CN105334612B - 显微扫描平台xy平面的平面度校准方法 - Google Patents

显微扫描平台xy平面的平面度校准方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了显微扫描平台XY平面的平面度校准方法，包括以下步骤：第一步：在控制单元，定义显微扫描平台平面的坐标系；第二步：选择一个标准条纹玻片，计算每个扫描点的扫描高度修正值，并将计算得到的每一个坐标点对于的修正值存储在控制单元内的存储单元；第三步：计算出扫描平台坐标系中的每一个坐标点n的扫描修正值坐标；并将该标准玻片对应的修正坐标值记录入控制单元中的存储单元；第四步：实际样本扫描过程中，反向加载控制单元的存储单元中记录的该坐标点对应的标准条纹玻片的扫描修正坐标，或者根据修正值计算理论平面扫描高度，并将修正后的实际扫描聚焦高度值传输给控制单元；第五步：控制单元下达指令驱动驱动器扫描成像。

Description

显微扫描平台XY平面的平面度校准方法
技术领域
本发明涉及显微扫描精度技术领域，特别是涉及显微扫描平台XY平面的平面度校准方法。
背景技术
显微是观察微观世界的常用工具，目前广泛用于生物医药诊断研究和工业生产中。目前自动显微的使用越来越广泛，即载玻片在载物台上的移动、镜头与样本之间的聚焦、样本图像的拍摄都由自动化的XY轴平台、Z轴镜头驱动和数码相机联动完成。
通常显微观察样本都放置在载玻片上(25mm x 75mm)透射光照明(生物样本居多)或直接放置在载物台上由落射光照明(工业用居多)，如果样本平面的公差在镜头的焦平面的景深范围内，理论上对样本的三个点聚焦后可以计算出整个样本的平面Z轴高度，得到平面高度后与XY平台联动可以实现连续快速扫描。
实现用单一聚焦平面连续扫描有以下前提：
首先，保证Z轴步进精度小于镜头的焦面景深(100X油镜焦面景深为0.2um)；
其次，还需保证样本平面的平面度在镜头的焦面景深内；
并且，还得保证XY平台的平面度在镜头的焦面景深内。
第一个前提:可以使用压电陶瓷镜头驱动器，Z轴的定位精度可以达到20nm。
第二个前提:细胞涂片或组织切片厚度为3-10um，载玻片平面度小于0.2um，镜头聚焦样本后，在景深范围内可得到清晰像。
第三个前提:XY扫描平台移动行程最少为Y方向25mm，X方向75mm，一般为X 100mm,Y 75mm，XY与样本接触物多放在各种原理的高精平台上，但由于行程范围、装配等因素，整个移动的高度差(平面度)约在2um左右，已经超过了镜头的焦面景深，连续扫描时部分区域会出现失焦的现象。
如果使用更高精度导轨的平台，成本支出会直线上升，且硬件复杂度也会增加(如使用磁悬浮导轨)。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了显微扫描平台XY平面的平面度校准方法，其目的在于以降低的成本实现显微扫描的高精度连续扫描，从而提高显微的扫描精度。
本发明所采用的技术方案是：显微扫描平台XY平面的平面度校准方法，包括以下步骤：
第一步，生成扫描坐标系S：在控制单元，例如电脑或者控制面板上，定义显微扫描平台平面的坐标系，将显微平台的工作面积按镜头与相机所对应的拍摄面积划分成扫描单位；
第二步，计算标准波纹片的扫描修正值：选择一个标准条纹玻片，置入显微平台，并在该坐标系中取三点聚焦扫描得到一个理论扫描平面，计算每个扫描点与该理论扫描平面高的差值，即扫描高度修正值En，并将计算得到的每一个坐标点对于的修正值，以文件形式存储在控制单元内的存储单元；
第三步，获取标准波纹片的扫描修正坐标系：根据第二步得到的扫描修正值，计算出扫描平台坐标系中的每一个坐标点n的扫描修正值坐标Dn(x，y，z)；并将该标准玻片对应的的修正坐标值Dn(x,y,z)记录入控制单元中的存储单元，等待调用；
第四步，实际样本扫描：以扫描坐标系S的坐标为准，任取三点作为基本平面的计算点，反向加载控制单元的存储单元中记录的该坐标点对应的标准条纹玻片的扫描修正坐标Dn(x，y，z)，或者根据修正值En计算理论平面扫描高度，以便在扫描样本各点时加上对应的扫描修正值进行扫描，并将修正后的实际扫描聚焦高度Zn值传输给控制单元；
第五步：扫描成像：所述控制单元下达指令给显微镜头的驱动器，驱动器驱动显微镜头至实际扫描聚焦高度Zn进行扫描聚焦，从而扫描成像。
进一步地，本发明的第一步定义显微扫描品台平面的坐标系，其中将扫描平面定义为扫描镜头的平面的所在的X轴和Y轴组成的平面，Z轴为扫描镜头的伸缩方向，其任意位置n处的坐标为Sn(x，y，z)，从而便于将显微控制单元与扫描镜头的伸缩很好地连接起来，便于显微扫描时，将物体成像系统的扫描镜头联系起来，实现单一聚焦平面连续扫描时，一方面，可以将Z轴步进精度与扫描镜头的焦面景深联系起来；其次，还可以调节样本平面的平面度与镜头的焦面景深的关系；并且，还可以调节XY平台的平面度在镜头的焦面景深内能够调节从而便于调节显微成像的精度。
更进一步地，扫描修正值的计算包括以下步骤：A、在该坐标系内进行聚焦，并采集聚焦若干个坐标，将采集到的坐标带入下列平面方程公式，
Ax+By+Cz+D＝0 (1)
即确定该扫描理论平面的平面系数A、B、C、D的数值，将A、B、C、D作为修正参数使用；
B、显微扫描聚焦在该坐标系内的任意位置处n中的i、j、k位置处进行分别进行一次聚焦扫描，并将实际聚焦扫描高度Zn以及这些位置处的坐标传输至控制单元中的存储单元，包括
Zi、Zj、Zk、Si(x，y，z)、Sj(x，y，z)、Sk(x，y，z)；
C、将步骤B中采集到的数值
Zi、Zj、Zk、Si(x，y，z)、Sj(x，y，z)、Sk(x，y，z)代入公式(1)中，见下式：
Axi+Byi+Czi+D＝0
Axj+Byj+Czj+D＝0
Axk+Byk+Czk+D＝0 (2)
计算出i、j、k对应位置处的理论聚焦高度ZPn；
D、设定任意位置处n的扫描修正值为En，则可以推导出标准条纹玻片的扫描修正值公式
En＝Zn-ZPn (3)
得到标准波纹片的扫描修正值En。
再进一步地，第四步在进行样本检测时，在扫描坐标系Sn中,任选三点设为Sp(x，y，z)、Sq(x，y，x)、Sr(x，y，z)，并将其一一代入公式(1),得到以下方程组(4)：
Axp+Byp+Czp+D＝0
Axq+Byq+Czq+D＝0
Axr+Byr+Czr+D＝0 (4)
根据上述方程组，计算出实际的聚焦高度ZPn,即ZPp、ZPq、ZPr。
又进一步地，本发明在第一四步进行检测样本时，根据实际聚焦扫描高度公式
Zn＝ZPn+En (5)
计算得到实际的聚焦扫描高度Zn，即Zp、Zq、Zr。
进一步地，根据上述的计算结果，驱动镜头至扫描高度Zp、Zq、Zr，便可进行连续扫描，无需进行显微结构上的更改，实现了显微结构的扫描精度的提升，不但节约了成本，还改进了其性能。
进一步地，第二步的三个扫描聚焦点和第四步的样本检测时的三个扫描聚焦点Sp(x，y，z)、Sq(x，y，x)、Sr(x，y，z)，其分别构成的三角形面积在标准波纹片上最大，以便获取更为精密的精度。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首先将显微平台的工作面积按镜头与相机所对应的拍摄面积划分成扫描单位，生成扫描坐标系。
其次，通过对标准波纹片在这一坐标系中获取扫描修正值，具体的方法是：在这个坐标系中取三点聚焦得到一个理论扫描平面，计算各个扫描点与这个理论扫描平面高的差值，即扫描高度修正值。
最后，在显微的样本扫描过程中，也即实际扫描过程中，以扫描坐标系坐标为准，任取三点作为基本平面的计算点，反向加载修正值后计算理论平面扫描高度，在扫描样本各点时加上修正值进行扫描，从而保证了实现用单一聚焦平面连续扫描有以下前提：
首先，保证Z轴步进精度小于镜头的焦面景深(100X油镜焦面景深为0.2um)；
其次，还需保证样本平面的平面度在镜头的焦面景深内；
并且，还得保证XY平台的平面度在镜头的焦面景深内。
最终实现了，显微在无需做结构上的改进的前提条件下，也能实现其扫描样本时的高精度连续扫描，从而提高了其连续扫描性能。
本发明的显微扫描平台XY平面的平面度校准方法，降低了成本显微的改进成本，并实现了显微扫描的高精度连续扫描，从而提高显微的连续扫描性能。使得XY平台能够适应连续扫描使用，而得粗精度XY平台适用于高精度连续扫描，从而降低了高精度扫描仪的制造成本。
附图说明
图1为显微扫描平台XY平面的平面度校准方法的一个实施例的流程图；
图2为显微扫描平台XY平面的平面度校准方法的坐标系建立的步骤流程图；
图3为显微扫描平台XY平面的结构示意图，其中301为XY平台样本放置区，横轴为X轴，代表理论平面；竖轴为Y轴，代表扫描聚焦点偏离理论平面的偏离距离，Z代表扫描时镜头的聚焦高度；
图4为显微扫描平台XY平面生成的扫面单位坐标系的一个实施例；
图5为图4的镜头聚焦位置示意图，501-镜头扫描聚焦位置；
图6为使用本发明的方法扫描样本的实际聚焦高度与理论平面的差值的一个实施例的示意图，其中横轴为X轴，代表理论平面；竖轴为Y轴，代表扫描聚焦点偏离理论平面的偏离距离；图中双向箭头表示的是实际聚焦高度与理论平面的差值；
图7为图6的实施例的修正后的扫面平面与理论平面的示意图，其中横轴为X轴，代表理论平面；竖轴为Y轴，代表扫描聚焦点偏离理论平面的偏离距离；图中双向箭头表示的是实际聚焦高度与理论平面的差值，黑圆点代表实际聚焦点，圆环点表示修正后的理论平面基本点高度；
图8为显微扫描平台XY平面的平面度校准方法的另一个实施例的流程图；
图9为显微扫描平台的结构原理图；
图10为显微扫描平台XY平面的平面度校准方法的原理的流程图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
显微扫描平台XY平面的平面度校准方法，包括以下步骤：
第一步，生成扫描坐标系S：在控制单元，例如电脑或者控制面板上，定义显微扫描平台平面的坐标系，将显微平台的工作面积按镜头与相机所对应的拍摄面积划分成扫描单位；
第二步，计算标准波纹片的扫描修正值：选择一个标准条纹玻片，置入显微平台，并在该坐标系中取三点聚焦扫描得到一个理论扫描平面，计算每个扫描点与该理论扫描平面高的差值，即扫描高度修正值En，并将计算得到的每一个坐标点对于的修正值，以文件形式存储在控制单元内的存储单元；
第三步，获取标准波纹片的扫描修正坐标系：根据第二步得到的扫描修正值，计算出扫描平台坐标系中的每一个坐标点n的扫描修正值坐标Dn(x，y，z)；并将该标准玻片对应的的修正坐标值Dn(x,y,z)记录入控制单元中的存储单元，等待调用；
第四步，实际样本扫描：以扫描坐标系S的坐标为准，任取三点作为基本平面的计算点，反向加载控制单元的存储单元中记录的该坐标点对应的标准条纹玻片的扫描修正坐标Dn(x，y，z)，或者根据修正值En计算理论平面扫描高度，以便在扫描样本各点时加上对应的扫描修正值进行扫描，并将修正后的实际扫描聚焦高度Zn值传输给控制单元；
第五步：扫描成像：所述控制单元下达指令给显微镜头的驱动器，驱动器驱动显微镜头至实际扫描聚焦高度Zn进行扫描聚焦，从而扫描成像。
为了便于对本发明的理解，在这里进一步阐述，如图9所示，本发明的扫描平台，一般来说，包括计算平台910和显微扫描品台920，计算平台910一般为电脑或者PLC控制平台；显微扫描平台920包括显微镜头921以及，启动显微镜头921的驱动器922。而计算平台910内完成的步骤、动作和软件及硬件包括：建立采集坐标；采集标准波纹片的坐标；建立标准波纹片上的每一个坐标的修正坐标数据库Dxy和修正值数据库，等待调用；扫描样本时，采集标准波纹片的修正值或者直接获取修正坐标，对聚焦高度进行修正；下达聚焦扫描指令，驱动镜头驱动器，进行聚焦扫描。并且，作为控制和运算单元的计算平台910与显微扫描平台920之间进行数据的传输和控制指令的下达。
进一步地，本发明的第一步定义显微扫描品台平面的坐标系，其中将扫描平面定义为扫描镜头的平面的所在的X轴和Y轴组成的平面，Z轴为扫描镜头的伸缩方向，其任意位置n处的坐标为Sn(x，y，z)，从而便于将控制单元与扫描镜头的伸缩很好地连接起来，便于显微扫描时，将物体成像系统的扫描镜头联系起来，实现单一聚焦平面连续扫描时，一方面，可以将Z轴步进精度与扫描镜头的焦面景深联系起来；其次，还可以调节样本平面的平面度与镜头的焦面景深的关系；并且，还可以调节XY平台的平面度在镜头的焦面景深内能够调节从而便于调节显微成像的精度。
更进一步地，扫描修正值的计算包括以下步骤：A、在该坐标系内进行聚焦，并采集聚焦若干个坐标，将采集到的坐标带入下列平面方程公式，
Ax+By+Cz+D＝0 (1)
即确定该扫描理论平面的平面系数A、B、C、D的数值，将A、B、C、D作为修正参数使用；
B、显微扫描聚焦在该坐标系内的任意位置处n中的i、j、k位置处进行分别进行一次聚焦扫描，并将实际聚焦扫描高度Zn以及这些位置处的坐标传输至控制单元中的存储单元，包括
Zi、Zj、Zk、Si(x，y，z)、Sj(x，y，z)、Sk(x，y，z)；
C、将步骤B中采集到的数值
Zi、Zj、Zk、Si(x，y，z)、Sj(x，y，z)、Sk(x，y，z)代入公式(1)中，见下式：
Axi+Byi+Czi+D＝0
Axj+Byj+Czj+D＝0
Axk+Byk+Czk+D＝0 (2)
计算出i、j、k对应位置处的理论聚焦高度ZPn；
D、设定任意位置处n的扫描修正值为En，则可以推导出标准条纹玻片的扫描修正值公式
En＝Zn-ZPn (3)
得到标准波纹片的扫描修正值En。
再进一步地，第四步在进行样本检测时，在扫描坐标系Sn中,任选三点设为Sp(x，y，z)、Sq(x，y，x)、Sr(x，y，z)，并将其一一代入公式(1),得到以下方程组(4)：
Axp+Byp+Czp+D＝0
Axq+Byq+Czq+D＝0
Axr+Byr+Czr+D＝0 (4)
根据上述方程组，计算出实际的聚焦高度ZPn,即ZPp、ZPq、ZPr。
又进一步地，本发明在第一四步进行检测样本时，根据实际聚焦扫描高度公式
Zn＝ZPn+En (5)
计算得到实际的聚焦扫描高度Zn，即Zp、Zq、Zr。
进一步地，根据上述的计算结果，驱动镜头至扫描高度Zp、Zq、Zr，便可进行连续扫描，无需进行显微结构上的更改，实现了显微结构的扫描精度的提升，不但节约了成本，还改进了其性能。
进一步地，第二步的三个扫描聚焦点和第四步的样本检测时的三个扫描聚焦点Sp(x，y，z)、Sq(x，y，x)、Sr(x，y，z)，其分别构成的三角形面积在标准波纹片上最大，以便获取更为精密的精度。
实施例
下面的实施例详细说明显微扫描平台的校准方法，本实施例是以扫面平台运动面积为100mm×75mm＝7500mm2的扫描平台来说明的，其校准的详细流程步骤如下：
第一步，如图2所示中的201步和202步所示，确定显微镜镜头放大倍率与相机成像芯片靶面S和显微镜的镜头放大倍率X，从而计算得出相机成像照片对应XY平台上的物理面积大小S。
第二步，如图2中的203步所示，计算扫描平台的运动面积S，即S＝100mm×75mm＝7500mm2，设定以相机成像大小覆盖整个运动区域，计算得出拍摄完整运动区域所需照片数量N，则N＝7500。
第三步，确定每幅拍摄照片的XY轴坐标，如每幅照片对应平台实际大小为1平方毫米，则拍摄7500平方毫米的区域，共需拍摄7500幅照片，相应有7500个拍摄坐标点，设为Sn(x,y),n∈[1，7500]，然后根据204的设定方法，确定拍摄照片的扫面次数N，最后进行第205步的扫面。
第四步，如图3所示的平台XY移动，其移动的单位就是上述的坐标点的单位，即一个固定镜头、控制单元中的存储单元组合将对应一个固定的平台移动坐标系，在这个坐标系所拍摄的照片将覆盖整个平台工作面积。
第五步，按照图1中的101步或者图8中的801步建立好扫描平台坐标系后，依据102步准备一个标准条纹玻片，其具体参数是：条纹宽度为0.5um，玻片平面平整度为0.01um。
第六步，应103、104和105步或803、804、805的要求，在Sn中任选至少3个点作为理论平面的基本点(为降低误差，使用的三点,其构成的三角形面积最大),设为Si，Sj，Sk。
第七步，如104或804所述，在Si，Sj，Sk位置分别聚焦标准玻片，得到三个基本点的空间位置,设为Pi(x,y,z),Pj(x,y,z),Pk(x,y,z),则可根据平面方程的公式Ax+By+Cz+D＝0，计算出参数A、B、C、D，作为扫描理论平面的修正参数使用。
第八步，如104或804所述，分别在Sn位置进行扫描聚焦，得到Sn(x,y)处的实际聚焦位置Zn，并获取该位置处的坐标，如107步或807步所述，即Zi、Zj、Zk、Si(x，y，z)、Sj(x，y，z)、Sk(x，y，z)。
第九步，如105或805所述，将第八步的数据代入公式
Ax+By+Cz+D＝0 (1)
计算得到计算出实际的聚焦高度ZPn,即ZPp、ZPq、ZPr，并设定106步中的任意位置处n的扫描修正值为En，则可以推导出标准条纹玻片的扫描修正值公式
En＝Zn-ZPn (3)
得到标准波纹片的扫描修正值En，计算完成后按照107步录入控制单元中的存储单元中待用。
第十步，扫描应用：如108和109所示，在显微的样本检测时，在Sn中，在扫描坐标系Sn中,任选三点设为Sp(x，y，z)、Sq(x，y，x)、Sr(x，y，z)，但是P、Q、R三点的选择最好为其在载玻片上构成的三角形面积最大，从而降低其误差，并将其一一代入公式(1),得到以下方程组(4)：
Axp+Byp+Czp+D＝0
Axq+Byq+Czq+D＝0
Axr+Byr+Czr+D＝0 (4)
根据上述方程组，计算出实际的聚焦高度ZPn,即ZPp、ZPq、ZPr，将标准玻片对应的校准值En录入控制单元的存储单元中。
第十一步，根据实际聚焦扫描高度公式
Zn＝ZPn+En (5)
计算得到实际的聚焦扫描高度Zn，即Zp、Zq、Zr，实现对聚焦高度的修正，如109步和110或809步。
第十二步，显微镜控制主板驱动镜头至Zp、Zq、Zr聚焦高度位置处进行扫描，如111或810实现了其高精度的扫描，得到更为清晰和真实的样品的成像，为样品的研制和研究提供坚实的理论基础。
如图1和图8所示，上述的第十步和第十一步，可以使用从控制单元中的存储单元中调出的校准坐标Dn(x，y，z)直接代替，见图8中的808、809和820步，将校准坐标Dn(x，y，z)作为修正后的时间扫描聚焦高度直接使用，从而进一步提高扫描的速度，提高显微扫描的效率。
作为本发明的实施例，我们再进行进一步的分析，如图4为显微扫描平台XY平面生成的扫面单位坐标系，而图5就是图4的镜头聚焦位置示意图，501-镜头扫描聚焦位置。
图6是本实施例的扫描样本的实际聚焦高度与理论平面的差值的示意图，而与此相比较的是图7，图7是经过修正后的显微成像系统的扫面平面与理论平面的示意图，其中横轴为X轴，代表理论平面；竖轴为Y轴，代表扫描聚焦点偏离理论平面的偏离距离；图中双向箭头表示的是实际聚焦高度与理论平面的差值，黑圆点代表实际聚焦点，圆环点表示修正后的理论平面基本点高度。对比图6和图7，可以看出，使用该方法校正后的显微扫描平台得到的成像保证了：
首先，保证了Z轴步进精度小于镜头的焦面景深(100X油镜焦面景深为0.2um)；
其次，还需保证样本平面的平面度在镜头的焦面景深内；
并且，还得保证XY平台的平面度在镜头的焦面景深内。得到了更为清晰和真实的样品的成像，为样品的研制和研究提供坚实的理论基础。
此外，需要说明的是，扫描平台的修正精度与标准聚焦片条纹尺寸、镜头倍率与相机相关，最高可校准至50nm精度。本发明通过使用标准波纹片(刻有1～5um的金属黑色条纹的载玻片)、20nm精度的Z轴镜头驱动器，将XY平台的平面度校准到镜头聚焦景深内(本处示例使用Olympus 60x Oil 1.35NA APO镜头，景深约为0.1um)，从而使得XY平台能够适应连续扫描使用，而得粗精度XY平台适用于高精度连续扫描，从而大大地降低了高精度扫描仪的制造成本。
本发明的实施例公布的是较佳的实施例，但并不局限于此，本领域的普通技术人员，极易根据上述实施例，领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.显微扫描平台XY平面的平面度校准方法，包括以下步骤：
第一步，生成扫描坐标系S：在控制单元，例如电脑或者控制面板上，定义显微扫描平台平面的坐标系，将显微平台的工作面积按镜头与相机所对应的拍摄面积划分成扫描单位；其中S坐标系的扫描平面为扫描镜头的平面的所在的X轴和Y轴组成的平面，Z轴为扫描镜头的伸缩方向，其任意位置n处的坐标为Sn(x，y，z)；
第二步，计算标准波纹片的扫描修正值：选择一个标准条纹玻片，置入显微平台，并在该坐标系中取三点聚焦扫描得到一个理论扫描平面，计算每个扫描点与该理论扫描平面高的差值，即扫描高度修正值En，并将计算得到的每一个坐标点对应的修正值，以文件形式存储在控制单元内的存储单元；三个扫描聚焦点构成的三角形面积在标准波纹片上最大；
扫描修正值的计算包括以下步骤：A、在该坐标系内进行聚焦，并采集聚焦若干个坐标，将采集到的坐标带入下列平面方程公式，
Ax+By+Cz+D＝0 (1)
即确定该扫描理论平面的平面系数A、B、C、D的数值，将A、B、C、D作为修正参数使用；B、显微扫描聚焦在该坐标系内的任意位置处n中的i、j、k位置处进行分别进行一次聚焦扫描，并将实际聚焦扫描高度Zn以及这些位置处的坐标传输至控制单元中的存储单元，包括Zi、Zj、Zk、Si(x,y，z)、Sj(x，y，z)、Sk(x，y，z)；
C、将步骤B中采集到的数值Zi、Zj、Zk、Si(x,y，z)、Sj(x，y，z)、Sk(x，y，z)代入公式(1)中，见下式：
Axi+Byi+Czi+D＝0
Axj+Byj+Czj+D＝0
Axk+Byk+Czk+D＝0 (2)
计算出i、j、k对应位置处的理论聚焦高度ZPn；
D、设定任意位置处n的扫描修正值为En，则可以推导出标准波纹片的扫描修正值公式
En＝Zn-ZPn (3)
得到标准波纹片的扫描修正值En；
第三步，获取标准波纹片的扫描修正坐标系：根据第二步得到的扫描修正值，计算出扫描平台坐标系中的每一个坐标点n的扫描修正值坐标Dn(x，y，z)；并将该标准波纹片对应的的修正坐标值Dn(x,y,z)记录入控制单元中的存储单元，等待调用；
第四步，实际样本扫描：以扫描坐标系S的坐标为准，任取三点作为基本平面的计算点，反向加载控制单元的存储单元中记录的该坐标点对应的标准波纹片的扫描修正坐标Dn(x，y，z)，或者根据修正值En计算理论平面扫描高度，以便在扫描样本各点时加上对应的扫描修正值进行扫描，并将修正后的实际扫描聚焦高度Zn值传输给控制单元；在进行样本检测时，在扫描坐标系Sn中,任选三点设为Sp(x，y，z)、Sq(x，y，x)、Sr(x，y，z)，样本检测时的三个扫描聚焦点Sp(x，y，z)、Sq(x，y，x)、Sr(x，y，z)，这三个扫描聚焦点构成的三角形面积在标准波纹片上最大；并将其一一代入公式(1),得到以下方程组(4)：
Axp+Byp+Czp+D＝0
Axq+Byq+Czq+D＝0
Axr+Byr+Czr+D＝0 (4)
根据上述方程组，计算出实际的聚焦高度ZPn,即ZPp、ZPq、ZPr；
根据实际聚焦扫描高度公式
Zn＝ZPn+En (5)
计算得到实际的聚焦扫描高度Zn，即Zp、Zq、Zr
第五步：扫描成像：所述控制单元下达指令给显微镜头的驱动器，驱动器驱动显微镜头至实际扫描聚焦高度Zn进行扫描聚焦，根据上述的计算结果，驱动镜头至扫描高度Zp、Zq、Zr，便可进行连续扫描,从而扫描成像。
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