CN105372423B - 基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒及方法，所述试剂盒包被底物为金黄色葡萄球菌多克隆抗体，一抗为金黄色葡萄球菌单克隆抗体，阳性对照标准品为金黄色葡萄球菌标准菌株。本发明在3小时内可完成检测，操作步骤简单，可以快速准确完成检测，适合样品的大批量检测，其特异性强、灵敏度高，背景干扰小，可以对食品中金黄色葡萄球菌进行快速筛查和检测，且检测温度适宜范围宽。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒及方法，属于生物技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌是一种人畜共患病的重要致病菌，该菌在自然界中广泛存在于空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。人和动物均有较高的带菌率，健康人的咽喉、鼻腔、皮肤、头发等常带有产肠毒素(SE)的菌株，食品受其污染的机会很多。今年来，美国疾控控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食品中毒，占整个细菌性食物中毒的33％，加拿大则更多，占到45％，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。所以，对金黄色葡萄球菌的快速、准确检验是保证人类健康的必要手段。
传统的检测细菌的方法包括了生化培养、分离鉴定，检验程序复杂繁琐、报告检验结果大致需4～7d，耗时太长，而且检测灵敏度低。所以建立快速而准确的检测方法一直病原微生物检验研究的核心问题。免疫测定法，以其准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等特点，成为检验中广泛应用的方法之一。
免疫传感器开始应用于食源性致病菌的检测要追溯到上世纪70年代，是利用抗原抗体特异免疫反应与高灵敏传感器件相结合构成的一种生物传感器件，它具有制备简便、特异性好、操作快速、灵敏的特点，因此将免疫传感技术用于食品中金黄色葡萄球菌的检测是当前一个新的发展方向。目前，国内外有食品中致病菌的免疫分析已有一些文献报告，但大多采用酶联免疫分析(ELISA)法测定。有关免疫传感技术的研究也有一定报道，如采用免疫磁珠捕获法结合经典PCR技术检测食品中的沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌0157：H7、志贺氏菌等致病菌；但这些工作离实际应用仍有相当距离，因此，用微间距叉指阵列电极方法开展食品中金黄色葡萄球菌高通量的快速分析检测是一项非常有意义的工作。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒及方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，包被底物为金黄色葡萄球菌多克隆抗体，一抗为金黄色葡萄球菌单克隆抗体，阳性对照标准品为金黄色葡萄球菌标准菌株。
在上述方案中优选的是，阴性对照标准品为PBS缓冲液，封闭液为浓度为3％的BSA溶液，二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG(H+L)，底物溶解液为AAP浓度为1mmol/L和AgNO3浓度为5mmol/L的灭菌甘氨酸-NaOH溶液。
在上述任一方案中优选的是，PBS缓冲溶液的制备方法：
加超纯水稀释至1000mL。
在上述任一方案中优选的是，封闭液的制备方法：BSA 3g，加100mL灭菌的0.01mol/L PBS配制。
在上述任一方案中优选的是，还包括一抗的稀释液为含0.1％BSA的PBS溶液。
在上述任一方案中优选的是，还包括二抗的稀释液，所述稀释液包括浓度如下的各组分：10mmol/L HEPES，0.15mol/L NaCl，0.1％Tween 20，0.1％BSA。
在上述任一方案中优选的是，所述底物溶解液的配制方法为：用灭菌的0.1mol/L甘氨酸-NaOH溶液配制AAP浓度为1mmol/L和AgNO3浓度为5mmol/L的溶液，4℃储存一周。
在上述任一方案中优选的是，所述试剂盒包括包被微间隙生物芯片96T/盒，阳性对照液4mL×1瓶；阴性对照液4mL×1瓶；一抗120μL×1瓶；酶标二抗120μL×1瓶；抗体稀释液30mL×1瓶；底物溶解液30mL×1瓶；AAP 1g×1瓶，AgNO31g×1瓶。
所述免疫定量传感器包括由叉指式双电极组成的微间距阵列电极，所述微间距阵列电极包括一对梳形微电极，每个梳形微电极均有多个叉指交叉排列形成叉指形状，所述微间距阵列电极的正电极和负电极的梳形齿宽均为20-100μm，电极间隙为20-100μm，且微间距阵列电极的表面固定有100μL的金黄色葡萄球菌多克隆抗体，该金黄色葡萄球菌多克隆抗体浓度为8μg/mL。
本发明还提供一种应用所述试剂盒的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的方法，包括方法以下各步骤：
(1)以PBS缓冲溶液稀释的金黄色葡萄球菌多克隆抗体，然后包被在96孔微间距阵列电极芯片孔中，每孔100μL，4℃孵育过夜；用超纯水清洗微间距叉指阵列电极三次，将清洗后的电极的每孔加入200μL封闭液，在37℃恒温孵育1小时，弃去封闭液，超纯水洗涤三次后，真空抽干过塑，4℃冷藏保存；
(2)将金黄色葡萄球菌标准菌株浓度为108CFU/mL的菌液100℃水浴加热15分钟，作为阳性对照标准品，
(3)分别取一系列不同浓度的金黄色葡萄球菌样品溶液，将所述每一种浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液和阳性对照标准品、阴性对照标准品分别加入到包埋有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的所述免疫定量传感器上，并在37℃恒温反应30分钟；
(4)用超纯水洗涤三次后加入金黄色葡萄球菌单克隆抗体作为一抗，并在37℃恒温反应30分钟后再用超纯水洗涤三次，加入AP标记山羊抗鼠IgG(H+L)作为二抗，并在37℃恒温反应30分钟后再用超纯水缓冲液洗涤三次；
(5)在所述免疫定量传感器的每孔中加入100μL含AgNO3底物溶液，并在37℃恒温避光反应15分钟后再用超纯水洗涤三次，电极晾干；
(6)将步骤(5)的免疫定量传感器的工作电极的正电极与电化学工作站的工作电极连接，电化学工作站对电极与参比电极复合，再与所述免疫定量传感器工作电极的负电极连接，并采用线性扫描伏安法在0-50mV点位范围检测，记录免疫定量传感器电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值。
在上述任一方案中优选的是，在所述步骤(3)中，加入浓度分别为108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL的金黄色葡萄球菌样品溶液，和阴性对照。
试验结果显示，金黄色葡萄球菌的电导率强，且浓度越高，其电导值越大，其他对照菌则是很低的电导率，因此，利用基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌具有非常好的检测效果。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明基于微间距阵列电极的免疫定量传感器试剂盒在3小时内可完成检测，操作步骤简单，可以快速准确完成检测，适合样品的大批量检测；
2、本发明的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器特异性强、灵敏度高，可实现浓度为104CFU/mL的食品中金黄色葡萄球菌的检测，达到我国食品中金黄色葡萄球菌的限量标准，且背景干扰小，可以对食品中金黄色葡萄球菌进行快速筛查和检测；
3、检测温度适宜范围宽，在4℃-40℃都可使用，结果正常。
4、本发明可以方便的对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行检测，适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场、食品企业等单位或个人对动物源性食品样品中的金黄色葡萄球菌进行快速检测。
附图说明
图1：本发明基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌试剂盒灵敏度实验结果图。
图2：本发明基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌试剂盒特异性实验结果图。
图3：本发明基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌试剂盒实际检测时验结果图。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
金黄色葡萄球菌多克隆抗体购自江苏千人生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌单克隆抗体购自江苏千人生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌菌株购自美国典型菌种保藏中心。
实施例1：
一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒，包被底物为金黄色葡萄球菌多克隆抗体，一抗为金黄色葡萄球菌单克隆抗体，阳性对照标准品为金黄色葡萄球菌标准菌株。
实施例2：
本实施例在实施例1的基础上：还包括阴性对照标准品、封闭液、二抗和底物溶液，阴性对照标准品为PBS缓冲液，封闭液为浓度为3％的BSA溶液，二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG(H+L)，底物溶解液为AAP浓度为1mmol/L和AgNO3浓度为5mmol/L的灭菌甘氨酸-NaOH溶液。
进一步地，PBS缓冲溶液的制备方法：
加超纯水稀释至1000mL。
更进一步地，封闭液的制备方法：BSA 3g，加100mL灭菌的0.01mol/L PBS配制。
更进一步地，还包括一抗的稀释液为含0.1％BSA的PBS溶液。
更进一步地，还包括二抗的稀释液，所述稀释液包括浓度如下的各组分：10mmol/LHEPES，0.15mol/L NaCl，0.1％Tween 20，0.1％BSA。
更进一步地，所述底物溶解液的配制方法为：用灭菌的0.1mol/L甘氨酸-NaOH溶液配制AAP浓度为1mmol/L和AgNO3浓度为5mmol/L的溶液，4℃储存一周。
更进一步地，所述试剂盒包括包被微间距生物芯片96T/盒，阳性对照液4mL×1瓶；阴性对照液4mL×1瓶；一抗120μL×1瓶；酶标二抗120μL×1瓶；抗体稀释液30mL×1瓶；底物溶解液30mL×1瓶；AAP 1g×1瓶，AgNO31g×1瓶。
实施例3：
一种应用实施例1所述试剂盒的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的方法，包括方法以下各步骤：
(1)以PBS缓冲溶液稀释的金黄色葡萄球菌多克隆抗体，然后包被在96孔微间距阵列电极芯片孔中，每孔100μL，4℃孵育过夜；用超纯水清洗微间距叉指阵列电极三次，将清洗后的电极的每孔加入200μL封闭液，在37℃恒温孵育1小时，弃去封闭液，超纯水洗涤三次后，真空抽干过塑，4℃冷藏保存；
(2)将金黄色葡萄球菌标准菌株浓度为108CFU/mL的菌液100℃水浴加热15分钟，作为阳性对照标准品，
(3)分别取一系列不同浓度的金黄色葡萄球菌样品溶液，将所述每一种浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液和阳性对照标准品、阴性对照标准品分别加入到包埋有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的所述免疫定量传感器上，并在37℃恒温反应30分钟；
(4)用超纯水洗涤三次后加入金黄色葡萄球菌单克隆抗体作为一抗，并在37℃恒温反应30分钟后再用超纯水洗涤三次，加入AP标记山羊抗鼠IgG(H+L)作为二抗，并在37℃恒温反应30分钟后再用超纯水缓冲液洗涤三次；
(5)在所述免疫定量传感器的每孔中加入100μL含AgNO3底物溶液，并在37℃恒温避光反应15分钟后再用超纯水洗涤三次，电极晾干；
(6)将步骤(5)的免疫定量传感器的工作电极的正电极与电化学工作站的工作电极连接，电化学工作站对电极与参比电极复合，再与所述免疫定量传感器工作电极的负电极连接，并采用线性扫描伏安法在0-50mV点位范围检测，记录免疫定量传感器电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值。
实施例4：
本实施例在实施例1的基础上：在所述步骤(3)中，加入浓度分别为108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL的金黄色葡萄球菌样品溶液，和阴性对照。
实施例5：试剂盒灵敏度分析
金黄色葡萄球菌菌悬液的制备：将菌液100℃水浴加热15分钟，然后进行系列稀释成108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL浓度的菌液。滴加到包埋有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的免疫定量传感器的电极表面，从该电极获取与金黄色葡萄球菌浓度相关的电导信号，记录变化值。结果表明，金黄色葡萄球菌的浓度越高，其电导值越大(见图1)。浓度越高，其电导值越大，最低检测限可达104CFU/mL。
实施例6：试剂盒特异性分析
将购自美国典型菌种保藏中心的金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、副溶血性弧(ATCC17802)、购自中国医学微生物菌种保藏管理中心的沙门氏菌(CMCC(B)50115)、志贺氏菌(CMCC(B)51592)、购自英国国家标准菌种保藏中心的O157(NCTC 12900)(浓度为107CFU/mL)作为待测样品，用实施例2的试剂盒进行交叉反应研究，试剂盒反应结果只有金黄色葡萄球菌为阳性，其余均为阴性，其中金黄色葡萄球菌电导率强，其他对照菌则是很低的电导率说明该试剂盒特异性较好(见图2)。
实施例7：试剂盒对实际样品的分析
(1)取金黄色葡萄球菌阳性样品，样品处理参考国标GB 4789.7-2013进行。即以无菌操作取检样25g，加入3％氯化钠碱性蛋白胨水225mL，用均质器均质1min，制成1:10的样品匀液，于36℃±1℃培养8小时-18小时。移取1mL的液体到小试管中，在100℃的水浴中加热15分钟，取出后冷却至室温，作为待测样品。
(2)将待测样品和阳性对照标准品、阴性对照标准品分别加入到实施例2的试剂盒免疫定量传感器上，并在37℃恒温反应30分钟；
(3)用超纯水洗涤三次后加入100μL稀释好的一抗，并在37℃恒温反应30分钟后再用超纯水洗涤三次，加入100μL稀释好的二抗，并在37℃恒温反应30分钟后再用超纯水缓冲液洗涤三次；
(4)在所述免疫定量传感器的每孔中加入100μL含AgNO3底物溶液，并在37℃恒温避光反应15分钟后再用超纯水洗涤三次，电极晾干；
(5)将步骤(4)的免疫定量传感器的工作电极的正电极与电化学工作站的工作电极连接，电化学工作站对电极与参比电极复合，再与所述免疫定量传感器工作电极的负电极连接，并采用线性扫描伏安法在0-50mV点位范围检测，记录免疫定量传感器电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值。
试剂盒反应结果只有待测样品和阳性对照为阳性，阴性对照正常，说明该试剂盒检测实际样品效果较好(见图3)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种应用基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测金黄色葡萄球菌的试剂盒的检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：包被底物为金黄色葡萄球菌多克隆抗体，一抗为金黄色葡萄球菌单克隆抗体，阳性对照标准品为金黄色葡萄球菌标准菌株，还包括阴性对照标准品、封闭液、二抗和底物溶液，阴性对照标准品为PBS缓冲液，封闭液为浓度为3％的BSA溶液，二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG(H+L)，底物溶解液为AAP浓度为1mmol/L和AgNO3浓度为5mmol/L的灭菌甘氨酸-NaOH溶液，PBS缓冲溶液的制备方法：
加超纯水稀释至1000mL；
所述方法包括以下各步骤：
(1)以PBS缓冲溶液稀释的金黄色葡萄球菌多克隆抗体，然后包被在96孔微间距阵列电极芯片孔中，每孔100μL，4℃孵育过夜；用超纯水清洗微间距叉指阵列电极三次，将清洗后的电极的每孔加入200μL封闭液，在37℃恒温孵育1小时，弃去封闭液，超纯水洗涤三次后，真空抽干过塑，4℃冷藏保存；
(2)将金黄色葡萄球菌标准菌株浓度为108CFU/mL的菌液100℃水浴加热15分钟，作为阳性对照标准品，
(3)分别取一系列不同浓度的金黄色葡萄球菌样品溶液，将所述每一种浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液和阳性对照标准品、阴性对照标准品分别加入到包埋有金黄色葡萄球菌多克隆抗体的所述免疫定量传感器上，并在37℃恒温反应30分钟；
(4)用超纯水洗涤三次后加入金黄色葡萄球菌单克隆抗体作为一抗，并在37℃恒温反应30分钟后再用超纯水洗涤三次，加入AP标记山羊抗鼠IgG(H+L)作为二抗，并在37℃恒温反应30分钟后再用超纯水缓冲液洗涤三次；
(5)在所述免疫定量传感器的每孔中加入100μL含AgNO3底物溶液，并在37℃恒温避光反应15分钟后再用超纯水洗涤三次，电极晾干；
(6)将步骤(5)的免疫定量传感器的工作电极的正电极与电化学工作站的工作电极连接，电化学工作站对电极与参比电极复合，再与所述免疫定量传感器工作电极的负电极连接，并采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录免疫定量传感器电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值，在所述步骤(3)中，加入浓度分别为108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL的金黄色葡萄球菌样品溶液，和阴性对照。
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