CN105311673A - 3d打印介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及3D打印介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架及其制备方法和用途，该生物陶瓷支架包括：利用三维打印技术制备的β-磷酸三钙生物活性支架、以及均匀涂覆于所述支架表面的介孔生物活性玻璃。本发明的生物陶瓷支架具有良好的力学性能，矿化能力及成骨、成血管活性，有望作为有效的骨修复材料，是一种潜在的多功能硬组织生物活性植入材料。

Description

3D打印介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及介孔生物活性玻璃改性的3D打印生物陶瓷支架及其制备方法和用途，属生物材料领域。

背景技术

长期以来，由创伤、肿瘤、先天性畸形、老龄化、运动及事故等原因导致的骨缺损问题对人体骨健康造成很大威胁。其中，由于大块骨缺损的修复超过人体自身骨再生能力范围，而金标准的自体骨移植受来源和手术风险的限制，用于大块骨修复的生物活性支架材料成为研究者们关注的热点。目前用于大块骨缺损修复与替代的生物材料表界面缺乏多功能性，比如界面活性不够理想，缺乏合适的微纳米结构，体内成骨整合不够等。而新型介孔生物活性玻璃(MBG)具有较高的比表面积和孔容，纳米孔径分布均匀可调[1]，可用于生物活性因子或药物的装载及释放[2]，其体外生物活性与成骨活性均优于传统的生物活性玻璃材料，同时在生物相容性和生物降解性方面也表现出良好的性能[3]。

参考文献

[1]ChengtieWu,*JiangChang.*Mesoporousbioactiveglasses:structurecharacteristics,drug/growthfactordeliveryandboneregenerationapplicationInterfaceFocus,2012(2):292–306.

[2]ChengtieWu,*JiangChang.*Multifunctionalmesoporousbioactiveglassesforeffectivedeliveryoftherapeuticionsanddrug/growthfactors.JournalofControlledRelease.2014(193):282-295.

[3]YanWu,ShouanZhu,ChengtieWu,JiangChang.ABi-lineageconducivescaffoldforosteochondraldefectregeneration.AdvancedFunctionalMaterials.2014(24):4473–4483.。

发明内容

本发明的目的在于提供具有良好力学性能和生物性能的3D打印介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架及其制备方法和用途。

一方面，本发明提供一种3D打印介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架，其包括：利用三维打印技术制备的β-磷酸三钙生物活性支架、以及均匀涂覆于所述支架表面的介孔生物活性玻璃。

本发明采用新型的介孔生物活性玻璃对骨组织修复用的大孔β-TCP支架进行改性，得到介孔生物活性玻璃改性的生物活性陶瓷支架，其具有良好的力学性能，矿化能力及成骨、成血管活性，有望作为有效的骨修复材料，是一种潜在的多功能硬组织生物活性植入材料。

较佳地，所述生物陶瓷支架具有多级结构，其中包括可控的大孔结构与高度有序的纳米介孔结构，其中大孔孔径为100～500μm，介孔孔径为2～8nm。

另一方面，本发明提供上述生物陶瓷支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)将β-磷酸三钙粉末与粘结剂以一定比例充分混合，利用三维打印技术制备β-磷酸三钙支架；

(2)将打印出的β-磷酸三钙支架进行烧结，得到β-磷酸三钙陶瓷支架；

(3)将介孔生物活性玻璃前驱体旋涂在所得的β-磷酸三钙陶瓷支架表面，并进行烧结，即可得到所述生物陶瓷支架。

本发明将3D打印和旋涂的方法结合起来制备了介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架，工艺简单易行，适合于大规模生产。

较佳地，步骤(1)中，β-磷酸三钙粉末与粘结剂的质量比为(1.5～2):1。

较佳地，步骤(2)中，在1100～1150℃烧结3～5小时。

较佳地，所述介孔生物活性玻璃前驱体通过如下方法制备：将Si源与乙醇溶剂和介孔模板剂混合为溶液，采用酸催化剂调节溶液的pH值、搅拌、充分水解Si源，再加入化学计量比的磷酸三乙酯、硝酸钙，搅拌得到介孔生物活性玻璃前驱体。

较佳地，采用正硅酸乙酯为Si源，与乙醇的质量比为1：(7-15)；采用P123为介孔模板，与乙醇的质量比为1：(10-20)；采用盐酸用作酸催化剂，调节后溶液的pH值为2-4。

较佳地，步骤(3)中，旋涂次数为2～8次。

较佳地，步骤(3)中，烧结温度为600～700℃，保温时间为3～7小时。

又一方面，本发明还提供上述生物陶瓷支架在制备骨修复材料中的用途。

附图说明

图1为纯β-磷酸三钙支架(a,b,c)，传统生物活性玻璃改性的(d,e,f)以及介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架(g,h,i)的宏观照片，低倍SEM照片以及高倍SEM照片，从图中可以看出介孔生物活性玻璃以及传统生物活性玻璃均匀的沉积在β-TCP支架表面；

图2为β-磷酸三钙支架表面的介孔生物活性玻璃(d,e,f)以及传统生物活性玻璃(a,b,c)纳米层的TEM照片以及能谱分析。图中可以明显看到有序的介孔孔道；

图3为三组支架的XRD分析结果，结果表明介孔生物活性玻璃以及传统生物活性玻璃的改性并没有影响生物陶瓷支架的物相，其中BG-β-TCP表示传统生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架，MBG-β-TCP表示介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架；

图4为进行力学测试的三组支架的宏观照片(a)以及抗压测试的应力应变曲线(b)与抗压强度值(c)。结果表明，介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架与传统生物活性玻璃改性支架力学强度有所提高；

图5为兔子骨髓基质干细胞在纯β-磷酸三钙支架(a,d,g)，传统生物活性玻璃改性的(b,e,h)以及介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架(c,f,i)表面培养1(a,b,c),3(d,e,f),7(g,h,i)天后粘附情况的SEM照片以及3天时细胞骨架染色的共聚焦照片。结果表明介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架具有良好的细胞粘附能力；

图6为兔子骨髓基质干细胞的增殖(a)和ALP活性(b)，以及兔子骨髓基质干细胞与成骨相关的基因表达(c,d,e,f)，结果表明介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架能促进细胞的增殖以及成骨相关的基因表达；

图7为人内皮细胞在纯β-磷酸三钙支架，传统生物活性玻璃改性的以及介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架表面培养1,3天后粘附情况的SEM照片与3天时细胞骨架染色的共聚焦照片(A)；细胞的增殖，成血管相关的基因表达(B)，结果表明，介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架具有更优异的细胞增殖以及成血管基因表达；

图8为在兔子颅骨缺损处植入三种材料4周和8周后的Micro-CT照片(A)，BV/TV，Tb.Th统计值(B)，结果表明介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架具有更良好的骨修复效果；

图9在兔子颅骨缺损处植入三种材料4周和8周后的组织切片染色(A)及新骨面积统计分析(B)，结果表明，介孔生物活性玻璃对β-磷酸三钙陶瓷支架的改性提高了陶瓷支架的成骨能力。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。

本发明将3D打印和旋涂的方法结合起来制备了介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架；通过系统研究介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架是否具有良好的力学性能，体外成骨能力，成血管能力，体内成骨活性等性能来确定其是否是一种适合于建立多功能材料表界面的新方法。通过系统的理化性能与生物学研究，建立了一种适合于建立多功能材料表界面的新方法。

本发明以β-磷酸三钙(β-TCP)为原材料，利用三维打印技术，制备出β-TCP生物活性支架，烧结后，利用旋涂方法将介孔生物活性玻璃涂覆在支架表面，得到介孔生物活性玻璃改性的磷酸三钙生物活性支架(MBG-β-TCP)。

本发明的介孔生物活性玻璃改性的磷酸三钙生物活性支架具有多级结构：可控的大孔结构(～400μm)与高度有序的纳米介孔结构(～5nm)；同时，介孔生物活性玻璃对生物陶瓷支架的改性提高了支架的力学强度；另一方面，体外细胞实验表明介孔生物活性玻璃改性后的生物陶瓷支架能够更好的支持细胞增殖、粘附、ALP活性、骨相关基因(Runx2，BMP2，OPN和ColI)表达以及成血管基因(VEGF，HIF-1α)表达等；体内动物实验进一步证明了介孔生物活性玻璃改性的磷酸三钙生物活性支架具有优异的体内成骨活性。实验结果表明了介孔生物活性玻璃改性生物陶瓷支架的表面是一种建立多功能生物材料表界面的新方法。

本发明利用三维打印技术制备出β-TCP支架；通过旋涂的方法将介孔生物活性玻璃涂覆在支架表面，得到介孔生物活性玻璃改性的生物活性陶瓷支架，其具有良好的力学性能，矿化能力及成骨、成血管活性。

在利用三维打印技术制备β-TCP支架的一个示例中，采用β-磷酸三钙粉末为原材料，并将其与粘结剂充分混合，同时调整其与粘结剂的比例，例如β-磷酸三钙粉末和粘结剂的质量比可为(1.5～2):1，其中粘结剂包括但不限于聚乙烯醇、海藻酸钠、甲基纤维素等；然后利用软件设计支架具体参数，调控支架的形状、尺寸等，进行3D打印。3D打印的参数可包括：单层厚度为1mm，粘结剂浓度为5～15wt％，打印速度为1～10mm/s,气压为400～700kP。

通过3D打印制得的β-TCP支架素坯进行烧结，制得β-磷酸三钙陶瓷支架。其中烧结例如可在1100～1150℃烧结3～5小时。

在一个实施方式中，介孔生物活性玻璃前驱体通过如下方法制备：将Si源与乙醇溶剂和介孔模板剂混合为溶液，采用酸催化剂调节溶液的pH值、搅拌、充分水解Si源，再加入化学计量比的磷酸三乙酯、硝酸钙，搅拌得到介孔生物活性玻璃前驱体。

以下，作为示例，说明制备的具体步骤：

(1)采用正硅酸乙酯为Si源原材料，并调整与乙醇溶剂和介孔模板剂P123的比例，采用盐酸调节溶液的pH值、搅拌、充分水解正硅酸乙酯，再依次加入化学计量比的磷酸三乙酯、硝酸钙，搅拌得到介孔生物活性玻璃前驱体；

(2)采用β-磷酸三钙为原材料，并调整与PVA的比例；

(3)利用软件设计支架具体参数，调控支架的形状、尺寸等；

(4)在一定温度下烧结β-磷酸三钙支架；

(5)将介孔生物活性玻璃前驱体旋涂在支架表面并烧结，得到介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架；

(6)对制备的陶瓷的理化性能，体外生物活性，动物体内成骨性进行系统的研究。

采用正硅酸乙酯为Si源，与乙醇的质量比为1：(7-15)；采用P123为介孔模板，与乙醇的质量比为1：(10-20)；采用盐酸用作催化剂，调节后溶液的pH值为2-4。

采用β-磷酸三钙为原材料，与PVA的质量比为(1.5-2):1。

在1100－1150℃烧结3-5小时，可制得β-磷酸三钙陶瓷。

利用介孔生物活性玻璃对支架表面进行改性，旋涂次数为2-6次，烧结温度为600-700℃，3-7小时。

以下，简述本发明的实施方案。

1.介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架的制备和表征

(1)将P123与乙醇按照1：(10-20)质量比混合、溶解，将分析纯正硅酸乙酯与乙醇按1：(7－15)的比例混合，并用盐酸调节pH值为2－4，在室温下充分搅拌60分钟，然后加入四水合硝酸钙、和磷酸三乙酯，搅拌20-30小时；

(2)将β-磷酸三钙粉体与PVA按质量比(1.5－2):1的比例混合，利用软件设计好所需程序打印支架，将打印好的支架在1100－1150℃煅烧3-5小时，得到β-磷酸三钙陶瓷；

(3)将介孔生物活性玻璃旋涂在β-磷酸三钙陶瓷支架上，旋涂3-8次，然后在600-700℃煅烧3-6个小时；

(4)通过XRD、TEM、SEM和等手段对介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架的物相、介孔结构、大孔结构等进行系统的表征。

2.介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架的多功能性研究

2.1介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架的力学性能

对介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架(9个平行样)抗压强度的测试，与传统生物活性玻璃改性以及纯β-磷酸三钙陶瓷支架进行比较。结果表明，由于表面介孔生物活性玻璃及传统生物活性玻璃的存在，β-磷酸三钙陶瓷支架的抗压强度得到了显著提高。

2.2介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架细胞相容性、成骨与成血管促进性将兔子骨髓基质细胞以及人内皮细胞分别种植在介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架，传统生物活性玻璃改性的以及纯β-磷酸三钙上，培养1，3，7天后用扫描电镜观察细胞的形貌，并采用MTT法检测细胞的增殖能力。通过RT-PCR测试兔子骨髓基质干细胞以及人内皮细胞在陶瓷支架上的基因表达。结果表明两种细胞均能够在三种支架材料上进行很好的黏附和增殖，介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架相对于传统生物活性玻璃改性的以及纯β-磷酸三钙更能促进细胞的粘附与增殖，并且促进兔子骨髓基质干细胞与成骨相关的基因表达以及人内皮细胞与成血管相关的基因表达。结果表明，介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架具有良好的细胞相容性、成骨与成血管促进性。

2.3介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架的体内成骨能力

为了研究介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架，传统生物活性玻璃改性的以及纯β-磷酸三钙的体内成骨活性，将三种材料植于兔子颅骨大块缺损模型，4周以及8周后观察结果。Micro-CT结果显示介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架植入8周后在缺损处形成的新骨明显比其他两组支架多。另一方面，组织切片分析显示植入材料4周后，β-TCP组骨缺损周围形成少量的新骨，而介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架在骨缺损周围和支架中心都有新骨形成。植入8周后，介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架新骨形成的量明显比另外两组更多。以上结果，说明介孔生物活性玻璃改性的β-磷酸三钙陶瓷支架具有很好的体内促进成骨的能力。

本发明的改性后支架不仅具有较好的力学性能，体外成骨、成血管能力，而且具有良好的体内成骨能力。有望作为有效的骨修复材料，是一种潜在的多功能硬组织生物活性植入材料。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1：

(1)将6gP123与90g乙醇混合、溶解搅拌1小时，加入10.05g正硅酸乙酯2.1g，四水合硝酸钙,1.10g磷酸三乙酯，1.5g盐酸搅拌24小时，得到介孔生物活性玻璃前驱体；

(2)纯β-磷酸三钙粉体4.5g，与3gPVA充分混合后，利用三维打印技术制备支架材料；

(3)将打印支架在1100℃煅烧3小时，得到纯的β-磷酸三钙陶瓷支架；

(4)将介孔生物活性玻璃前驱体旋涂在纯β-磷酸三钙支架表面3次，并在650℃烧结5小时，得到介孔生物活性玻璃对β-磷酸三钙陶瓷支架。

然后进行力学性能，成骨活性和成血管活性的评价如上所述。本实施例的介孔生物活性玻璃改性β-磷酸三钙陶瓷支架的结构表征及性能表征见图1-9。

实施例2：

(1)将6gP123与100g乙醇混合、溶解搅拌1小时，加入10.05g正硅酸乙酯，2.1g四水合硝酸钙,1.10g磷酸三乙酯，1.5g盐酸搅拌24小时，得到介孔生物活性玻璃前驱体；

(2)纯β-磷酸三钙粉体4.5g，与2gPVA充分混合后，利用三维打印技术制备支架材料；

(3)将打印支架在1150℃煅烧3小时，得到纯的β-磷酸三钙陶瓷支架；

(4)将介孔生物活性玻璃前驱体旋涂在纯β-磷酸三钙支架表面6次，并在600℃烧结6小时，得到介孔生物活性玻璃改性β-磷酸三钙陶瓷支架。

然后进行力学性能，成骨活性和成血管活性的评价如上所述。结果同样证实本实施例中介孔生物活性玻璃对生物陶瓷支架的改性提高了支架的力学强度；另一方面，体外细胞实验表明介孔生物活性玻璃改性后的生物陶瓷支架能够更好的支持细胞增殖、粘附、ALP活性、骨相关基因(Runx2，BMP2，OPN和ColI)表达以及成血管基因(VEGF，HIF-1α)表达等；体内动物实验进一步证明了介孔生物活性玻璃改性的磷酸三钙生物活性支架具有优异的体内成骨活性。

Claims (10)

1.一种3D打印介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架，其特征在于，包括：利用三维打印技术制备的β-磷酸三钙生物活性支架、以及均匀涂覆于所述支架表面的介孔生物活性玻璃。

2.根据权利要求1所述的3D打印介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架，其特征在于，所述生物陶瓷支架具有多级结构，其中包括可控的大孔结构与高度有序的纳米介孔结构，其中大孔孔径为100～500μm，介孔孔径为2～8nm。

3.一种权利要求1或2所述的3D打印介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将β-磷酸三钙粉末与粘结剂以一定比例充分混合，利用三维打印技术制备β-磷酸三钙支架；

（2）将打印出的β-磷酸三钙支架进行烧结，得到β-磷酸三钙陶瓷支架；

（3）将介孔生物活性玻璃前驱体旋涂在所得的β-磷酸三钙陶瓷支架表面，并进行烧结，即可得到所述生物陶瓷支架。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，β-磷酸三钙粉末与粘结剂的质量比为（1.5～2）:1。

5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，在1100～1150℃烧结3～5小时。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述介孔生物活性玻璃前驱体通过如下方法制备：将Si源与乙醇溶剂和介孔模板剂混合为溶液，采用酸催化剂调节溶液的pH值、搅拌、充分水解Si源，再加入化学计量比的磷酸三乙酯、硝酸钙，搅拌得到介孔生物活性玻璃前驱体。

7.根据权利要求3至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，采用正硅酸乙酯为Si源，与乙醇的质量比为1：(7-15)；采用P123为介孔模板，与乙醇的质量比为1：（10-20）；采用盐酸用作酸催化剂，调节后溶液的pH值为2-4。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，旋涂次数为2～8次。

9.根据权利要求3至8中任一项所述的所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，烧结温度为600～700℃，保温时间为3～7小时。

10.一种权利要求1或2所述的3D打印介孔生物活性玻璃改性的生物陶瓷支架在制备骨修复材料中的用途。