CN105368962A - 肺癌alk基因重排快速检测荧光探针及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及肺癌相关基因快速检测技术领域。本发明所获得的肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，具有准确性高、特异性好及假阳性低的优点。利用本发明所述的快速荧光原位杂交液，将杂交时间由原来的16h缩短到2h，大大提高了诊断效率节约时间。

Description

肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及肺癌相关基因快速检测技术领域。

背景技术

随着现代医学的发展以及治疗理念的更新，肿瘤的治疗已经由传统的手术以及放化疗逐渐向个性化的分子靶向治疗转变，而寻找一个特异并且有效的治疗靶点，是当前肿瘤治疗研究的热点之一。棘皮动物微管相关样蛋白4(Echinodermmicrotubuleassociatedprotein—like4，EML4)与问变性淋巴瘤激酶(AnaplasticLymphomaKinase，ALK)融合基因是非小细胞肺癌(NSCLC)中继表皮生长因子受体(EGFR)突变、Kras(ras基因家族中一种)突变后的又一特异性肿瘤驱动基因的分子靶向位点。EML4和ALK基因均定位于2号染色体的短臂，分别位于P21带和P23带，由于两者的分布方向相反，故在发生融合时，其中一者需要从染色体上断裂，从而调转方向，与另一者发生融合。由于EML4断裂位点的多变，所以与ALK发生融合可以形成多种不同的亚型。目前已经发现的EML4-ALK融合基因亚型至少有11种，其中部分亚型与肿瘤的发生密切相关。这些融合位点包括EML4编码蛋白质N端的基因片段和ALK编码蛋白质C端激酶结构域的基因片段。新融合基因的蛋白产物能够持续激活ALK激酶，激活下游信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、分化、抗凋亡。到目前为止除EML4基因外，已知还有TGF、KIF5B等多种基因可与ALK基因发生融合，启动ALK基因的表达，从而驱动致癌。靶向药物克唑替尼可以通过抑制ALK基因从而发挥遏制肿瘤生长的作用，是第1个针对间变性淋巴瘤激酶(ALK)进行靶向治疗的药物，用于治疗通过FDA批准的检测方法诊断为ALK阳性的局部晚期或转移性非小细胞肺癌患者。2011年8月美国食品药品管理局(FDA)批准克唑替尼用于EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC的治疗。2013年我国SFDA也批准了克唑替尼用于临床治疗NSCLC。

荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，FISH)是基于放射性原位杂交的一种非放射性分子细胞遗传技术，荧光标记取代了同位素。因为ALK基因重排包括大的染色体片段插入和易位，所以选择荧光原位杂交(FISH)方法来检测所有类型的ALK基因重排。该方法可以通过探针特异性标记细胞核中的ALK断裂点来检测ALK重排，进而鉴别出EML4-ALK。相对于THC和RT-PCR，FISH具有高敏感性和高特异性的优势。目前FISH是美国食品和药物管理局唯一批准的在应用克唑替尼前检测ALK基因重排的方法，是检测EML4-ALK融合基因的金标准。

目前市场上已有肺癌ALK基因重排的检测试剂盒，但是需要杂交试剂过长，通常在16h以上，影响诊断效率。

发明内容

本发明提供一种肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针的制备方法及一种快速荧光原位杂交液的配方。通过所述探针制备方法得到两组荧光探针分别位于ALK基因的3’端的两侧，而此位置为ALK基因重排的活性热点，不仅能够EML4、TGF、KIF5B等多种基因与ALK基因重排，而且能够检测目前尚未知其他基因与ALK基因重排从而启动ALK基因表达引发的致癌检测。该方法、配方操作简单，特异性和敏感性高，可以快速、准确地检测出肺癌融合基因，检测结果准确可靠，检测结果准确可靠，可为医师对肺癌进行分子分型提供参考依据，适用于大规模推广应用。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：

一种肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针，其特征在于，它的制备步骤如下：

(1)探针DNA的获取：选取含有ALK基因的BAC菌种经过划线接种、初始培养及过夜培养之后，提取BAC菌种质粒；

(2)酶切DNA：通过切口平移法酶切BAC菌种质粒DNA；

(3)连接反应：采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光标记，该连接体系在16℃反应2.5小时；

(4)沉淀DNA：采用乙醇沉淀法进行沉淀。

上述(3)中该连接反应体系为：

所述反应体系中DNaseI的浓度为0.01-0.1U每反应体系、DNApolymerase的浓度为10-15U每反应体系。

所述反应体系中五种核苷酸的质量比例为dATP：dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝3:2:3:3:2。

一种快速荧光原位杂交液的配方，其特征在于：由SSC、CTAB、去离子甲酰胺、葡聚糖、人类胎盘DNA和水组成。

所述2×SSC溶液的配制方法如下：NaCl175g和柠檬酸钠88g加dH₂O溶解后定容至1000ml，调PH至7.4，高压灭菌，得20×SSC溶液，工作液稀释10倍后即得2×SSC。

所述CTAB溶液由CTAB和水组成，CTAB的终浓度为1-10mM；

所述去离子甲酰胺溶液终浓度为45％-60％；

所述葡聚糖溶液由葡聚糖和水组成，葡聚糖的终浓度为2％-13％；

所述人类胎盘DNA的终浓度为10-100μg/ml。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供的两组荧光探针分别位于ALK基因的3’端的两侧，而此位置为ALK基因重排的活性位点，因此能够检测所有ALK基因重排的情况。同时本发明公开了制备所述荧光探针的优化体系，使标记的探针具有最合适的荧光信号。

2.通过优化探针制备过程及杂交液配方，可以将杂交时间由原来的16h缩短到2h，大大提高了诊断效率，节约时间。

附图说明

图1为ALK基因重组检测荧光探针示意图；

图2为ALK信号计数指南；

图3为ALK信号特征指南。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，操作步骤如下：

一、探针DNA的获取

1.划线接种：将携带有ALK基因的BAC菌种划线接种于含有抗生素(氯霉素)的琼脂平板上，37℃培养过夜(约14小时)；

2.初始培养：次日挑取生长状态良好的单克隆菌种，接种于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中，37℃温度下，摇速约200rpm，培养6-8小时；

3.过夜培养：每1ml菌液转移至200ml培养体系，37℃温度下，转速200rpm，培养过夜(约14小时)；

4.次日按照质粒大量提取试剂盒(OMEGABAC/PAC大型质粒提取试剂盒)操作说明，进行DNA大量提取和纯化。

二、探针标记

1.探针荧光标记

采用提取的质粒DNA进行荧光素标记。

方法如下：

(1)取避光的EP管，先加入水，最后加入DNase1和DNApolymerase(酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系反应：

(2)所述反应体系中DNaseI的浓度为0.07U每反应体系、DNApolymerase的浓度为10-15U每反应体系，上述体系混匀后，瞬时离心，15℃孵育2.5小时；

(3)加入5μl的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应，混匀后瞬时离心，放在-20℃避光保存。

3.沉淀DNA

(1)PCR产物中加1/10的3M醋酸铵，再加入3倍体积的无水乙醇，冰浴30分钟，13600rpm离心20分钟，弃上清；

(2)加入75％乙醇，13600rpm离心20分钟弃上清；

(3)将得到的白色沉淀真空干燥，加ddH₂O回溶即可。

三、杂交反应

1.肺癌组织石蜡切片预处理程序

(1)将载玻片浸入2％3-氨基丙基三乙氧基硅烷丙酮溶液中5分钟，在丙酮、蒸馏水中漂洗，自然干燥载玻片；

(2)从福尔马林固定石蜡包埋的肺癌组织中获得多块4-6μm切片，分别置于无蛋白的水浴槽(40℃)中展片，将切片固定在有机硅包被切片的正面，风干载玻片；

(3)将组织玻片于56℃下过夜烘干；

(4)切片脱蜡：室温下，每隔10分钟依次分别将切片浸没在二甲苯IIIIII中，随后将切片于100％的乙醇中脱水5分钟(重复该步骤一次)，将切片依次放入85％和70％的酒精中各脱水3分钟，之后，用去离子水清洗切片3次；

(5)切片修复：取适量的去离子水(可淹没住玻片为宜)倒入不锈钢容器，在电磁炉上加热至沸腾，改电磁炉加热状态为保温，然后，放入玻片，修复20分钟；

(6)蛋白酶消化：取39.6ml去离子水加入到考普林缸内，放入水浴锅，水浴温度为37℃，待石蜡切片需要消化处理之前，再加入400μl1MHCL和800μl胃蛋白酶，充分混匀，将组织切片浸入蛋胃白酶工作液中37℃孵育10-15分钟，用去离子水漂洗两次，用钻石笔标出组织片的肿瘤区域。

注意：此步操作过程中，可以用镊子晃动玻片，使组织消化均匀。

2.杂交

(1)混合探针：将探针与本发明中快速原位杂交液(2×SSC，50％去离子甲酰胺，10％葡聚糖，100μg/mL人类胎盘DNA，1mMCTAB)混合；

(2)样本杂交：取10μl探针混合物加入到钻石笔标记的组织片区域，立即盖上盖玻片，使探针试剂在盖玻片下均匀铺开，将盖玻片边缘全部密封，最后组织切片放入杂交仪中，84-90℃变性5分钟，47℃杂交过夜。

3.洗涤

(1)在考普林缸中加入杂交后洗涤缓冲液(0.1％NP-40和2×SSC)40ml，于72±1℃水浴该考普林缸锅中水浴，30分钟，另取两个考普林缸，分别加入洗涤缓冲液40ml和2×SSC40ml，常温放置；

(2)关闭杂交仪，取出载玻片，用镊子轻轻去掉橡胶粘合剂，然后放入2×SSC的考普林缸中浸泡，使盖玻片自然脱落(载玻片数≦4张/缸)，在此同时，取出湿条，放入纯水中浸泡；

(3)将从2×SSC的溶液中取出载玻片，放入0.3％NP-40和2×SSC的考普林缸中2分钟，取出后，放入0.1％NP-40和2×SSC的考普林缸中3分钟；

(4)取出组织片，依次放入70％和85％的乙醇中脱水，取出后于暗室条件下自然晾干。

4.复染

在载玻片的目标区域滴加8-10μl的4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染液，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片，将载玻片置于-20℃，黑暗中保存。

7.镜检

在荧光显微镜下观察，利用蓝色滤光镜观察绿色信号，利用绿色滤光镜观察绿红色，利用双通道滤镜观察红和绿色融合后的信号。选择背景干净，杂交信号强烈，细胞核大小均一无重叠，核边界清晰，DAPI染色均一的区域进行细胞计数，并拍照记录。

三、结果判断

ALK基因双色分离探针：ALK基因双色分离探针采用ALK基因3’端外侧探针红色荧光素标记，ALK基因5’端探针绿色荧光素标记。在ALK基因重排阴性的肺癌细胞上呈现出红色和绿色信号相邻或融合(在红/绿双通滤光片下观察为黄色)。红色和绿色信号分离，但是距离小于两个信号直径的大小，这种情况也视为融合信号。单独存在一个绿色荧光信号，不伴有相应的红色信号；而在ALK基因重排阳性的肺癌细胞上可以观察到原来融合的红绿色分开，至少有一组红色和绿色荧光信号分离的距离超出两个信号直径大小。除了融合和/或分离的信号之外，单独存在一个红色荧光信号，不伴有相应的绿色荧光信号(参照图2、图3)。

Claims (9)

1.一种肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针，其特征在于，所述荧光探针是双色分离探针，两组荧光探针分别位于ALK基因的3’端的两侧。

2.如权利要求1所述一种肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针，其特征在于，所述荧光探针为红色、绿色两种探针，ALK基因位于2号染色体短臂2区3带的位置，基因长度为728.793Kb，采用ALK基因3’端上游300Kb基因红色荧光标记，ALK基因3’端下游420Kb采用绿色荧光标记。

3.如权利要求1所述的肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针的制备方法，其特征在于，它的步骤如下：

(1)探针DNA的获取：含有ALK基因和EML4基因的BAC菌种经过划线接种、初始培养及过夜培养之后，提取BAC菌种质粒；

(2)探针标记：采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光标记，该连接体系在16℃反应2.5小时；

(3)沉淀DNA：采用乙醇沉淀法进行沉淀DNA。

4.如权利要求3所述的肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的连接反应体系为：

5.如权利要求4所述的肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针的制备方法，其特征在于：所述反应体系中DNaseI的浓度为0.01-0.1U每反应体系、DNApolymerase的浓度为10-15U每反应体系。

6.如权利要求4所述的肺癌ALK基因重排快速检测荧光探针的制备方法，其特征在于：所述反应体系中五种核苷酸的浓度比例为dATP：dTTP：dCTP：dGTP：dUTP＝3:2:3:3:2。

7.一种快速荧光原位杂交液，其特征在于：由2×SSC、CTAB、去离子甲酰胺、葡聚糖、人类胎盘DNA和水组成。

8.如权利要求7所述一种快速荧光原位杂交液，其特征在于：所述2×SSC溶液的配制方法如下：NaCl175g和柠檬酸钠88g加ddH₂O溶解后定容至1000ml，调PH至7.4，高压灭菌，得20×SSC溶液，工作液稀释10倍后即得2×SSC。

9.如权利要求7所述一种快速荧光原位杂交液，其特征在于：

所述CTAB溶液由CTAB和水组成，CTAB的终浓度为1-10mM；

所述去离子甲酰胺溶液终浓度为45％-60％；

所述葡聚糖溶液由葡聚糖和水组成，葡聚糖的终浓度为2％-13％；

所述人类胎盘DNA的终浓度为10-100μg/ml。