CN105308161A - 用于改善植物油的水性酶促脱胶的方法 - Google Patents

Abstract

一种使用至少一种糖苷切割酶来对植物油进行脱胶或减少植物油胶中的油含量的方法，其中至少一种糖苷切割酶不呈现磷脂酶活性或酰基转移酶活性，并且组成中不包含磷脂酶或酰基转移酶。

Description

用于改善植物油的水性酶促脱胶的方法

技术领域

本发明涉及一种用于甘油三酯、特别是粗品植物油的酶促脱胶的方法，其中磷脂保持不变。本发明的主题还包括用于降低植物油胶中的油含量或者从植物油特别是菜籽油和大豆油中回收卵磷脂的方法。

背景技术

粗品植物油含有磷脂、含蛋白和碳水化合物的物质、植物胶和胶体化合物，其急剧地降低油的储存期限。因此，必须除去这些物质。

在植物油的精炼中，除去不希望有的相关物质。化学和物理精炼之间存在区别。化学精炼由以下过程组成：1.脱胶、2.中和、3.漂白、和4.脱臭。在脱胶中，将磷脂(“胶”)和金属离子从油中除去。中和用于提取脂肪酸。在漂白中，除去着色剂、另外的金属离子和残余的胶。脱臭是除去破坏油的气味和味道的其他化合物的蒸汽蒸馏。在物理精炼中，在精炼过程的最后，脱酸与脱臭一起进行。

可以通过用水或水溶液或者与Ca²⁺和Mg²⁺离子络合的酸例如柠檬酸或磷酸来提取磷脂，从而进行油的脱胶。在该情形中，常常首先进行称作预脱胶的水性过程，以除去水溶性磷脂。这些称作可水化的磷脂。

可水化的和不可水化的磷脂的主题例如记载于Nielsen,K.,Compositionofdifficultlyextractablesoybeanphosphatides,J.Am.Oil.Chem.Soc.1960.37.217-219和A.J.Dijkstra,Enzymaticdegumming,Eur.J.LipidSci.Technol.,2010,112,1178-1189。具体地，讨论了磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇。在现有技术中，用钙-和镁-络合酸例如柠檬酸或磷酸的稀的水溶液进行的处理已经使得不可水化的磷脂转化成可水化的磷脂。另一变化方式称作“碱法精炼(causticrefining)”。使用该方法来尽可能地将所有磷脂与游离脂肪酸一起从油中除去。该方法记载于例如WO08/094847。

传统的油脱胶方法的其他缺点在于，水性预脱胶和使用水性酸的处理均引起油的损耗，其由以下事实造成，即转移到水中的磷脂是使得水相中的一小部分植物油乳化的乳化剂，引起植物油损失。

称作酶促脱胶的方法避免了现有方法的若干缺点，或者改善提取过程。在现有技术中记载了，酶促脱胶使用磷脂酶，具体为磷脂酶A1和A2、B或磷脂酶C或磷脂酶组合。

酶促油脱胶的另一变化形式是对分离后胶相的酶促处理，在其之后根据传统方法使油脱胶，例如用水和/或柠檬酸。通过该方法，可以得到额外有价值的原料，例如卵磷脂。

在回收卵磷脂以用于食品或动物饲料时，从通过对植物油的水性预脱胶而得到的水溶液中回收卵磷脂。在该方法中，使用薄膜蒸发器除去水。

在现有技术中，粗品卵磷脂的脱油(de-oiling)基本上通过丙酮提取的方式实现，例如，如WO94/01004中所记载的。对于卵磷脂要用作乳化剂的大多数应用，均要求粗品卵磷脂的脱油，因为存在的油降低乳化性，并且还降低卵磷脂的活性含量。

另外在作为饲料成分的用途中，在一些情形中将粗品卵磷脂进行脱油是有利的。

发明内容

本发明的目的在于以如下方式改善甘油三酯的脱胶，即在磷脂保持其化学结构不变并且因此其乳化表现也不变的同时，在所分离的胶中存在更少的油。因此，本发明的一个目的在于增加油的收率。

本发明的另一目的在于，提供一种以高收率且不存在卵磷脂的化学变化的情况下从甘油三酯特别是粗品大豆油、葵花籽油或菜籽油中回收卵磷脂的方法，其中回收的卵磷脂中油的含量尽可能地低，换言之，提供一种用于卵磷脂的脱油或降低植物油胶中的油含量的方法。

上述目的通过以下方法实现，即一种用于甘油三酯的酶促脱胶或者用于降低油脱胶过程中累积的植物油胶中的油含量的方法，该方法包括以下步骤：

首先，在步骤a)中使甘油三酯或油脱胶中累积的植物油胶与包含至少一种糖苷切割酶的组合物接触，至少一种糖苷切割酶不表现出磷脂酶活性或酰基转移酶活性，并且组合物不含磷脂酶或酰基转移酶。

此后，当使用甘油三酯作为起始原料时，在步骤b1)中从甘油三酯中分离胶。优选地，使用的甘油三酯应当是粗品植物油。

另外可选地，可以使用植物油脱胶过程中累积的植物油胶来代替甘油三酯，无论其是在根据传统方法的脱胶还是在根据本发明的方法中产生的。根据步骤a)，使植物油胶与糖苷切割酶接触，然后根据步骤b2)分成含有卵磷脂的水相和含有油的相，其中步骤b2)与步骤b1)类似地进行。胶相或植物油胶具体用在卵磷脂的回收中。

“酶活性”在本发明的范围内定义为由一种或多种催化蛋白(酶)催化化学反应。在该反应中，将酶底物转化成一种或多种产物。某些酶或酶组合具有一种或者甚至多种酶促活性。例如，即使纯的酶也可以催化多于一种的反应(将底物转化成产物)，因此具有多于一种的酶促活性。这些活性划分为称作“主要活性”和“次要活性”的活性。酶促活性与反应速率有关。其表示在酶组成中含有多少活性酶。酶促活性的单位是酶单位(U)，1U定义为在指定条件下每分钟转化1微摩尔底物的酶的量：1U＝1μmol/min。

磷脂切割酶次要活性在本发明中定义为在4小时反应时间中游离脂肪酸的含量在相对基础上增加程度不多于10％，优选在相对基础上增加不多于8％，特别优选增加不多于5％。这些值是指脂肪酸浓度的相对增加，其定义为以油酸表达的游离脂肪酸(FFA)相对于总的脂肪酸的百分比。游离脂肪酸(FFA)的测定在“方法”部分中说明。

低于5％的磷脂切割次要活性在本发明范围内不定义为次要活性，但是在通常的测量波动范围以内。

磷脂切割酶主要活性在本发明中定义为在4小时的反应时间中游离脂肪酸的含量增加程度多于10％，优选增加多于12％，特别优选增加多于15％。这些值是指脂肪酸浓度的相对增加，其定义为以油酸表达的游离脂肪酸(FFA)相对于总的脂肪酸的百分比。

次要磷酸酶活性(水解磷酸酯键)在本发明中定义为在4小时的反应时间中游离脂肪酸的含量在相对基础上增加的程度不多于10％，优选在相对基础上增加不多于8％，特别优选增加不多于5％。这些值是指脂肪酸浓度的相对增加，其定义为以油酸表达的游离脂肪酸(FFA)相对于总的脂肪酸的比例。游离脂肪酸(FFA)的测定在“方法”部分中说明。

低于5％的次要磷酸酶活性(水解磷酸酯键)在本发明的范围内不定义为次要活性，但在通常的测量波动范围内。

主要磷酸酶活性(水解磷酸酯键)在本发明中定义为在4小时的反应时间中游离脂肪酸的含量的增加程度多于10％，优选增加多于12％，最特别优选增加多于15％。这些值是指游离酸浓度的相对增加，其定义为以油酸表达的游离脂肪酸(FFA)相对于总的脂肪酸的百分比。

术语“甘油三酯”应理解成指代甘油与脂肪酸的三酯，其构成天然油脂的主要组分，无论是植物来源或动物来源。甘油三酯包括植物或动物油脂，及其混合物，其中混合物均为这些油脂的混合物或者与合成的或修饰的油脂的混合物。

术语“植物油”应理解成指代任何植物来源的油。本发明含义内优选的油是大豆油、菜籽油、葵花籽油、橄榄油、棕榈油、麻疯果油(jatrophaoil)、亚麻油(camelinaoil)或棉籽油。此外，本发明含义内的植物油还包括不同植物油彼此的混合物以及植物油与动物油和/或合成的或修饰的油脂的混合物。在本发明的范围内，术语“植物油”包括粗品、预调制的和预脱胶的植物油。

在该情况下，术语“粗品”是指油尚未进行任何脱胶、中和、漂白和/或脱臭步骤的事实。在本发明的范围内还可以使用或预处理若干种粗品油的混合物，例如，将预脱胶的和/或预调制的油用酶进行处理。

在本发明的范围内，术语“卵磷脂相”/“胶相”/“胶”/“植物油胶”均理解成指代在用含酸溶液和/或水溶液处理之后从油中作为重相沉积的整个类群的物质(MichaelBokisch:FatsandOilsHandbook,AOCSPress,Champaign,Illinois,1998.Pages428-444)。这些术语在本发明的范围内用作同义词。该植物油胶作为进料的用途对于卵磷脂的回收特别重要，因为卵磷脂是植物油胶的必要组分。

在本发明的范围内，术语“降低植物油胶的油含量”应理解成是指从使用的植物油胶中分离油，其因而称为“脱油”。取决于各个观点，焦点在于油的回收和/或含卵磷脂的胶相的回收。

在本发明的范围内，术语“预脱胶”或“湿法脱胶”应理解成是指将粗品油用水或酸的水溶液处理，从而以尽可能最大的程度将水溶性磷脂从油中除去。这两个术语在本发明的范围内作为同义词使用。在预脱胶或湿法脱胶过程中，在加入酸之后，还可以任选地加入碱，以中和酸。水相的分离发生在酶的加入前。在预脱胶之后，粗品油中约500～1500ppm的含磷量降低至经预脱胶的油例如大豆油和菜籽油中的小于200ppm。通过预脱胶的方式，可以例如从得到的胶相中回收卵磷脂，或者将胶相作为原料再加工。但是，分离水相或降低含磷量的缺点是，油的收率低。转化到水相中的磷脂具有乳化作用，并引起油在水相中乳化并与该相一起分离。在此之后，可以对油进行进一步的酶促处理，但必须在另一步骤中分离酶。

在本发明的范围内，术语油的“预调制”应理解成向粗品油中加入水或酸的水溶液。在此之后，通过加入碱例如氢氧化钠溶液，将pH调节至发生后续酶促反应的水平。理想状态下，建立对于酶反应最佳的pH。但是，在这之后并不是水相的分离，而是立刻加入酶。因此，胶暂时留在油或乳液中。不进行水相的分离以及由此的酶的分离，直至酶已作用于(任选地预调制的)粗品油。

在本发明含义的范围内，甘油三酯优选为植物油，特别优选为粗品植物油、或植物油和动物油的混合物。

具体地，至少一种糖苷切割(glycoside-cleaving)酶表现出底物特异性，从而其切割α(1-4)糖苷键、α(1-2)糖苷键、α(1-6)糖苷键、β(1-2)糖苷键、β(1-3)糖苷键、β(1-4)糖苷键和/或β(1-6)糖苷键。优选地，切割α(1-4)糖苷键。

在一个实施方式中，至少一种糖苷切割酶选自淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、普鲁兰酶、阿拉伯糖酶、昆布糖酶、果胶裂合酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、纤维二糖酶和木聚糖酶。

具体地，淀粉酶是α-淀粉酶，并且优选为特异性地切割α(1-4)糖苷键的α-淀粉酶。

特别优选α-淀粉酶得自以下物种：芽孢杆菌(Bacillusspp.)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、米曲霉(Aspergillusoryzae)或黑曲霉(Aspergillusniger)，另外特别优选为枯草芽孢杆菌和米曲霉。

在优选的实施方式中，使用单独的α-淀粉酶作为酶，特别是得自枯草芽孢杆菌和/或米曲霉的α-淀粉酶。

根据优选的实施方式，可以使用处于担载形式的多种糖苷切割酶。

本发明中优选使用的油是大豆油、菜籽油、葵花籽油、橄榄油、棕榈油、麻疯果油、米糠油、花生油、亚麻油或棉籽油，特别是大豆油、菜籽油或葵花籽油。这些油应当优选地以粗品形式(粗品油)用于根据本发明的步骤a)和b1)的过程。

另外可选地，在步骤a)和b2)中，可以使用从前述油分离得到的植物油胶而不是植物油本身。这使得胶相中含有的油得以回收，并且使得胶中含有的卵磷脂得以脱油。

一个实施方式涉及在进行水性油脱胶时使用糖苷切割酶来增加油的收率，并且还降低卵磷脂相中的油含量，即，使卵磷脂脱油。

用于根据本发明的方法的酶是不构成磷脂切割酶的酶。

“磷脂切割酶”可以是能够从磷脂上切割脂肪酸残基或磷脂酰残基或首基(headgroup)的磷脂酶。例子为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶B、磷脂酶D或磷脂酶混合物。而且，其也可以是称作是酰基转移酶的酶，其中脂肪酸残基的切割与该残基的转移有关，然后是与油相中游离固醇的酯化。在本发明的范围内，“磷脂切割”酶是指任何表现出作为其主要或次要活性的磷脂酶活性和/或酰基转移酶活性的酶。

在特别优选的实施方式中，组合物不含磷脂切割酶。

而且，优选地，在本发明的范围内，不使用任何磷酸酶，即，具有作为其主要活性的磷酸酶活性的酶，或者其他酶，特别是具有作为其主要或次要活性的磷酸酶活性的糖苷切割酶。在本发明的范围内，术语“磷酸酶活性”是指酶可以从磷酸酯或多聚磷酸酯中切割磷酸。

在特别优选的实施方式中，组合物不含表现出磷酸酶活性的酶。

关于根据本发明的糖苷切割酶，优选为可以切割α(1-4)糖苷键、α(1-2)糖苷键、α(1-6)糖苷键、β(1-2)糖苷键、β(1-3)糖苷键、β(1-4)糖苷键和/或β(1-6)糖苷键的那些，例如，淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、普鲁兰酶、阿拉伯糖酶、昆布糖酶、果胶裂合酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、纤维二糖酶和木聚糖酶。在该情形中，也可以使用两种或更多种前述糖苷切割酶的组合。

在该情形中，酶还可以得自任何合意的有机体(例如，分离自嗜热有机体)或合成的来源。在本发明的范围内，还可以使用类型相同但得自不同来源或物种的酶。这还包括通过重组方法从两种或更多种具有酶促活性的不同种产生的嵌合融合蛋白。

而且，优选淀粉酶，特别是α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶和异淀粉酶以及甘露聚糖酶。

关于淀粉酶和甘露聚糖酶，优选为得自芽孢杆菌属、假单胞菌属或真菌物种的那些，或者来自(哺乳动物)胰腺的那些，特别是来自芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、绿脓杆菌、荧光假单胞菌、米曲霉、黑曲霉或里氏木霉(Trichodermareesei)的那些。对于甘露聚糖酶，特别优选为得自里氏木霉的那些。

优选将得自芽孢杆菌的α-淀粉酶用于大豆油的脱胶。具体地，对于菜籽油的脱胶，优选得自芽孢杆菌或曲霉的α-淀粉酶，特别是得自枯草芽孢杆菌或米曲霉的α-淀粉酶。

将甘油三酯用作起始原料(步骤b1)，优选为与糖苷切割酶接触(步骤a)、并然后分离成胶和(脱胶的)甘油三酯。

作为甘油三酯的替代物，可以将例如通过常规脱胶方法例如用水或含水酸的处理得到的植物油胶与糖苷切割酶接触(步骤a)，然后分离成含有卵磷脂的水相和油相(步骤b2)。在根据传统方法分离植物油胶的情形中，在将其分离之后将糖苷切割酶加入到植物油胶中，而根据本发明该植物油胶在与酶接触时还未进行分离。使用该方法，因此，可以从植物油胶中回收额外的油以及脱油的卵磷脂。

这两种可替代选择物的共同之处是于，使起始原料与糖苷切割酶接触以及后续的分离成水相和油相的过程步骤，或者，简言之，通过酶促分离来回收不含卵磷脂的油和不含油的卵磷脂。

上述方法的优势在于，卵磷脂相中含有较少的油，从而降低进一步再处理的成本，特别是在后续的卵磷脂的脱油中。同时，用于植物油进一步处理的油收率增加，这也是有益的。

在另一优选实施方式中，糖苷切割酶的酶促活性选自0.01～6单位/g油的范围，优选为0.1～3单位/g油，特别优选为范围0.2～2.5单位/g油，最优选为范围0.3～1单位/g油(单位：酶促活性的国际单位；1单位对应于1μmol/min的底物转化)。

在该方法中，例如，酶可以以冻干形式使用或者在溶解于水或相应的酶缓冲液中之后使用。优选的例子包括柠檬酸盐缓冲液，0.01～0.25M，pH3.8～7.5，或者乙酸盐缓冲液，0.01～0.25M，pH3.8～7.5。在优选的实施方式中，将酶放置在水或酶缓冲液中，并加入到粗品油中。为实现更好的酶溶解性，特别是在含有磷脂的混合物中，也可以加入有机溶剂。例如，在磷脂的分离中使用这些。应当优选地使用非极性有机溶剂，例如己烷或丙酮或其混合物，优选以1～30％(w/w)的量使用(可用溶剂的例子记载于EP1531182A2)。

在另一优选的实施方式中，将一种或多种酶以担载的形式使用。本发明范围内的优选担体材料是有机担体材料，例如硅胶、沉淀的硅石、硅酸盐或铝硅酸盐以及例如甲基丙烯酸酯或离子交换树脂的有机担体材料。担载酶的优势在于，它们更容易分离和/或表现出改善的可再利用性。

出人意料地发现，根据本发明的糖苷切割酶有效地降低胶的体积以及植物油在水相中的乳化性。这使得根据本发明的方法可以以特别有利的方式用于粗品植物油的脱胶或者用于胶相的再加工。在该情形中，例如，如果其用于粗品植物油的脱胶，可以通过传统脱胶方法或者根据本发明的方法而获得胶相。

令人惊异的是，已在该情形中发现，加入酶使得可以增加脱胶的反应速率，降低胶体积，和/或提高所形成的胶相的可分离性。

在本发明的方法中，“接触”可以通过任何本领域技术人员已知适用于本发明目的的方式进行。优选的接触方法是将粗品油与糖苷切割酶混合。

在粗品油与酶混合之后，优选地搅拌粗品油和酶的混合物，从而使组分接触。特别优选地，用浆式混合机以200～800rpm、优选250～600rpm、最优选300～500rpm进行搅拌。

在该接触过程中，混合物的温度优选为15～99℃，更优选为20～95℃，进而更优选为30～80℃，相似地，优选为35～80℃，特别优选为37～78℃。根据实施方式，该过程中的混合物温度始终选择成不超过酶的变性温度，并且混合物的温度优选比酶的变性温度或酶的最低变性温度低至少5℃。在该情形中，在使用分离自嗜热有机体的酶时，通常优选较高的温度。如果在本发明的范围内使用一种或多种热稳定性酶，处理温度应当优选地为60～120℃，更优选为80～100℃。使用热稳定性酶的优势为，可以因此选择升高的处理温度，使得植物油的粘度降低，过程总体上缩短，这也是因为酶的反应速率升高。而且，即使在升高的温度下也有利地进行预处理，避免了对后续的将所用酶冷却至低于变性温度的需求。总体上，热稳定性酶的使用将由此缩短过程，并降低成本。

取决于如何使用卵磷脂，优选地使包含在所分离卵磷脂中的酶变性，例如，取决于所用的酶，通过将卵磷脂加热至80～100℃，持续0.5～10分钟。在热稳定性酶的使用中，必须确保变性过程不使卵磷脂经受过度的热负载，因为否则其将会变得不好看或脱色，例如不再适用于食品应用。

在该情况下，接触时间优选为1分钟至12小时的范围内，更优选为5分钟至10小时，进而更优选为10分钟至3小时。

接触过程中混合物的pH优选为3～8，特别优选为3.5～7.5。

根据本发明方法的步骤b)对胶进行的分离可以以本领域技术人员已知适合于本发明目的的任何方式进行。但是，分离优选地通过离心或过滤进行，优选离心。在离心中，发生混合物的相分离，使得经过处理的植物油、胶和酶组合物处于可以很容易彼此分离的分离相中。

在该优选的实施方式中，含有胶的相和含有用于本发明方法的酶的相与处理后的油分离。在该情形中，特别优选与胶同时分离酶。

本发明的另一优选实施方式涉及上述的方法，其还包括以下步骤：

c)使步骤b1)的甘油三酯再次与酶组分接触。

该接触优选地在与上述用于本发明方法的步骤a)的相同的条件下进行。在特别优选的实施方式中，在将其与酶再次接触之前使酶进行再生或纯化。

在特别优选的实施方式中，粗品植物油在根据本发明方法的步骤a)与酶接触之前与水和/或酸接触。在该情形中的优选的酸是单独的或组合的钙-和镁-络合酸，例如柠檬酸和磷酸。

在根据本发明方法的另一优选实施方式中，在方法的步骤a)之前，进行称作预调制的处理，在该处理中，将粗品油在单独的处理步骤中与量为200～2000ppm的有机酸，优选柠檬酸混合。混合物的温度优选调节至35～90℃，特别优选为48℃～80℃。在5分钟至2小时、优选15分钟至1小时的反应时间之后，通过加入化学计量的碱溶液，优选为氢氧化钠溶液，优选以0.5～2mol/L、特别优选为1mol/L的量加入，从而将混合物调节至pH4～5。在这之后不进行水相或碱溶液与油相的分离，而是进行根据本发明方法的步骤a)。

在根据本发明方法的优选实施方式中，在步骤a)之前，在30℃～90℃的温度下使粗品油与水接触5～240分钟，优选10～60分钟，温度优选为35～90℃，且温度特别优选为40～90℃。在另一可能的实施方式中，在加入酶之前，将温度升高至对于所用酶最佳的温度。35～80℃的温度、优选40～78℃是合适的，并且来自嗜热有机体的酶，即，具体为温度稳定性酶使得可以在80～100℃使用，从而在粗品植物油与水接触和使其与根据本发明方法的酶接触之间不要求降低温度。在另一可能的实施方式中，随后对水相进行分离，例如，通过离心而分离。

而且，在优选的实施方式中，对粗品油进行预脱胶。在根据本发明方法的范围内，使粗品植物油与水或含水酸、特别是柠檬酸或磷酸接触，优选地在30℃～90℃的温度下进行5～240分钟，优选10～120分钟，温度优选为35～90℃，温度特别优选为40～90℃。在另一可能的实施方式中，随后将含酸的相或水相分离，例如，通过离心而分离。在优选的实施方式中，在酸处理之后，执行使用相应碱的中和步骤，以达到pH3.5～8.0，以及4～7。在此之后，可以通过例如离心或过滤将油与得到的胶分离。

在加入酶之前，优选地将反应温度调节成不超出酶的最佳温度范围，以防止酶的变性。35～80℃的温度、优选40～78℃是合适的，并且来自嗜热有机体的酶，即，具体地为温度稳定性酶使得可以在80～100℃下使用，从而在粗品植物油与水和/或酸接触和使其与糖苷切割酶接触之间不要求降低温度。温度稳定性的增加也可以通过将酶组分的酶固定化来实现。由于许多酶表现出对于有机溶剂的一定耐受性(Faber,K.,BiotransformationsinOrganicChemistry(2001),Springer-Verlag,Heidelberg)，相应地，预处理的油或胶可以用本发明范围内的酶处理。

在特别优选的实施方式中，本发明的用于甘油三酯的酶促脱胶的方法包括以下步骤，其中实施方式绝无意于限定本发明的范围：

大体的实施方式1)

a)使甘油三酯与包含至少一种糖苷切割酶的组合物接触，该至少一种糖苷切割酶不表现出磷脂酶活性和酰基转移酶活性，且组合物不含磷脂酶和酰基转移酶，其中甘油三酯优选地选自粗品大豆油和/或粗品菜籽油和/或粗品棕榈油，至少一种糖苷切割酶优选为切割α-糖苷键的酶，特别是切割α(1-4)-糖苷键的酶；

b)通过离心将胶从甘油三酯中分离。

在该情形中，特别优选地，组合物不含磷脂切割酶，最优选地，组合物也不含具有磷酸酶活性的酶。

大体的实施方式2)

根据大体的实施方式2，使通过传统脱胶方法或通过根据本发明方法分离的胶相，而不是粗品植物油，与糖苷切割酶接触。该方法优选地根据实施方式1)进行。例如，该方法使得可以从胶相中回收包含在胶相中并从中分离的油；因此，这增加油的收率。

当根据传统方法例如用水或酸的水溶液进行植物油胶的回收时，可以在分离出(含有卵磷脂的)胶相之后向植物油胶中加入根据本发明的酶，以进一步从植物油胶中提取油。在该情形中，措辞“在分离(含有卵磷脂的)胶相之后”与根据本发明方法的步骤b2)无关。

与大体的实施方式2)相反，在大体的实施方式1)中，在从油中分离胶相(步骤b1)之前，加入根据本发明的酶。该情况通过步骤a)和b1)的顺序确定。

实施方式1)和2)中的处理步骤是相同的：即，a)使起始原料，无论其是(粗品)甘油三酯还是(不完全脱油的)植物油胶，与根据本发明的酶接触，以及在甘油三酯的情形中，根据步骤b1)，将混合物分离成水性胶相和含有甘油三酯的油相，或者在来自起始原料的植物油胶的情形中，根据步骤b2)，分离成水相(含有卵磷脂)和油相。另外，该方法根据实施方式1)和2)用相同的设备根据相同的原理进行。由于根据本发明的方法，可以在不使用磷脂切割酶的情况下降低油中的胶体积。

具体实施方式

方法

确定油收率、胶相中的油含量和胶体积

油收率、胶相中的含油量和胶体积的确定可以通过检测胶体积根据标准化方法例如在PCT/EP2013/053199中记载的那些来进行。此外，胶的油含量可以在分离胶的索氏提取之后根据DINISO659另外确定。

确定磷脂酶的活性

在根据本发明的方法中，为排除磷脂酶或酰基转移酶活性，对脱胶过程中油中的游离脂肪酸的含量进行考察。这根据美国油化学协会(theAmericanOilChemistrySociety，AOCS)Ca5a-40的参考方法N.G.D.C10的修改后版本进行。

对于游离脂肪酸的确定，使用cdR公司(意大利)的FoodLab装置，其与内置的分光光度计一起构成独立的紧凑型分析装置；其由温度受控的孵育模块组成，该模块具有12个比色皿室和3个独立的测量室，各个均具有2个不同波长的光束。

在开启用于光度测定游离脂肪酸(FFA)的量的FoodLab装置后，将CDR公司的准备就绪的测量比色室预热至37℃，在这之后在菜单上选择FFA确定方法，并确定比色皿的空白值。在此之后，将所需体积的植物油移液至测量比色皿的溶液中，该溶液由各种醇、KOH和酚酞衍生物组成。取决于FFA的含量，所用样本的量对于大豆油通常为2.5pL，对于菜籽油为1pL。弃去一次从植物油样本中吸取的体积，以润洗移液管，在此之后吸取新的样本，并移液至完成的测量溶液中。在此之后，将移液管用测量溶液严格润洗10次，使油样本的体积的失真尽可能地小。然后将移液管手动打旋10次。样本中的脂肪酸(pH<7.0)与发色部分反应，形成有色络合物，然后在装置的测量室中在630nm下测定其强度。其表达单位为油酸的百分比，并与样本中总的酸浓度成比例。

在4小时的酶促脱胶过程中，以油酸表达并相对于所有脂肪酸的总量的游离脂肪酸浓度的(相对)增加通常不多于10％，优选不多于8％。根据参考方法N.G.D.C10,AOCSCa5a-40的修改后版本进行确定。

例如大豆油在酶促脱胶过程中的游离脂肪酸的浓度增加不多于，例如，0.22％(w/w)游离脂肪酸～0.24％(w/w)游离脂肪酸，其在pH<7下根据参考方法N.G.D.C10,AOCSCa5a-40的修改后版本以游离油酸确定并相对于脂肪酸的总重量(参见表1)。

与根据本发明的酶相比，表1示出加入磷脂切割酶例如磷脂酶A1(PLA1)情况下通过相同方法测量的游离脂肪酸的浓度增加。在反应过程中，FFA的浓度从反应10分钟时间后的0.15％(w/w)增加至240分钟后的0.34％(w/w)，得到FFA浓度的126％的相对增加。

在例如菜籽油的酶促脱胶中，情况类似(参见表2)。根据本发明的得自曲霉的淀粉酶将游离脂肪酸的浓度从10分钟后的1.69％(w/w)增加至240分钟后的1.71％(w/w)，在相对基础上增加仅1.2％。淀粉酶PET也将游离脂肪酸的浓度从10分钟后的1.76％(w/w)增加至180分钟后的1.79％(w/w)，得到FFA浓度的1.7％的相对增加。

相反，磷脂切割酶PLA1将游离脂肪酸的浓度从10分钟后的例如1.76％(w/w)增加至240分钟后的2.22％(w/w)，得到FFA浓度的26％的相对增加.

表1.大豆油：酶促油脱胶过程中以％(w/w)计的FFA测量结果以及与糖苷切割酶-磷脂酶A1(PLA1)的比较

表2.菜籽油：酶促油脱胶过程中以％(w/w)计的FFA测量结果以及与糖苷切割酶-磷脂酶A1(PLA1)的比较

表3.大豆油：酶促油脱胶过程中以％(w/w)计的FFA测量结果以及与糖苷切割酶-磷脂酶A1(PLA1)的比较

表1和表2中的数值以％(w/w)的单位示出，并表明以油酸计算的游离脂肪酸相对于总的脂肪酸的量。数值根据参考方法N.G.D.C10,AOCSCa5a-40的修改后版本进行测定。

确定植物油的钙、镁和磷含量

根据DEVE-22通过ICP进行磷的确定。

变化方式1：

将400～600g量的要处理的粗品油倒入1000mLDN120Duran反应器中，取出样本进行分析。使用加热板将Duran反应器中的油加热至温度35～90℃，优选48℃，或者特别优选80℃。在达到温度之后，开始预调制。出于该目的，取决于油的量，将指定量的稀柠檬酸(例如450ppm，1.372mL)计量到油中。在此之后，将混合物用Ultraturrax彻底混合1分钟。作为另外可选的方式，可以将混合物在以约600rpm搅拌的同时孵育1小时，以等待酸的反应。在此之后，加入指定量的氢氧化钠溶液(4mol/L，剩余体积至3％(v/v)，来自加入酸和加入酶的较少的水，在搅拌的同时再继续孵育10分钟。在80℃的预处理中，在加入酶之前将混合物冷却至例如50℃。然后加入酶、酶混合物或固定化物，优选溶解在缓冲液中。将酶混入，出于该目的，搅拌器速度可以暂时增加(例如，增加至900rpm1分钟)，在此之后继续在较低速度下搅拌。在反应的最后，通过离心将油相与胶相分离，在索氏提取之后确定胶相中残余的油组分。

变化方式2：

在另一实施中，将单独的或适当组合的糖苷切割酶作为游离的酶或固定化的酶与0.05～5％(w/v)水相一起加入到粗品油中。乳液由水、酶、以及酶担体(如果适用)和油组成，将其彻底混合。理想状态下，将反应温度控制至30～80℃，优选为40～78℃。在这之后，等待相分离，沉淀出固体，或者可以将其通过本领域技术人员已知的标准方法例如离心或过滤而除去。作为后处理，可以使用本领域技术人员已知为“脱胶”的方法用稀酸(例如柠檬酸)或碱溶液从油中除去残余的胶。

变化方式3：

在另一实施中，将油胶用酶处理。将糖苷切割酶加入到通过本领域技术人员已知为“脱胶”的方法得到的油胶中。这些可以溶解在水相中或者悬浮在有机溶剂中。该批次理想地将温度控制在20～70℃，优选为35～60℃。将该批料彻底搅拌，直至过程完成。这可以通过粘度测量或在视觉上通过溶解否则为固体的胶相来证实。离心使得相分离得以实现，并且各个相可以分离。通常，顶部相由得到的油组成，中间相由磷脂组成，底部的相是含有酶的水相。通过再利用水相，可以将酶循环再利用。取决于二价离子的含量，在进一步使用离子之前，油或含酶的水相可能必须通过加入络合剂而进行提纯。

变化方式4：

在另一实施中，将粗品油加热至高温，特别是70～100℃，更具体地为75～85℃。根据上述方法，将粗品油用酸和碱溶液调制，保持温度，并加入热稳定性酶。进一步的过程如上所述。将酶搅入，出于该目的，搅拌器速度可以暂时增加(例如，增加至900rpm1分钟)，在此之后，在600rpm下继续搅拌，直至反应完成。油胶的分离可以如上所述进行。

变化方式5：

在另一实施中，将粗品油加热至高温，特别是70～100℃，更具体地为75～85℃。将单独的或适当组合的热稳定性糖苷切割酶作为游离的酶或固定化的酶与0.05～5％(w/v)的水相一起加入到粗品油中。乳液由水、酶、任选的酶担体、以及油组成，将其彻底搅拌。进一步的过程如上所述。将酶搅入，出于该目的，搅拌器速度可以暂时增加(例如，增加至900rpm1分钟)，在此之后在600rpm下继续搅拌，直至反应完成。油胶的分离可以如上所述进行

实施例：

以下通过实施例的方式对本发明加以更详细的解释。在此强调的是，实施例在本质上仅仅是示例说明性的，并说明本发明的特别优选的实施方式。实施例绝不限制本发明的范围。

实施例1：

粗品大豆油(进行预调制)

根据反应的变化方式1，使用柠檬酸水溶液(1000ppm)和氢氧化钠水溶液(4mol/L)对大豆油进行预调制(反应的总含水量：3％)。作为比较，加入酶，即来自有机体芽孢杆菌的α-淀粉酶(Sigma-Aldrich)进行相同的预调制(参见表1)。

表3.大豆油：实施例1中在胶相的索氏提取之后反应的总油收率

试剂	油收率[％]
		H3Cit(柠檬酸)	97.1
α-淀粉酶芽孢杆菌	97.9

实施例2：

粗品菜籽油(进行预调制)

根据反应的变化方式1，使用柠檬酸水溶液(1000ppm)和氢氧化钠水溶液(4mol/L)对菜籽油进行预调制(反应中的总含水量：3％)。作为比较，加入酶，即来自有机体枯草芽孢杆菌的淀粉酶PET(ASASpezialenzymeGmbH)或来自米曲霉的α-淀粉酶(Sigma-Aldrich)进行该相同的预调制(参见表2)。

表4.菜籽油：实施例2中在胶相的索氏提取之后反应的总油收率

表1和表2示出实施例1和2在胶相的索氏提取之后的反应总油收率。可以看出，与使用柠檬酸的标准方法相比较，使用的糖苷切割酶大大增加油的收率。

全世界产生4300万吨大豆油。油收率的体积从标准方法的97.1％增加至使用芽孢杆菌α-淀粉酶的97.9％，这意味着，可以多产生35万吨的大豆油。

全世界产生约2350万吨菜籽油。在该情形中，油收率的体积从标准方法的96.2％增加至使用淀粉酶PET的97.4％，这意味着，可以多产生约30万吨菜籽油。

实施例3：

粗品大豆油(进行水脱胶/卵磷脂回收)

根据反应的变化方式2，将粗品大豆油与总量为2％的水混合。在各个实验中，将1单位/g油的各种以下酶溶解在水中：来自芽孢杆菌的α-淀粉酶(Sigma-Aldrich)、胞壁酰葡聚糖酶M719L和淀粉酶AD11P(均来自Biocatalysts有限公司)。在60℃下，将悬浮液在搅拌的同时孵育1小时。在此之后，通过离心来分离相，并测定卵磷脂相中的含油量。

表5：实施例3中在索氏提取后测量的反应后卵磷脂相中的含油量

试剂	卵磷脂相的含油量
		水	49
来自芽孢杆菌的α淀粉酶	36
		胞壁酰葡聚糖酶M 719L	33
淀粉酶AD 11P	34

表5示出大豆油与各种糖苷切割酶反应之后卵磷脂相中的含油量，其与标准方法(水)加以比较。在所有情形中，卵磷脂中油的量降低，这意味着发生了改善的卵磷脂脱油，因而同时增加了油的收率。

表6显示出，卵磷脂部分中含油量的降低不是收率降低的结果。表6显示出反应之后油的离子值。钙、镁和磷的浓度在所有反应中均相当。因此得到相似的卵磷脂收率。

表6.大豆油：实施例3中反应后的钙、镁和磷的浓度

表7：

所使用的酶

Claims (9)

1.一种用于甘油三酯的酶促脱胶或者用于降低在油脱胶中累积的植物油胶中的油含量的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使甘油三酯或在油脱胶中累积的植物油胶与包含至少一种糖苷切割酶的组合物接触，所述至少一种糖苷切割酶不表现出磷脂酶活性和酰基转移酶活性，并且所述组合物不包含任何磷脂酶或酰基转移酶；以及

b1)在甘油三酯作为起始原料的情况下，从甘油三酯中分离胶；或

b2)在植物油胶作为起始原料的情况下，分离成含有卵磷脂的水相和含有油的相。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述组合物不包含磷脂切割酶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述组合物不包含具有磷酸酶活性的酶。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述至少一种糖苷切割酶切割α(1-4)糖苷键、α(1-2)糖苷键、α(1-6)糖苷键、β(1-2)糖苷键、β(1-3)糖苷键、β(1-4)糖苷键和/或β(1-6)糖苷键。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述至少一种糖苷切割酶选自淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、异淀粉酶、葡糖淀粉酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、普鲁兰酶、阿拉伯糖酶、昆布糖酶、果胶裂合酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、纤维二糖酶和木聚糖酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述淀粉酶是α-淀粉酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述α-淀粉酶得自芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、绿脓杆菌、荧光假单胞菌、米曲霉或黑曲霉。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，一种或多种所述糖苷切割酶以担载形式存在。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，使用在权利要求8的油之一的油脱胶中累积的水性植物油胶来替代植物油。