CN105300955B - 集成液芯光波导和纳米金属的微流控sers芯片检测装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种集成液芯光波导与纳米金属的微流控SERS芯片检测装置、芯片制备方法和检测方法。芯片由基片和盖片组装构成，在芯片中有微通道，微通道两端有进样口和出样口；所述微通道中有检测区，在检测区集成有Teflon AF液芯光波导，在Teflon AF液芯光波导内表面固定有纳米金属结构。本发明利用液芯光波导与纳米金属的协同SERS增强效应，即纳米金属的局域电磁增强效应可使其表面样品分子的拉曼信号强度获得极大提高的同时，液芯光波导良好的导光性能可使内部更多的纳米颗粒和表面样品分子受到激发光的作用从而产生化学增强，最终实现对血清及生物液体样本进行高灵敏度、可重复性的SERS检测。

Description

集成液芯光波导和纳米金属的微流控SERS芯片检测装置

技术领域

本发明涉及微纳米结构和器件技术领域和表面增强拉曼散射（SERS）检测技术领域。具体涉及用于血液及生物样本无损检测的微流控SERS检测芯片新装置及新的检测模式。

背景技术

目前，常用于血液及生物样本的检测手段包括GC/LC-MS、DNA测试、免疫测试和显微观测等，这些检测方式消耗样本量较大且对样本有损坏。现有的无损检测的方法主要采用超声检测、射线检测、磁检测、声发射检测、激光全息检测、红外检测等声光检测模式，但这些技术主要应用于机械器件或者骨头等密度较大的固体检测，而拉曼光谱技术由于其在分析过程中不会对样品造成化学和机械的损伤，也不易产生光和热分解情况，同时由于水的拉曼散射很弱，使其在生化溶液类试样的检测中有特别的优势，非常适合于医疗卫生领域特别是血液等特殊样本的无损检测。但是，普通的拉曼检测技术检测灵敏度低，难以用其实现对液体样品的检测。

1974年SERS技术发现以来，作为一种高灵敏度及高特异性的检测技术，SERS受到了广泛的关注，尤其在生化检测领域，与微流控芯片的结合，是目前的一个研究热点。目前，微流控芯片中进行SERS测试，普遍采用垂直入射反向收集的检测模式，激发光的作用范围仅为几到几十平方微米的小光斑，与金属纳米颗粒接触的受激样品分子数少，导致了检测灵敏度较低；另外，受纳米制备技术的影响，微通道内集成的SERS增强基底的均匀性普遍不佳，导致了SERS测试的可重复性不理想。因此，发展检测灵敏度高、可重复性好的微流控SERS检测微结构是目前的一个研究热点。相关专利文献CN 203929644 U “基于SERS机理的微流检测器”公开了一种将相互间隔开的多个金属薄片构成的线型光栅集成在微流道中，并采用电化学沉积法在光栅结构图案上电沉积金属Au，利用光栅形成大量的SERS活性热点增加SERS检测灵敏度的微流控SERS检测器。该检测器中的光栅需要通过借助电子束光刻技术形成，制备过程复杂且成本高，而且，要使检测器具有高的检测灵敏度，需增加光栅的周期，同时，光栅金属片之间的空隙很窄，对于体积相对较大的生物样品在流动过程中易造成堵塞，从而影响该检测器的使用普及性。相关专利文献CN 203365328 U“一种用于流动液体拉曼信号检测的SERS衬底”公开了一种在玻璃管内组装核壳结构的纳米粒子层的管状SERS基底，用于对流动样品的SERS检测。但该文献并未指出其发明的SERS基底对应的检测方法，对于传统的垂直入射反向收集检测方式，使用该基底检测时聚焦困难的同时，样品与物镜之间的纳米结构和管壁也会造成较大的光损耗，SERS检测效率不高。

目前，已有研究者提出借助其他的光学元件延长激发光在微通道内的作用长度来提高SERS检测的灵敏度，目前得以利用的光学元件主要有光子晶体光纤（PCF）和液芯光波导。前者具有导光性能好，SERS检测灵敏度高等优点，但不易实现在微流控芯片内的原位集成。而后者具有在微流控通道内可原位集成的优点，对流体可控操作的同时，实现高灵敏度的SERS检测。现有在微通道内集成的液芯光波导的种类和方法较少，且在液芯光波导内表面实现纳米金属结构的原位集成也未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种集成液芯光波导与纳米金属的微流控SERS芯片检测装置、芯片制备方法和检测方法。利用液芯光波导与纳米金属的协同SERS增强效应，即纳米金属的局域电磁增强效应可使其表面样品分子的拉曼信号强度获得极大提高的同时，液芯光波导良好的导光性能可使内部更多的纳米颗粒和表面样品分子受到激发光的作用从而产生化学增强，最终实现对血清及生物液体样本进行高灵敏度、可重复性的SERS检测。

本发明的第一目的是公开一种集成液芯光波导与纳米金属的微流控SERS芯片微装置，其包括：芯片由基片和盖片组装构成，在芯片中有微通道，微通道两端有进样口和出样口；所述微通道中有检测区，在检测区集成有Teflon AF液芯光波导，在Teflon AF液芯光波导内表面固定有纳米金属结构。

芯片中设有三条并行排列的微通道AD₁、BD₂和CD₃, D₁、D₂和D₃为出样口，三条微通道的A、B和C点与Teflon AF溶液与纳米金属溶胶入口O₂连通，三条微通道经A、B和C点后向中间再汇集，共用一个样品入口O₁。

所述微通道的O₁B段长2-3mm,O₁A段和O₁C段长度为3-4mm，O₂A段长度为2-3mm，AD₁、BD₂和CD₃段通道为集成有Teflon AF液芯光波导和纳米金属的SERS检测区，长度为1.5-2cm。

本发明第二目的是公开一种微通道中Teflon AF液芯光波导与纳米金属的集成制备方法，步骤如下：利用Teflon AF自身的粘附性，物理吸附在微通道内表面，再借助真空作用力抽去未吸附到微通道表面的多余物质，在微通道内形成能够将光限制在波导内厚度的光滑的Teflon AF薄膜。然后,在保持波导原有导光性能不变的前提下，利用高锰酸钾与HNO3的强氧化性对Teflon AF液芯光波导内表面进行羟基化处理。接着通入聚阳离子电解质PDDA（聚二烯丙基二甲基氯化铵）使Teflon AF膜表面带正电荷；最后通过静电作用力化学自组装模式，将带负电荷的不同尺寸、不同形貌的Au/Ag/Cu等多种类型的金属纳米结构沉积在Teflon AF膜表面。操作简单，方便，可控性好且成本低。

基于本发明提出的微流控SERS分析芯片微装置，本发明第三目的是公开一种用此装置进行血液及生物样本检测的平行入射反向散射收集方法，具体是：样本充满进样柱I₁，分别在出口端（D₁、D₂或D₃）施加负压，使样本从进样口O₁流入集成Teflon AF液芯光波导与纳米金属的SERS检测区微通道内，最终分别流至出口端D₁、D₂、D₃；借助夹具，将芯片固定在拉曼检测仪载物台上，使芯片检测区通道出口端对准物镜，通过调节夹具使物镜透出的光通过检测通道出口端耦合入波导芯部。调节激光波长、曝光时间、循环次数、激光功率、聚焦深度，产生的拉曼光再通过检测通道出口端被物镜收集，进入光谱仪，得到测试样品的SERS光谱信息。利用该方法对微流控SERS分析芯片微装置中的样品进行SERS测试时，避免了修改光路造成的实验复杂度，并降低了成本。

本发明装置利用液芯光波导的全反射原理使激发光作用至检测区通道全长，通过在液芯光波导包层介质内表面原位组装纳米金属颗粒作为SERS活性基底，利用二者的协同拉曼增强效应，提高血清及生物样本检测的灵敏度和重现性。

因此采用本发明的微流控SERS检测装置进行SERS检测，在液芯光波导与纳米金属的协同拉曼增强作用下，有利于提高血清及生物样本的检测限、灵敏度、可重复性及可操作性。本发明的芯片不仅尺寸小、便于携带，可以作为检测人员随身携带的检测工具，而且制备方法相对简单，成本低廉，适用于生化样本的并行SERS测试。本发明所提供的微流控SERS检测器及检测方式可广泛应用于医学卫生领域对于病人与正常人的血清及生物样本的检测，提供获取的SERS谱图，可分析和解析各种血清及生物样本中各生物大分子、小分子的类别和含量（10^-2M～10^-11M ）。

附图说明

图1A为微流控SERS芯片的底片和盖片结构示意图。

图1B为集成液芯光波导及纳米金属的微流控SERS芯片平面示意图。

图2为集成液芯光波导和纳米金属的微流控SERS检测区结构示意图。

图3为微流控SERS芯片及测试装置示意图。

图4为采用集成液芯光波导和纳米金微流控SERS分析测试芯片获得的人血清的表面增强拉曼光谱图。

具体实施方式

实施例1

微通道检测区内Teflon AF1600液芯光波导、纳米金的集成制备具体实施步骤：

（1）制备一个带微通道的衬底，将该衬底与PDMS盖片紧密结合构成一个封闭的微通道结构。

（2）利用1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基甲硅烷增加Teflon AF1600与微通道的结合度；利用物理沉积法将Teflon AF1600包裹到微通道检测区内部，在检测区集成液芯光波导结构；

（3）利用化学自组装法将纳米金组装在波导内部Teflon AF1600表面，在检测区形成液芯光波导与纳米金的集成SERS检测微结构。

本实施例中，步骤（2）中包括PDMS衬底的预处理和1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基甲硅烷的修饰及Teflon AF1600在芯片检测区的物理沉积。

PDMS衬底的预处理：取PDMS盖片和带微通道的PDMS基片，分别用无水乙醇和去离子水超声清洗5min，以便除去表面的杂质。晾干后通过UV/Ozone照射将PDMS盖片与基片永久封合，接着通入新制备的处理液（H₂O:30% H₂O₂:37%HCl=5:1:1）中5min，接着分别用去离子水和无水乙醇清洗，备用。

1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基甲硅烷的修饰：然后取浓度为2%的1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基甲硅烷，通入微通道中，沉积30min后，放入110度的烘箱中处理10min，备用。

Teflon AF1600在芯片检测区的物理沉积：接着将浓度为6%的Teflon AF1600通入检测区微通道中，用-0.09Mpa的真空力往外抽10min，将未吸附到表面的Teflon AF1600抽掉，然后放入155度烘箱中加热20min，将溶剂蒸发掉；再将温度升高至175度，保持20min，形成厚度为10～15um的光滑的薄膜。

本实施例中，步骤（3）中包括化学腐蚀法对Teflon AF1600进行化学改性及PDDA改变Teflon AF1600表面电性和Au纳米颗粒的化学自组装。

化学腐蚀法对Teflon AF1600进行化学改性：将64%的HNO₃与6%的高锰酸钾溶液以1:10的比例混合后，持续搅拌30min得到化学腐蚀液，然后将腐蚀液通入微通道的液芯光波导结构中，40℃温度下处理1h，去离子水冲洗，备用。

PDDA改变Teflon AF1600表面电性：向改性后的液芯波导中通入0.1%的聚阳离子电解质PDDA静置30min，然后用去离子水冲洗微通道去掉没有吸附的聚电解质。

金纳米粒子化学自组装：向微通道的液芯波导结构中通入纳米金溶胶1h后用去离子水冲洗后。纳米金溶胶是按照Lee and Melsel方法，100mL质量浓度为0.01%的HAuCl₄溶液搅拌加热至沸腾，再加入8mL的质量浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热15分钟。制得的纳米颗粒粒径为20nm。

本芯片也可以采用其他类型的金属纳米颗粒进行组装，其他不同类型的纳米金属颗粒可通过改变实验中原料加入配比，搅拌速度，组装时间等实现。

制备获得的微流控SERS芯片结构如图1A和图1B所示：

芯片由底片1、盖片2构成。其内包括微流体通道3、入口O₁、O₂，和另一端的出样口D₁、D₂和D₃。在微流体通道检测区AD₁、BD₂和CD₃段，集成有Teflon AF1600液芯光波导和纳米金属颗粒。芯片底片材料是玻璃、石英、硅片或聚合物材料，盖片材料是PDMS（聚二甲基硅氧烷）薄膜。在含有微通道的基片上面键合盖片。微通道尺寸为宽 100-500um，深度50-100um，长度2.5-3 cm。在微通道AD₁、BD₂和CD₃段内表面包裹Teflon AF1600材料4以及原位组装纳米金5后，芯片可直接用于进行样品溶液6的SERS测试。

芯片整体为长3cm×宽1cm×高0.3cm的长方体。芯片基片和盖片厚度均为1.5mm，芯片内含三条并行排列的微通道3，它们共用一个样品入口O₁和一个Teflon AF1600溶液与纳米金属溶胶入口O₂。其中O1B段长2-3mm,O1A段和O1C段长度为3-4mm，O₂A段长度为2-3mm，BD段长度为1.5-2cm。

实施例2

对实施例1中的SERS微检测器进行SERS应用检测。利用压力进样将血清及生物样本通入微流控芯片9的SERS检测器中，然后将提前制作好的支架11放在载物台10上，再将微流控芯片固定在支架上。采用LabRAM HR Evolution 拉曼光谱仪（HORIBA JobinYvonS.A.S., 法国），移动支架，使显微镜物镜7对准微通道出口端D，使得激发光和拉曼光8均从检测区的同一个出口端D处与物镜耦合。选用的激光器波长为633nm，激光功率17mW, 衰减片20%，曝光次数2次，积分时间2s，检测量1ul进行SERS活性测试，获取人血清的SERS谱图。

人血清的SERS谱图参见图4，两条谱图分别是从仅包裹了纳米金的检测区微通道和集成了液芯光波导和纳米金的检测区微通道中得到的SERS图谱。从图谱中可以看出集成了液芯光波导和纳米金的微检测器可以对人血清进行有效的识别，对提高通道中样品的SERS检测灵敏度有明显的效果。

本发明的微通道检测区液芯光波导和纳米金属的原位集成结构，在延长激发光作用光程、减小SERS信号损失、提高检测灵敏度及可重复性上有明显优势。

Claims (7)

1.一种集成液芯光波导与纳米金属的微流控SERS芯片微装置，芯片由基片和盖片组装构成，在芯片中有微通道，微通道两端有进样口和出样口；其特征在于：所述微通道中有检测区，在检测区集成有Teflon AF液芯光波导，在Teflon AF液芯光波导内表面固定有纳米金属结构；Teflon AF液芯光波导与纳米金属的集成制备是利用Teflon AF自身的粘附性，物理吸附在微通道内表面，再借助真空作用力抽去未吸附到微通道表面的多余物质，在微通道内形成能够将光限制在波导内的光滑的Teflon AF薄膜；然后,在保持波导原有导光性能不变的前提下，利用高锰酸钾与HNO₃的强氧化性对Teflon AF液芯光波导内表面进行羟基化处理；接着通入聚阳离子电解质聚二烯丙基二甲基氯化铵PDDA使Teflon AF膜表面带正电荷；最后通过静电作用力化学自组装模式，将带负电荷的不同尺寸、不同形貌的Au/Ag/Cu多种类型的金属纳米结构沉积在Teflon AF膜表面。

2.根据权利要求1所述的集成液芯光波导与纳米金属的微流控SERS芯片微装置，其特征在于，所述芯片中设有三条并行排列的微通道D₁A、D₂B和D₃C, D₁、D₂和D₃为出样口，三条微通道的A、B和C点与Teflon AF溶液及纳米金属溶胶入口O₂连通，三条微通道经A、B和C点后向中间再汇集，共用一个样品入口O₁。

3.根据权利要求1或2所述的集成液芯光波导与纳米金属的微流控SERS芯片微装置，其特征在于，所述微通道的O₁B段长2-3mm,O₁A段和O₁C段长度为3-4mm，O₂A段长度为2-3mm，三条并行排列的D₁A、D₂B和D₃C段通道为集成有Teflon AF液芯光波导和纳米金属的SERS检测区，长度为1.5-2cm。

4.根据权利要求3所述的集成液芯光波导与纳米金属的微流控SERS芯片微装置，其特征在于，所述芯片为长3cm×宽1cm×高0.3cm的长方体，芯片基片和盖片厚度均为1.0-2.0mm，微通道的宽度为50-500um，高度为10-150um。

5.根据权利要求4所述的集成液芯光波导与纳米金属的微流控SERS芯片微装置，其特征在于，利用1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基甲硅烷增加Teflon AF与微通道的结合度。

6.根据权利要求5所述的集成液芯光波导与纳米金属的微流控SERS芯片微装置，其特征在于，所述Teflon AF在芯片检测区的物理吸附是：将浓度为6%的Teflon AF1600溶液通入检测区微通道中，用-0.09Mpa的真空力往外抽10min，将未吸附到表面的Teflon AF1600抽掉，然后放入155℃烘箱中加热20min，将溶剂蒸发掉；再将温度升高至175℃，保持20min，形成厚度为10～15um的光滑的薄膜。

7.一种用权利要求1-6之任一项所述微流控SERS芯片微装置进行血液及生物样本检测的收集方法，其特征在于：将样本充满进样柱I₁，分别在出口端D₁、D₂、D₃施加负压，使样本从进样口O₁流入集成Teflon AF液芯光波导与纳米金属的SERS检测区微通道内，最终流至出口端D₁、D₂、D₃；借助夹具，将芯片固定在拉曼检测仪载物台上，使芯片检测通道的出口端对准物镜，通过调节夹具使物镜透出的光通过检测通道出口端耦合入波导芯部；调节激光波长、曝光时间、循环次数、激光功率、聚焦深度，产生的拉曼光再通过检测通道出口端被物镜收集，进入光谱仪，得到测试样品的SERS光谱信息。