级烷基基团。典型的低级烷氧基包括甲氧基，乙氧基，异丙氧基或丙氧基，丁氧基等。烷氧基的含义进一步包括多个烷氧基侧链，例如乙氧基乙氧基，甲氧基乙氧基，甲氧基乙氧基乙氧基等和取代的烷氧基侧链，例如，二甲基氨基乙氧基，二乙基氨基乙氧基，二甲氧基-磷酰基甲氧基等。
本申请使用的术语“mPEG”表示甲氧基聚乙二醇，其可商购(例如Sigma-Aldrich或ID Biochem(韩国))。mPEG的分子量分布可以依据制造商和/或批次变化。在本发明的一种实施方式中，mPEG的平均分子量(MW)为约1500Da至约3000Da。在本发明的另一种实施方式中，mPEG的平均MW为约2000Da至约2200Da。平均MW通过MALDI-TOF质谱法测定。
“药学上可接受的衍生物”例如药学上盐和酯、载体、赋形剂表示药学上可接受且对于给药于特定化合物的对象基本上无毒性。
“药学上可接受的盐”是指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留本发明化合物的生物学效果和性质并且由适宜的非毒性有机或无机酸或有机或无机碱形成。样品酸加成盐包括源自无机酸的那些以及源自有机酸的那些等，所述无机酸例如为氢氯酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸和硝酸，所述有机酸例如为对甲苯磺酸，水杨酸，甲磺酸，草酸，琥珀酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸，富马酸，三氟乙酸。样品碱加成盐包括源自氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠和氢氧化季铵(例如四甲基氢氧化铵)的那些。将药物化合物(即，药剂)化学改性成盐是制药化学家公知的技术，从而获得改善的化合物的物理和化学稳定性，收湿性，流动性和溶解性。参见，例如，Ansel et al.，Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(6th Ed.1995)在pp.196和1456-1457。
在一种实施方式中，用于本发明方法的MDM2-抑制剂是下式的4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸
Figure BDA0000897694410000131
该化合物及其制备方法例如公开于WO 2011/098398。
根据本发明的另一种具体化合物是
2-((1-(4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4-(4-氯-2-氟苯基)-4-氰基-5-新戊基吡咯烷-2-甲酰胺基)-3-甲氧基苯甲酰氧基)乙氧基)羰基氨基)乙酸。
根据本发明的另一种具体化合物是
2-(((4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4-(4-氯-2-氟苯基)-4-氰基-5-新戊基吡咯烷-2-甲酰胺基)-3-甲氧基苯甲酰氧基)甲氧基)-羰基氨基)乙酸。
根据本发明的另外的化合物是
4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4-(4-氯-2-氟苯基)-4-氰基-5-新戊基吡咯烷-2-甲酰胺基)-3-甲氧基苯甲酸3-氧代-2,4,7,10,13,16,19-七氧杂二十烷基(heptaoxaicosyl)酯。
根据本发明的具体化合物是
4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-mPEG-羰基氧基-乙酯(mPEG，平均MW，～2000)。
根据本发明的具体化合物是
4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-mPEG-羰基氧基-乙酯(mPEG，平均MW，～2200)
根据本发明的具体化合物是
4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-mPEG-羰基氧基-甲酯(mPEG，平均MW，～2000)。
根据本发明的具体化合物是
4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4-(4-氯-2-氟苯基)-4-氰基-5-新戊基吡咯烷-2-甲酰胺基)-3-甲氧基苯甲酸3-氧代-2,4,7,10,13-五氧杂十四烷基酯；
根据本发明的具体化合物是
4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4-(4-氯-2-氟苯基)-4-氰基-5-新戊基吡咯烷-2-甲酰胺基)-3-甲氧基苯甲酸27-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,28-十氧杂三十烷-29-基酯。
根据本发明的具体化合物是
4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-[(2R,3R,4R,5S)-2-((R)-1,2-二羟基-乙基)-4,5-二羟基-四氢呋喃-3-基氧基羰基氧基]-乙酯。
根据本发明的另一种具体化合物是
4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-(2-{2-[2-(2-二苄氧基磷酰氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基羰基氧基)-乙酯。
同样，根据本发明的具体化合物是
4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-(2-{2-[2-(2-膦酰氧基-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基羰基氧基)-乙酯。
同样，根据本发明的具体化合物是
4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-mPEG-羰基氧基-乙酯(mPEG，平均MW，～2000)
Figure BDA0000897694410000151
平均MW：～2695
该化合物及其制备方法例如公开于WO 2013/135648。
同样，根据本发明的具体化合物是
4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-mPEG-羰基氧基-乙酯(mPEG，平均MW，～2200)
Figure BDA0000897694410000152
平均MW：～2900
该化合物及其制备方法例如公开于WO 2013/135648。
同样，根据本发明的具体化合物是式(A)的化合物，也命名为化合物A(RG7112)
Figure BDA0000897694410000161
该化合物及其制备方法例如公开于WO 2007/063013。
在癌症细胞系集合中建立MDM2拮抗剂治疗预测标签。
为生成MDM2拮抗剂治疗预测标签，将体外MDM2拮抗剂治疗的响应与基因表达概况分析(图1)合并。统称为肿瘤学细胞系(Cell Lines for Oncology)(CELLO)的一整排281人类癌症细胞系代表不同人类癌症肿瘤类型的宽范围组，使用几种高通量的基因组技术平台对所述细胞系进行评价。通过外显子测序确定来自各细胞系的核酸的突变状态。经由RNA测序获得在MDM2拮抗剂治疗之前基线处的信使RNA(mRNA)表达水平。MDM2拮抗剂治疗化合物A在本申请有时称为RG7112，其响应通过本领域技术人员已知的试验获得，例如RNA测序和使用基因芯片人基因组(Gene Chip Human Genome)U133Plus 2.0试验进行的微阵测量。MDM2治疗响应通过高通量筛选试验获得。根据它们对化合物A的响应，将这些细胞系分类为敏感的(规定为IC50<＝1)，或耐受的(规定为IC50>＝10)。
Figure BDA0000897694410000162
化合物A(RG7112)
表1：CELLO细胞系
Figure BDA0000897694410000163
Figure BDA0000897694410000171
Figure BDA0000897694410000181
Figure BDA0000897694410000191
Figure BDA0000897694410000201
Figure BDA0000897694410000211
Figure BDA0000897694410000221
Figure BDA0000897694410000231
Figure BDA0000897694410000241
Figure BDA0000897694410000251
Figure BDA0000897694410000261
Figure BDA0000897694410000271
Figure BDA0000897694410000281
在细心注释去除了低质量细胞和生殖系突变之后，在281个细胞系之中，210个细胞系显示TP53突变。细胞系聚藏(harboring)突变TP53对MDM2拮抗剂治疗(P<2.2x10-16)的灵敏性远远较小，这与之前公开的数据一致。但是，在使用TP53突变状态作为化合物A的潜在预测生物标记物中观察到两点问题。首先，尽管不希望受理论限制，但是几种TP53突变的细胞系显示对化合物A的敏感响应，最有可能是因为它们聚藏非功能性TP53突变，例如22Rv1，DU145，KMS-12-BM，KMS-26，LCLC-103H，LN-18，MKN-45，NCI-H2122，NCI-H226，PC-9，SW1463。
一些其它的试验方法包括但不限于a)免疫组织化学(IHC)分析，b)蛋白质免疫印迹法，c)免疫沉淀法，d)酶联免疫吸附剂测定(ELISA)，e)放射免疫测定，f)荧光激活细胞分选法(FACS)，g)质谱法，包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI，例如MALDI-TOF)和电喷雾电离质谱法(ESI--MS)。
评定对MDM2拮抗剂的潜在响应的一种方法是评定TP53基因是否突变。但是，以下事实会让这变得复杂：在癌症情况下，在TP53中可发现大量突变。并非所有这些突变都会干扰p53蛋白的活性，进一步使解释TP53突变试验变得复杂。而且，在野生型TP53细胞系和患者中，存在一系列对MDM2拮抗剂的响应。因此，由容易解释的诊断工具预测对MDM2拮抗剂的响应性的能力是MDM2拮抗剂的临床开发未满足的需求。为此，匹配p53途径活性的的基因表达标签的开发可提供选择最有可能对MDM2拮抗剂治疗响应的患者的方法。
为此，进行基线mRNA表达和MDM2拮抗剂治疗响应(IC50)之间的全基因组关联分析，确定显著相关的13个基因的清单，其中P为2.38x10-47至9.56x10-23。
功能注释表明，来自全基因组关联分析且相关系数为-0.47至-0.31(其中一个正相关，0.28)的13个重要基因在有关的MDM2-P53相互作用或下游P53途径(包括细胞周期阻滞和凋亡)中是已知的调节子(参见表2)。在它们之中，MDM2是排名第4位的基因，对与体外灵敏性相关的MDM2过度表达，这与之前公开的数据一致。
检测至少一种选自BAX、RPS27L、EDA2R、XPC、DDB2、FDXR、MDM2、CDKN1A、TRIAP1、BBC3、CCNG1、TNFRSF10B、或CDKN2A的基因的水平，和使用该水平作为预测患者对化合物的响应的生物标记物，其中所述化合物是MDM2-p53相互作用的抑制剂。
因此，在一种实施方式中，本发明提供预测患癌症患者对治疗的响应性的方法，所述方法包括检测至少一种根据表2的基因的水平，和使用该水平作为预测所述患者对化合物的响应的生物标记物，其中所述化合物是MDM2-p53相互作用的抑制剂(MDM2-抑制剂)。在该实施方式中，本发明也提供预测所述患者对用MDM2-抑制剂进行治疗的响应的方法，所述方法包括检测包括根据表2的2个、或3个、或4个、或5个、或6个、或7个、或8个、或9个、或10个、或11个、或12个、或检测全部13个基因的总水平。此外，在该实施方式中，检测根据表2的所述基因或基因组合也可用于监测所述患者在用所述MDM2-抑制剂进行治疗期间的响应以便于决定所述治疗是否将要继续进行。仍在该实施方式中，所述方法包括以下步骤：
a)从患者采集标本；
b)测量所述标本中根据表2的至少一种基因的水平；
c)将所述得自患者的水平与标准值例如得自患有相同癌症的患者的值进行比较；和
d)将担当MDM2-p53相互作用的抑制剂的化合物给药。
如果本发明方法用作患者对治疗的响应的预测方法，则在治疗开始之前获得a)中的标本，如果本发明方法用于治疗监测，则在治疗过程中获得标本。
根据本发明，术语“检测(或测量)水平”优选表示检测(或测量)mRNA表达水平。
在另一种实施方式中，本发明提供至少一种根据表2的基因或其组合，其用作确定癌症患者对用本申请定义的MDM2-抑制剂进行治疗的响应的生物标记物。术语“癌症”如本申请定义，优选为AML(参见第4页)。
为进一步构建mRNA标签，通过向上模式选择过程(upward model selectionprocedure)在13个基因之中建立多元逻辑回归分类器。mRNA标签包括：三种基因包括MDM2、XPC(着色性干皮病，互补组C)、BBC3(BCL2结合组分3)的上调，以及肿瘤抑制基因CDKN2A细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2a的下调。
表2：来自全基因组关联分析的重要基因表达预测表
Figure BDA0000897694410000301
Figure BDA0000897694410000311
最终的标签能够用观测者操作特性(ROC)曲线下面积，即0.93(95％CI0.92至0.95，表3)，来将MDM2拮抗剂灵敏性细胞系与MDM2拮抗剂耐受性细胞系区分，该值由10倍交叉效度分析估算。因此，MDM2拮抗剂灵敏性细胞系证明MDM2、XPC、和BBC3的基线上调，和CDKN2A的基线下调；而MDM2拮抗剂耐受性细胞系的特征在于MDM2、XPC、和BBC3的下调以及CDKN2A的上调。(参见图2)。
表3：来自预测性生物标记物的预计
Figure BDA0000897694410000312
Figure BDA0000897694410000321
a.在CELLO中，响应者定义为IC50<1；非响应者定义为IC50>10
b.在NO21279中，响应者定义为CR/MLFS；非响应者定义为HI/PD
c.特异性：得分或MDM2表达低于相应的约登指数的非响应者的比例
d.灵敏性：得分或MDM2表达高于相应的约登指数的响应者的比例
e.特异性：具有TP53突变的非响应者的比例
f.灵敏性：具有野生型TP53的响应者的比例
除了目标基因MDM2之外，标签中的其它三个基因作为MDM2-p53相互作用或下游p53途径中的调节子全部有生物学支持。XPC基因在涉及修复损伤DNA、有助于损伤识别、开放复合物形成、和修复蛋白复合物形成方面起到重要作用。BBC3mRNA水平通过暴露于DNA-损伤剂和通过介导DNA损伤诱导的凋亡的p53诱导。CDKN2A、p16和p14ARF的两种基因产物都与主要肿瘤途径关联；特别是p14ARF，其通过将MDM2隔离在核仁中来抑制MDM2功能。为检验与mRNA标签有关的分子机制，将mRNA标签得分与P53突变状态和在MDM2-P53相互作用和下游P53途径中涉及的关键调控基因关联。
如图2所示，具有低标签得分的细胞系最有可能是p53突变体；而具有高标签得分的细胞系最有可能是p53野生型(P<2.2x10-16)。参见表4中的各细胞系的p53突变状态。此外，具有野生型TP53但是具有低标签得分的大多数耐受性细胞系在MDM2-P53相互作用和下游P53途径中涉及的关键调控基因中聚藏突变。这表明，标签得分可以用作MDM2-P53途径功能的代替性mRNA-水平指示物。
表4：p53突变状态
Figure BDA0000897694410000331
Figure BDA0000897694410000341
Figure BDA0000897694410000351
Figure BDA0000897694410000361
Figure BDA0000897694410000371
Figure BDA0000897694410000381
Figure BDA0000897694410000391
Figure BDA0000897694410000401
Figure BDA0000897694410000411
为检验遍及所研究的肿瘤类型中mRNA标签得分的特异性预测能力，并且为了确定由标签得分得到的预测不会被肿瘤谱系干扰，检查CELLO中每种可获得的肿瘤类型的标签得分。
表5：在MDM2-p53相互作用和下游p53途径中涉及的关键调控基因的mRNA标签得分和突变状态之间的相关性
Figure BDA0000897694410000421
为接近在各种技术平台下测量的标签鲁棒性，检查标签mRNA表达以及RNA测序鉴定和微阵量化之间的综合得分。
用来自NO21279白血病试验的标本在临床环境中测试MDM2拮抗剂预测性mRNA响应标签的性能(图1)。招收28个在MTD治疗的AML患者，完成预治疗和C1D10(周期1，第10天)采样。患者由年龄中值为59岁的18个男性和10个女性组成(表6)。NO21279中的临床终点分为4类：完全响应(CR)，形态学上无白血病状态(MLFS)，血液改善(HI)，和进展性疾病(PD)。在单剂量(周期1第2天，C1D2)和给药最后一天(周期1第10天，C1D10)之后，在基线筛选处收集白血病血液标本和骨髓活检标本，并通过
Figure BDA0000897694410000431
分离法进行分离11。白血病血液标本中MDM2拮抗作用的早期药物动力学效果通过测量基线和C1D10之间的MDM2RT PCR变化评定。对于在基线、C1D2和C1D10获得的外周血白血病细胞和骨髓活检标本，产生组成全局基因表达图谱。
生物标记物面板测量过程之前已经报道过11。TP53突变的分析通过Caris LifeSciences(Irving，TX，USA)使用基于PCR的和基于微阵的AmpliChip TP53试验(开发中，Roche Molecular Systems，Pleasanton，CA，USA)进行。该试验报告外显子2-11中的单核苷酸取代或缺失以及它们的剪接位点11，14。MDM2mRNA浓度在Roche Molecular Systems通过实时定量PCR用来自MACs从血液分离的白血病细胞的50ng总RNA评定。同时使用两种不同的荧光报道分子设计TaqMan(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)探针来检测MDM2mRNA和参照mRNA，即β-葡糖醛酸酶。基因表达图谱使用Affymetrix U133Plus 2.0微阵产生。
基于肿瘤标本评估，28个患者中的23个具有野生型TP53，5个患者具有TP53突变(表6)。在第1天，在28个研究的患者之中，RG7112的24小时(AUC0-24h)的曲线下面积的中值是190,315ng*h/mL(IQR：119,032-242,857ng*h/mL)。28个患者的临床响应包括3个CR，4个MLFS，6个HI和15个PD。来自C1D10的标本中的中值MDM2mRNA表达相对于基线增加了2.46倍(IQR：1.62-4.59)，证明源自MDM2转录的p53活化的药物动力学生物标记物响应。药物暴露量与患者的临床响应显著相关(p＝0.002)。15个PD患者中的8个具有不足的暴露量，定义为AUC0-24h小于150,000ng*h/mL；而仅1个患者在其它三个类别里具有不足的暴露量。
表6：临床试验的详情
试验 NO21279 NO21280 NP22890
肿瘤类型 AML 晚期恶性肿瘤 脂肪肉瘤
患者数目 28 22 14
平均年龄(SD) 53.3(17.6) 57.1(15.0) 61.4(14.5)
女性数目(％) 10(35) 11(50) 6(43)
具有P53突变的患者数目 5 0 2
对于28个患有AML的患者的每一个，通过将MDM2、BBC3、XPC加在一起，减去在基线处的CDKN2A表达水平，计算确定的4-基因标签得分。在标签得分和患者对MDM2拮抗剂治疗的临床响应(PD<Hl<MLFS<CR)之间存在显著相关性(斯皮尔曼相关系数0.58，P＝6.6x10-4)。标签得分也与患者的药物动力学生物标记物响应显著相关，通过从基线到C1D10的MDM2mRNA变化测得(斯皮尔曼相关系数0.41，P＝0.02)。对于15个具有足够高暴露量的患者的子集，标签得分和患者临床响应之间的相关性进一步增强，定义为AUC0-24h高于150,000ng*h/mL的患者(斯皮尔曼相关系数0.64，P＝5.2x10-3)。
该4基因标签面板能够区分在用MDM2抑制剂按照以下方式治疗之后响应类别中的AML患者：将CR/MLFS患者与PD/Hl患者区分，其中ROC曲线的AUC为0.82，并能将CR/MLFS/Hl患者与PD患者区分，其中AUC为0.83。相反，作为单独生物标记物的MDM2mRNA表达仅可将CR/MLFS患者与PD/Hl患者区分(AUC为0.51)，和将CR/MLFS/Hl患者与PD患者区分(AUC为0.61)。使用标签得分15的分界点，在MDM2拮抗剂治疗之前的基线处，将患者分类成可能的响应者组和可能的非响应者组，其中灵敏性为100％，特异性为71％。因此，标签面板具有显著的潜力可用作MDM2拮抗剂治疗的伴随预测性生物标记物，从而选择最可能响应的AML患者的子集；并避免暴露最不可能响应的AML患者。
因此，在一种实施方式中，本发明提供确定可能对包括给药MDM2抑制剂的治疗响应的患癌症患者的方法，所述方法包括，
a)从所述患者采集标本；
b)测量所述标本中MDM2mRNA的表达水平；
c)将得自所述患者的MDM2mRNA表达水平与得自患有相同癌症的患者的标准值进行比较；和
d)将担当MDM2-p53相互作用的抑制剂的化合物给药。
“标准值”例如是按照本申请定义的患者标签得分的分界点值(分界点或参考水平)。
在另一种实施方式中，本发明提供确定可能对包括MDM2抑制剂的治疗响应的患癌症患者的体外方法，所述方法包括，
a)测量得自治疗前患者的标本中MDM2、XPC、BBC3和CDKN2A的mRNA表达水平；
b)将在a)中获得的表达水平应用于数学方程以便于计算患者的标签得分；
c)将得自b)的所述患者标签得分与参考水平进行比较；和
d)当患者标签得分高于所述参考水平时，将所述患者确定为较可能对包括所述MDM2抑制剂的治疗响应的患者。
在一种实施方式中，高于参考水平的患者标签得分表明患者对利用MDM2抑制剂的治疗的响应的高可能性，而低于所述水平的标签得分表明所述患者对该治疗较不可能响应。
在一种实施方式中，在a)中获得的标本是白血病血液标本，或骨髓活检标本。
在另一种实施方式中，b)中的患者标签得分如下计算：在基线(即，在治疗之前)测量的log2-转换的mRNA表达水平的总和乘以体外观察方向，定义为标签得分＝GMDM2+GXPC+GBBC3–GCDKN2A。在该实施方式中，在基线的mRNA表达水平通过微阵测量法、优选通过使用GeneChip Human Genome U133Plus 2.0Array测量。同样，在该实施方式中，在基线的mRNA表达水平可以通过RNA测序测量。
在一种实施方式中，使用GeneChip Human Genome U133Plus 2.0Arraymeasurement(“微阵技术”或“微阵测量法”)计算的患者标签得分的参考水平为14.0或14.5。在另一种实施方式中，患者标签得分的参考水平为15。在优选的实施方式中，患者标签得分的参考水平为15.4(通过约登指数选择)。
在另一种实施方式中，患者标签得分根据通过RT PCR测量法获得的mRNA表达水平计算。使用RT PCR计算的患者标签得分可能与基于微阵技术计算的值不同。但是，在根据本发明的该实施方式内，通过这些方法之间建立的相关性，可将基于RT PCR的患者标签得分转化为当使用微阵技术时获得的值，如本领域技术人员公知。
在另一种实施方式中，当在基线的mRNA表达水平通过RT-PCR测量时，b)中的患者标签得分由运算法则1计算：在基线(即，在治疗之前)测量的log2转换的相对表达水平(Δ-CP)的总和，乘以体外观察方向，定义为标签得分＝GMDM2+GXPC+GBBC3–GCDKN2A，其中G＝Δ-CP，因此Δ-CPMDM2＝CPhousekeeper-CPMDM2，Δ-CPXPC＝CPhousekeeper-CPXPC，Δ-CPBBC3＝CPhousekeeper-CPBBC3，Δ-CPCDKN2A＝CPhousekeeper-CPCDKN2A。“housekeeper”基因是TMEM。
如果在相同组的患者标本上测量，得自RT-PCR的标签得分的测量值(基于以上运算法则1)与得自GeneChip Human Genome U133Plus 2.0Array的标签得分测量值相关，其中相关系数为0.79。在该实施方式中，得自RT-PCR测量的患者标签得分的参考水平为约2.0、或2.10或2.20。仍在该实施方式中，患者标签得分的参考水平为2.26(通过约登指数选择)。
再在另一种实施方式中，当通过RT-PCR测量在基线的mRNA表达水平时，b)中的患者标签得分也可以由运算法则2计算：在基线(即在治疗之前)测量的相对表达水平(2Δ-CP)的总和，乘以体外观察方向，定义为标签得分＝GMDM2+GXPC+GBBC3-GCDKN2A，其中G＝2Δ-CP，Δ-CP在运算法则1中定义。“housekeeper”基因是TMEM。
如果在相同组的患者标本上测量，得自RT-PCR的标签得分的测量值(基于以上运算法则2)与得自GeneChip Human Genome U133Plus 2.0Array的标签得分测量值相关，其中相关系数为0.63。在该实施方式中，得自RT-PCR测量的患者标签得分的参考水平为约4.10、或4.20或4.30。仍在该实施方式中，患者标签得分的参考水平为4.34(通过约登指数选择)。
在一种实施方式中，癌症是血液肿瘤，优选为AML，或MDS，或MPN。
在另一种实施方式中，癌症是实体肿瘤，例如肺、前列腺、结肠、头部、颈部、或胰腺的癌症，或者肉瘤或黑素瘤。
在一种实施方式中，MDM2-抑制剂是特别公开于以下文献的化合物，美国专利8,354,444B2，或WO 2007/063013，WO 2010/031713，WO 2011/098398和WO 2013/135648；或根据式I、II、IIa或III的化合物，或其组合，优选为式IIa或III的化合物。
在另一种实施方式中，MDM2抑制剂是本申请限定的化合物A(RG7112)。
再在另一种实施方式中，MDM2抑制剂是下式化合物4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸
Figure BDA0000897694410000471
再在另一种实施方式中，MDM2抑制剂是下式化合物4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-mPEG-羰基氧基-乙酯(mPEG，平均MW，～2000)：
Figure BDA0000897694410000472
(平均MW：～2695)
再在另一种实施方式中，MDM2抑制剂是化合物4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-mPEG-羰基氧基-乙酯(mPEG，平均MW，～2200)：
Figure BDA0000897694410000481
(平均MW：～2900)
再在另一种实施方式中，本申请提供使用基因表达(mRNA)标签来预测患者对于利用MDM2抑制剂(拮抗剂)的治疗的响应。在该实施方式中，当在基线测量时，即当在用MDM2抑制剂(拮抗剂)治疗之前测量时，“基因表达标签”是4-基因mRNA标签，由MDM2、XPC、和BBC3的高表达以及CDKN2A的低表达组成。
标签得分测量值也与患者的药物动力学生物标记物响应(MDM2表达变化)相关。实施例5中所示的数据证明，根据本发明的4mRNA标签得分也是用于监测包括MDM2抑制剂的癌症治疗的功效的药物动力学生物标记物。因此，在另一种实施方式中，提供了在患癌症患者中监测包括如上限定的MDM2抑制剂的治疗的功效的体外方法，所述方法包括
a)测量得自治疗前患者的标本中MDM2、XPC、BBC3和CDKN2A的mRNA表达水平；
b)将在a)中获得的表达水平应用于数学方程，以便于计算治疗前患者的标签得分的值；
c)在开始用所述MDM2抑制剂进行治疗之后重复步骤a)和b)；和
d)将在开始治疗之后获得的标签得分与在治疗之前获得的那些进行比较，其中治疗后较高的标签得分表明患者对该治疗的响应，因此推荐继续该治疗。
在该实施方式中，MDM2抑制剂如上文定义。癌症是实体肿瘤或AML。a)中获得的标本是白血病血液标本，或骨髓活检标本。同样在该实施方式中，治疗过程中的标签得分优选在治疗开始后(即在开始将MDM2抑制剂给药后)第10天获得。在开始给药MDM2抑制剂之后第10天标签得分之差是在基线(即，在治疗之前)测量的得分的至少1.20倍。在优选的实施方式中，在开始给药MDM2抑制剂之后第10天标签得分是在治疗之前测量的得分的约1.23至约1.26倍，这表明患者对治疗有响应，治疗应该继续。
根据式I、II、III的化合物或其组合或其药学上可接受的衍生物可以用于人体或动物体(对象)(患者)的预防性处理或特别是治疗性处理，特别是用于治疗肿瘤病(癌症)。这样的癌症的实例包括但不限于，上皮性肿瘤，鳞状细胞肿瘤，基底细胞肿瘤，移行细胞乳头状瘤和恶性上皮肿瘤，腺瘤和腺癌，附近和皮肤附件肿瘤，粘液表皮样瘤，囊性肿瘤，粘液性和浆液性肿瘤，导管、小叶和髓样肿瘤，腺泡细胞肿瘤，复性上皮肿瘤(complexepithelial neoplasms)，特化性腺肿瘤(specialized gonadal neoplasms)，副神经节瘤和血管球瘤，痣和黑素瘤，软组织肿瘤和肉瘤，纤维瘤，粘液瘤，脂肪瘤，肌瘤，复杂混合肿瘤和间质瘤(complex mixed and stromal neoplasms)，纤维上皮性肿瘤，滑膜样肿瘤，间皮瘤，生殖细胞肿瘤，滋养层细胞肿瘤，中肾瘤，血管瘤，淋巴管肿瘤，骨肿瘤和软骨瘤，巨细胞瘤，杂骨肿瘤(miscellaneous bone tumours)，牙源性肿瘤，神经胶质瘤，神经上皮瘤(neuroepitheliomatous neoplasms)，脑膜瘤，神经鞘瘤，颗粒细胞肿瘤和腺泡状软组织肉瘤，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，其它淋巴网状内皮细胞肿瘤，血浆细胞肿瘤，肥大细胞肿瘤，免疫增生性疾病，白血病，杂骨髓增生性疾病(miscellaneousmyeloproliferative disorders)，淋巴组织增生性疾病和骨髓增生异常综合征。
特别优选地，根据本发明的疾病是肿瘤病，癌症，更特别是AML。
就受影响的器官或身体部分而言癌症的实例包括但不限于，乳房，子宫颈，卵巢，结肠，直肠，(包括结肠和直肠，即，结肠直肠癌)，肺，(包括小细胞肺癌，非小细胞肺癌，大细胞肺癌和间皮瘤)，骨，内分泌系统，肾上腺，胸腺，肝，胃，肠，(包括胃癌)，胰，骨髓，恶性血液病，(例如淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤)，膀胱，尿路，肾，皮肤，甲状腺，脑，头，颈，前列腺和睾丸。优选地，癌症选自乳癌，前列腺癌，子宫颈癌，卵巢癌，胃癌，结肠直肠癌，胰腺癌，肝癌，脑癌，神经内分泌癌，肺癌，肾癌，恶性血液病，黑素瘤和肉瘤。特别优选地，癌症选自乳癌，子宫颈癌，卵巢癌，结肠直肠癌，黑素瘤和肺癌。更特别优选地，癌症选自肺癌，黑素瘤，卵巢癌和结肠直肠癌。在另一种优选的实施方式中，对于预期的耐受性是获得的耐受性的情况，癌症是肺癌或卵巢癌。再在另一种优选的实施方式中，对于预期的耐受性是固有耐受性的情况，癌症选自结肠直肠癌，肺癌或黑素瘤。
治疗方法
本发明也涉及治疗方法，其中首先相对于标准水平或标准水平组或预治疗起始水平建立来自患者的标本对于灵敏性的活性水平，然后将MDM2-抑制剂给药。优选地，所述MDM2-抑制剂是如上定义的通式I、II、III的化合物或其药学上可接受的衍生物，更优选为式IIa或III的化合物或其药学上可接受的衍生物。所述化合物可以按药物组合物形式给药，这是本领域技术人员公知的。特别优选地，对于温血动物，尤其是人类，组合物的给药形式为例如鼻腔给药，口腔给药，直肠给药，或特别是口服给药，对于肠胃外给药，例如为静脉注射给药，肌肉给药或皮下给药。更特别地，优选静脉注射给药组合物。
通式I、II或III的化合物、优选为通式IIa或III的化合物或其药学上可接受的衍生物可以单独给药或者以与一种或多种其它治疗试剂的组合给药。可能的组合治疗可以采取的形式为固定组合，或将本发明化合物和一种或多种其它治疗试剂错开给药或彼此独立给药，或固定组合和一种或多种其它治疗试剂的组合给药。
除此之外，通式I、II或III的化合物、优选为通式IIa或III的化合物或其药学上可接受的衍生物可以特别针对肿瘤治疗与以下的组合进行给药：化疗(细胞毒疗法)，靶向治疗，内分泌治疗，放疗免疫疗法，外科手术，或这些的组合。如上所述，关于其它治疗策略，长期治疗与辅助治疗是均等可能的。其它可能的治疗是在肿瘤退化之后维持患者状态的治疗，或甚至是对于例如风险患者的化学预防性治疗。
成套用品和装置
一方面，本发明涉及预测响应的成套用品，另一方面，涉及预测响应的装置，优选为对象(或患者)的癌症对通式I、II、III的化合物、优选为通式IIa或III的化合物或其药学上可接受的衍生物的响应，如本申请限定，包括测量MDM2基因所必需的试剂。
成套用品和装置也可以优选包括比较器组件，其包括标准值或标准值组,将其与标本中MDM2的水平进行比较。在优选的实施方式中，比较器组件包括在成套用品的使用说明中。在另一种优选的实施方式中，比较器组件的形式为显示装置，例如颜色带或数字编码的材料，将其设计放在紧邻标本测量的读出器旁边以指示耐受性水平。标准值或标准值组可以如上所述确定。
以下实施例说明本发明但不限制本发明。
实施例
实施例1
CELLO细胞系的RNA测序
通过下一代测序(NGS)技术进行的RNA测序(RNA-seq)是测量基因表达的精确而灵敏的方法，其中附加动力用于检测选择性剪接，等位基因特异性表达，非编码RNA，以及各种形式的突变(SNP，插入和缺失，基因融合)。NGS Illumina HiSeq机器以50或100bp长度的读出(reads)产生原始碱基呼叫(raw base calls)，使其进行几个数据分析步骤。RNA-seq以40至50百万读出/样品进行。该数目对于检测低表达基因提供相对较高的灵敏度，同时使得可进行换算的标本复合(multiplexing)。RNA由标准成套用品制备，而RNA文库由polyATruSeq Illumina成套用品制备。对于各RNA-seq反应，使用100ng的mRNA/细胞系。对于每种标本，多种质量控制程序应用于RNA-seq数据。Illumina HiSeq软件报告了每个泳道中装载的簇(DNA片段)的总数，通过测序质量过滤器的百分比(其可鉴定由于过装载和测序化学带来的误差)，每个序列读出的每个碱基的phred质量得分，对于每个测序周期的总体平均phred得分，以及总百分比误差(基于与参考基因组的比对)。对于每个RNA-seq标本，计算包含线粒体和核糖体RNA的读出的百分比。FASTQC包用于提供另外的QC指标(碱基分布，序列复制，过度出现的序列(overrepresented sequences)，和富集的kmer)和图表汇总。最后，使用Picard工具包，其提供另外的RNA-seq指标，包括估计
Figure BDA0000897694410000511
偏好性(bias)(由在标本制备中使用多聚腺苷酸捕集(poly-A capture)或引发cDNA合成造成)，匹配到外显子、内含子和基因区间的读出的百分比。
实施例2
CELLO细胞系的Exom测序
化合物A体外试验
将281种细胞用MDM2拮抗剂处理，产生IC50(治疗响应)。细胞系跨越了广泛范围的肿瘤细胞类型的衍生。
在细心注释去除了低质量细胞和生殖系突变之后，在评价的281种细胞系之中，210种细胞系显示TP53中的突变。在测试的7种AML细胞系之中，5种显示TP53中的突变。容纳突变型TP53的细胞系对MDM2拮抗剂治疗的灵敏性远远较小(P<2.2x10-16)，这与之前公开的数据一致。基线mRNA表达和MDM2拮抗剂治疗响应(IC50)之间的全基因组关联鉴定出显著相关的13种基因的清单，其中P-值为2.38x10-47至9.56x10-23(补充表2)。功能注释表明，来自全基因组关联分析且相关系数为-0.47至-0.31(其中一个正相关，0.28)的13种重要基因在有关的MDM2-P53相互作用或下游P53途径(包括细胞周期阻滞和凋亡)中是已知的调节子(补充表2)。在它们之中，MDM2是排名第4位的基因，MDM2过度表达与体外灵敏性相关，这与之前公开的数据一致。
定义多变量逻辑回归分类器，其包含：包括MDM2、XPC(着色性干皮病，互补组C)、BBC3(BCL2结合组分3)的三种基因的上调，和肿瘤抑制基因CDKN2A(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A)的下调(表2)。最终标签能够将MDM2拮抗剂灵敏性细胞系与MDM2拮抗剂耐受性细胞系区分，其中AUC为0.93(95％CI 0.92至0.95)。因此，MDM2拮抗剂灵敏性细胞系展现基线MDM2、XPC、和BBC3的上调，和CDKN2A的下调；而MDM2拮抗剂耐受性细胞系的特征在于MDM2、XPC、和BBC3的下调以及CDKN2A的下调(图2)。
表7：在CELLO中和在NP21279中的生物标签基因性能
Figure BDA0000897694410000521
Figure BDA0000897694410000531
除了靶基因MDM2之外，标签中的其它三种基因在生物学上全部可用作MDM2-p53相互作用或下游p53途径中的调节子。XPC基因在涉及修复损伤DNA方面起到重要作用，有助于损伤识别、开放复合物形成、和修复蛋白复合物形成。也称为凋亡的p53上调调谐子(PUMA)的BBC3通过暴露于DNA损伤剂和通过p53(其介导DNA损伤诱导的凋亡)诱导。CDKN2A的两种基因产物p16和p14ARF都与主要肿瘤阻抑子途径关联；特别是p14ARF，其通过将MDM2隔离在核仁中来抑制MDM2功能。为检验与mRNA标签有关的分子机制，进一步将mRNA标签得分与p53突变状态和在MDM2-p53相互作用和下游p53途径中涉及的关键调控基因关联(表4)。如图2所示，具有低标签得分的细胞系更有可能是p53突变型；而具有高标签得分的细胞系更有可能是p53野生型(P<2.2x10-16)。此外，我们确定，具有野生型TP53但是具有低标签得分的耐受性细胞系大多数在MDM2-p53相互作用和下游p53途径中涉及的关键调控基因中容纳突变。这些证据表明，标签得分可以用作MDM2-P53途径功能的代替性mRNA水平指示物。
为检验在研究的肿瘤类型中mRNA标签得分的特异性预测能力，并且为了确保得自标签得分的预测不受肿瘤谱系混淆，进一步检验CELLO中每种可得肿瘤类型内的标签得分(表8)。值得注意的是，在AML细胞系中保持标签得分的预测能力。
表8：肿瘤类型特异性关联
Figure BDA0000897694410000541
mRNA标签在各种检测平台上的功用的有力证明在临床生物标记物开发中是关键的。在此研究的情况下，标签随着表达测量的RNAseq量化而开发，这利用了其灵敏性以及超越微阵技术增加的动力学范围。如表2所示，通过RNAseq测量的四种基因的mRNA表达水平与通过微阵测量的那些充分相关。通过微阵量化可保持单个基因以及总得分的高度区分能力。
实施例3
体外试验基因表达分析方法
在MDM2拮抗剂治疗之前，基线处的信使RNA(mRNA)表达水平通过RNA测序(RNA-seq)和使用GeneChip Human Genome U133Plus 2.0Array的微阵测量获得。在此总结RNA-seq数据的基因表达分析。首先，将序列读出匹配到参考人类基因组和匹配到源自参考基因组上已知外显子位置的剪接连接片段的其它数据库(Cufflinks软件)。然后将这些匹配的读出组合，产生读出(或确定序列的碱基)的离散计数(counts)/基因。然后将这些基因表达计数标准化从而均衡每个样品的RNA计数的总量，并将其进行基因/转录物长度(RPKM)校正。移除所有细胞系中表达值小于RPKM＝1的所有基因(这大体等同于小于一个拷贝的RNA分子/细胞的表达水平)。接着，统计学测试标准化的基因计数以鉴定响应者细胞系和非响应者细胞系之间的差异表达基因，其中使用可利用负二项式模型找到差异表达(DE)基因的统计学方法。实施的负二项式模型是DEseq软件。将20355种基因在QC之后进行差异表达分析。Bonferroni校正阈值用于确定统计显著性。也估算和报告假发现率(False discoveryrate)。
4基因标签的开发
将来自单变量DE分析的12种显著基因设置为用于建立标签的候选者。通过基因当中响应者细胞系与非响应者细胞系的倍数变化来将它们排位。阳性基因定义为倍数变化大于1的那些；而阴性基因定义为倍数变化小于1的那些。然后通过向上模式选择过程建立多变量逻辑回归分类器，从而以10倍交叉验证使观测者操作特性(ROC)曲线的曲线下面积最大化。模式选择是通过R包bestglm实施的过程。最终选择的模式由4种基因构成。因此，每种细胞系通过它们的基因表达值(log转换的RPKM)加权它们的回归系数的线性组合评价，定义为化合物A标签＝1.43GMDM2+1.23GXPC+0.48GBBC3–0.73GCDKN2A。
微阵基因表达分析方法
为减少微阵之间的变化，各微阵中标本的强度值通过分位数标准化方法重新调整。然后将各强度值进行log2转换。
化合物A临床试验中4基因标签的评价
在NO21279 1期临床试验中，将患有复发/难治疗的白血病的患者用增高剂量的化合物A治疗。将来自在MTD(1500mg BID x10天)治疗的患者的子集的标本作为当前基因表达研究的一部分进行评价。在基线、周期1第2天(C1D2)和周期1第10天(C1D10)收集白血病血液标本，并通过MACs分离法分离。
基于患者在基线时在治疗前4种基因的mRNA表达值计算他们的风险得分。为确保严格和无偏差的验证，不采用测试分组中的系数。但是，由于平台差异以及患者和细胞系之间巨大的生物学差异，不可直接应用患者水平分类器的体外系数组。因此，患者的标签得分仅仅是通过微阵分析测得的标签基因的表达水平之和乘以体外观察方向，定义为化合物A标签＝GMDM2+GXPC+GBBC3–GCDKN2A。注意这不是基因表达水平的最佳组合。因此，报告的关联性和得分的预测能力是对得分性能的保守估计。
实施例4
微阵基因表达分析方法
为减少微阵之间的变化，各微阵中标本的强度值通过分位数标准化方法重新调整。然后将各强度值进行log2转换。
化合物A临床试验中4基因标签的验证
在NO21279 1期临床试验中，将患有复发/难治疗的白血病的患者用增高剂量的化合物A治疗。将来自在MTD(1500mg BID x10天)治疗的患者的子集的标本作为当前基因表达研究的一部分进行评价。在基线、周期1第2天(C1D2)和周期1第10天(C1D10)收集白血病标本，并通过MACs分离法分离。
基于患者在基线时在治疗前4种基因的mRNA表达值计算他们的风险得分。为确保严格和无偏差的验证，不计算测试分组中的系数。但是，由于平台差异以及患者和细胞系之间巨大的生物学差异，不应用患者水平分类器的体外系数组。因此，患者的标签得分仅仅是通过微阵分析测得的标签基因的表达水平之和乘以体外观察方向，定义为化合物A标签＝GMDM2+GXPC+GBBC3–GCDKN2A。注意这不是基因表达水平的最佳组合。因此，报告的关联性和得分的预测能力是对得分性能的保守估计。
实施例5
体内测试
在NO21279 1期临床试验中，将患有复发/难治疗的白血病的患者用增高剂量的RG7112治疗。将来自在MTD(1500mg BID x10天)治疗的患者的子集的标本作为当前基因表达研究的一部分进行评价。在基线、周期1第2天(C1D2)和周期1第10天(C1D10)收集白血病标本，并通过MACs分离法分离。
患者由年龄中值为59岁的18名男性和10名女性构成。基于肿瘤标本评估，28名患者中的23名具有野生型TP53，5名患者具有TP53突变(一名患者具有内含子7中A变为C的突变；两名患者具有外显子5中CGC变为CAC的突变；一名患者具有外显子9中缺失G 323_3-324_1的移码；一名患者具有外显子7中S240G--S240，AGT变为GGT的突变)。在第1天，在28名研究的患者之中，化合物A的24小时的曲线下面积(AUC0-24h)的中位值是190,315ng*h/mL(IQR：119,032-242,857ng*h/mL)。评价临床响应并将其分为4类：完全响应(CR)，形态学上无白血病状态(MLFS)，血液改善(HI)，和进展性疾病(PD)。评价28名患者的响应，包括3例CR，4例MLFS，6例HI和15例PD。除了基线标本的评估之外，也评价处理标本(周期1第10天)。来自C1D10的活检标本中的中位MDM2mRNA表达比基线增加2.46倍(IQR：1.62–4.59)，证明源自MDM2转录的p53活化的药效学生物标记物响应。
使用Affymetrix GeneChip Human Genome U133Plus 2.0微阵评价来自28名在MTD给药的可评价患者的基线血细胞标本。如下计算28名患者中每一人的已鉴定的4基因标签得分：在基线处将MDM2、BBC3、XPC加在一起，减去CDKN2A表达水平。在标签得分和患者对MDM2拮抗剂治疗的临床响应(PD<HI<MLFS<CR)之间存在显著相关性(斯皮尔曼相关系数0.58，P＝6.6x10-4)。标签得分也与患者的药效学生物标记物响应显著相关，所述响应通过MDM2mRNA从基线到C1D10的变化测量(斯皮尔曼相关系数0.41，P＝0.02；图3)。对于15名具有足够高暴露量的患者的子集，标签得分和患者的临床响应之间的相关性进一步增强，所述患者定义为AUC0–24h高于150,000ng*h/mL的患者(斯皮尔曼相关系数0.64，P＝5.2x10-3)。此小组能够区分CR/MLFS患者与PD/HI患者，其中ROC曲线的AUC为0.82(图4，表10)，以及区分CR/MLFS/HI患者与PD患者，其中AUC为0.83(图4)。相反，作为单个生物标记物的MDM2mRNA表达仅可区分CR/MLFS患者与PD/HI患者，其中AUC为0.51，以及区分CR/MLFS/HI患者与PD患者，其中AUC为0.61。
表10：MDM2拮抗剂治疗预测性标签的评价
Figure BDA0000897694410000581
Figure BDA0000897694410000591
a在28名研究的患者之中RG7112在第1天的24小时曲线下面积(AUC0–24h)的中位暴露量值。
bAUC0–24h小于150,000ng*h/mL定义为不足的暴露量。
使用标签得分15、或15.4(由约登指数选择)的分界点，将患者分类为在基线时在MDM2拮抗剂治疗之前可能的响应者组和可能的非响应者组，其中灵敏度为100％，特异性为71％。因此，标签小组具有显著的潜力可用作MDM2拮抗剂治疗的伴随预测性生物标记物，从而选择最可能响应的AML患者的子集；并避免暴露不太可能响应的AML患者。
为理解与mRNA标签有关的分子机制，将mRNA标签得分与P53突变状态关联。具有低标签得分的患者更有可能是TP53突变型的；而具有高标签得分的患者更有可能是TP53野生型的或具有预测为良性的突变的TP53突变型的(P＝6.86x10-2)。在五名p53突变的患者中，四人显示进展性疾病，其平均得分为14.2±0.8(一名患者具有内含子7中A变为C的突变；2名患者具有外显子5中CGC变为CAC的突变；一名患者具有外显子9中缺失G323_3-324_1的移码)，而一人显示MLFS，具有外显子7中S240G-S240，AGT变为GGT的突变，通过IARC数据库预测不与DNA直接相互作用或不与同DNA相互作用的任何氨基酸残基直接相互作用，得分为15.8。该证据表明，标签得分可潜在用作MDM2-P53途径功能的代替性mRNA水平指示物。
为检验mRNA标签的组织特异性，使用Affymetrix GeneChip Human GenomeU133Plus 2.0微阵由在MTD给药的18名患者的可得子集测量基线骨髓细胞标本。血液标签得分和骨髓标签得分显著相关，斯皮尔曼相关系数为0.50(P＝0.016)。骨髓标签得分与患者对MDM2拮抗剂治疗的临床响应以及药效学生物标记物响应(从周期1第1天到周期1第10天的MDM2表达变化)显著相关，其中斯皮尔曼相关系数分别为0.46(P＝0.052)和0.42(P＝0.069)。
为研究mRNA标签的药效学性质，在C1D10测量28名患者的大部分的血细胞标本，并在C1D10推导标签。来自C1D10的标本中的中位MDM2、XPC和BBC3mRNA表达是基线的2.37倍(IQR：1.71–5.00)，1.69倍(IQR：1.27–1.88)，1.45倍(IQR：1.13–1.99)，证明对于标签中正相关的基因而言通过MDM2拮抗剂治疗刺激的各基因的上调。另一方面，在活检标本中来自C1D10的中位CDKN2A mRNA表达比基线下降0.26倍(IQR：0.09–0.38)，证明对于标签中负相关的基因而言通过MDM2拮抗剂治疗刺激的下调。因此，在活检标本中来自C1D10的总标签得分是基线的3.05倍(IQR：1.88–4.23)，证明通过MDM2拮抗剂治疗刺激的总得分的上调。总之，当在基线测量时(相关系数0.58，P＝9x10-4)，以及在治疗方案过程中，标签得分也一致地与患者的临床响应相关：C1D2(相关系数0.40，P＝2.69x10-2)，和C1D10(相关系数0.65，P＝3.5x10-4)。当在基线(相关系数0.41，P＝1.92x10-2)、C1D2(相关系数0.64，P＝1.07x10-3)、和C1D10(相关系数0.64，P＝3.3x10-4)测量时，标签得分测量值也一致地与患者的药效学生物标记物响应(MDM2表达变化)相关。对于PD、HI、MLFS和CR患者，在C1D2的中位标签得分分别是基线的1.11倍(IQR：1.05–1.16)，1.08倍(IQR：1.04–1.10)，1.17倍(IQR：1.14–1.19)，和1.15倍(IQR：1.13–1.15)。对于PD、HI、MLFS和CR患者，在C1D10的中位得分分别是基线的1.14倍(IQR：1.08–1.21)，1.25倍(IQR：1.23–1.30)，1.26倍(IQR：1.23–1.31)，和1.23倍(IQR：1.22–1.24)。该证据表明，mRNA标签得分同时是MDM2拮抗剂治疗活性的预测性生物标记物和药效学生物标记物。基线mRNA标签得分因此对于患者对MDM2抑制剂的响应而言是预测性的，而MDM2拮抗剂治疗在治疗周期过程中不同程度地刺激患者，这指示了患者的临床响应(图3)。
实施例6
I期实体肿瘤试验中MDM2拮抗剂治疗预测性标签的评价
在两项实体肿瘤试验中也评价预测性mRNA标签(图1)。在试验NP21280中，评价30名具有治疗前和C1D5肿瘤活检标本的患者；在NP22890中，评价20名具有治疗前和C1D8肿瘤活检标本的患者(表1)。在两项临床试验中，都评价能够评估p53途径活化的生物标记物包(p53IHC，p21IHC，MDM2mRNA，和Ki67)，MDM2抑制作用使P53途径活化并减少细胞增殖。如之前报告，在NP22890中，P53和P21浓度、以及MDM2mRNA表达在C1D8全部相对于基线显著增加，而Ki-67阳性肿瘤细胞相对于基线下降。生物标记物响应的这些变化与药物暴露量没有显著相关，除了MIC-1变化之外12。在NP21280中，P53和P21浓度、以及MDM2mRNA表达在C1D10全部相对于基线显著增加(分别为p＝2.88x10-3，2.32x10-3，1.03x10-5)；而Ki-67阳性肿瘤细胞相对于基线下降(p＝2.62x10-2)。生物标记物响应的这些变化也与药物暴露量显著相关(对于P53变化为p＝4.77x10-3，对于P21变化为p＝5.30x10-2，对于MDM2变化为p＝2.5x10-3)，所不同的是Ki-67阳性肿瘤细胞的数目。
在基线和在C1D5(NO21280)以及C1D8(NP22890)类似地为患者推导标签得分。mRNA标签得分显示了不同程度的与化合物A药动学和药效学标记物小组的以及在两项试验之间的相关性。在NP21280中，基线得分与患者的MDM2mRNA表达变化显著相关，其中相关系数为0.41(p＝2.82x10-2)，但是未观察到标签得分和P21或Ki-67阳性肿瘤细胞数目之间存在显著相关。在NP22890中，仅观察到在标签得分与MDM2变化和P21变化之间的正相关的提示(表9)。对于实体肿瘤试验标本没有可行的临床结果的评定。
表9：在NO21280和NP22890中得分和生物标记物响应之间的相关性
Figure BDA0000897694410000611
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Claims (12)

1.用于检测MDM2、XPC、BBC3和/或CDKN2A的mRNA表达水平的试剂在制备用于方法的试剂盒或试剂中的用途，所述方法用于预测患有癌症的患者对治疗的响应性，所述方法包括：检测由MDM2、XPC、BBC3和CDKN2A组成的四基因标签的mRNA表达水平，和使用该水平作为预测患者对MDM2-p53相互作用的抑制剂的响应的生物标记物，
其中所述响应是患者对癌症治疗的响应，并且体外测量取自所述患者的一个或多个标本的生物标记物。
2.根据权利要求1的用途，所述方法包括：
a)测量所述标本中根据权利要求1的MDM2、XPC、BBC3和CDKN2A的mRNA表达水平；
b)将得自所述患者的水平与得自患有相同癌症的患者的标准值进行比较。
3.根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述抑制剂是下式的4-{[2R,3S,4R,5S)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸
Figure FDA0002506797060000011
4.根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述抑制剂是下式的4-{[(2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯烷-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸1-mPEG-羰基氧基-乙酯：
Figure FDA0002506797060000021
5.根据权利要求4的用途，其中所述mPEG的平均MW为～2000。
6.根据权利要求1或2任一项的用途，其中所述抑制剂是
Figure FDA0002506797060000022
7.根据权利要求1的用途，特征在于所述四基因标签包括：包括MDM2、XPC、BBC3的三种基因的上调，以及CDKN2A的下调。
8.根据权利要求1的用途，其中癌症选自乳癌，前列腺癌，子宫颈癌，卵巢癌，胃癌，结肠直肠癌，胰腺癌，肝癌，脑癌，神经内分泌癌，肺癌，肾癌，血液恶性肿瘤，黑素瘤和肉瘤。
9.根据权利要求8的用途，其中癌症是急性髓细胞白血病(AML)。
10.根据权利要求1的用途，其中在下述情况下一个或多个标本中较高的MDM2 mRNA表达水平可预测对于用所述MDM2-p53相互作用的抑制剂进行治疗的灵敏性
i)相对于取自患有相同癌症的患者的标准值或标准值组；或
ii)在治疗开始之后获取并且相对于取自相同患者在治疗开始之前的一个或多个标本；或
iii)相对于取自正常细胞或组织的标准值或标准值组。
11.用于检测MDM2、XPC、BBC3和/或CDKN2A的mRNA表达水平的试剂在制备用于方法的试剂盒或试剂中的用途，所述方法用于在患癌症患者中监测包括MDM2抑制剂的治疗的功效，所述方法包括
a)测量得自治疗前患者的标本中MDM2、XPC、BBC3和CDKN2A的mRNA表达水平；
b)使用在a)中获得的表达水平计算定名为治疗前患者的标签得分的值；
c)在开始用所述MDM2抑制剂进行治疗之后重复步骤a)和b)；和
d)将在开始治疗之后获得的标签得分与在治疗之前获得的那些进行比较，其中治疗后较高的标签得分表明患者对该治疗的响应，因此推荐继续该治疗。
12.权利要求11的用途，其中MDM2抑制剂是用于权利要求4、5、6或7的用途的抑制剂。
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