CN105296495A - 周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的cDNA全长序列及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的cDNA全长序列及应用，该序列全长1716bp，含完整的开放阅读框，编码571个氨基酸。通过实时荧光定量PCR方法，研究不同温度下白蛾周氏啮小蜂Hsp60基因表达的变化，结果表明，高温和低温胁迫都会诱导周氏啮小蜂Hsp60表达量增高，在40℃和-7℃时表达量最大。本发明可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂进行生态防治提供分子基础。

Description

周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的cDNA全长序列及应用

本发明得到：国家自然科学基金（31201730）；天津市高等学校科技发展计划项目（20110602）；天津师范大学博士基金（52XB1003）及天津市动植物抗性重点实验室开放基金的资助。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，研究周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的cDNA全长序列和不同温度下Hsp60表达的变化。

背景技术

热激蛋白Heatshockprotein(Hsp)是一类在生物体内广泛存在的，对体内外环境变化极为敏感的高保守性蛋白质，广泛参与了各种生理代谢途径，近年来已成为生物研究领域中的一个热点。根据其分子量的大小可将其分为不同的蛋白家族，其中Hsp60与温度胁迫应激性密切相关。温度是影响生物体生存至关重要的环境因子，只有在一定的温度范围内生物体才能进行物质能量代谢以维持正常生理活动，超出温度的耐受范围都会使生物的生长发育停滞甚至死亡。一般来说生物体受到高温或低温刺激后，蛋白合成量会有显著变化，用以增强抗逆境能力。由于热激蛋白会在胁迫消除后一段时间内保持一定的含量使生物体更好生存，可以认为其存在对于生物体适应环境有着重要作用。

周氏啮小蜂ChouioiacuneaYang是我国重要入侵物种美国白蛾Hyphantriacunea（Drury）的重要寄生性天敌，体长1.1-1.5mm，群集内寄生于美国白蛾蛹中，是抑制美国白蛾的主要天敌因子，对控制美国白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美国白蛾外，还可寄生于鳞翅目的枯叶蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和双翅目的蝇科、寄蝇科及鞘翅目的叶甲科和瓢甲科等。

通过野外释放C.cunea可以达到有效防治美国白蛾的目的。然而，在野外环境下，C.cunea的活力会受到多重因素的影响，其中，温度作为一个主要生态因素，会影响C.cunea的生命力。在合适的温度范围投放小蜂，才会起到更好的防治效果。本发明通过转录组测序，报道了一个周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的cDNA全长序列，该序列可为深入研究周氏啮小蜂的温度耐受性机制奠定基础。通过实时荧光定量PCR方法，研究不同温度下白蛾周氏啮小蜂Hsp60基因表达的变化，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂提供理论基础。

发明内容

本发明的目的是报道一个周氏啮小蜂热激蛋白基因Hsp60基因的cDNA全序列及其对于温度协迫的影响。

本发明采用的技术方案是通过转录组测序获得周氏啮小蜂热激蛋白基因Hsp60基因的全序列，在通过RT-qPCR的方法研究不同温度下Hsp60基因表达的变化。

为此本发明公开了如下的技术内容：

周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的核苷酸序列，该序列全长1716bp，含完整的开放阅读框，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。对应的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；该序列编码571个氨基酸，分子量为60.7KDa，等电点为5.44。

本发明进一步公开了周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的核苷酸序列在用于检测防治美国白蛾病方面的应用。所述防治美国白蛾指的是：Hsp60基因表达受温度调控，通过检测Hsp60基因的表达情况，可以得知周氏啮小蜂对于温度胁迫的耐受情况，在低于周氏啮小蜂承受极限温度下释放小蜂，可以更好的起到防治美国白蛾的目的。通过实时荧光定量PCR方法，研究不同温度下白蛾周氏啮小蜂Hsp60基因表达的变化，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂提供理论基础。

周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60基因，其cDNA序列和编码氨基酸的序列如序列表1、表2所示。

序列表

表2

MFRLPTVLRSAALRQMQLQSRTYAKDVRFGAEVRALMLQGVDILADAVAVTMGPKGRNVILEQSWGSPKITKDGVTVAKGVELKDKFQNIGAKLVQDVANNTNEEAGDGTTTATVLARAIAKEGFEKISKGANPVEIRRGVMMAVDKIKEELKNLSKPVTTPEEIAQVATISANGDTAIGNLISDAMKKVGKEGVITVKDGKTLNDDLEVIEGMKFDRGYISPYFINSTKGAKVEFQDALVLFSDKKISSVQSIIPALELANSQRKPLVIVAEDIDGEALSTLVVNRLKIGLQVAAVKAPGFGDNRKATMQDMAIATGGIVFGDDANLVKIEDVQPSDLGQVGEVLITKDDTLFLKGKGKKSDIDRRAEQLRDQIQDTTSDYEKEKLQERLARLASGVAVLRIGGSSEVEVNEKKDRVNDALNATRAAVEEGIVPGGGTALLRCAPALKTLQPKNEDQKTGINIVANALRMPCLQIAQNAGVDASVVVAKVSEGKLGYDAMNNEYVDMIEKGIIDPTKVVRTALTDAAGVASLLTTAEAVVTELPKEDPPMPGGMGGMGGMGGMGGMGGMM

本发明公开的周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的cDNA全长序列的优点在于：

（1）本发明是在国内外首次公开周氏啮小蜂Hsp60基因的cDNA全序列，该序列可为深入研究周氏啮小蜂的温度耐受性机制奠定基础。

（1）在通过RT-qPCR的方法研究不同温度下Hsp60基因表达的变化，结果显示在不同温度条件下周氏啮小蜂体内的Hsp60基因的表达水平处于一个动态过程中，高温和低温胁迫都使周氏啮小蜂体内Hsp60有一个高的表达量，在40℃和-7℃体内表达量最大。因此本发明的提出研究了周氏啮小蜂适应外界环境的变化，避免受到胁迫因子对自身的伤害的保护机制，对于防治美国白蛾有重大意义，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。

附图说明

图1为周氏啮小蜂Hsp60在相同时间不同温度胁迫下表达变化。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。本发明中所述的提取白蛾周氏啮小蜂总RNA的提取，cDNA的合成，实时荧光定量RT-qPCR等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒TransScript?RT、TransStart?TopGreenqPCRSuperMix等都可以从生产商家购买。

实施例1：

获得白蛾周氏啮小蜂Hsp60基因序列

实验材料取自室内传代培养的白蛾周氏啮小蜂（培养条件：于人工气候箱（PQX-350H）中，温度25℃，相对湿度60%~80%，无光黑暗）。取羽化后24h内的雌性周氏啮小蜂，于解剖镜下切取触角，立即浸于RNAlater（Ambion公司，AM7020）中；每200头雌性白蛾周氏啮小蜂的触角贮存于一个1.5mL离心管中，共搜集8管样品，并于-20℃下低温保存，样品制备完成后送华大基因科技服务有限公司（http://www.genomics.cn/index）进行转录组测序。

应用高通量测序平台IlluminaHiSeq?2000对周氏啮小蜂触角样本进行转录组测序，采用Trinity软件对每个读取序列片段进行聚类后拼接成unigene，再结合生物信息学软件进行靶标序列cDNA全长的判定，进行Blast同源序列检索予以确认，得到Hsp60基因cDNA序列和编码氨基酸的序列。

实施例2：

总RNA的提取

选取30头左右白蛾周氏啮小蜂进行不同温度处理，高温处理（1h）为28℃、32℃、36℃、40℃和42℃；低温处理（1h）为11℃、6℃、1℃、-3℃、-7℃。处理后产物立即使用或保存于-20℃冷冻。

（1）取30头左右白蛾周氏啮小蜂置于1.5mL的无菌离心管内，倒入液氮并迅速用研磨棒进行充分研磨。将600μLTrizon溶液加入离心管，静置5min。

（2）将200μL氯仿加入离心管，剧烈振荡15s，静置3min。

（3）4℃下12000rpm离心15min，将上层无色水相转入新无菌离心管中，加入400μL异丙醇，-20℃下放置20min，12000rpm离心10min。

（4）小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入600μL75%乙醇洗涤沉淀。4℃下7500rpm离心5min，再重复一次乙醇洗涤沉淀操作。

（5）小心弃去上清液，室温干燥2min。将RNA沉淀溶于20μLRelutionBuffer中，必要时可55℃-60℃水浴10min。

（6）所得沉淀即为白蛾周氏啮小峰总RNA，产物立即使用或冷冻保存于-70℃

实施例3：

cDNA的合成

以实施例2所述白蛾周氏啮小蜂总RNA作为模板。取一消毒的0.2mL离心管，加入以下反应体系（20μL体系)：TotalRNA5μL，orRandomPrimer（N9）（0.1μg/μL）1μL，2×TSReactionMix10μL，TransScript?RT/RIEnzymeMix1μL，RNase-freeWater3μL，混匀。

反应条件为25℃水浴保温10分钟，42℃水浴保温30分钟，85℃高温加热5分钟，以使离心管中存留的TransScript?RT失去活性。产物立即使用或保存于-20℃冷冻。

实施例4：

荧光定量PCR反应体系和条件

（1）引物设计：根据所得Hsp60基因的全长序列，使用Primer5软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下：

（2）实时荧光PCR：运用SYBRGreen嵌合荧光法进行RT-PCR分析。使用CF96XPCR仪（Bio-Rad）进行PCR反应。以上述实施例3中合成的cDNA为模板，用上述（1）中所设计的特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值（即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数）取平均数。

实时荧光PCR扩增体系设置如下：

实时荧光PCR扩增参数设置如下：

50℃120s；

95℃120s；95℃1s；60℃30s(40个循环)；

白蛾周氏啮小蜂在不同温度下Hsp60基因相对表达量计算：

当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2^－ΔΔCT法计算各个温度下Hsp60基因的mＲNA相对表达量，用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，Duncan氏新复极差法检验不同处理间差异显著性。

图1为不同温度下周氏啮小蜂Hsp60基因的相对表达量。从图中看出无论是高温还是低温都可以影响周氏啮小蜂体内的Hsp60的表达。在低温胁迫的情况下，随着温度的不断降低，周氏啮小蜂体内的Hsp60的相对表达量呈上升的趋势，并且在-7℃时达到最大表达量；在高温胁迫的情况下，随着温度的不断升高，周氏啮小峰体内的Hsp60的相对表达量也呈上升的趋势，但在40℃时达到最大表达量。这对于以后在何种室外温度下放飞白蛾周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。

SEQUENCELISTING

<110>天津师范大学

<120>周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的cDNA全长序列及应用

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1716

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgttcagactaccaactgttcttcgctctgctgctctgcgacagatgcagttgcaatca60

cgtacttatgctaaagatgttcgatttggagcagaggtgcgggcactcatgttgcaagga120

gttgacatcttggctgatgctgtcgctgtcactatgggtcccaagggacgtaatgtcatt180

ctcgaacagagttggggtagcccaaaaatcacaaaggatggtgtcactgtcgcaaagggt240

gttgaattgaaggacaaattccagaatattggagctaagttagtacaagatgttgccaac300

aacactaatgaagaagctggagatggaaccaccacagccacagttttggctagggctatt360

gccaaagaaggttttgaaaaaatcagcaaaggagctaacccagttgaaatcaggcgtggt420

gtaatgatggctgtggacaaaatcaaggaggaactcaaaaacttgagcaaaccagtaaca480

acacctgaagagattgcccaagtagctaccatttctgccaatggtgatacagctattggt540

aatcttatctctgatgccatgaaaaaagtaggaaaagagggtgtaatcacagtcaaggat600

ggcaaaactctcaatgatgatctggaagttattgaggggatgaaatttgatcgtggatac660

atttccccatatttcattaactctacaaagggtgccaaagtggagttccaggatgctctt720

gtcttattcagtgacaagaaaatttcttctgtccagagcatcattccagctttggagctt780

gcaaactctcaacgcaaaccacttgtcattgttgctgaagacattgatggtgaagcactt840

tcaactttggttgtcaatcgtttgaaaatcggattgcaagttgcagcagttaaggctcct900

ggttttggagacaacaggaaagctactatgcaagacatggcaattgccactggaggtatc960

gtttttggagacgacgcaaatctagtcaagatcgaagatgttcagccttcagacttggga1020

caagttggcgaagtactcatcacgaaagacgacacactctttttgaagggaaaaggaaag1080

aaatccgacatcgacagaagggccgaacaacttagagatcaaattcaggatacaacgtct1140

gactatgaaaaggagaaattgcaggaacgattggccaggcttgcttctggtgtagccgtt1200

ttgagaattggaggaagcagtgaagtcgaagtcaacgaaaagaaagaccgtgttaacgat1260

gctctcaatgctactcgtgctgctgttgaagaaggaattgttcctggaggtggtaccgct1320

ctactaagatgcgcaccagctttgaagactttgcagcctaagaacgaagaccagaagacg1380

ggcatcaacattgtggcaaacgcactccgtatgccatgcttacagatcgctcaaaatgct1440

ggagttgacgcaagtgtcgtcgttgccaaagtgtccgaaggcaagcttggttacgatgcg1500

atgaacaacgaatacgtcgacatgatcgagaaaggcattatcgatccaaccaaggtcgta1560

cgcactgctcttaccgatgccgctggagtcgcttcactattgacgaccgctgaggcagtg1620

gtgaccgaattgcctaaagaggatccaccaatgcctggtggtatgggtggaatgggcggt1680

atgggtggtatgggtggtatgggcggcatgatgtaa1716

<210>2

<211>571

<212>PRT

<213>周氏啮小蜂Hsp60基因编码的氨基酸序列

<400>2

MetPheArgLeuProThrValLeuArgSerAlaAlaLeuArgGlnMet

151015

GlnLeuGlnSerArgThrTyrAlaLysAspValArgPheGlyAlaGlu

202530

ValArgAlaLeuMetLeuGlnGlyValAspIleLeuAlaAspAlaVal

354045

AlaValThrMetGlyProLysGlyArgAsnValIleLeuGluGlnSer

505560

TrpGlySerProLysIleThrLysAspGlyValThrValAlaLysGly

65707580

ValGluLeuLysAspLysPheGlnAsnIleGlyAlaLysLeuValGln

859095

AspValAlaAsnAsnThrAsnGluGluAlaGlyAspGlyThrThrThr

100105110

AlaThrValLeuAlaArgAlaIleAlaLysGluGlyPheGluLysIle

115120125

SerLysGlyAlaAsnProValGluIleArgArgGlyValMetMetAla

130135140

ValAspLysIleLysGluGluLeuLysAsnLeuSerLysProValThr

145150155160

ThrProGluGluIleAlaGlnValAlaThrIleSerAlaAsnGlyAsp

165170175

ThrAlaIleGlyAsnLeuIleSerAspAlaMetLysLysValGlyLys

180185190

GluGlyValIleThrValLysAspGlyLysThrLeuAsnAspAspLeu

195200205

GluValIleGluGlyMetLysPheAspArgGlyTyrIleSerProTyr

210215220

PheIleAsnSerThrLysGlyAlaLysValGluPheGlnAspAlaLeu

225230235240

ValLeuPheSerAspLysLysIleSerSerValGlnSerIleIlePro

245250255

AlaLeuGluLeuAlaAsnSerGlnArgLysProLeuValIleValAla

260265270

GluAspIleAspGlyGluAlaLeuSerThrLeuValValAsnArgLeu

275280285

LysIleGlyLeuGlnValAlaAlaValLysAlaProGlyPheGlyAsp

290295300

AsnArgLysAlaThrMetGlnAspMetAlaIleAlaThrGlyGlyIle

305310315320

ValPheGlyAspAspAlaAsnLeuValLysIleGluAspValGlnPro

325330335

SerAspLeuGlyGlnValGlyGluValLeuIleThrLysAspAspThr

340345350

LeuPheLeuLysGlyLysGlyLysLysSerAspIleAspArgArgAla

355360365

GluGlnLeuArgAspGlnIleGlnAspThrThrSerAspTyrGluLys

370375380

GluLysLeuGlnGluArgLeuAlaArgLeuAlaSerGlyValAlaVal

385390395400

LeuArgIleGlyGlySerSerGluValGluValAsnGluLysLysAsp

405410415

ArgValAsnAspAlaLeuAsnAlaThrArgAlaAlaValGluGluGly

420425430

IleValProGlyGlyGlyThrAlaLeuLeuArgCysAlaProAlaLeu

435440445

LysThrLeuGlnProLysAsnGluAspGlnLysThrGlyIleAsnIle

450455460

ValAlaAsnAlaLeuArgMetProCysLeuGlnIleAlaGlnAsnAla

465470475480

GlyValAspAlaSerValValValAlaLysValSerGluGlyLysLeu

485490495

GlyTyrAspAlaMetAsnAsnGluTyrValAspMetIleGluLysGly

500505510

IleIleAspProThrLysValValArgThrAlaLeuThrAspAlaAla

515520525

GlyValAlaSerLeuLeuThrThrAlaGluAlaValValThrGluLeu

530535540

ProLysGluAspProProMetProGlyGlyMetGlyGlyMetGlyGly

545550555560

MetGlyGlyMetGlyGlyMetGlyGlyMetMet

565570

Claims (4)

1.周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的核苷酸序列，该序列全长1716bp，含完整的开放阅读框，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的序列，其中所述核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；该序列编码571个氨基酸，分子量为60.7KDa，等电点为5.44。

3.权利要求1所述周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60的核苷酸序列在用于检测防治美国白蛾方面的应用。

4.权利要求3所述的应用，其中所述防治美国白蛾指的是：Hsp60基因表达受温度调控，通过检测Hsp60基因的表达情况，可以得知周氏啮小蜂对于温度胁迫的耐受情况，在低于周氏啮小蜂承受极限温度下释放小蜂，可以更好的起到防治美国白蛾的目的。