CN105377942A - 通过跨越血脑屏障的纳米颗粒递送治疗剂和显像剂的方法 - Google Patents

通过跨越血脑屏障的纳米颗粒递送治疗剂和显像剂的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105377942A
CN105377942A CN201480040041.1A CN201480040041A CN105377942A CN 105377942 A CN105377942 A CN 105377942A CN 201480040041 A CN201480040041 A CN 201480040041A CN 105377942 A CN105377942 A CN 105377942A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nano particle
polypeptide
linker
receptor
specific binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201480040041.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105377942B (zh
Inventor
马克·E·戴维斯
戴文·威利
安德鲁·克拉克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
California Institute of Technology CalTech
Original Assignee
California Institute of Technology CalTech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by California Institute of Technology CalTech filed Critical California Institute of Technology CalTech
Publication of CN105377942A publication Critical patent/CN105377942A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105377942B publication Critical patent/CN105377942B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/4045—Indole-alkylamines; Amides thereof, e.g. serotonin, melatonin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/593—Polyesters, e.g. PLGA or polylactide-co-glycolide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/644—Transferrin, e.g. a lactoferrin or ovotransferrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A61K47/6937—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol the polymer being PLGA, PLA or polyglycolic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
    • A61K51/1241—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins
    • A61K51/1244—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins microparticles or nanoparticles, e.g. polymeric nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本文描述了通过向受试者施用具有纳米颗粒核心和靶向剂的纳米颗粒将纳米颗粒递送至受试者脑部的方法。多种靶向剂可用来促进所述的纳米颗粒的递送。例如，靶向剂可包含特异于对由脑内皮细胞表达的受体特异性的配体和将配体连接至纳米颗粒核心外表面的衔接物。另外，当在细胞内部时，衔接物可促进配体从纳米颗粒解离。

Description

通过跨越血脑屏障的纳米颗粒递送治疗剂和显像剂的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年5月14日提交的美国临时专利申请61/822,983的权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。
政府权利
本文公开的主题根据由美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)给予的拨款号R01NS0711121和由美国国家癌症研究所(NationalCancerInstitute)给予的拨款号CA151849在政府支持下做出。美国政府在本文公开的主题中拥有某些权利。
背景
在发达国家，中枢神经系统(centralnervoussystem)(CNS)的慢性疾病是发病和死亡的主要原因。在美国，单阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease)就影响超过五百万人，并且预计在2050年前会增长至超过一千三百万。在2012年，用于患有阿尔茨海默病的人的护理总成本估计超过2000亿美元，并且预计在未来四十年内增长至1.2万亿美元。此外，在美国，虽然来自死亡的许多其他主要原因(诸如心脏疾病和中风)的死亡比例在过去十年已发现显著减少，但是来自阿尔茨海默病的死亡比例已增加了68％。类似的趋势，即高经济成本和治疗进展相对缺乏两者，见于许多其他神经退行性疾病，包括亨廷顿氏舞蹈症(Huntington’sdisease)、帕金森病(Parkinson’sdisease)和多发性硬化症(multiplesclerosis)发现了。
治疗这些疾病缺乏进展的重要原因是由于血脑屏障(blood-brainbarrier)(BBB)的存在。BBB是CNS实质和脉管系统之间的物理屏障，其在维持CNS内的稳态中起重要作用。内皮细胞之间存在紧密连接，其抑制极性分子、大分子和细胞的细胞旁路扩散。这迫使进入CNS的溶质运移主要发生于跨越单独的内皮细胞。虽然对于维持CNS稳态至关重要，BBB对大多数溶质的不可透过性已证明对药物递送至CNS是巨大障碍。目前，98％的小分子治疗剂和基本上100％的大分子治疗剂，包括单克隆抗体、蛋白和基因疗法，都不跨越BBB。
在由溶质跨越BBB使用的内源性方法中，受体介导的转胞吞作用(receptor-mediatedtranscytosis)(RMT)已经显示了用于药物递送的最大希望(见Wiley等人，PNAS,110(21):8662-667(2013)，其通过引用以其整体并入本文)。尽管在过去的二十多年，对开发用于递送至脑的靶向治疗剂已存在很大兴趣，还尚未出现用于临床研究的可行的候选物。
概述
本文描述了通过向受试者施用具有纳米颗粒核心和靶向剂的纳米颗粒将纳米颗粒递送至受试者脑部的方法。多种靶向剂可用来促进所述的纳米颗粒的递送。例如，靶向剂可包含对由脑内皮细胞表达的受体特异性的配体和将配体连接至纳米颗粒核心的外表面的衔接物。另外，当在细胞之内时，衔接物可促进配体从纳米颗粒解离。
所述的方法可使用多种纳米颗粒来进行。例如，纳米颗粒核心的表面可由以下制成：阳离子粘液酸聚合物(cationicmucicacidpolymers)(cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)(PLGA)、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、金、氧化铁或如由本领域技术人员所理解的其他类似材料。这些聚合物可与配体结合，所述配体诸如转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体或特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽。另外，纳米颗粒核心与配体可通过衔接物缀合，当在脑内皮细胞之内时所述衔接物促进配体从纳米颗粒解离。在一些所述的实施方案中，衔接物可包含二硫键，当纳米颗粒在脑内皮细胞之内时，所述二硫键可被还原导致配体从纳米颗粒解离。在一些所述的实施方案中，衔接物可包含多肽，当纳米颗粒在脑内皮细胞之内时，所述多肽可被酶促裂解导致配体从纳米颗粒解离。在一些所述的实施方案中，衔接物可包含可水解的化学键，当纳米颗粒在脑内皮细胞之内时，所述可水解的化学键可在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离。在一些所述的实施方案中，衔接物可包含具有以下pKa的化学键，当纳米颗粒在脑内皮细胞之内时，所述化学键可在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离。
提供的方法可以用利用各种衔接物的靶向剂来进行，所述衔接物用于将配体缀合至纳米颗粒核心并且用于在脑内皮细胞之内后促进配体从纳米颗粒核心解离。在一些实施方案中，所述的方法可使用这样的衔接物来进行，所述衔接物当未结合至纳米颗粒时具有硝基苯硼酸，该硝基苯硼酸在所述衔接物结合至纳米颗粒核心时形成硝基苯硼酸酯，其中衔接物和纳米颗粒核心的解偶联将在酸性pH(例如，约6.8至约2.0)下是有利的。在另一个实施方案中，靶向剂可包含二氨基缩酮(DAK)键连，在脑内皮细胞之内后，所述二氨基缩酮(DAK)键连促进纳米颗粒与配体解离，其中衔接物和纳米颗粒核心的解偶联将在酸性pH下是有利的。另外，所述的方法可使用含具有二硫键的衔接物的靶向剂来进行，所述具有二硫键的衔接物可在脑内皮细胞中遇到的还原性条件下促进附连的配体从纳米颗粒解离。在一些所述的实施方案中，靶向剂包含位于配体和介导与纳米颗粒核心缀合的区段之间的聚乙二醇聚合物。
为进行所述的方法，控制缀合至所述的纳米颗粒的靶向剂的数目可以是有利的。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒可具有多达1000个缀合的靶向剂。在其他实施方案中，所述的纳米颗粒可具有多达500个缀合的靶向剂。可选择地，所述的纳米颗粒可具有少至从约20个至50个缀合的靶向剂。在还另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有少于5个缀合的靶向剂。靶向剂的数目可依据被递送的纳米颗粒的种类、所递送的靶、用于靶向颗粒的配体或许多其他因素进行调整。
所述方法可用于通过在将纳米颗粒施用至受试者之前使所述纳米颗粒负载感兴趣的治疗剂或显像剂，将治疗剂或显像剂递送至受试者的脑部。递送负载的纳米颗粒之后，靶向剂将促进至感兴趣的靶细胞，诸如脑内皮细胞的递送。在由被靶细胞内化后，纳米颗粒将从靶向剂解离。在脑内皮细胞的情况下，内化的纳米颗粒然后将被从细胞被排出进入脑间质空间，在脑间质空间，颗粒将去稳定(destabilize)并分泌所负载的药剂物质，从而将药剂物质递送到脑部或其他靶位置。在一些实施方案中，可进行所述的方法以将神经递质神经递质诸如5-羟色胺或多巴胺递送至脑部，所述神经递质神经递质可被用来治疗神经紊乱。用于治疗神经紊乱的其他物质还可经由所述的方法递送至脑部。自身可能不容易进入脑部的显像剂也可使用所述的方法进行递送。此外，可使用所述的方法将一个或更多个治疗剂、显像剂或治疗剂和显像剂两者的组合递送至受试者的脑部。
本文还描述了用于产生靶向递送至脑部的纳米颗粒的试剂盒。例如，所述的试剂盒可包含：组装纳米颗粒的材料和试剂，所述纳米颗粒具有阳离子粘液酸聚合物(cMAP)外表面或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)外表面，对由脑内皮细胞表达的受体特异性的靶向剂，其中靶向剂包含被缀合至衔接物的配体，所述衔接物在脑内皮细胞内部时导致配体从纳米颗粒解离；以及用于组装纳米颗粒的说明书。所述的试剂盒还可包含靶向脑内皮细胞的配体，诸如转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽。
附图简述
图1用于将治疗剂和/或显像剂递送至脑实质的总体设计图。纳米颗粒具有三个基本的设计组分：(1)纳米颗粒核心；(2)间隔分子；以及(3)靶向剂。
图2被靶向的纳米颗粒(targetednanoparticle)穿过血脑屏障(BBB)的运输，该运输由靶向分子脱离纳米颗粒所促进。(1)血液中被靶向的纳米颗粒到达BBB腔表面。(2)纳米颗粒的配体结合至其在BBB血液侧的受体上。(3)受体-纳米颗粒复合体的内化。(4)纳米颗粒当其跨越BBB时经历的化学和/或物理变化导致配体从纳米颗粒剩余部分解离。(5)未靶向的纳米颗粒(untargetednanoparticle)到达BBB的脑侧。(6)纳米颗粒扩散至CNS。纳米颗粒的组分在图左侧的插入图例(insetkey)中示出。图右侧括号内的术语指出了参与此次序的相关分区。
图3PEG偶联反应的MALDI-TOF分析。NH2-PEG-SH(3.4kDa)和COOH-PEG-SH(2kDa)反应在24小时时的MALDI光谱。峰A和B分别相应于反应物，COOH-PEG-SH和NH2-PEG-SH。峰C、D和E分别相应于如在方案1中概述的三个潜在产物，4kDa、5.4kDa和6.8kDa的聚合物。
图4二硫键裂解反应的MALDI-TOF分析。NH2-PEG-SH(3.4kDa)和COOH-PEG-SH(2kDa)反应在加入过量β-巯基乙醇(BME)后的MALDI光谱。峰A和B分别相应于亲本聚合物COOH-PEG-SH和NH2-PEG-SH。不存在来自由于过量BME所导致的巯基-二硫键交换在PEG聚合物之间二硫键形成的产物的证据。
图5包含二硫键的纳米颗粒与Neuro2A细胞的结合亲合力(bindingavidity)。示出了测量的数据点，正方形、菱形或三角形分别指示包含二硫键的PLGA-PEG-Tf纳米颗粒(S-S)、用二硫苏糖醇处理后的包含二硫键的PLGA-PEG-Tf纳米颗粒(S-S+DTT)和甲氧基封端的PLGA-PEG纳米颗粒(mPEG)。每个制剂的模型曲线都基于Langmuir结合等温线。
图6小鼠脑切片中PLGA-mPEG纳米颗粒的共聚焦图。图A：488nm激发，图B：DAPI信号，图C：图A和B的合并图。图D显示出了图C中合并图的放大图。实线箭头指示与细胞核共定位的荧光。由于该现象见于非靶向颗粒，其被认为是正常组织背景荧光。虚线箭头指示血管。
图7小鼠脑切片中低-TfPLAGA-PEG纳米颗粒的共聚焦图。图A示出了来自488nm激发的荧光。图B示出了DAPI信号。图C示出了图A和B的合并图。图D示出了图C中的合并图的放大图。实线白色箭头指示与细胞核共定位的荧光。虚线白色箭头指示血管。空心白色箭头指示在实质中与细胞核不相关的、确定为纳米颗粒信号的荧光。
图8小鼠脑切片中高-TfPLGA-PEG纳米颗粒的共聚焦图。图A示出了来自488nm激发的荧光。图B示出了DAPI信号。图C示出了图A和B的合并图。图D示出了图C中合并图的放大图。实线白色箭头指示与细胞核共定位的荧光。虚线白色箭头指示血管。空心白色箭头指示在实质中与胞核不相关的、确定为纳米颗粒信号的荧光。
图9小鼠脑切片中高-Tf加上二硫化PLGA-PEG纳米颗粒的共聚焦图。图A示出了来自488nm激发的荧光。图B示出了DAPI信号。图C示出了图A和B的合并图。图D示出了图C中合并图的放大图。实线白色箭头指示与细胞核共定位的荧光。虚线白色箭头指示血管。空心白色箭头指示在实质中与细胞核不相关的、确定为纳米颗粒信号的荧光。
图10DSS-DAK-PEG-OPSS与Tf缀合反应的MALDI-TOF追踪。未反应的Tf和数个阶的PEG化的Tf被标记。
图11Tf-DAK-PEG-OPSS随时间在pH5.5缓冲液中的降解。示出了在5min(A)、15min(B)、30min(C)、60min(D)、120min(E)、24小时(F)孵育时间的粗混合物组成。
图12Tf-DAK-PEG-Au纳米颗粒与K562细胞在pH5.5(正方形)或pH8(菱形)的缓冲液中孵育一个小时之后的结合。
图13示出了三种不同的纳米颗粒随时间至涂覆bEnd.3的的底部孔(basalwell)的迁移。菱形图反映显示了仅涂覆了mPEG的金纳米颗粒的迁移，正方形图反映显示了涂覆了不含可pH裂解的DAK衔接物的Tf-PEG的金纳米颗粒的迁移，三角图显示了涂覆了含可pH裂解的DAK衔接物的Tf-PEG的金纳米颗粒的迁移。
图14示出了来自在用具有酸可裂解的衔接物的包含Tf的金纳米颗粒处理之后小鼠脑部的切片的图。实线箭头示出了血管中的NP，且空心(open)箭头示出了脑中的NP。
图15组织培养系统的示意图。
图16图A示出了不可裂解纳米颗粒的制备。图B示出了包含二硫键的纳米颗粒的制备。每一种聚合物混合物在10mg/mL的总PLGA浓度下在DMF中被制备，然后通过纳米沉淀法形成纳米颗粒。
说明性实施方案详述
本文提供了将纳米颗粒递送至受试者脑部的方法，还描述了纳米颗粒以及可用于连接递送所述的纳米颗粒或包含在纳米颗粒中的感兴趣的化合物的相关的组合物、方法和试剂盒。
当关于数字范围、截断值或具体值使用时，术语“约(about)”用来表示被列举的数值可从所列值变化多达10％。因为本文所用的许多数值是实验确定的，本领域技术人员应该理解，这样的确定可，并且经常情况下，将在不同的实验中变化。本文所用的值不应该被认为是由于此固有变化而过度限制。术语“约”用来包含多达或等于10％的此类变化。
如本文所用的术语“纳米颗粒(nanoparticle)”指纳米级尺寸的复合结构。特别地，纳米颗粒通常是大小在从约1至约1000nm范围内的颗粒，且尽管取决于纳米颗粒组成不同的形态是可能的，但通常是球形。纳米颗粒接触该纳米颗粒的外部环境的部分通常被确定为纳米颗粒的表面。在本文所述的纳米颗粒中，尺寸限制可限于两个维度，并因此本文所述的纳米颗粒包括具有直径从约1至约1000nm的复合结构，其中具体直径取决于根据实验设计的纳米颗粒组成以及纳米颗粒的预期用途。例如，用于一些治疗应用中的纳米颗粒通常具有约200nm或以下的尺寸，并且特别地，用于与癌症治疗相关的递送使用的纳米颗粒通常具有从约1至100nm的直径。
另外的可期望的纳米颗粒特性，诸如表面电荷和空间稳定，也可鉴于感兴趣的具体应用而变化。技术人员在阅读本公开内容之后可理解颗粒的特性。纳米颗粒的尺寸和特性可通过本领域已知的技术进行检测。检测颗粒尺寸的示例性技术包括但不限于：动态光散射(DLS)和纳米颗粒追踪分析(NTA)以及多种显微术诸如透射电子显微术(TEM)和原子力显微术(AFM)。检测颗粒形态的示例性技术包括但不限于TEM和AFM。检测纳米颗粒表面电荷的示例性技术包括但不限于ζ电势法。适合于检测其他化学特性的另外的技术包括1H、11B和13C和19FNMR(核磁共振)，UV/Vis(紫外/可见光)与红外/拉曼(Raman)光谱和荧光光谱和显微术(当纳米颗粒与荧光标记结合使用时)以及由技术人员可确认的另外的技术。
如本文所用的“递送(deliver)”和“递送(delivery)”指影响化合物的空间位置且特别是指定化合物的优选位置的活动。因此，从本公开内容的意义上说，递送化合物指影响化合物在某一时间在某组条件下的定位和运动使得化合物在那些条件下的定位和运动相对于化合物本来具有的定位和运动而变化的能力。
如本文所用的术语“靶(target)”指包括器官、组织或其任何部分的感兴趣的生物系统，且可包括体外或体内生物系统或其任何部分。
如本文所用的术语“聚合物(polymer)”指包含通常由共价化学键连接的重复结构单元的大分子。适合的聚合物可以是线形和/或支链的，并可采取均聚物或共聚物的形式。如果使用共聚物，共聚物可以是无规共聚物或支化共聚物。示例性的聚合物包括水分散性聚合物和特别是水溶性聚合物。例如，适合的聚合物包括，但不限于多糖、聚酯、聚酰胺、聚醚、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯，等等。对于治疗和/或药物用途和应用，聚合物应当具有低毒性，且特别是无毒或无细胞毒性的。适合的聚合物包括具有约500,000或以下分子量的聚合物。特别地，适合的聚合物可具有约100,000和以下的分子量。
如本文所用的术语“包含硼酸的聚合物(polymercontainingaboronicacid)”或“具有硼酸的衔接物(linkerhavingaboronicacid)”以及类似物，指包含呈递用于结合至包含多元醇的聚合物的羟基基团的至少一个硼酸基团。特别地，本文所述的纳米颗粒的包含硼酸的聚合物包括在至少一个结构单元中包含包含碳-硼化学键的烷基或芳基取代的硼酸的聚合物。适合的硼酸聚合物包含其中硼酸处于末端结构单元或其他任何适合位置以提供所得聚合物的亲水特性的聚合物。在本文所述的纳米颗粒中，多元醇聚合物被偶联至硼酸聚合物。关于两个分子之间的附连，如本文所用的术语“偶联(coupled)”或“偶联(coupling)”指形成可逆共价键的相互作用。特别地，在适合的介质存在下，硼酸聚合物上呈递的硼酸与多元醇的羟基基团经由快速和可逆的成对共价相互作用在适合的介质中形成硼酸酯。适合的介质包括水和几种水溶液以及由技术人员可确认的另外的有机介质。特别地，当在水性介质中接触时，硼酸聚合物和多元醇聚合物反应，产生水作为副产物。硼酸多元醇相互作用通常在水溶液中是更有利的，但还已知在有机介质中进行。另外，用1,2二醇和1,3二醇形成的环酯通常比其非环酯的相对物更稳定。
如本文所用的术语“附连(attach)”、“附连的(attached)”或“附连(attachment)”指通过键(bond)、连接(link)、力(force)或连接(tie)连接或联合(uniting)以保持两个或更多个组分在一起，其包括直接或间接附连，使得例如其中第一化合物被直接键合至第二化合物，以及实施方案其中一个或更多个中间体化合物并特别是分子被布置在第一化合物和第二化合物之间被处理的实施方案。
如本公开内容所用的术语“配体(ligand)”和“靶向配体(targetingligand)”指可被呈递在纳米颗粒表面上用于以下目的的任何分子：接合特定靶以及特别是特定细胞识别，例如通过使细胞受体附连纳米颗粒。适合的配体的实例包括，但不限于，维生素(例如叶酸)、蛋白(例如转铁蛋白和单克隆抗体)、单糖(例如半乳糖)、肽和多糖。特别地，靶向配体可以是针对某些表面细胞受体，诸如转铁蛋白受体(“TfR”)的抗体。
如本文所用的，术语“转铁蛋白(transferrin)”(简写为“Tf”)意指包括能够结合至转铁蛋白受体(“TfR”)的该蛋白的变体和亚型，以及能够结合至转铁蛋白受体(“TfR”)的该蛋白的片段。例如，该术语将包括全铁转铁蛋白以及转铁蛋白自身。
术语“抗体(antibody)”包括提及的与特定抗原反应的免疫球蛋白分子。该术语还包括基因工程形式诸如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(heteroconjugateantibodies)(例如，双特异性抗体)以及重组单链Fv片断(scFv)、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)或pFv片段。术语“抗体”还包括抗体的抗原结合形式(例如，Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv和rlgG)。与特定抗原免疫反应或对特定抗原“特异性”的抗体是相对术语，并意指抗体以比对于该抗体展现出的非特异性结合将观察到的亲和力高至少10倍的亲和力结合该抗原。因此，被称作给定抗原“特异性”的抗体，可事实上以比其在非特异性相互作用中展现出的亲和力高10倍的亲和力选择性地结合其他抗原。
开发能够以更大的量到达CNS的靶向治疗剂以治疗许多神经衰弱性疾病是必要的。利用在RMT期间经历的化学改变以增加治疗剂在CNS内的积累是可能的。本文描述了通过向受试者施用具有纳米颗粒核心和靶向剂的纳米颗粒将纳米颗粒递送至受试者的脑部的方法。多种靶向剂可用来促进所述的纳米颗粒的递送。例如，靶向剂可包括对脑内皮细胞表达的受体特异性的配体以及将配体连接至纳米颗粒核心的外表面的衔接物。另外，当在细胞内部时衔接物可促进配体从纳米颗粒解离。
所述的方法可使用多种纳米颗粒来进行。例如，纳米颗粒核心的表面可由阳离子粘液酸聚合物(cMAP)构成。在一些实施方案中，所述的cMAP纳米颗粒核心可由具有以下的任一个表示的结构的cMAP构成：
其中n是从2至约20的任何整数。在一些实施方案中，n是从2至约10的任何整数。在一些实施方案中，n是从2至约5的任何整数。在一些实施方案中，n是2、3、或4。
产生所述的纳米颗粒核心使用的cMAP可具有式V的结构：
其中m是从5至约200的任何整数。在一些实施方案中，m是从5至约150的任何整数。在一些实施方案中，m是从5至约100的任何整数。在一些实施方案中，m是从5至约50的任何整数。在一些实施方案中，m是从5至约25的任何整数。在一些实施方案中，m可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任何一个。如本文所提供的，在一些实施方案中，m是11。
在所述的方法的一些实施方案中，纳米颗粒用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)聚合物核心来做出。PLGA聚合物可具有式VI的结构：
其中x和y彼此独立地是从约5至约500的任何整数。在一些实施方案中，x和y彼此独立地是从约5至约100的任何整数。在一些实施方案中，x和y彼此独立地是从约20至约80的任何整数。在一些实施方案中，x和y彼此独立地是从约40至约60的任何整数。在一些实施方案中，x和y彼此独立地是40、42、44、46、48、50、52、54、56、58或60。在一个实施方案中，x和y都是50。具有PLGA聚合物的纳米颗粒核心可根据需要还被修饰以适应靶向剂的附连。例如，在其中靶向剂经由一个或更多个酯键通过存在于靶向剂上的硼酸和存在于纳米颗粒表面上的二醇的反应形成而缀合至纳米颗粒的实例中，PLGA纳米颗粒可被修饰为在其外表面具有二醇结构。在一个实施方案中，PLGA纳米颗粒核心还可被修饰为包含具有适合的羟基基团以允许颗粒被缀合至包含硼酸的靶向剂的糖。其他这样的修饰可被做出以促进本文所述的靶向剂的缀合或鉴于本公开内容其他这样的修饰可对本领域技术人员明显。
除了描述了具有由cMAP和PLGA构成的核心的纳米颗粒以外，所述的纳米颗粒还可以用由以下构成的核心来产生：金、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、树状聚体、金或氧化铁。另外，脂质体或聚合物胶束还可用来形成用于所述的方法的纳米颗粒。例如，具有金核心的纳米颗粒可被缀合至具有pH敏感衔接物的靶向剂，所述衔接物被键合至Tf以允许金颗粒靶向脑内皮细胞并导致金纳米颗粒被递送至脑实质。
所述的方法可使用具有如本文所述的核心的纳米颗粒来进行，其被缀合至导致纳米颗粒优选地定位至受试者中优选的或期望的位置的靶向剂。所述的靶向剂具有两个主要区段：衔接物和配体。衔接物包括介导将靶向剂附连至纳米颗粒核心的外表面的区段，且配体是优先地或特异性结合至感兴趣的靶的分子。例如，在一些实施方案中，靶向剂可具有聚乙二醇(PEG)衔接物，其在一个末端被共价键合至纳米颗粒核心的聚合物且在另一个末端被缀合至Tf，从而将纳米颗粒靶向至表达TfR的细胞。所述的靶向剂和相关的衔接物可与产生本文所述的纳米颗粒核心使用的多种材料一起使用。在一些实施方案中，靶向剂和衔接物可与由以下构成的纳米颗粒核心一起使用：cMAP、PLGA、金、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、树状聚体、金或氧化铁。另外，还可使用脂质体或聚合物胶束以使用所述的靶向剂和衔接物形成纳米颗粒。
可使用多种衔接物进行所述的方法，并在一些情况下可与不同的颗粒一起使用。在一些所述的实施方案中，衔接物可包含以下多肽或化学键，当纳米颗粒在脑内皮细胞内部时所述多肽或化学键可被化学或酶促裂解以导致配体从纳米颗粒解离。例如，衔接物可在紧邻附连配体之前包含酶靶序列以在进入细胞核内体(cellularendosome)之后促进裂解配体，从而将配体从纳米颗粒分离。在一个实施方案中，衔接物可包含促进配体从纳米颗粒解离的组织蛋白酶裂解位点。本领域技术人员将理解，被酶靶向的其他序列可以以相似的方式被应用以导致纳米颗粒从其配体解离，其将允许纳米颗粒在被细胞分泌之后移入CNS实质。可选择地，蛋白酶体降解标签还可被掺入衔接物中以导致配体被降解，但留下自身完整的纳米颗粒，因为这将在细胞摄取之后有效地解离配体和纳米颗粒。具有可被化学裂解的特定化学键诸如原酸酯键、缩醛键、缩酮键、亚胺键和腙键的衔接物的使用也应当被理解为在本公开内容的范围之内，因为本领域技术人员将理解这样的化学键可被用来促进配体从缀合的纳米颗粒解离。
在一些所述的实施方案中，衔接物可包括二硫键，当纳米颗粒在脑内皮细胞内部时所述二硫键可被还原导致配体从纳米颗粒解离。在一个实施方案中，所述二硫键可被置于桥接纳米颗粒和配体的两个组分聚合物之间，使得在二硫键还原后，纳米颗粒和配体就将被分开。在一个实施方案中，衔接物包含由二硫键连接的两个PEG聚合物，其中一个PEG聚合物被缀合至纳米颗粒核心，且另一个被缀合至当连接至纳米颗粒核心时介导靶向的配体。在这样的颗粒被细胞内吞后，配体将从纳米颗粒解离，其将促进纳米颗粒的离开而进入CNS实质。
在一些所述的实施方案中，衔接物可包含可水解的化学键，当纳米颗粒在脑内皮细胞内部时，所述可水解的化学键可在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离。在一个实施方案中，所述可水解的键可被置于桥接纳米颗粒和配体的两个组分聚合物之间，使得在键水解后，纳米颗粒和配体将被分开。在一个实施方案中，衔接物包含在一个末端被辍合至纳米颗粒核心并经由二氨基缩酮(DAK)被连接至介导靶向的配体的PEG聚合物。在这样的颗粒被细胞内吞后，配体将在纳米颗粒遇到低pH环境时从纳米颗粒解离，其将促进纳米颗粒的离开而进入CNS实质。在一个特别的实施方案中，具有可在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离的可水解的化学键的靶向剂可通过具有附连至被附连至聚PEG-邻二硫吡啶(PEG-orthopyridyldisulfide)(OPSS)的DAK衔接物的配体来形成，其中配体和OPSS位于靶向剂的相对末端(见，例如，以下方案2)。
在一些所述的实施方案中，衔接物可包含具有以下pKa的化学键，当纳米颗粒位于脑内皮细胞内部时，所述化学键可在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离。在一个实施方案中，所述可水解的键可被置于靶向剂的一个末端以介导至纳米颗粒核心的缀合。在该构型中，促成纳米颗粒核心和靶向剂之间的键的水解的pH变化将导致核心从靶向剂上的配体分离。在一个实施方案中，靶向剂可以是在PEG区段的相对末端上具有配体的PEG化的硝基苯硼酸，且纳米颗粒核心可由cMAP构成。存在于cMAP上的二醇和硼酸将允许颗粒核心与靶向剂的共价键合，但是这些键将具有约6.8的pKa。因此，在颗粒被细胞内吞后，配体将在纳米颗粒遇到低pH环境时变成从纳米颗粒解离，其将促进纳米颗粒的离开而进入CNS实质。在一个实施方案中，本文所述的靶向剂可具有式VII的结构：
其中n是2和2000之间的任何整数，R是官能团，包括，但不限于，伯胺、叠氮化物、醇、巯基、醛或羧酸。在某些实施方案中，n可以是约120和约180之间的任何整数。在一些实施方案中，n可以是约140和160之间的任何整数。在一些实施方案中，n可以是145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160中的任一个。
基于前述公开内容，本领域技术人员将理解，衔接物的变体形式可与所述靶向剂一起使用以允许所述靶向的纳米颗粒的递送，并然后介导纳米颗粒从配体解离。因为鉴于本公开内容和本领域普通知识，这样的替代物将是对本领域技术人员容易明显的，其被认为在本公开内容的范围内。
所述的聚合物、纳米颗粒核心和衔接物可与介导所述纳米颗粒的靶向的一个或更多个配体组合。在一些实施方案中，配体将特异性结合至由脑内皮细胞表达的受体或表面蛋白。在另外的实施方案中，配体特异性结合至由经历转胞吞作用的脑内皮细胞表达的受体或表面蛋白。经历转胞吞作用的蛋白的细胞转运使其成为用于进行本文所提供的方法的期望的但不是绝对必要的靶。经历转胞吞作用的靶向细胞蛋白可增加所提供的方法成功的可能性，因为已知这些细胞蛋白通常以协调方式将蛋白和其他分子从细胞的一侧转运至另一侧。可与所述的方法一起使用的配体包括，但不限于，转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2(angiopep-2)、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽。本领域已知的能够促进转胞吞作用的其他细胞蛋白还可被用于进行本文公开的方法的配体靶向。
多种配体可被使用以进行所述的方法，且可与不同的纳米颗粒和衔接物一起使用。可与所述方法一起使用的配体包括，但不限于，转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽。在一些所述的实施方案中，所述的配体可与以下多肽或化学键结合使用，当纳米颗粒在脑内皮细胞内部时，所述多肽或化学键可被化学或酶促裂解导致配体从纳米颗粒解离。例如，附连至配体的衔接物可在紧邻附连配体之前包含酶靶序列以在进入细胞核内体之后促进配体的裂解，从而将配体从纳米颗粒分离。在一个实施方案中，裂解位点可包含促进配体从纳米颗粒解离的组织蛋白酶靶序列。本领域技术人员将理解，被酶靶向的其他序列可以以相似的方式被应用以导致纳米颗粒从其配体解离，其将允许纳米颗粒在被细胞分泌之后移入CNS实质。可选择地，蛋白酶体降解标签还可被掺入衔接物中以导致配体被降解，但留下自身完整的纳米颗粒，因为这将在细胞摄取之后有效地解离配体和纳米颗粒。具有可被化学裂解的特定化学键诸如原酸酯键、缩醛键、缩酮键、亚胺键和腙键的衔接物的使用也应当被理解为在本公开内容的范围之内，因为本领域技术人员将理解这样的化学键可被用来促进配体从缀合的纳米颗粒解离。
在一些所述的实施方案中，所述配体可与具有二硫键的衔接物一起使用，当纳米颗粒在脑内皮细胞内部时，所述二硫键可被还原导致配体从纳米颗粒解离。可与所述方法一起使用的配体包括，但不限于，转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽。在一个实施方案中，二硫键可被置于桥接纳米颗粒和配体的两个组分聚合物之间，使得在二硫键还原后，纳米颗粒和配体被分开。在一个实施方案中，衔接物包含由二硫键连接的两个PEG聚合物，其中一个PEG聚合物被缀合至纳米颗粒核心，且另一个被连接至本文所述的当被连接至纳米颗粒核心时介导靶向的配体。在这样的颗粒被细胞内吞后，配体将变成从纳米颗粒解离，其将促进纳米颗粒的离开而进入CNS实质。
在一些所述的实施方案中，所述的配体可与具有可水解的化学键的衔接物缔合，当纳米颗粒在脑内皮细胞内部时，所述可水解的化学键可在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离。可与所述的方法一起使用的配体包括，但不限于，转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽。在一个实施方案中，可水解的键可被置于桥接纳米颗粒和本文所述配体的任一个的两个组分聚合物之间，使得在键水解后，纳米颗粒和配体被分开。在一个实施方案中，衔接物包含PEG聚合物，所述PEG聚合物在一个末端被缀合至纳米颗粒核心，且在相对的末端经由二氨基缩酮(DAK)被连接至所述配体的任一个。在这样的颗粒被细胞内吞之后，配体将在纳米颗粒遇到低pH环境时变成从纳米颗粒解离，其将促进纳米颗粒的离开而进入CNS实质。在一个实施方案中，具有可在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离的可水解的化学键的靶向剂可通过使所述配体的任一个附连至DAK衔接物形成，所述DAK衔接物被附连至PEG-邻二硫吡啶(OPSS)，其中配体和OPSS位于靶向剂的相对末端。在一个特别的实施方案中，具有可在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离的可水解的化学键的靶向剂可通过使Tf附连至DAK衔接物形成，所述DAK衔接物被被附连至PEG-邻二硫吡啶(OPSS)，其中配体和OPSS位于靶向剂的相对末端(见，例如，以下方案2)。
在一些所述的实施方案中，所述配体可通过包含具有以下pKa的化学键的衔接物被缀合至纳米颗粒核心，当纳米颗粒在脑内皮细胞内部时，所述化学键可在低pH时被破坏导致配体从纳米颗粒解离。可与所述方法一起使用的配体包括，但不限于，转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽。在一个实施方案中，可水解的键可被置于靶向剂的一个末端以介导至纳米颗粒核心的缀合。在该构型中，促成纳米颗粒核心和靶向剂之间的键的水解的pH变化将导致核心从靶向剂上的配体分离。在一个实施方案中，靶向剂可以是在PEG区段的相对末端上的具有所述配体中任一个的PEG化的硝基苯硼酸。相应纳米颗粒核心可由cMAP构成。存在于cMAP上的二醇和硼酸将允许颗粒核心与靶向剂的共价键合；然而，当键具有约6.8或更小的pKa时，当纳米颗粒遇到低pH环境时配体将从纳米颗粒解离。该解离将促进纳米颗粒的离开而进入CNS实质。在一个实施方案中，本文所述的靶向剂可具有被附加至Tf配体的式VII的结构：
其中n是2和2000之间的任何整数。在某些实施方案中，n可以是约120和约180之间的任何整数。在一些实施方案中，n可以是约140和160之间的任何整数。在一些实施方案中，n可以是110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160中的任一个。可选择地，与任何本文所述衔接物一起使用的PEG区段可以是约2kDa、约5kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa或约15kDa。
基于前述公开内容，本领域技术人员将理解，衔接物的变体形式可与所述靶向剂一起使用形成多种靶向剂以允许所述靶向的纳米颗粒的递送，并然后介导纳米颗粒从配体解离。因为鉴于本公开内容和本领域普通知识这样的替代物将是对本领域技术人员容易明显的，其被认为在本公开内容的范围内。
为进行所述的方法，控制缀合至所述的纳米颗粒的靶向剂的数目可以是有利的。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒可具有多达1000个缀合的靶向剂。在其他实施方案中，所述的纳米颗粒可具有多达500个缀合的靶向剂。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒可具有多达400个缀合的靶向剂。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒可具有多达300个缀合的靶向剂。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒可具有多达200个缀合的靶向剂。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒可具有多达100个缀合的靶向剂。此外，所述的纳米颗粒可具有少至从约20个至50个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有少于15个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有10个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有9个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有8个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有7个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有6个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有5个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有少于4个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有3个缀合靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有2个缀合的靶向剂。在又另一个实施方案中，所述的纳米颗粒可具有1个缀合的靶向剂。靶向剂的数目可依据被递送的纳米颗粒的种类、递送靶、靶向颗粒使用的配体，或许多其他因素进行调整。
可选择地，本文所述的纳米颗粒可具有被附连至纳米颗粒核心的靶向剂和间隔分子(没有附连的配体的靶向剂)的混合物。在一些实施方案中，缀合至纳米颗粒核心的靶向剂数目将超过附连的间隔分子数目。在一些实施方案中，缀合至纳米颗粒核心的靶向剂与间隔分子的比可以是约100:1、约50:1、约20:1、约10:1、约7:1、约5:1、约4:1、约3:1或约2:1。在一些实施方案中，缀合至纳米颗粒核心的靶向剂与间隔分子的比可以大致相同-约1:1。在一些实施方案中，缀合至纳米颗粒核心的间隔分子数目将超过附连的靶向剂数目。在一些实施方案中，缀合至纳米颗粒核心的间隔分子与靶向剂的比可以是约100:1、约50:1、约20:1、约10:1、约7:1、约5:1、约4:1、约3:1或约2:1。理解缀合至纳米颗粒核心的间隔分子和靶向剂的相对分布的另一种方式是根据是靶向剂的总附连的缀合物的百分比。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约100％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约90％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约80％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约70％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约60％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约50％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约40％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约30％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约20％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约19％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约18％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约17％。在一些实施方案中，是靶向分子(与剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约16％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约15％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约14％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约13％。在一些实施方案中，在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约12％。在一些实施方案中，在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约11％。在一些实施方案中，在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约10％。在一些实施方案中，在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约9％。在一些实施方案中，在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约8％。在一些实施方案中，在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约7％。在一些实施方案中，在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约6％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约5％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约4％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约3％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约2％。在一些实施方案中，是靶向分子(剩余是间隔分子)的附连至纳米颗粒核心的缀合物的总百分比为约1％。本文所述的比和百分比可以说明缀合物的混合群，诸如其中多于一种靶向剂和/或间隔分子被附连至纳米颗粒核心的实施方案。
本文所述的方法部分地依赖于所述纳米颗粒的细胞运输，以允许颗粒定位至脑实质。在大多数情况下，所述的方法将利用穿过靶向的脑内皮细胞的某种形式的核内体运输。该方面以及其他实践方面，诸如颗粒亲合力，导致粒度是设计与所提供方法一起使用的纳米颗粒中考虑的重要因素。适合于与所提供方法一起使用的颗粒可以是从约40nm至约100nm。在一些实施方案中，本文所述的方法可使用包含如本文所述的纳米颗粒核心的靶向的纳米颗粒来进行，所述纳米颗粒核心被缀合至本文所述靶向剂中的任一个，其中靶向的纳米颗粒的总尺寸是从约20nm至约100nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约40nm至约100nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约40nm至约90nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约40nm至约80nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约40nm至约70nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约40nm至约60nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约40nm至约50nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约50nm至约100nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约50nm至约90nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约50nm至约80nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约50nm至约70nm。在一些实施方案中，靶向的纳米颗粒的尺寸是从约70nm至约100nm。
本文所述的方法部分地依赖于所述的纳米颗粒的细胞运输，以允许颗粒定位至脑实质。在设计跨越血脑屏障的脑内皮细胞的纳米颗粒时，考虑颗粒的可促进而不是抑制颗粒与这些内皮细胞的相互作用的方面是重要的。一个这样的特性是颗粒的电荷。因此，所述的方法可使用包含如本文所述的纳米颗粒核心的靶向的纳米颗粒来进行，所述纳米颗粒核心被缀合至本文所述的靶向剂中的任一个，其中靶向的纳米颗粒的电荷接近中性。所述的颗粒的ζ电势可依据制造颗粒核心使用的材料、所使用的衔接物和配体而变化。在大多数情况下，靶向的纳米颗粒的ζ电势将落在负值范围内。用于与本文所述方法一起使用的纳米颗粒的ζ电势范围可从约-0.5mV至约-15.0mV。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-2.0mV至约-11.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-3.0mV至约-11.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-4.0mV至约-11.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-5.0mV至约-11.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-6.0mV至约-11.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-7.0mV至约-11.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-8.0mV至约-11.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-9.0mV至约-11.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-2.0mV至约-10.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-2.0mV至约-9.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-2.0mV至约-8.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-2.0mV至约-7.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-4.0mV至约-8.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有从约-5.0mV至约-7.0mV的ζ电势。在一些实施方案中，所述的纳米颗粒将具有-5.0、-5.1、-5.2、-5.3、-5.4、-5.5、-5.6、-5.7、-5.8、-5.9、-6.0、-6.1、-6.2、-6.3、-6.4、-6.5、-6.6、-6.7、-6.8、-6.9、-7.0、-7.1、-7.2、-7.3、-7.4、-7.5、-7.6、-7.7、-7.8、-7.9或-8.0mV的ζ电势。
所述的方法可用于通过在向受试者施用纳米颗粒之前使所述纳米颗粒负载感兴趣的治疗剂或显像剂，将治疗剂或显像剂递送至受试者的脑部。递送负载的纳米颗粒之后，靶向剂将促进至感兴趣的靶细胞，诸如脑内皮细胞的递送。在由靶细胞内化后，纳米颗粒将从靶向剂解离。在脑内皮细胞的情况下，内化的纳米颗粒然后将从细胞被排出进入脑间质空间，在脑间质空间，颗粒将去稳定并分泌所负载的药剂，从而将药剂递送到脑部或其他靶位置。在一些实施方案中，可进行所述的方法以将神经递质诸如5-羟色胺或多巴胺递送至脑部，所述神经递质可被用来治疗神经紊乱。用于治疗神经紊乱的其他药剂还可经由所述的方法被递送至脑部。自身可能不容易进入脑部的显像剂也可使用所述的方法进行递送。在一些实施方案中，所述方法可被用来将携带显像剂Cu64的纳米颗粒递送至受试者的脑部以允许用于成像。此外，所述的方法可被用来将一个或更多个治疗剂、显像剂或治疗剂、显像剂两者的组合递送至受试者的脑部。
本文所述的纳米颗粒可以以任何可接受的剂型被口服施用，所述剂型诸如胶囊、片剂、水性悬液、溶液剂或类似物。纳米颗粒还可被非肠道施用，包括但不限于：皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内和颅骨内注射或输液技术。可选择地，纳米颗粒将被静脉内或腹膜内施用，例如，通过注射。
受试者可以是任何动物，且优选地是哺乳动物例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔子、猫、狗、猴子、驴、牛、马、猪以及类似物。最优选地，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，受试者可以以每kg受试者体重0.01μg至500mg的日剂量范围被施用至少一种所述的纳米颗粒。施用至受试者的剂量还可根据每天施用的至少一种所述的纳米颗粒的总量来测量。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量5至5000毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达10毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达100毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达250毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达500毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达750毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达1000毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达1500毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达2000毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达2500毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达3000毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达3500毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达4000毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达4500毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，受试者被施用每一剂量多达5000毫克的至少一种所述的纳米颗粒。在一些实施方案中，所述的方法可被进行，使得本文所述的纳米颗粒被每周一次、两周一次、每月一次、两月一次、每半年一次或一年一次施用至受试者。治疗可开始于少于最佳剂量的较小剂量，随后在治疗过程中增加剂量直至在此情况下达到最佳效果。
本文所提供的方法可通过向受试者施用悬浮于药学上可接受的载体中的本文所述的纳米颗粒来进行。这样的组合物，例如，对施用至患者治疗神经紊乱有用。组合物可被配制为本领域已知和适合的各种制剂中的任一种。在一些实施方案中，组合物是水性制剂。水溶液可通过在水中或适合的生理缓冲液中混合纳米颗粒来制备，并且根据需要任选地添加适合的着色剂、防腐剂、稳定剂和增稠剂以及类似物。水性悬液还可通过在具有粘性材料的水中或生理缓冲液中分散纳米颗粒来制备，所述粘性材料诸如天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素纳以及其他熟知的悬浮剂。
还包括了液体制剂以及意图在临使用之前转化为液体制剂的固体形式的制剂。这样的液体剂包括溶液、悬液、糖浆剂、浆液剂和乳剂。液体制剂可通过常规方法用诸如以下的药学上可接受的添加剂来制备：悬浮剂(例如，山梨糖醇浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪或油)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树脂)；非水的媒介物(例如，杏仁油、油性酯或分馏植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。除了活性剂之外，这些制剂可包含着色剂、香料、稳定剂、缓冲液、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂以及类似物。组合物可呈粉末形式或冻干形式以在使用之前用适合的媒介物构建，所述适合的媒介物诸如无菌水、生理缓冲液、盐溶液或醇(alcohol)。
组合物可被配制用于注射进入受试者。对于注射，所述的组合物可在水溶液，诸如水或醇中，或在生理上相容的缓冲液诸如Hank溶液、Ringer溶液、或生理盐缓冲液中被配制。溶液可包含一种或更多种配方剂(formulatoryagent)诸如悬浮剂、稳定剂或分散剂。注射制剂还可被制备为意图在临使用之前被转化为适合于注射的液体形式制剂的固体形式制剂，例如，通过用适合的媒介物诸如无菌水、盐溶液或醇在使用之前构建。
本文描述了用于产生靶向递送至脑部的纳米颗粒的试剂盒。例如，所述的试剂盒可包含组装纳米颗粒的材料和试剂，所述纳米颗粒具有以下的外表面：阳离子粘液酸聚合物(cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、金、氧化铁或如被本领域技术人员所理解的其他类似材料；对由脑内皮细胞表达的受体特异性的靶向剂，其中靶向剂包括被缀合至衔接物的配体，所述衔接物在脑内皮细胞内部时导致配体从纳米颗粒解离；以及用于组装纳米颗粒的说明书。所述的试剂盒还可包含用于靶向已知经历转胞吞作用的脑内皮细胞蛋白的配体。
本文还描述了用于产生靶向递送至脑部的纳米颗粒的试剂盒。例如，所述的试剂盒可包含组装纳米颗粒的材料和试剂，所述纳米颗粒具有以下的外表面：阳离子粘液酸聚合物(cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、金、氧化铁或如被本领域技术人员所理解的其他类似材料；对由脑内皮细胞表达的受体特异性的靶向剂，其中靶向剂包含被缀合至衔接物的配体，所述衔接物当在脑内皮细胞内部时导致配体从纳米颗粒解离；以及包含用于组装纳米颗粒的说明书。所述的试剂盒还可包含靶向脑内皮细胞的配体，诸如转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽。
在下面提供了先前所述主题的说明性的实施方案。这些实施方案旨在说明并非限制前述公开内容。
1.一种将纳米颗粒递送至受试者脑部的方法，所述方法包括向所述受试者施用具有纳米颗粒核心和靶向剂的纳米颗粒，其中所述靶向剂包含对由脑内皮细胞表达的受体特异性的配体和将所述配体连接至所述纳米颗粒核心的衔接物，其中所述衔接物当在脑内皮细胞内部时导致所述配体从所述纳米颗粒解离，且其中所述配体通过所述衔接物缀合至所述纳米颗粒核心的外表面。
2.如实施方案1所述的方法，其中：
所述纳米颗粒核心的表面包含以下的任一个：阳离子粘液酸聚合物(cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、树状聚体、金或氧化铁；
所述配体是以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；并且
所述衔接物当未结合至所述纳米颗粒时包含硝基苯硼酸，并且当结合至所述纳米颗粒时形成硝基苯硼酸酯。
3.如实施方案2所述的方法，其中所述纳米颗粒核心包含具有以下结构阳离子粘液酸聚合物(cMAP)：
其中m是5和50之间的任何整数。
4.如实施方案3所述的方法，其中m是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16中的任一个。
5.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述靶向剂的衔接物还包含在所述硝基苯硼酸和所述配体之间的聚乙二醇(PEG)聚合物。
6.如实施方案5所述的方法，其中所述衔接物具有以下结构：
其中n是2和2000之间的任何整数，且R是选自以下的官能团：伯胺、叠氮、醇、巯基、醛或羧酸。
7.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述靶向剂是
且n是2和2000之间的任何整数。
8.如实施方案6或7所述的方法，其中n是从约110至约150的任何整数。
9.如实施方案1所述的方法，其中：
所述纳米颗粒核心的表面包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)聚合物，
所述配体是以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；并且
所述衔接物包含PEG聚合物。
10.如实施方案9所述的方法，其中所述PEG聚合物经由二硫键或具有酶裂解位点的多肽被缀合至所述配体。
11.如实施方案9或10所述的方法，其中所述纳米颗粒核心包含具有以下结构的PLGA：
其中，x和y独立地是5和500之间的任何整数。
12.如实施方案11所述的方法，其中x和y独立地是40、45、50、55或60中的任一个。
13.如实施方案11或12所述的方法，其中包含PLGA的所述纳米颗粒核心被缀合至PEG衔接物，并具有以下结构：
且z是2和2000之间的任何整数，且x和y独立地是5和500之间的任何整数，且R选自伯胺、叠氮、醇、巯基、醛或羧酸。
14.如实施方案13所述的方法，其中z是从约110至约150之间的任何整数，且x和y是50。
15.如实施方案9至14的任一项所述的方法，其中所述靶向剂是：
且z是从约110至约150的任何整数，且x和y是50。
16.如实施方案1所述的方法，其中：
所述纳米颗粒核心的表面包含以下的任何一个：阳离子粘液酸聚合物(cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、树状聚体、金或氧化铁；
所述配体是以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；以及
所述衔接物包含缀合至PEG的二氨基缩酮。
17.如实施方案1所述的方法，其中所述衔接物包含当所述纳米颗粒在脑内皮细胞内部时能够被还原导致所述配体从所述纳米颗粒解离的二硫键。
18.如实施方案1所述的方法，其中所述衔接物包含当所述纳米颗粒在脑内皮细胞内部时能够被酶促裂解导致所述配体从所述纳米颗粒解离的多肽或化学键。
19.如实施方案1所述的方法，其中所述衔接物包含当所述纳米颗粒在脑内皮细胞内部时能够在低pH下被破坏导致所述配体从所述纳米颗粒解离的可水解的化学键。
20.如实施方案1所述的方法，其中所述衔接物包含具有以下pKa的化学键，当纳米颗粒在脑内皮细胞之内时，所述化学键能够在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离。
21.如实施方案19或20所述的方法，其中低pH是从约6.8至约2.0的值。
22.如实施方案21所述的方法，其中低pH是从约5.5至约2.5的值。
23.如实施方案21所述的方法，其中低pH是从约5.5至约4.0的值。
24.如实施方案17至23中的任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒核心的表面包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
25.如实施方案17至23中的任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒核心的表面包含阳离子粘液酸聚合物(cMAP)。
26.如实施方案17至23中的任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒核心的表面包含金。
27.如实施方案1所述的方法，其中：
所述纳米颗粒核心的表面包含所述纳米颗粒核心的表面包含以下的任一个：阳离子粘液酸聚合物(cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、树状聚体、金或氧化铁；
所述配体为以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；并且
所述衔接物包括选自以下的可酸裂解的化学键：辍合至PEG的原酸酯、缩醛、缩酮、亚胺或腙。
28.如任一前述实施方案所述的方法，其中所述纳米颗粒包含少于200个辍合至其表面的靶向剂。
29.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述纳米颗粒包含少于20个辍合至其表面的靶向剂。
30.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述纳米颗粒包含少于5个辍合至其表面的靶向剂。
31.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述纳米颗粒包含单个辍合至其表面的靶向剂。
32.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过动态光散射(DLS)测量的从约40nm至约100nm的尺寸。
33.如实施方案32所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过动态光散射(DLS)测量的从约50nm至约70nm的尺寸。
34.如实施方案33所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过动态光散射(DLS)测量的55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm或69nm的尺寸。
35.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过相位分析光散射测量的从约-0.5mV至约-15.0mV的平均ζ电势。
36.如实施方案35所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过相位分析光散射测量的-5.0、-5.1、-5.2、-5.3、-5.4、-5.5、-5.6、-5.7、-5.8、-5.9、-6.0、-6.1、-6.2、-6.3、-6.4、-6.5、-6.6、-6.7、-6.8、-6.9、-7.0、-7.1、-7.2、-7.3、-7.4、-7.5、-7.6、-7.7、-7.8、-7.9或-8.0mV的平均ζ电势。
37.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述纳米颗粒还包含治疗剂。
38.如实施方案37所述的方法，其中所述治疗剂针对神经紊乱有效。
39.如实施方案37或38所述的方法，其中所述治疗剂是5-羟色胺或多巴胺。
40.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述纳米颗粒还包含显像剂。
41.如实施方案40所述的方法，其中所述显像剂是Cu-64。
42.如任一项前述实施方案所述的方法，其中所述纳米颗粒包含第一靶向剂和第二靶向剂，其中所述第二靶向剂包含：
衔接物，当在脑内皮细胞内部时，所述衔接物并不易于从所述纳米颗粒核心解离，以及
配体，所述配体将所述颗粒靶向至脑中的特定细胞。
43.一种用于产生靶向递送至脑部的纳米颗粒的试剂盒，所述试剂盒包含阳离子粘液酸聚合物(cMAP)；对由脑内皮细胞表达的受体特异性的靶向剂，其中所述靶向剂包含被缀合至衔接物的配体，所述衔接物当在脑内皮细胞内部时导致所述配体从所述纳米颗粒解离；以及用于组装所述纳米颗粒的说明书。
44.一种用于产生靶向递送至脑部的纳米颗粒的试剂盒，所述试剂盒包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)；对由脑内皮细胞表达的受体特异性的靶向剂，其中所述靶向剂包含被缀合至衔接物的配体，所述衔接物当在脑内皮细胞内部时导致所述配体从所述纳米颗粒解离；以及用于组装所述纳米颗粒的说明书。
45.如实施方案43或44所述的试剂盒，其中所述配体是以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；并且其中所述衔接物当未结合至所述纳米颗粒时包含硝基苯硼酸，而当结合至所述纳米颗粒时形成硝基苯硼酸酯。
46.如实施方案43至45的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含治疗剂或显像剂。
以下实施例被提供以更详细地描述本文所述的实施方案。所述实施例旨在说明而非限制实施方案。
实施例I--使用还原敏感型衔接物将配体从纳米颗粒解离
进行研究以评估具有缀合的靶向剂的纳米颗粒是否可使用还原敏感型衔接物从靶向剂的配体解离。进行最初的研究以确定二硫键连接的聚合物是否可被分离产生原始聚合物。对于该工作，聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇(PLGA-PEG)分子通过两个包含末端巯基基团的PEG分子的氧化反应被合成，以在接近PEG分子中心处包含二硫键(方案1)。应用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)确认进行的氧化反应(图3)。然后将还原剂β-巯基乙醇(BME)添加至二硫键连接的PEG聚合物，且MALDI-TOF确认二硫键被还原，并且重新生成两个亲本聚合物(图4)。
方案1.二硫键在两个PEG聚合物之间的形成。将聚合物分子量写在适当的反应物或产物之下。
确定了二硫键连接的聚合物可被还原而产生原始组分聚合物之后，进行研究以确定该相同原理是否可被用来解离键合至靶向纳米颗粒的配体。为了评估这，表达TfR的Neuro2A细胞与不同浓度的甲氧基封端的聚乳酸-羟基乙酸共聚物聚乙二醇颗粒(PLGA-mPEG)、包含二硫键的PLGA-PEG-Tf(PLGA-PEG-S-S-PEG-Tf)或用还原剂二硫苏糖醇(DTT)处理之后的包含二硫键的PLGA-PEG-Tf进行孵育。这些制剂中的每一个的结合曲线呈现在图5中。每一个制剂的纳米颗粒尺寸和ζ电势列于表1中。
表1
Tf靶向的包含二硫键的纳米颗粒最强地结合Neuro2A细胞，并具有对TfRs的最高的亲合力。通过用DTT处理的二硫键裂解以及Tf从纳米颗粒的随后解离显著降低了纳米颗粒对Neuro2A细胞的结合，通过减少的最大荧光强度所见。非靶向的(PLGA-mPEG)纳米颗粒具有与DTT处理的纳米颗粒基本上相同的结合曲线，表明绝大部分由DTT处理的颗粒的结合是由于纳米颗粒与细胞表面的非特异性的相互作用。这些结果证实包含二硫键的纳米颗粒以高亲合力结合至TfR，但在Tf脱离纳米颗粒之后，所述纳米颗粒就像非靶向的纳米颗粒一样非特异性结合至Neuro2A细胞。这表明二硫键存在于纳米颗粒中，并且当破坏时，导致靶向配体从纳米颗粒损失，以及对靶向配体的受体的结合亲合力的随后损失。
进行研究以确定含有具有可解离的配体的靶向剂的纳米颗粒是否显示了跨越血脑屏障的改进的能力。BALB/c小鼠经由侧尾静脉注射被施用四种荧光标记的PLGA纳米颗粒制剂：(1)非靶向的纳米颗粒(mPEG)；(2)低亲合力的纳米颗粒(每一纳米颗粒30个Tf)；(3)高亲合力的纳米颗粒(每一纳米颗粒300个Tf)，以及(4)包含二硫键衔接物的高亲合力纳米颗粒(每一纳米颗粒300个Tf+S-S)。图6-9示出了观察到每一个纳米颗粒制剂到达脑实质的程度。纳米颗粒被明确地确定为明显高于自发荧光的荧光信号，所述纳米颗粒明显远离血管并在脑实质内。与细胞核相关的荧光见于阴性对照，且因此不被认为是对纳米颗粒特异性的。非靶向的PLGA-mPEG纳米颗粒未进入脑实质，且仅保持在脉管系统(图6)。低-Tf的PLGA-PEG纳米颗粒存在于实质，与其他的观察结果相一致(图7)。高-Tf的PLGA-PEG纳米颗粒未清楚地见于脑实质，具有与PLGA-mPEG制剂相似的荧光模式(图8)。这与为了成功释放进入脑实质而调整纳米颗粒亲合力的必要性一致。高-Tf+S-S的纳米颗粒提供了脑实质内的最大量的荧光(图9)。
实施例II--具有pH敏感的衔接物的纳米颗粒
使用pH敏感的衔接物从纳米颗粒解离配体
进行初步研究以确定二氨基缩酮(DAK)是否可以连接Tf与PEG并允许Tf在弱酸性pH下解离。将DAK添加至NHS-PEG-OPSS的胺反应末端，随后通过与二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)的反应再次引入胺反应功能。将DSS-DAK-PEG-OPSS添加至人holo-Tf(全铁转铁蛋白)以制备Tf-DAK-PEG-OPSS(方案2)。成功的缀合被MALDI-TOF验证(图10)。缀合物的酸敏感性通过观察粗制混合物中的Tf-PEG在pH5.5缓冲液中在24小时内的慢分解来验证(图11)。高阶PEG化的显著减少在15分钟时是清楚的，并且在2小时时几乎所有PEG被裂解。
方案2：DSS-DAK-PEG-OPSS的合成以及其至TF的缀合
然后，金纳米颗粒(Au-NP)以每纳米颗粒120个Tf-DAK-PEG分子进行制备。典型批次的非靶向(mPEG)颗粒和包含Tf-DAK的颗粒的纳米颗粒表征数据在表2中示出。
表2：典型批次的NP表征数据。对于DLS直径与ζ电势，给出了来自三次测量的平均数值加/减一个标准偏差。对于NTA，给出了来自三次测量的平均模式加/减一个标准偏差。
对Tf-DAKAN-NP在酸性pH下孵育之后的减少的亲合力进行评估。在pH5.5下孵育1小时之后，Tf-DAK-PEG-AuNP显示了对K562细胞低得多的结合亲合力(图12)。在pH8下放置的颗粒的Kd是0.0294nM，而在pH5.5的那些大于0.2nM。这表明在暴露于pH5.5缓冲液之后，较少的与K562细胞上的TfR结合的Tf被缀合至颗粒。
具有含有pH敏感的衔接物的靶向剂的纳米颗粒的体外转胞吞作用
Tf-DAKAU-NP的纳米颗粒转胞吞作用使用bEnd.3细胞作为BBB内皮的模型来测量。可裂解的、不可裂解的以及非靶向的纳米颗粒被各自添加至涂覆bEnd.3细胞的的顶室。从1小时至6小时，具有可裂解的Tf的纳米颗粒显示了至底部孔的增加的递送，而不可裂解的和非靶向的颗粒显示了彼此相似的经历转胞吞作用的能力(图13，表3)。这些结果表明酸敏感的衔接物的存在增加了纳米颗粒跨越BBB体外模型的能力。NTA方法的测量与测量(measurement-to-measurement)的变异性仍被确定，且可能的异常值已经被观察到(例如，图13和表3中mPEG样品60分钟的点)。
制剂
表3：对于每一种制剂底部孔中的总NP随时间的百分比。可能的异常值以星号标示。
具有含有pH敏感的衔接物的靶向剂的纳米颗粒的体内转胞吞作用
包含每颗粒120个Tf-DAK-PEG分子的金纳米颗粒经由侧尾静脉注射被注入BALB/c小鼠。注射12小时后，大脑被分离、固定和切片、以及用银增强溶液染色。金纳米颗粒通过光学显微镜被确定为明显的单独的黑点(图14)。被确定明显位于血管边界之外的纳米颗粒被确定是在脑实质内的纳米颗粒。大量的纳米颗粒被确定在实质内，表明可酸裂解的衔接物的存在增加了纳米颗粒跨越BBB的能力。
实施例III--使用具有含有pH敏感的衔接物的靶向剂将治疗剂递送至脑部
对神经紊乱具有治疗益处(interest)和实验效用的一种药物是多巴胺。帕金森病被表征为多巴胺能神经元在中脑内部黑质中的损伤。所述损伤导致多巴胺在中脑内的水平降低，以及包括僵硬、运动迟缓、震颤与神经精神病学的一系列临床症状变化。多巴胺不能够被用来直接治疗疾病，因为其不能跨越BBB。
将制备具有与最佳Au-NP制剂相同的可裂解配体的密度、流体动力学直径和ζ电势的PLGA纳米颗粒并使其负载3H标记的多巴胺。颗粒将被静脉内施用至小鼠，并且使用静脉注射技术定量多巴胺，这是用于测量药物跨越BBB的能力的黄金标准。游离多巴胺由于被限于血流而可被用作阴性对照。在实质中积累的多巴胺的量将与在系统施用之后到达脑部的L-DOPA的浓度相比，L-DOPA是可跨越BBB并且目前被用于帕金森病的治疗的多巴胺前体药物。
PLGA颗粒应该能够比单独的游离药物单递送更多的多巴胺至CNS。颗粒剂量可被调整为足够高以达到治疗有用量。靶向和转胞吞作用的起始取决于Tf-TfR的相互作用，因此在NP到达BBB内皮之后，PLGA颗粒应该与Au-NP颗粒表现相似；然而，低密度纳米颗粒核心诸如PLGA是否将影响纳米颗粒在血流中的流动，以及是否影响在BBB的表面Tf-TfR相互作用的速率，仍然未知。这可需要Tf-配体浓度和/或给药量的优化以增加-或减少-Tf-TfR的相互作用并导致最大量的转胞吞作用。
方法
除非另外说明，以下方法被用来进行在先前实施例中描述的实验。
PLGA-PEG-S-S-PEG-Tf纳米颗粒制备、表征以及分析
PEG内部二硫键的制备
将胺基-PEG-巯基(NH2-PEG-SH，3.4kDa)以20mg/mL的浓度溶解于DMF中。将羧基-PEG-巯基(COOH-PEG-SH，2kDa)以等摩尔浓度添加(方案1)。将过氧化氢(H2O2)以产生3％H2O2的终浓度添加。将反应混合物在室温下搅拌24小时，并通过MALDI-TOF进行分析。通过将1000x摩尔过量的β-巯基乙醇添加至聚合物，确认二硫键连接PEG聚合物，并通过MALDI-TOF验证二硫键的裂解和聚合物的解离。
PLGA-PEG嵌段共聚物的合成(方案3)。PLGA-NHS通过将250mg羧基封端的聚D,L-乳酸-羟基乙酸共聚物(50/50)(PLGA-COOH)溶解于1.1mL乙腈中来制备。将10倍摩尔过量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)添加至该溶液并在室温下搅拌90分钟。产物通过添加30mL甲醇随后以2700g离心10分钟从溶液中沉淀析出。将上清液弃去，且产物用30mL甲醇洗涤并通过离心再次收集。该过程再重复两次，总计三次洗涤。将纯化的PLGA-NHS在真空下干燥。
将多种异双官能团聚乙二醇(PEG)聚合物添加至PLGA-NHS形成PLGA-PEG嵌段共聚物。所有PEG聚合物包含胺基末端以与PLGA聚合物上的NHS酯反应，且在另一端包含羧基(NH2-PEG-COOH；5kDa)；甲氧基(NH2-PEG-OCH3，5kDa)；或巯基(NH2-PEG-SH；3.4kDa)末端。将干燥的PLGA-NHS以5mM的浓度溶解于乙腈中，随后添加1.5x摩尔过量的异双官能团PEG和10x摩尔过量的N,N-二异丙基乙醇胺(DIPEA)。产物通过在室温下温和搅拌24小时之后添加30mL二乙醚来沉淀。PLGA-PEG嵌段共聚物通过以2700g离心10分钟来收集。将上清液弃去，且产物用另一个30mL乙醚洗涤，并通过离心再次收集。该过程再重复两次，总计三次洗涤。将产物在真空下干燥。
方案3.PLGA-PEG嵌段共聚物的合成。在步骤二中，异双官能团PEG聚合物中标记为‘R’的化学基团相应于甲氧基基团、羧酸基团或游离巯基基团。
包含二硫键的PLGA-PEG共聚物的合成(方案4)。PLGA-PEG-S-S-PEG-COOH通过将100mgPLGA-PEG-SH溶解于2mLDMF中来制备。将5x摩尔过量的SH-PEG-COOH(2kDa)添加至该溶液。在SH-PEG-COOH溶解后，将200uL30％过氧化氢(H2O2)添加至反应混合物以产生3％H2O2的终浓度。将反应置于室温下搅拌24小时。
方案4.包含二硫键的PLGA-PEG聚合物的合成。A
PLGA-AF488的合成。荧光标记的PLGA聚合物通过将50mgPLGA-NHS溶解于1mLDMF中随后添加溶解于0.5mLDMF中的1mgAlexa-fluor488尸胺(AF488)来制备。产物在1小时之后用20mL甲醇沉淀以2700g离心10分钟来收集。产物以另一个20mL甲醇来洗涤，并通过离心再次收集。该过程再重复两次，总计三次洗涤。将纯化的产物在真空下干燥。
PLGA-PEG纳米颗粒的制备(方案5)。PLGA-PEG纳米颗粒通过纳米沉淀法来制备(图16)。将PLGA-PEG嵌段共聚物的多种组合以10mg/mLPLGA-PEG共聚物的总浓度溶解于3mLDMF中。每一种制剂按重量计包含2.5％PLGA-AF488。将聚合物混合物逐滴地添加至30mL搅拌的水，并允许混合2小时。将所得的纳米颗粒混合物通过0.2μm过滤器，并通过用50kDaMWCO离心过滤器以2700g超滤10分钟来纯化。将纳米颗粒保留物重悬于10mL水中，并通过再超滤两次总计三次洗涤来收集。在最终洗涤循环之后，将浓缩的纳米颗粒重悬于1mLPBS中。制造四种不同的纳米颗粒制剂使用的每一种聚合物的相对量在表4中示出。每一种制剂包含2.5％PLGA-AF488。
表4.
将人全铁转铁蛋白添加至纳米颗粒。纳米颗粒浓度使用纳米颗粒追踪分析(NTA)来确定。将纳米颗粒制剂以PBS稀释至0.0001mg/mL，且颗粒浓度使用NanosightNS500来确定。将EDC和NHS以对存在于制剂中的羧基封端的PLGA-PEG嵌段共聚物(PLGA-PEG-COOH或PLGA-PEG-S-S-PEG-COOH)的总量的10x摩尔过量添加至纳米颗粒，并允许在室温下搅拌10分钟。基于通过NTA确定的纳米颗粒浓度，在PBSpH7.2中制备的人全铁转铁蛋白(Tf)以对于低-Tf制剂的30x摩尔过量和对于高-Tf并包含二硫键的制剂的300x摩尔过量被添加。将反应混合物在室温下搅拌90分钟，并然后通过用100kDaMWCO离心过滤器以3000g超滤10分钟来纯化。将纳米颗粒保留物重悬于0.5mLPBS中，并通过超滤再次收集。该过程再重复两次总计三次洗涤。
PLGA-PEG纳米颗粒的表征。颗粒尺寸和ζ电势用Brookhaven仪器DLS与ΖetaPALS来测量。颗粒直径在PBS中在2分钟之内来测量。ζ电势在1.5mMKCl(pH7.0)中来采集，并从3次运行以0.018的靶剩余来平均。
包含二硫键的纳米颗粒结合亲和力的体外确定。将Neuro2A细胞培养于10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM中。在与纳米颗粒的孵育之前，将细胞在4℃下在BD中固定15分钟，在PBS+4％BSA中洗涤并重悬。多种浓度的纳米颗粒制剂与2x106个细胞以1x106个细胞/mL孵育90分钟。为了裂解存在于包含二硫键的纳米颗粒制剂中的二硫键，这些颗粒在添加至Neuro2A细胞之前在室温下用二硫苏糖醇(DTT)处理30分钟。过量的DTT通过在PBS中洗涤纳米颗粒并通过超滤收集纳米颗粒来去除。将细胞以200g沉淀5分钟，并重悬于200uLPBS中。纳米颗粒的结合通过测量以488nm激发、525nm发射的荧光强度来测量。将数据拟合至Langmuir结合等温线，Bmax和KD使用Matlab函数nlinfit(非线性最小二乘数据拟合)数字上确定。
动物研究。所有动物根据由加州理工学院动物护理与使用委员会(CaltechInstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准的用于动物护理与使用的NIH指导方针来处理。包含1x1010个至1x1011个颗粒的纳米颗粒制剂在150uLPBS中来制备，并经由测尾静脉注入雌性BALB/c小鼠中。小鼠在注射一小时后通过CO2窒息处死。将大脑取出并在4％多聚甲醛中固定过夜用于进一步的组织处理。
共聚焦显微术。将甲醛固定的组织嵌入石蜡、切片和脱蜡。组织使用具有DAPI(核染色剂)的ProlongAntifade试剂来固定。切片在具有ZeissPlanNeofluar40x/1.3油物镜的ZeissLSM510倒置共聚焦扫描显微镜下进行成像。用于DAPI的激发波长是710nm(双光子激光器)，且488nm用于Alexafluor488标记的纳米颗粒。其相应的发射滤波器分别是390-465nm和530-560nm。
包含缩酮的PEG(DSS-DAK-PEG-OPSS)的合成：将二氨基缩酮(DAK；图4)掺入在Tf与PEG之间。简言之，将150mgOPSS-PEG-NHS(5kDa，LaysanBio)溶解于干燥的DCM中。向其添加20x摩尔过量的TEA和20xDAK(SigmaAldrich)。将溶液在氩下在室温下搅拌5小时。将预浸的N-(2-氨基乙基)氨基甲基聚苯乙烯珠子(NH2-珠子，EMDMillipore)以10x摩尔过量添加至DAK，并在同样的条件下搅拌一小时。将溶液过滤，并通过添加150mL二乙醚来沉淀。在室温下静置15分钟后，沉淀物通过以3220g离心15分钟来分离。再重复两次将固体物用醚洗涤，并通过离心收集。将产物在真空下干燥以产生致密的白色的固体。将所得的DAK-PEG-OPSS(100mg)溶解于干燥的DCM中。以10x摩尔过量添加二琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS，Pierce)和TEA。反应在室温下搅拌90分钟。产物通过添加60mL醚来沉淀。在室温下静置30分钟之后，沉淀物通过以3220g离心15分钟来分离。再重复两次将固体物用醚洗涤并通过离心收集。固体产物在真空下干燥以产生致密的白色的固体。
DSS-DAK-PEG-OPSS至Tf的缀合：将人holo-Tf(20mg)溶解于900uL100mMNaHCO3pH8.5中。将DSS-DAK-PEG-OPSS(2x摩尔过量)溶解于100uLDMSO中，并添加至Tf。溶液在室温下轻轻搅拌放置60分钟。将过量的PEG去除，并且反应通过以14000g离心5分钟通过50kDaMWCO旋转过滤器(EMDMillipore)来淬灭。保留物用10mMNaH2PO4pH8.0再洗涤两次。缀合使用芥子酸基质通过MALDI-TOF来验证。
Tf-DAK-PEG-OPSS的纯化：较高阶PEG化如下从混合物去除：使用1M硫酸铵与50mM磷酸钠pH7.5的高盐缓冲液和仅由后一种盐组成的洗脱缓冲液，通过在AKTAPrimePlusFPLC系统(GEHealthcare，5mLHiTrap苯基柱)上的疏水相互作用色谱(HIC)。混合物中剩余的单-PEG化的Tf的量通过联吡啶二硫化物裂解测定来确定。将Tf-PEG混合物在具有5mMEDTA的PBSpH7.2中来稀释，并记录在343nm处的吸光度。添加二硫苏糖醇(DTT)以产生1.5mg/mL的终浓度。在室温下15分钟之后，343nm处的吸光度再次被记录。吸光度中的差异用来计算存在于混合物中的OPSS的量以及，随后，Tf-DAK-PEG-OPSS的量。在100mMNaHCO3pH8.6中的柠檬酸铁以对单-PEG化级分的2.5x摩尔过量被添加，并在轻轻搅拌下在室温下孵育60分钟。过量的铁用100mM碳酸氢钠通过50kDa离心过滤器的六次洗涤来去除。Tf的铁载量含量通过UV-VIS通过A465/A280的比来测量，并与原始未处理的holo-Tf的相同比进行比较。高于0.8的A465/A280比被认为是铁载量的足够证据。
pH5.5下Tf-DAK-PEG-OPSS半衰期的评价：将Tf-DAK-PEG-OPSS在37℃在100mMNaOAcpH5.5中稀释至1mg/mL。在多种时间点，等分试样被取出，以1:10在10mMNaH2PO4pH8.0中稀释并被冻存在干冰上。在最后等分试样被取出之后，所有的样品被融化并立即使用芥子酸基质通过MALDI-TOF来测量。
Tf-PEG-OPSS的合成和纯化：OPSS-PEG-NHS(5kDa，LaysanBio)在1mL100mMNaHCO3pH8.5中以8x摩尔过量添加至人holo-Tf(20mg)的。反应在轻轻搅拌下在室温下放置90分钟。过量的PEG被去除，并且反应通过以14000g离心5分钟通过50kDaMWCO旋转过滤器(EMDMillipore)来淬灭。保留物用10mMNaH2PO4pH8.0再洗涤两次。缀合使用芥子酸基质通过MALDI-TOF来验证。单PEG化的级分通过HPLC(1200系列，Agilent，使用串联的两个TOSOHTSK凝胶G3000swxl柱子)来分离，并使用芥子酸基质通过MALDI-TOF来验证。
Tf-DAK-PEG-Au纳米颗粒的制备：Tf-DAK-PEG-OPSS或Tf-PEG-OPSS以120x摩尔过量添加至具有50nm直径的金纳米颗粒(BBIinternational)的。溶液被强烈搅拌90分钟。mPEG-SH(5kDa，LaysanBio)以10,000x过量来添加并搅拌60分钟。颗粒通过以20,000g离心10分钟来收集，并用dH2O洗涤和短暂声处理。该过程再重复两次以给予总计三次洗涤。在最终离心之后，将颗粒重悬于10mMNaH2PO4pH8.0中。为了制备非靶向的颗粒(Au-PEG)，仅mPEG-SH被添加至50mM金核心，伴随强烈搅拌60分钟。颗粒如以上描述来纯化。
纳米颗粒表征：将纳米颗粒在PBS中稀释，并且流体动力学直径使用动态光散射(DLS)和纳米追踪分析(NTA)来测量。颗粒浓度(颗粒/mL)还使用相同样品中三次测量的平均值通过NTA来确定。ζ电势使用0.02的靶剩余在1.5mMKCl(pH7.0)通过DLS来测量。
纳米颗粒对K562细胞的结合亲和力：K562细胞在37℃，5％CO2下，在具有青霉素/链霉素的DMEM+10％FBS中生长。细胞用PBS来洗涤，并使用细胞刮取出。在300g离心3分钟之后，细胞在4℃下使用BDCytofix(BDBiosciences)固定20分钟。细胞在PBS+4％BSA中清洗和重悬。将包含120个Tf/颗粒的Tf-DAK-PEG-AuNP在37℃下在100mMNaOACpH5.5或100mMNaHCO3pH8.5中孵育一小时。颗粒通过以20,000g离心10分钟来收集，并重悬于PBS+4％BSA中。将渐增浓度的纳米颗粒添加至以5e6个细胞/mL的1e6个细胞，并在RT下静置90分钟。细胞以300g离心3分钟，并用15mLPBS洗涤两次。最后，细胞用银增强溶液(TedPella)进行染色，显影15分钟，并且荧光使用酶标仪(Tecan,infiniteM900)来读取(310nm激发、400nm发射)。使用Matlab中的nlinfit将数据拟合至Langmuir结合等温线并计算KD。
纳米颗粒跨越bEnd.3细胞的转胞吞作用：bEnd.3细胞在37℃，5％CO2下，在具有青霉素/链霉素的DMEM+10％FBS中生长。细胞以82,500个细胞/孔接种在12mm涂覆PET的支持物(Corning)上。每三天替换顶部孔和底部孔中的培养基。跨上皮电阻(TEER)在Endohm室中并使用EVOM电阻计(WorldPrecisionInstruments)来测量。在TEER达到≥30Ohms*cm2之后，进行转胞吞试验。将可裂解的，非可裂解的以及非靶向的颗粒以1e10个颗粒/孔添加至顶部孔中。在多种时间点，从底部孔中取出50uL并用新鲜培养基替换。该等分试样使用PBS稀释至250uL，并且纳米颗粒浓度使用NTA进行测量。顶部孔中的总纳米颗粒的运行计数被计算并用来确定转胞吞作用的能力(图15)。
Tf-DAK-PEG-Au纳米颗粒注入BALB/c小鼠。所有动物根据由加州理工学院动物护理与使用委员会(CaltechInstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批准的用于动物护理与使用的NIH指导方针来处理。每颗粒包含120个Tf-DAK-PEG分子的总计4.5x1011个金纳米颗粒如先前描述来制备。在纯化之后，将颗粒悬于150uLPBSpH7.4中，并注入雌性BALB/c小鼠(Jacksonlaboratory)的侧尾静脉中。小鼠在注射十二个小时之后通过CO2窒息被安乐死。将大脑立即取出并置于10％中性缓冲的福尔马林中，并在4℃储存过夜。大脑然后在渐增浓度的乙醇中(3x30分钟每次)脱水，在二甲苯中平衡(3x30分钟洗涤)以及在50％二甲苯/50％熔融石蜡中平衡(30分钟)。将组织置于纯熔融石蜡中(3x1小时)，置于石蜡模具，让其冷却，并获得5um切片。切片用二甲苯脱蜡，用连续稀释的乙醇再水化。纳米颗粒通过根据制造商的指导手册用银增强溶液(TedPella)染色来可视化。组织用渐增量的乙醇和二甲苯脱水，并用Permount(Fisher)进行固定。所有光学显微术图像使用OCapturePro成像软件(QImaging)在具有40x物镜的OlympusIX50显微镜上采集。

Claims (46)

1.一种将纳米颗粒递送至受试者脑部的方法，所述方法包括向所述受试者施用具有纳米颗粒核心和靶向剂的纳米颗粒，其中所述靶向剂包含对由脑内皮细胞表达的受体特异性的配体和将所述配体连接至所述纳米颗粒核心的衔接物，其中所述衔接物当在脑内皮细胞内部时导致所述配体从所述纳米颗粒解离，并且其中所述配体通过所述衔接物被缀合至所述纳米颗粒核心的外表面。
2.如权利要求1所述的方法，其中：
所述纳米颗粒核心的表面包含以下的任一个：阳离子粘液酸聚合物(cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、树状聚体、金或氧化铁；
所述配体是以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2(angiopep-2)、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；并且
所述衔接物当未结合至所述纳米颗粒时包含硝基苯硼酸，并且当结合至所述纳米颗粒时形成硝基苯硼酸酯。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述纳米颗粒核心包含具有以下结构的阳离子粘液酸聚合物(cMAP)：
其中m是5和50之间的任何整数。
4.如权利要求3所述的方法，其中m是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16中的任一个。
5.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述靶向剂的衔接物还包含在所述硝基苯硼酸和所述配体之间的聚乙二醇(PEG)聚合物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述衔接物具有以下结构：
其中n是2和2000之间的任何整数，且R是选自以下的官能团：伯胺、叠氮、醇、巯基、醛或羧酸。
7.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述靶向剂是
且n是2和2000之间的任何整数。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中n是从约110至约150的任何整数。
9.如权利要求1所述的方法，其中：
所述纳米颗粒核心的表面包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)聚合物，
所述配体是以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；并且
所述衔接物包含PEG聚合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述PEG聚合物经由二硫键或具有酶裂解位点的多肽被缀合至所述配体。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述纳米颗粒核心包含具有以下结构的PLGA：
其中，x和y独立地是5和500之间的任何整数。
12.如权利要求11所述的方法，其中x和y独立地是40、45、50、55或60中的任一个。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中包含PLGA的所述纳米颗粒核心被缀合至PEG衔接物，并具有以下结构：
且z是2和2000之间的任何整数，且x和y独立地是5和500之间的任何整数，且R选自伯胺、叠氮、醇、巯基、醛或羧酸。
14.如权利要求13所述的方法，其中z是从约110至约150之间的任何整数，且x和y是50。
15.如权利要求9至14的任一项所述的方法，其中所述靶向剂是：
且z是从约110至约150的任何整数，且x和y是50。
16.如权利要求1所述的方法，其中：
所述纳米颗粒核心的表面包含以下的任何一个：阳离子粘液酸聚合物(cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、合成的聚合物诸如聚乙烯亚胺、树状聚体、金或氧化铁；
所述配体是以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；并且
所述衔接物包含缀合至PEG的二氨基缩酮。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接物包含当所述纳米颗粒在脑内皮细胞内部时能够被还原导致所述配体从所述纳米颗粒解离的二硫键。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接物包含当所述纳米颗粒在脑内皮细胞内部时能够被酶促裂解导致所述配体从所述纳米颗粒解离的多肽或化学键。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接物包含当所述纳米颗粒在脑内皮细胞内部时能够在低pH下被破坏导致所述配体从所述纳米颗粒解离的可水解的化学键。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述衔接物包含具有以下pKa的化学键，当纳米颗粒在脑内皮细胞之内时，所述化学键能够在低pH下被破坏导致配体从纳米颗粒解离。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中低pH是从约6.8至约2.0之间的值。
22.如权利要求21所述的方法，其中低pH是从约5.5至约2.5之间的值。
23.如权利要求21所述的方法，其中低pH是从约5.5至约4.0之间的值。
24.如权利要求17至23中的任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒核心的表面包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。
25.如权利要求17至23中的任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒核心的表面包含阳离子粘液酸聚合物(cMAP)。
26.如权利要求17至23中的任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒核心的表面包含金。
27.如权利要求1所述的方法，其中：
所述纳米颗粒核心的表面包含所述纳米颗粒核心的表面包含以下的任一个：阳离子粘液酸聚合物(cMAP)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、合成聚合物诸如聚乙烯亚胺、树状聚体、金或氧化铁；
所述配体为以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；并且
所述衔接物包括选自以下的可酸裂解的化学键：辍合至PEG的原酸酯、缩醛、缩酮、亚胺或腙。
28.如任一前述权利要求所述的方法，其中所述纳米颗粒包含少于200个辍合至其表面的靶向剂。
29.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述纳米颗粒包含少于20个辍合至其表面的靶向剂。
30.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述纳米颗粒包含少于5个辍合至其表面的靶向剂。
31.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述纳米颗粒包含单个辍合至其表面的靶向剂。
32.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过动态光散射(DLS)测量的从约40nm至约100nm的尺寸。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过动态光散射(DLS)测量的从约50nm至约70nm的尺寸。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过动态光散射(DLS)测量的55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm或69nm的尺寸。
35.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过相位分析光散射测量的从约-0.5mV至约-15.0mV的平均ζ电势。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述纳米颗粒具有通过相位分析光散射测量的-5.0、-5.1、-5.2、-5.3、-5.4、-5.5、-5.6、-5.7、-5.8、-5.9、-6.0、-6.1、-6.2、-6.3、-6.4、-6.5、-6.6、-6.7、-6.8、-6.9、-7.0、-7.1、-7.2、-7.3、-7.4、-7.5、-7.6、-7.7、-7.8、-7.9或-8.0mV的平均ζ电势。
37.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述纳米颗粒还包含治疗剂。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述治疗剂针对神经紊乱有效。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述治疗剂是5-羟色胺或多巴胺。
40.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述纳米颗粒还包含显像剂。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述显像剂是Cu-64。
42.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述纳米颗粒包含第一靶向剂和第二靶向剂，其中所述第二靶向剂包含：
衔接物，当在脑内皮细胞内部时，所述衔接物并不易于从所述纳米颗粒核心解离，以及
配体，所述配体将所述颗粒靶向至脑中的特定细胞。
43.一种用于产生靶向递送至脑部的纳米颗粒的试剂盒，所述试剂盒包含阳离子粘液酸聚合物(cMAP)；对由脑内皮细胞表达的受体特异性的靶向剂，其中所述靶向剂包含被缀合至衔接物的配体，所述衔接物当在脑内皮细胞内部时导致所述配体从所述纳米颗粒解离；以及用于组装所述纳米颗粒的说明书。
44.一种用于产生靶向递送至脑部的纳米颗粒的试剂盒，所述试剂盒包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)；对由脑内皮细胞表达的受体特异性的靶向剂，其中所述靶向剂包含被缀合至衔接物的配体，所述衔接物当在脑内皮细胞内部时导致所述配体从所述纳米颗粒解离；以及用于组装所述纳米颗粒的说明书。
45.如权利要求43或44所述的试剂盒，其中所述配体是以下的任一个：转铁蛋白、对转铁蛋白受体特异性的抗体、特异性结合至转铁蛋白受体的多肽、胰岛素、对胰岛素受体特异性的抗体、特异性结合至胰岛素受体的多肽、胰岛素样生长因子1、对胰岛素样生长因子受体1特异性的抗体、特异性结合至胰岛素样生长因子受体1的多肽、载脂蛋白E、血管肽素-2、对低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白特异性的抗体、特异性结合至低密度脂蛋白受体或脂蛋白受体相关蛋白的多肽；对白喉毒素受体特异性的抗体、或特异性结合至白喉毒素受体的多肽；并且其中所述衔接物当未结合至所述纳米颗粒时包含硝基苯硼酸，而当结合至所述纳米颗粒时形成硝基苯硼酸酯。
46.如权利要求43至45的任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含治疗剂或显像剂。
CN201480040041.1A 2013-05-14 2014-05-14 通过跨越血脑屏障的纳米颗粒递送治疗剂和显像剂的方法 Active CN105377942B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361822983P 2013-05-14 2013-05-14
US61/822,983 2013-05-14
PCT/US2014/000099 WO2014185964A1 (en) 2013-05-14 2014-05-14 Method of delivering therapeutics and imaging agents by nanoparticles that cross the blood brain barrier

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105377942A true CN105377942A (zh) 2016-03-02
CN105377942B CN105377942B (zh) 2018-07-31

Family

ID=51898753

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480040041.1A Active CN105377942B (zh) 2013-05-14 2014-05-14 通过跨越血脑屏障的纳米颗粒递送治疗剂和显像剂的方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20140348754A1 (zh)
EP (1) EP2997070A4 (zh)
JP (1) JP6366690B2 (zh)
CN (1) CN105377942B (zh)
CA (3) CA2911344C (zh)
WO (1) WO2014185964A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108721642A (zh) * 2018-06-08 2018-11-02 复旦大学 一种含有硼酯单元聚合物的抗体偶联物及其构建方法
CN108884224A (zh) * 2016-03-30 2018-11-23 国立大学法人东京大学 以醛糖二酸为结构单元的新型聚合物和制造方法
CN110433330A (zh) * 2019-09-19 2019-11-12 重庆大学 一种钛基活性骨植入体及其制备方法
CN114848609A (zh) * 2022-05-06 2022-08-05 十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院） 一种覆盖tf-peg-plga涂层的载药zif-8纳米粒及其制备方法与应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101661746B1 (ko) 2008-08-13 2016-09-30 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 캐리어 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템
US9468681B2 (en) 2013-03-01 2016-10-18 California Institute Of Technology Targeted nanoparticles
CN107922609B (zh) 2015-07-01 2020-04-24 加州理工学院 基于阳离子粘酸聚合物的递送系统
CN105078895B (zh) * 2015-08-14 2018-02-09 中国人民解放军第二军医大学 一种脑靶向的仿生纳米药物递释系统的制备及在治疗脑胶质瘤中的应用
PT3583120T (pt) 2017-02-17 2022-12-15 Denali Therapeutics Inc Polipeptídeos de ligação ao recetor de transferrina manipulados
WO2019241327A1 (en) * 2018-06-13 2019-12-19 California Institute Of Technology Nanoparticles for crossing the blood brain barrier and methods of treatment using the same
CN110623941A (zh) * 2019-09-12 2019-12-31 东华大学 一种掺杂Mn2+的聚多巴胺纳米载体及其制备方法
JP2023506703A (ja) 2019-12-04 2023-02-20 ダンタリ インコーポレイテッド 治療用ナノ粒子を合成するための方法及び組成物
KR20220130678A (ko) 2019-12-23 2022-09-27 데날리 테라퓨틱스 인크. 프로그라눌린 변이체들
WO2021186430A1 (en) * 2020-03-15 2021-09-23 Bar Ilan University Nano-delivery system and therapeutic and diagnostic use thereof
IL310109A (en) * 2021-07-14 2024-03-01 Nanocarry Therapeutics Ltd A multi-purpose brain penetration system and its uses
WO2024092164A1 (en) * 2022-10-27 2024-05-02 California Institute Of Technology Targets for receptor-mediated control of therapeutic biodistribution and efficacy
CN116531524B (zh) * 2023-07-07 2023-09-15 深圳大学总医院 一种脑靶向纳米粒及其制备方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101631567A (zh) * 2007-01-29 2010-01-20 日东电工株式会社 多功能药物载体
CN102114000A (zh) * 2009-12-31 2011-07-06 复旦大学 一种载药的共输送脂质纳米递药系统
CN102123698A (zh) * 2008-08-13 2011-07-13 加利福尼亚技术学院 载体纳米颗粒和相关的组合物、方法和系统
US20110176994A1 (en) * 2002-11-26 2011-07-21 Seacoast Neuroscience, Inc. Buoyant Polymer Particles for Delivery of Therapeutic Agents to the Central Nervous System
WO2012158622A2 (en) * 2011-05-13 2012-11-22 The Regents Of The University Of California Reversibly crosslinked micelle systems

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4631190A (en) * 1981-06-26 1986-12-23 Shen Wei C Acidity-sensitive spacer molecule to control the release of pharmaceuticals from molecular carriers
US5972707A (en) * 1994-06-27 1999-10-26 The Johns Hopkins University Gene delivery system
US6372250B1 (en) 2000-04-25 2002-04-16 The Regents Of The University Of California Non-invasive gene targeting to the brain
WO2003051278A2 (en) * 2001-07-10 2003-06-26 North Carolina State University Nanoparticle delivery vehicle
US7157277B2 (en) * 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7591994B2 (en) * 2002-12-13 2009-09-22 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
US9062126B2 (en) 2005-09-16 2015-06-23 Raptor Pharmaceuticals Inc. Compositions comprising receptor-associated protein (RAP) variants specific for CR-containing proteins and uses thereof
RU2009109353A (ru) * 2006-08-17 2010-09-27 Новартис АГ (CH) Композиции на основе наночастиц
EP2066293A2 (en) * 2006-09-29 2009-06-10 Genzyme Corporation Amide dendrimer compositions
US20100004055A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Gormley Kevin Jerome System and method for donations using online interactive games
JP2013510229A (ja) * 2009-11-06 2013-03-21 ユニヴァーシティ・オブ・ワシントン・スルー・イッツ・センター・フォー・コマーシャリゼーション 双性イオン性ポリマーからの自己組織化粒子および関連する方法
WO2011072133A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-16 William Marsh Rice University Therapeutic compositions and methods for delivery of active agents cleavably linked to nanoparticles
CN103002919B (zh) * 2010-02-04 2015-03-25 得克萨斯系统大学评议会 纳米聚合物对免疫调节剂的肿瘤靶向递送
EP2605799A4 (en) * 2010-08-20 2014-02-26 Cerulean Pharma Inc CONJUGATES, PARTICLES, COMPOSITIONS AND RELATED METHODS
US20120148489A1 (en) * 2010-12-10 2012-06-14 California Institute Of Technology Targeting Kidney Mesangium With Nanoparticles of Defined Diameter
US9132097B2 (en) 2013-03-01 2015-09-15 California Institute Of Technology Nanoparticles stabilized with nitrophenylboronic acid compositions

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110176994A1 (en) * 2002-11-26 2011-07-21 Seacoast Neuroscience, Inc. Buoyant Polymer Particles for Delivery of Therapeutic Agents to the Central Nervous System
CN101631567A (zh) * 2007-01-29 2010-01-20 日东电工株式会社 多功能药物载体
CN102123698A (zh) * 2008-08-13 2011-07-13 加利福尼亚技术学院 载体纳米颗粒和相关的组合物、方法和系统
CN102114000A (zh) * 2009-12-31 2011-07-06 复旦大学 一种载药的共输送脂质纳米递药系统
WO2012158622A2 (en) * 2011-05-13 2012-11-22 The Regents Of The University Of California Reversibly crosslinked micelle systems

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108884224A (zh) * 2016-03-30 2018-11-23 国立大学法人东京大学 以醛糖二酸为结构单元的新型聚合物和制造方法
CN108721642A (zh) * 2018-06-08 2018-11-02 复旦大学 一种含有硼酯单元聚合物的抗体偶联物及其构建方法
CN108721642B (zh) * 2018-06-08 2021-06-04 复旦大学 一种含有硼酯单元聚合物的抗体偶联物及其构建方法
CN110433330A (zh) * 2019-09-19 2019-11-12 重庆大学 一种钛基活性骨植入体及其制备方法
CN110433330B (zh) * 2019-09-19 2021-11-09 重庆大学 一种钛基活性骨植入体及其制备方法
CN114848609A (zh) * 2022-05-06 2022-08-05 十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院） 一种覆盖tf-peg-plga涂层的载药zif-8纳米粒及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3166758A1 (en) 2014-11-20
US20140348754A1 (en) 2014-11-27
US20170071857A1 (en) 2017-03-16
CN105377942B (zh) 2018-07-31
CA2911344A1 (en) 2014-11-20
EP2997070A4 (en) 2016-12-14
EP2997070A1 (en) 2016-03-23
JP6366690B2 (ja) 2018-08-01
WO2014185964A1 (en) 2014-11-20
JP2016522197A (ja) 2016-07-28
CA2911344C (en) 2022-08-30
US10182986B2 (en) 2019-01-22
CA3222990A1 (en) 2014-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105377942A (zh) 通过跨越血脑屏障的纳米颗粒递送治疗剂和显像剂的方法
Zhang et al. PLGA nanoparticle− peptide conjugate effectively targets intercellular cell-adhesion molecule-1
Yousefpour et al. Co‐opting biology to deliver drugs
Mortimer et al. Cryptic epitopes of albumin determine mononuclear phagocyte system clearance of nanomaterials
Pardridge Re-engineering biopharmaceuticals for delivery to brain with molecular Trojan horses
EP3313527B1 (en) Anticancer drug-containing plant virus particles
JP5866117B2 (ja) 分子を送達するための方法および材料
Nowak et al. Delivery of nanoparticles and macromolecules across the blood–brain barrier
AU2019271919A1 (en) Nanoparticle immunoconjugates
Tosi et al. Exploiting bacterial pathways for BBB crossing with PLGA nanoparticles modified with a mutated form of diphtheria toxin (CRM197): In vivo experiments
Wu et al. Peptide-functionalized nanoinhibitor restrains brain tumor growth by abrogating mesenchymal-epithelial transition factor (MET) signaling
Zhang et al. Small morph nanoparticles for deep tumor penetration via caveolae-mediated transcytosis
Pardridge Brain drug delivery and blood–brain barrier transport
KR20080100376A (ko) 친수성 단백질에 기초한 활성제-농축된 나노입자
WO2021245539A9 (ko) 약물 전달과 내재화 효율이 강화된 약물복합체
Heravi Shargh et al. Chemosensitization of temozolomide-resistant pediatric diffuse midline glioma using potent nanoencapsulated forms of a N (3)-propargyl analogue
Zhang et al. Receptor-mediated transportation through BBB
Choudhury et al. Dendrimer-based delivery of macromolecules for the treatment of brain tumor
Chander et al. Pluronic-F127/Platelet Microvesicles nanocomplex delivers stem cells in high doses to the bone marrow and confers post-irradiation survival
Dewangan Albumin as natural versatile drug carrier for various diseases treatment
Komedchikova et al. Two-Step Targeted Drug Delivery via Proteinaceous Barnase-Barstar Interface and Doxorubicin-Loaded Nano-PLGA Outperforms One-Step Strategy for Targeted Delivery to HER2-Overexpressing Cells
Ennen et al. Sphere-Like Protein–Glycopolymer Nanostructures Tailored by Polyassociation
Nguyen et al. Harnessing the versatility of PLGA nanoparticles for targeted Cre-mediated recombination
Bao et al. Targeting cerebral diseases with enhanced delivery of therapeutic proteins across the blood-brain barrier
Tincu et al. Recent Advancements and Strategies for Overcoming the Blood–Brain Barrier Using Albumin-Based Drug Delivery Systems to Treat Brain Cancer, with a Focus on Glioblastoma

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant