CN105352926A - 一种随机扫描的系统 - Google Patents

Abstract

本发明适用于显微成像领域，提供了一种随机扫描的系统，包括色散预补偿单元、随机扫描单元和成像单元；所述色散预补偿单元，用于对入射光进行色散预补偿和光路调整后，垂直入射至所述随机扫描单元用以实现任意区域的扫描；所述随机扫描单元，还用于收集进行任意区域扫描后产生的荧光信号，并对所述荧光信号进行处理后入射至所述成像单元进行成像。本发明使用基于双声光偏转器的扫描技术，避免了振镜扫描的机械偏移，具有较高的扫描精度和较快的扫描速度，同时声光偏转器的扫描技术还可以实现快速感兴趣区域的选区并扫描成像，在保证分辨率不变的情况下大大降低了光损伤，而且在视场中的非感兴趣区域实现基本没有光损伤。

Description

一种随机扫描的系统

技术领域

本发明属于显微成像领域，尤其涉及一种针对STED超分辨显微成像的随机扫描系统。

背景技术

自1994年德国科学家S.E.Hell首次提出受激发射损耗显微(Stimulatedemissiondepletionmicroscopy,STED)超分辨的概念后，超分辨显微成像就一直备受关注，特别是2014年超分辨显微成像获得诺贝尔化学奖后，使超分辨成像的研究推向了高潮。STED、STORM和PALM是目前主要的几种超越衍射极限的方法，STORM和PALM需要采集大量图片后再进行重建形成超分辨成像，因此成像速度非常慢，不太适应于活体成像，而STED是利用光学的方法实现超越衍射极限来形成超分辨成像的，因此是非常适合应用活体细胞超分辨成像的，但是STED超分辨成像有个缺点那就是损耗光的强度较大，对活体细胞有一定的损伤。

为了推广STED超分辨在活体细胞中的应用，大家常用的方法是降低损耗光的强度来降低光对活细胞的损伤。这样虽然降低了对细胞的光损伤，但却大大降低了系统的分辨率，限制了其广泛的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一个随机扫描的系统，旨在保证STED超分辨显微成像系统分辨率的基础上避免活体细胞遭受光损伤。

本发明是这样实现的，一种随机扫描的系统，包括色散预补偿单元、随机扫描单元和成像单元；

所述色散预补偿单元用于对入射光进行色散预补偿和光路调整后，垂直入射至所述随机扫描单元用以实现任意区域的扫描；

所述随机扫描单元，还用于收集进行任意区域扫描后产生的荧光信号，并对所述荧光信号进行处理后入射至所述成像单元进行成像。

进一步地，所述入射光包括STED损耗光和激发光。

进一步地，所述色散预补偿单元包括第一菱镜、第二菱镜、第一反光镜组、第二反光镜组；

所述STED损耗光经所述第一菱镜进行色散预补偿后入射至所述第一反光镜组，经所述第一反光镜组进行光路调整后垂直入射至所述随机扫描单元；

所述激发光经所述第二菱镜进行色散预补偿后入射至所述第二反光镜组，经所述第二反光镜组进行光路调整后垂直入射至所述随机扫描单元。

进一步地，所述第一菱镜和所述第二菱镜均在水平方向倾斜45°放置。

进一步地，所述随机扫描单元包括：

第一二维声光偏转器、与所述第一二维声光偏转器相连接的第一数据采集卡；

第二二维声光偏转器、与所述第二二维声光偏转器相连接的第二数据采集卡；

反光镜、第一双色镜、第二双色镜和物镜；

经色散预补偿后的STED损耗光垂直入射至所述第一二维声光偏转器，所述第一二维声光偏转器在所述第一数据采集卡的控制下对入射的STED损耗光进行光束调制和偏转，经调制和偏转后的STED损耗光通过所述反光镜反射改向后，经所述第一双色镜投射后入射至所述物镜；

经色散预补偿后的激发光垂直入射至所述第二二维声光偏转器，所述第二二维声光偏转器在所述第二数据采集卡的控制下对入射的激发光进行光束调制和偏转，经调制和偏转后的激发光经所述第二双色镜投射后入射至所述物镜；

所述物镜用于聚焦入射的激发光和STED损耗光入射至样品，从而激发样品产生超越衍射极限的荧光信号；还用于收集样品产生的荧光信号并照射至所述第二双色镜；

所述第二双色镜还用于透射所述荧光信号经所述第一双色镜反射后入射至所述成像单元。

进一步地，所述第一菱镜与所述第一二维声光偏转器之间的距离为35CM；所述第二菱镜与所述第二二维声光偏转器之间的距离为35CM。

进一步地，所述成像单元包括：分束镜、光电倍增管、图像传感器和成像模块；

所述分束镜用于将入射的荧光信号按照比例分成第一荧光信号和第二荧光信号；

所述第一荧光信号经所述光电倍增管进行放大后，传输至所述成像模块进行处理并成像；

所述第二荧光信号经所述图像传感器进行光路调整后，传输至所述成像模块进行实时显示。

进一步地，所述分束镜按照9:1的比例将所入射的荧光信号分成第一荧光信号和第二荧光信号。

本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明使用基于双声光偏转器的扫描技术，避免了振镜扫描的机械偏移，具有较高的扫描精度和较快的扫描速度，同时声光偏转器的扫描技术还可以实现快速感兴趣区域的选区并扫描成像，在保证分辨率不变的情况下大大降低了光损伤，而且在视场中的非感兴趣区域实现基本没有光损伤。

附图说明

图1是本发明实施例提供的一种随机扫描系统的结构示意图。

图2是本发明实施例提供的一种随机扫描系统的具体结构示意图。

图3是AOD在中心频率时的衍射光斑图。

图4是两束光经过AOD后重叠的示意图。

图5是激发光经过AOD后形成4×4的点阵示意图。

图6是激发光和STED损耗光分别经过各自的AOD后形成4×4点阵叠加的示意图。

图7是利用固定点阵坐标寻找两组AOD频率的方法，实现两束光点阵重合的示意图。

图8是利用两组二维AOD技术，实现STED超分辨任意寻址扫描的示意图。

图9利用AOD技术实现字母“A”STED超分辨扫描成像的示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

目前常用的STED超分辨系统，采用的是点扫描，其成像的速度较慢，采用的扫描系统为振镜扫描，这种扫描方式需要对整个视场进行扫描成像，因此在活体STED超分辨显微成像实验过程中，整个视场内的细胞都会有光损伤。为了减小或去除不必要的光损伤，本申请发明了STED超分辨成像系统中基于双二维声光偏转器(Acousto-opticdefector,AOD)的任意选区扫描技术，该扫描技术具有快速任意感兴趣区域选区扫描成像的优点，这样将在保证分辨率不变的情况下大大降低了光损伤，且在视场中的非感兴趣区域基本没有光损伤。

STED超分辨的基本思想是：利用受激辐射效应来减小有效荧光发光面积，一个典型的STED显微系统中需要两束光，一束为激发光，另一束为耗尽光。当激发光照射荧光样品，会使其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子将会跃迁到激发态，然后再将圆环形的耗尽光叠加在激发光上，耗尽光使得处于重叠部分激发态的电子以受激辐射的方式回到基态，其它位于激光光斑中心的激发态电子由于没有受到耗尽光的影响，继续以自发辐射的形式向外发生荧光回到基态。由于在受激辐射和自发辐射过程中发出荧光的方向和波长不同，因此经过过滤后被探测器所接受到的光子均是由位于激发光光斑中心位置的荧光样品通过自发荧光的方式产生的。这样有效荧光的发光面积得以减小，从而提高了系统的空间分辨率。

基于上述原由，本发明实施例提供了如图1所示的一种随机扫描的系统，包括色散预补偿单元1、随机扫描单元2和成像单元3；

色散预补偿单元1用于对入射光进行色散预补偿和光路调整后，垂直入射至随机扫描单元2用以实现任意区域的扫描；

随机扫描单元2，还用于收集进行任意区域扫描后产生的荧光信号，并对所述荧光信号进行处理后入射至成像单元3进行成像。

下面结合图2对本发明实施例进行进一步的解释：

色散预补偿单元1包括第一菱镜Prism1、第二菱镜Prism2、第一反光镜组、第二反光镜组，所述第一反光镜组包括反光镜M2、反光镜M1，所述第二反光镜组包括反光镜M5、反光镜M4。

随机扫描单元2包括：

第一二维声光偏转器2D-AOD1、与所述第一二维声光偏转器2D-AOD1相连接的第一数据采集卡DAQ1；

第二二维声光偏转器2A-AOD2、与所述第二二维声光偏转器2D-AOD2相连接的第二数据采集卡DAQ2；

反光镜M3、第一双色镜DM1、第二双色镜DM2和物镜；

成像单元3包括：分束镜BS、光电倍增管PMT、图像传感器CCD和成像模块；成像模块在本实施例中为一计算机。

下面对各部件进行性详细的阐述：

STED超分辨显微成像中基于AOD的随机扫描系统，包括：

第一菱镜(Prism1)，主要是对STED损耗光的色散进行预补偿，目的是抵消后面AOD产生的色散，注意这里的菱镜要在水平方向倾斜约45°放置；

第二菱镜(Prism2)，主要是对激发光的色散进行预补偿，目的是抵消后面AOD产生的色散，注意这里的菱镜要在水平方向倾斜约45°放置；

第一二维声光偏转器(2D-AOD1),用于实现对红色的STED损耗光随机任意选区扫描；

第二二维声光偏转器(2D-AOD2),用于实现对绿色的激发光随机任意选区扫描；

第一反光镜M1和第二反光镜M2，主要用于调整经过菱镜后的STED损耗光，确保其垂直进入2D-AOD1；

反光镜M3，用于对经过2D-AOD1的(1，1)衍射光进行反射改向，并在实验过程中有微调的作用；

第四反光镜M4和第五反光镜M5，主要用于调整经过菱镜后的激发光，确保其垂直进入2D-AOD2；

第一双色镜(DM1)，用于透射780nm的STED损耗光，反射约680nm的荧光；

第二双色镜(DM2),用于反射633nm的激发光，透射约680nm的荧光。

分束镜(BS)，用于将物镜收集的信号分成两部分(10％：90％)，10％的荧光信号进入CCD用于调整光路，90％的荧光信号进入PMT用于超分辨成像。

数据采集卡(DAQ1和DAQ2),用于产生控制信号，实现对两对声光偏转器的实时控制,同时为了保持同步性，两DAQ之间共用一个时钟信号，这样就可以用两个DAQ实现两套AOD同步产生不同的扫描频率。

物镜，用于聚焦激发光和STED损耗光，激发产生超越衍射极限的荧光，同时收集样品产生的荧光信号；

光电倍增管(PMT),对荧光信号进行放大，并将放大后的信号传输给计算机进行成像。

图像传感器CCD，用于调整光路时收集荧光信号，并将信号传输给计算机进行实时显示。

计算机(Computer)，用于控制数据采集卡和光电倍增管，同时对光电倍增管的信号进行处理，最终形成一张完整的超分辨图像。

本发明详细过程如下：首先假定激发光和STED损耗光到达随机扫描系统时都已经调整好并满足STED成像要求，已经调整好的激发光首先通过菱镜2进行色散预补偿，然后通过反射镜(M4和M5)进行光束的高度调整，接着进入二维声光偏转器，此时在声光偏转器中产生的色散恰好与菱镜补偿的色散相互抵消，经过声光偏转器出射的激发光应为一个圆形光斑，然后经过双色镜DM2反射，再通过物镜聚焦。同样已经调整好的STED损耗光，经过菱镜预补偿后，再通过反射镜(M1和M2)调整损耗光的高度，让其水平入射二维声光调制器，经过声光调制器后，通过菱镜预补偿的色散应与声光调制器产生的色散相互抵消，最后从声光偏转器出射的光，经过物镜聚焦后应为一个圆环光斑。由于控制两组AOD信号的数据采集卡DAQ1和DAQ2共用一个时钟。因此，激发光和STED损耗光是同步执行扫描的。但是在脉冲时间间隔上激发光要比STED损耗光快约180ps到达样品，才能得到比较好的超分辨图像。

实施过程中，需要先对AOD的扫描系统进行微调，因为由于波长的不同AOD的衍射角度会有微小的变化，因此系统调好后在激发光和STED损耗光的光源出口处放置光谱仪，随时监控波长的变化，将波长对扫描系统的影响减到最小。在对系统的微调时，首先用为本发明设计的软件Scanimaging控制数据采集卡(DAQ)让两束的光经过AOD时AOD都固定在中心频率(AOD的频率范围为6000Hz-9000Hz，中心频率为7500Hz)。因此，此时的AOD就相当于固定的光栅，两束光分别经过各自的AOD后在AOD出光口处会出现衍射光斑，在本发明中选取(-1,-1)点，然后在荧光光路上用CCD采集光斑进行实时成像，此时通过微调反光镜和双色镜来确保两束光的(-1，-1)点完全重合。然后再寻找每个像素坐标与AOD扫描频率的一一对应关系，首先寻找激发光的像素点坐标与AOD扫描频率之间的关系，确定关系后再固定激发光光斑对应像素点的坐标位置，来反向寻找在相同坐标的位置上与之对应的控制损耗光AOD频率之间的关系，以确保在每个像素点上两束光都能完全重合。

具体的，本发明实施例默认进入菱镜的激发光和STED损耗光均已经调整好，而本发明要做的工作是随时保证激发光和STED损耗光的高度重叠，按照图2的方式搭建光路。首先搭建的是激发光光路，激发光保持水平，调整菱镜的位置，保证激发光以约45°的方式入射，同时菱镜自身要与水平面成约45°角放置，激发光经过菱镜色散预补偿后，通过双反射镜组合，用以调整激发光的高度和方向。调整AOD的位置保持AOD到菱镜的位置约35厘米左右，然后经过AOD衍射(此时AOD工作的频率为中间频率)，将衍射点投射在纸屏上，在纸屏上可以看到四个衍射点(如图3所示)，其中(-1,-1)级衍射点即为需要的光斑，观察衍射斑点的形状，如果为椭圆，可以通过微调菱镜、AOD放置的倾斜角度或AOD到菱镜的距离，来改变光斑的形状，直到光斑为圆形为止，如图3所示，为调制好后的衍射图。同样STED损耗光也进行相同的操作。当两束光都调整好后，用反光性较好的物体作为样品(本实施例中采用载玻片)进行反射成像，首先开启激发光，在CCD上可以看到一个圆形光斑，通过调节CCD让光斑位于CCD的正中心，然后关掉激发光开启STED损耗光，在CCD上可以看到一个圆环形光斑，通过调节反光镜M3使环形光斑位于CCD正中心，最后再开启激发光，观察两束光的重合程度，通过微调反光镜M3和双色镜DM2，确保两束光完全重合，如图4所示。

由于本发明是使用AOD执行扫描，而每组AOD是有两个单独的AOD组成(每个AOD都可以执行一维线扫描)，这样就可以通过一组AOD执行面扫描，为了实现随机扫描的功能，必须让二维AOD的扫描频率和扫描面上的二维坐标一一对应。为此，在本实施例中利用AOD扫描系统进行点阵扫描，然后利用MATLAB找到各点质心的坐标，再结合AOD提高的点阵扫描频率，找到点阵坐标和频率的对应公式f_k(x,y)。

首先，以激发光为例：假设一个AOD执行X方向扫描，另一个AOD执行Y方向的扫描，要想实现如图5所示的点阵扫描，X和Y方向的AOD频率设置为[6000,9000]，步长为750。然后通过CCD采集点阵图，通过MATLAB软件利用质心定位的方法找到各个点的质心坐标，假设坐标上的各点与AOD的频率是线性的，则f1(x,y，F1)表达式如下所示：

x＝A_1x*λ₁*F_1x+B_1x

y＝A_1y*λ₁*F_1y+B_1y

上式中x,y分辨为坐标点，F_1x和F_1y分别为x方向和y方向的频率，A_1x和A_1y为频率前的系数，B_1x和B_1y为常量，已知坐标点的位置和频率分布，可以通过MATLAB找出A_1x、A_1y、B_1x和B_1y这些参数，一旦这些参量确定，方程f₁(x,y，F₁)就可以确定，就可以根据任意位置坐标，让软件自动通过公式f₁(x,y，F₁)找到与之对应的频率，来实现AOD的任意选区扫描成像。

同样，在STED损耗光的操作上也是执行相同的方法。但是由于激发光的波长为633nm,而STED损耗光的波长为780nm，AOD对不同波长的衍射角度会有些不同，因此在重叠的时候，两束光的点阵质心的位置会存在一些偏移，如图6所示。为了使两束光点阵的质心重合，本实施例中利用两组AOD(2D-AOD1和2D-AOD2)来分别控制激发光和STED损耗光，为了能让两束光产生的点阵重合，首先让激发光产生一组点阵如图5所示，然后以图5中各点质心坐标的位置为目标，结合AOD的频率分布，同样可以找到公式f₂(x,y，F₂)，但是此时公式的各项参数不同于激发光的公式f₁(x,y，F₁)，因此，在这里假设f₂(x,y，F₂)的表达式如下。

x＝A_2x*λ₂*F_2x+B_2x

y＝A_2y*λ₂*F_2y+B_2y

上式中F_2x和F_2y分别为x方向和y方向的频率，A_2x和A_2y为频率前的系数，B_2x和B_2y为常量，在此点阵中质心坐标和频率均为已知，因此可以通过MATLAB软件计算出各个参数，确定方程f₂(x,y，F₂)，最后将两组方程f₁(x,y，F₁)和f₂(x,y，F₂)的参数分别输入对应的扫描控制软件Scanimaging，运行软件，执行4×4的点阵扫描，既可以得到如图7所示的点阵图，说明激发光和STED损耗光在视场内的各点是重合的。因此可以执行如图8所示STED超分辨变任意寻址的扫描，基本思想如下：首先在视场内确定自己感兴趣的点(x_i,y_j),然后根据方程f₁(x,y，F₁)和f₂(x,y，F₂)，找到各点对应的频率F₁(x_i,y_j)和F₂(x_i,y_j)，然后执行扫描软件就可以实现点(x_i,y_j)的STED超分辨成像。如图9所示，为本实施例利用设计好的软件，实现字母“A”STED超分辨成像的示意图，因此，可以利用两组二维AOD系统来实现STED超分辨系统的任意选区成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种随机扫描的系统，其特征在于，所述系统包括色散预补偿单元、随机扫描单元和成像单元；

所述色散预补偿单元，用于对入射光进行色散预补偿和光路调整后，垂直入射至所述随机扫描单元用以实现任意区域的扫描；

所述随机扫描单元，还用于收集进行任意区域扫描后产生的荧光信号，并对所述荧光信号进行处理后入射至所述成像单元进行成像。

2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述入射光包括STED损耗光和激发光。

3.如权利要求2所述的系统，其特征在于，所述色散预补偿单元包括第一菱镜、第二菱镜、第一反光镜组、第二反光镜组；

所述STED损耗光经所述第一菱镜进行色散预补偿后入射至所述第一反光镜组，经所述第一反光镜组进行光路调整后垂直入射至所述随机扫描单元；

所述激发光经所述第二菱镜进行色散预补偿后入射至所述第二反光镜组，经所述第二反光镜组进行光路调整后垂直入射至所述随机扫描单元。

4.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述第一菱镜和所述第二菱镜均在水平方向倾斜45°放置。

5.如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述随机扫描单元包括：

第一二维声光偏转器、与所述第一二维声光偏转器相连接的第一数据采集卡；

第二二维声光偏转器、与所述第二二维声光偏转器相连接的第二数据采集卡；

反光镜、第一双色镜、第二双色镜和物镜；

经色散预补偿后的STED损耗光垂直入射至所述第一二维声光偏转器，所述第一二维声光偏转器在所述第一数据采集卡的控制下对入射的STED损耗光进行光束调制和偏转，经调制和偏转后的STED损耗光通过所述反光镜反射改向后，经所述第一双色镜投射后入射至所述物镜；

经色散预补偿后的激发光垂直入射至所述第二二维声光偏转器，所述第二二维声光偏转器在所述第二数据采集卡的控制下对入射的激发光进行光束调制和偏转，经调制和偏转后的激发光经所述第二双色镜投射后入射至所述物镜；

所述物镜用于聚焦入射的激发光和STED损耗光入射至样品，从而激发样品产生超越衍射极限的荧光信号；还用于收集样品产生的荧光信号并照射至所述第二双色镜；

所述第二双色镜还用于透射所述荧光信号经所述第一双色镜反射后入射至所述成像单元。

6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述第一菱镜与所述第一二维声光偏转器之间的距离为35CM；所述第二菱镜与所述第二二维声光偏转器之间的距离为35CM。

7.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述成像单元包括：分束镜、光电倍增管、图像传感器和成像模块；

所述分束镜用于将入射的荧光信号按照比例分成第一荧光信号和第二荧光信号；

所述第一荧光信号经所述光电倍增管进行放大后，传输至所述成像模块进行处理并成像；

所述第二荧光信号经所述图像传感器进行光路调整后，传输至所述成像模块进行实时显示。

8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述分束镜按照9:1的比例将所入射的荧光信号分成第一荧光信号和第二荧光信号。