CN105368939A - 一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测的引物及其试剂盒 - Google Patents

一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测的引物及其试剂盒 Download PDF

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测引物及其试剂盒，所述引物包括如下引物的至少一组：第一组：rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC？rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT第二组：rpoB-F：AGCCAGCTGAGCCAATTCAT？rpoB-R：GCCCGGCACGCTCACGT第三组：rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG？rpoB516-R：GCACGCTCACGTGACAGAC。

Description

一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测的引物及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种生物检测试剂的研发，尤其是一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测的引物及其试剂盒，属于分子生物学技术领域。
背景技术
利福平自1971年发明以来，一直是抗结核化疗方案中的关键药物之一，可缩短结核病的疗程。结核杆菌对利福平耐药常导致疗程延长、患者愈后不良甚至化疗失败。快速检测获得菌株的耐药性信息，及时设计、调整临床化疗方案，是治疗结核病的关键。目前，常规的“金标准”固体培养基药敏检测法，是将菌株接种到含有被检测药物的固体培养基上进行培养，观察其生长情况来判断耐药性，但是，此方法耗时长，一般需要1个月，且费用高，已不能满足耐药结核病早发现、早治疗的迫切需求。一些其他方法也有各自的局限性，例如，PCR-SSCP法检测虽然耗时短，但是其操作复杂，结果判读容易受到电泳条件、以及凝胶染色条件的影响，而不易判断，不易在基层推广。PCR-DNA测序法虽然结果较准确，但DNA测序耗时长，费用高，不易在边远地区推广。ropB-LIPA(LineProbAssay)法中待检样品的制备质量影响其检测结果，XpertMtb/RIF法仪器价格高，操作条件要求较高，推广受限。因此，一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测引物及其试剂盒被提出，本发明依据结核杆菌rpoB基因中利福平耐药决定区的DNA序列，设计检测其突变的引物，所采用的方法属于荧光PCR熔解曲线法，本发明设计的引物序列及其组合具有独特性，检测结果图形可视容易判读，利福平耐药检测的敏感性为80.95％；特异性75.86％，获得菌株的耐药性信息消耗的时间不超过3天，在结核杆菌利福平耐药性检测中可起到较好的辅助诊断作用。另外，菌株ropB基因中利福平耐药决定区的同义突变可能是影响检测特异性的主要原因。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测引物及其试剂盒。
本发明的目的是提供一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测的引物，所述引物包括如下引物的至少一组：
第一组：
rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC
rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT
第二组：
rpoB-F：AGCCAGCTGAGCCAATTCAT
rpoB-R：GCCCGGCACGCTCACGT
第三组：
rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG
rpoB516-R：GCACGCTCACGTGACAGAC
一种用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒，其特征在于：至少包括引物
rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC
rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT
或者：至少包括引物
rpoB-F：AGCCAGCTGAGCCAATTCAT
rpoB-R：GCCCGGCACGCTCACGT
或者：至少包括引物
rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG
rpoB516-R：GCACGCTCACGTGACAGAC
一种用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒的应用，其特征在于：主要包括如权利2所述的用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒在PCR扩增中的应用。
表1为：实验数据准确率数据表
本发明还涉及使用上述用于结核杆菌利福平耐药性快速检测引物组制成的试剂盒，采用高分辨率熔解曲线(HRM)技术，建立了快速检测结核杆菌利福平耐药的方法。
与现有技术相比，本发明具有检测时间短，一般不超过3天，准确率高，操作简单，费用低，易推广等特点。
附图说明
图1是第一组引物HRM分析结果。
图2是第二组引物HRM分析结果。
图3是第三组引物HRM分析结果。
具体实施方式
实施例1：参照图1，为本发明实施例1的实验结果。
实验方案如下：
1、试验方法：
(1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管中，85℃金属浴灭活45min。
(2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DNA。
(3)测DNA浓度，按照不同的浓度稀释到10ug/ml。
反应体系：总体积10ul(HRMMix：5ul；MgCl2：1.2ul；H2O：2.3ul；第一组引物：
rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT各0.5ul；DNA模板：1ul)
反应参数：预变性95℃10min；变性95℃10s；退火62℃15s；sectarget53℃；延伸72℃10s；95℃1min；40℃1min；70℃1s；95℃s；40℃30s；共50个循环。
2实验结果判断：
(1)每个样品设置3个重复。
(2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp＜30。如果Cp值大于30，则要稀释样品，重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0.5之内以减小试验误差。
(3)HRM检测结果如图1所示，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判断为突变株。
实施例2：参照图2，为本发明实施例2的实验结果。
实验方案如下：
1、试验方法：
(1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管中，85℃金属浴灭活45min。
(2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DNA。
(3)测DNA浓度，按照不同的浓度稀释到10ug/ml。
反应体系：总体积10ul(HRMMix：5ul；MgCl2：1.2ul；H2O：2.3ul；第二组引物：
rpoB-F：AGCCAGCTGAGCCAATTCAT和rpoB-R：GCCCGGCACGCTCACGT各0.5ul；DNA模板：1ul)
反应参数：预变性95℃10min；变性95℃10s；退火62℃15s；sectarget53℃；延伸72℃10s；95℃1min；40℃1min；70℃1s；95℃s；40℃30s；共50个循环。
2实验结果判断：
(1)每个样品设置3个重复。
(2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp＜30。如果Cp值大于30，则要稀释样品，重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0.5之内以减小试验误差。
(3)HRM检测结果如图2所示，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判断为突变株。
实施例3：参照图3，为本发明实施例3的实验结果。
实验方案如下：
1、试验方法：
(1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管中，85℃金属浴灭活45min。
(2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DNA。
(3)测DNA浓度，按照不同的浓度稀释到10ug/ml。
反应体系：总体积10ul(HRMMix：5ul；MgCl2：1.2ul；H2O：2.3ul；第三组引物：rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG和rpoB516-R：GCACGCTCACGTGACAGAC各0.5ul；DNA模板：1ul)
反应参数：预变性95℃10min；变性95℃10s；退火62℃15s；sectarget53℃；延伸72℃10s；95℃1min；40℃1min；70℃1s；95℃s；40℃30s；共50个循环。
2实验结果判断：
(1)每个样品设置3个重复。
(2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp＜30。如果Cp值大于30，则要稀释样品，重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0.5之内以减小试验误差。
(3)HRM检测结果如图3所示，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判断为突变株。
实施例4：实验方案如下：
1、试验方法：
(1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管中，85℃金属浴灭活45min。
(2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DNA。
(3)测DNA浓度，按照不同的浓度稀释到10ug/ml。
反应体系：总体积10ul(HRMMix：5ul；MgCl2：1.2ul；H2O：2.3ul；第一组引物：
rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT各0.5ul；DNA模板：1ul)
反应参数：预变性95℃10min；变性95℃10s；退火62℃15s；sectarget53℃；延伸72℃10s；95℃1min；40℃1min；70℃1s；95℃s；40℃30s；共50个循环。
2实验结果判断：
(1)每个样品设置3个重复。
(2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp＜30。如果Cp值大于30，则要稀释样品，重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0.5之内以减小试验误差。
(3)HRM检测结果，样品的3个复孔的峰形相同且与野生型相同，说明第一组引物对所检测菌株不具备特异性。将试验中所用的第一组引物rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT更换为第二组引物rpoB-F：AGCCAGCTGAGCCAATTCAT和rpoB-R：GCCCGGCACGCTCACGT，其他实验数据不变，得出HRM检测结果与图2一致，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判定样品为突变株。
实施例5：实验方案如下：
1、试验方法：
(1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管中，85℃金属浴灭活45min。
(2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DNA。
(3)测DNA浓度，按照不同的浓度稀释到10ug/ml。
反应体系：总体积10ul(HRMMix：5ul；MgCl2：1.2ul；H2O：2.3ul；第一组引物：
rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT各0.5ul；DNA模板：1ul)
反应参数：预变性95℃10min；变性95℃10s；退火62℃15s；sectarget53℃；延伸72℃10s；95℃1min；40℃1min；70℃1s；95℃s；40℃30s；共50个循环。
2实验结果判断：
(1)每个样品设置3个重复。
(2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp＜30。如果Cp值大于30，则要稀释样品，重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0.5之内以减小试验误差。
(3)HRM检测结果，样品的3个复孔的峰形相同且与野生型相同，说明第一组引物对所检测菌株不具备特异性。将试验中所用的第一组引物rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT更换为第三组引物rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG和rpoB516-R：GCACGCTCACGTGACAGAC，其他实验数据不变，得出HRM检测结果与图3一致，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判定样品为突变株。
实施例6:实验方案如下：
1、试验方法：
(1)用接种环刮取在改良罗氏培养基上生长良好的菌，放入装有TEbuffer的EP管中，85℃金属浴灭活45min。
(2)按照柱式分枝杆菌DNAout试剂盒的说明书提取各种菌株的DNA。
(3)测DNA浓度，按照不同的浓度稀释到10ug/ml。
反应体系：总体积10ul(HRMMix：5ul；MgCl2：1.2ul；H2O：2.3ul；第一组引物：
rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT各0.5ul；DNA模板：1ul)
反应参数：预变性95℃10min；变性95℃10s；退火62℃15s；sectarget53℃；延伸72℃10s；95℃1min；40℃1min；70℃1s；95℃s；40℃30s；共50个循环。
2实验结果判断：
(1)每个样品设置3个重复。
(2)进行HRM分析时，试验孔对应的Cp＜30。如果Cp值大于30，则要稀释样品，重新进行试验，直至样品的Cp值小于30且复孔Cp值的变化控制在0.5之内以减小试验误差。
(3)HRM检测结果，样品的3个复孔的峰形相同且与野生型相同，说明第一组引物对所检测菌株不具备特异性。将试验中所用的第一组引物rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC和rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT更换为第二组引物rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG和rpoB516-R：GCACGCTCACGTGACAGAC，其他实验数据不变，得出HRM检测结果，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型相同，则说明第二组引物对所检测菌株也不具备特异性，再将引物更换位第三组引物rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG和rpoB516-R：GCACGCTCACGTGACAGAC，其他实验数据不变，得出HRM检测结果与图3一致，样品的3个复孔的峰形相同但与野生型不同，则判定样品为突变株。

Claims (3)

1.一种用于结核杆菌利福平耐药快速检测的引物，所述引物包括如下引物的至少一组：
第一组：
rpoBForwarD：CGCCGCGATCAAGGAGTTC
rpoBReverse：GCCCGGCACGCTCATGT
第二组：
rpoB-F：AGCCAGCTGAGCCAATTCAT
rpoB-R：GCCCGGCACGCTCACGT
第三组：
rpoB516-F：AGGAGTTCTTCGGCACCAG
rpoB516-R：GCACGCTCACGTGACAGAC。.
2.一种用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒，其特征在于：至少包括如权利要求1所述的引物中的至少一组。
3.一种用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒的应用，其特征在于：主要包括如权利2所述的用于结核杆菌利福平耐药性快速检测的试剂盒在PCR扩增中的应用。
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