CN105289434A - 一种Fe3O4@CA-β-CD纳米微球的制备方法及其应用 - Google Patents
一种Fe3O4@CA-β-CD纳米微球的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法及其应用采用超声辅助共沉淀法合成了柠檬酸修饰的四氧化三铁Fe3O4CA纳米微粒；将Fe3O4CA加入蒸馏水得到Fe3O4CA溶液，向Fe3O4CA溶液中加入β-环糊精，搅拌均匀，然后干燥、洗涤、用强磁铁分离得到Fe3O4CA-β-CD纳米微球。将Fe3O4CA-β-CD纳米微球置于去氧蒸馏水中进行超声分散，然后加入多柔比星用超声细胞破碎仪超声处理，分离、洗涤、干燥得到装载多柔比星的四氧化三铁纳米微球Fe3O4CA-β-CD-DOX，在pH7.4的磷酸盐缓冲液中释放缓慢，释放时间长达12h，具有缓释效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法及其应用。
背景技术
四氧化三铁纳米粒是一种容易合成并且表面功能化的纳米磁性材料，具有良好的生物相容性、生物降解性、低毒等优点，广泛应用于生物医学工程等领域，如基因转染、细胞及蛋白分离、磁共振成像、药物靶向传递系统；被美国FDA批准用于磁共振造影剂和靶向药物传递载体。目前制备四氧化三铁纳米粒的方法很多，比较典型的有水相共沉淀法、热分解法、水热\溶剂热法、微乳液法等。由于四氧化三铁纳米粒表面积较大，容易发生团聚，因此需要在四氧化三铁表面包裹一层无机或有机壳层，形成核-壳结构从而提高其稳定性。壳层材料需要满足以下几个条件：①良好的化学稳定性；②良好的生物降解性；③良好的生物相容性和血液相容性；④无毒或低毒；⑤能有效抑制四氧化三铁纳米粒的团聚；⑥易于制备并控制其厚度。本文选用柠檬酸作为壳层材料，通过控制反应条件使柠檬酸包覆在四氧化三铁纳米粒表面，达到抑制团聚的目的。
现有的磁靶向药物传递系统存在一些问题，如载药率低、药物释放存在明显突释现象等。β-环糊精作为一种常用的包合材料，是由7个D-葡萄糖分子以1,4-糖苷键连接的环状低聚糖化合物，具有能容纳疏水性药物的空穴结构，其自身毒性很低，适用于提高疏水性药物的水溶性或者延缓药物释放，是一种比较理想的制剂辅料。
发明内容
本发明的目的是提供一种Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，本发明的另一目的是提供目Fe3O4CA-β-CD纳米微球包载多柔比星的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，步骤如下：
（1）表面修饰柠檬酸的四氧化三铁纳米微粒Fe3O4CA的制备；以FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O为铁源，以柠檬酸为稳定剂，采用超声辅助共沉淀法合成了柠檬酸修饰的四氧化三铁Fe3O4CA纳米微粒；
（2）Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备：将Fe3O4CA纳米微粒加入蒸馏水中，然后加入β-环糊精，搅拌均匀，干燥、洗涤、用强磁铁分离得到Fe3O4CA-β-CD纳米微球。
所述步骤（1）中Fe3+与Fe2+的摩尔比为2∶1，柠檬酸的用量以质量计是铁源用量的50-100%，反应时间15min，共沉淀法制备时的陈化时间为30min，陈化温度90℃。
所述步骤（2）中β-环糊精的用量以质量计是Fe3O4CA纳米微粒的0.8-2.6倍。
所述步骤（2）中1gFe3O4CA纳米微粒需要蒸馏水1~2mL。
所述步骤（2）中的干燥是在105~115℃的真空干燥箱中干燥2.5~3.5h。
所述步骤（2）中干燥后的样品用无水乙醇和去氧蒸馏水洗3~5遍。
所述的四氧化三铁纳米微球的制备方法制备得到的四氧化三铁纳米微球包载多柔比星的应用。
将Fe3O4CA-β-CD纳米微球置于去氧蒸馏水中进行超声分散，然后加入多柔比星用超声细胞破碎仪超声处理，然后离心分离、洗涤、干燥得到装载多柔比星的四氧化三铁纳米微球Fe3O4β-CD-DOX，于2~8℃密封保存。
超声分散时1gFe3O4CA-β-CD纳米微球需要去氧蒸馏水2~3mL，所述多柔比星的质量是Fe3O4CA-β-CD纳米微球质量的2~2.5倍。
利用超声细胞破碎仪进行超声处理时的超声频率70kHz，超声功率为300W，超声时间10~90min。
本发明的有益效果：1、热重分析表明柠檬酸在Fe3O4CA中的含量为12.1%；磁性能检测显示其具有顺磁性，饱和磁化强度M s 为17.5emu/g，适合用于构建磁靶向药物传递体系。2、Fe3O4CA-β-CD对多柔比星的载药量可达12%，在超声作用下仅30min就能达到最大载药量，药物包封率30%。Fe3O4CA-β-CD-多柔比星药物传递系统在pH7.4的磷酸盐缓冲液中释放缓慢，释放时间长达12h，具有缓释效果。
图说明
图1为柠檬酸修饰的Fe3O4的XRD图。
图2为Fe3O4CA（a）、β-CD（b）和Fe3O4CA-β-CD（c）的红外光谱图。
图3为Fe3O4CA(a)和Fe3O4CA-β-CD(b)的热失重曲线。
图4为Fe3O4CA-β-CD的粒径分布图。
图5为Fe3O4CA（a）和Fe3O4CA-β-CD（b）的室温（300K）磁滞曲线。
图6为多柔比星标准曲线。
图7为磁性微球Fe3O4CA-β-CD的载药量及包封率变化曲线。
图8为Fe3O4β-CD-DOX载药系统体外释放曲线。
具体实施方式
实施例1
本实施例的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，步骤如下：
（1）表面修饰柠檬酸的四氧化三铁纳米微粒Fe3O4CA的制备；以FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O为铁源，以柠檬酸为稳定剂，采用超声辅助共沉淀法合成了柠檬酸修饰的四氧化三铁Fe3O4CA纳米微粒，其中Fe3+与Fe2+的摩尔比为2∶1，柠檬酸的用量以质量计是铁源用量的80%，反应时间15min，共沉淀法制备时的陈化时间为30min，陈化温度90℃；
（2）Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备：将1gFe3O4CA纳米微粒加入1.5mL蒸馏水中，然后加入2gβ-环糊精，搅拌均匀，β在110℃的真空干燥箱中干燥3h，燥后的样品用无水乙醇和去氧蒸馏水洗3~5遍，用强磁铁分离得到Fe3O4CA-β-CD纳米微球。
图1为共沉淀法制得的Fe3O4CA纳米微粒XRD谱图。从衍射谱图看，峰的位置、强度结果与粉末衍射PDF卡（JCPDSNO.82-1533）上的Fe3O4标准数据基本吻合，2θ=30.26°,35.61°,43.64°,53.91°,57.33°,62.84°处的六个明显衍射峰分别对应于（220），（311），（400），（422），（511）和（440）的六个晶面，这表明通过改进化学共沉淀法制备所得的产物为Fe3O4，并具有立方晶系结构，晶型应为反尖晶石。未见杂质峰存在，说明晶体纯度高。衍射峰较尖锐，说明粒径小且分布较窄。
图2中b曲线1029cm-1、1159cm-1、2927cm-1三个峰为β-环糊精特征吸收峰。c曲线中626cm-1是Fe-O振动吸收峰，1030cm-1、2924cm-1是β-环糊精的特征吸收峰。1154cm-1、1590cm-1是柠檬酸的特征吸收峰。从红外光谱来看，β-环糊精成功与Fe3O4CA偶联。
为了验证β-CD是否连接在Fe3O4CA纳米粒上，把Fe3O4CA(a)和Fe3O4β-CD(b)的热失重曲线做一对比。从图3可以看出，曲线a中从室温到120℃累计失重为2.4%，是由于样品中含有的水受热蒸发。当加热到400℃时，累计失重达到14.5%，由柠檬酸高温下分解造成。400℃以后重量不再损失，说明柠檬酸已完全分解。曲线b中从室温到120℃累计失重为3.3%，是由于样品中所含结晶水蒸发。当加热到800℃时，累计失重为32.2%。经查询Scifinder数据库，β-环糊精的熔点是293~294℃，在该温度下同时发生分解。b曲线是柠檬酸和β-环糊精先后发生分解形成的曲线。热失重测试结果表明β-环糊精连接在Fe3O4CA纳米粒上，与红外结论一致。
图4为Fe3O4CA-β-CD的粒径分布图，粒径分析结果，Fe3O4β-CD的平均粒径为104nm，多分散指数（PDI）=0.199，相比Fe3O4CA平均粒径增大了20nm。其Zeta电位无法确定，原因可能是Fe3O4CA表面的柠檬酸分子的游离羧基在与β-环糊精的羟基在真空干燥条件下形成共价键，不再有游离羧基。
图5为Fe3O4CA（a）和Fe3O4CA-β-CD（b）的室温（300K）磁滞曲线，从图上可以看到，当外加磁场的强度变为零的时候，样品的磁化强度也变为零，且无剩磁。并且在整个外加磁场的变化过程中（-20koe~20koe）没有明显的磁滞回环，说明Fe3O4β-CD具有顺磁性，饱和磁化强度Ms为15.7emu/g。与Fe3O4CA相比，饱和磁化强度略有降低，原因是Fe3O4β-CD微球中Fe3O4相对含量较少。
实施例2
本实施例的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，步骤如下：
（1）表面修饰柠檬酸的四氧化三铁纳米微粒Fe3O4CA的制备；以FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O为铁源，以柠檬酸为稳定剂，采用超声辅助共沉淀法合成了柠檬酸修饰的四氧化三铁Fe3O4CA纳米微粒，其中Fe3+与Fe2+的摩尔比为2∶1，柠檬酸的用量以质量计是铁源用量的50%，反应时间为15min，共沉淀法制备时的陈化时间为30min，陈化温度90℃；
（2）Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备：将Fe3O4CA纳米微粒加入蒸馏水中，1gFe3O4CA纳米微粒需要蒸馏水1mL，然后加入0.8gβ-环糊精，搅拌均匀，在115℃的真空干燥箱中干燥2.5h，燥后的样品用无水乙醇和去氧蒸馏水洗3~5遍，用强磁铁分离得到Fe3O4CA-β-CD纳米微球。
实施例3
本实施例的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，步骤如下：
（1）表面修饰柠檬酸的四氧化三铁纳米微粒Fe3O4CA的制备；以FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O为铁源，以柠檬酸为稳定剂，采用超声辅助共沉淀法合成了柠檬酸修饰的四氧化三铁Fe3O4CA纳米微粒，其中Fe3+与Fe2+的摩尔比为2∶1，柠檬酸的用量以质量计是铁源用量的100%，反应时间15min，共沉淀法制备时的陈化时间为30min，陈化温度90℃；
（2）Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备：将1gFe3O4CA纳米微粒加入2mL蒸馏水中，然后加入1.6gβ-环糊精，搅拌均匀，在105℃的真空干燥箱中干燥3.5h，燥后的样品用无水乙醇和去氧蒸馏水洗3~5遍，用强磁铁分离得到Fe3O4CA-β-CD纳米微球。
实施例4
本实施例的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，步骤如下：
（1）表面修饰柠檬酸的四氧化三铁纳米微粒Fe3O4CA的制备；以FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O为铁源，以柠檬酸为稳定剂，采用超声辅助共沉淀法合成了柠檬酸修饰的四氧化三铁Fe3O4CA纳米微粒，其中Fe3+与Fe2+的摩尔比为2∶1，柠檬酸的用量以质量计是铁源用量的60%，反应时间15min，共沉淀法制备时的陈化时间为30min，陈化温度90℃；
（2）Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备：将Fe3O4CA纳米微粒加入蒸馏水中，1gFe3O4CA纳米微粒需要蒸馏水1.6mL，然后加入1.5gβ-环糊精，搅拌均匀，在108℃的真空干燥箱中干燥3h，燥后的样品用无水乙醇和去氧蒸馏水洗3~5遍，用强磁铁分离得到Fe3O4CA-β-CD纳米微球。
实施例5
本实施例的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，步骤如下：
（1）表面修饰柠檬酸的四氧化三铁纳米微粒Fe3O4CA的制备；以FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O为铁源，以柠檬酸为稳定剂，采用超声辅助共沉淀法合成了柠檬酸修饰的四氧化三铁Fe3O4CA纳米微粒，其中Fe3+与Fe2+的摩尔比为2∶1，柠檬酸的用量以质量计是铁源用量的80%，反应时间15min，共沉淀法制备时的陈化时间为30min，陈化温度90℃；
（2）Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备：将1gFe3O4CA纳米微粒加入1.8mL蒸馏水中，然后加入0.8gβ-环糊精，搅拌均匀，在112℃的真空干燥箱中干燥3h，燥后的样品用无水乙醇和去氧蒸馏水洗3~5遍，用强磁铁分离得到Fe3O4CA-β-CD纳米微球。
实施例6
Fe3O4CA-β-CD纳米微球包载多柔比星的应用。
1、多柔比星标准曲线的绘制
精密称取10mg多柔比星溶解于30mL蒸馏水中，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，再分别吸取上述溶液2mL，3mL，4mL，6mL，8mL，10mL，12mL分别置于25mL容量瓶中，稀释至刻度，配制成浓度（C）分别为8.15，12.24，16.32，20.40，24.45，32.64，48.96μg/mL的系列溶液，测定其在480nm处的吸光度（A）值，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归，经Origin8.0处理得标准曲线（如图6所示），多柔比星回归方程为：A=0.01689C－0.02619，回归系数r=0.9998。
2、将实施例1制备得到的Fe3O4CA-β-CD纳米微球置于去氧蒸馏水中进行超声分散，然后加入Fe3O4CA-β-CD纳米微球质量的2~2.5倍多柔比星用超声细胞破碎仪超声处理，超声频率70kHz，超声功率为300W，超声处理时间分别为10min、20min、30min、60min、90min，将混悬液装入离心管，高速离心（8000rpm）5min，上清液测紫外吸收，根据多柔比星标准曲线确定上清液中多柔比星的浓度，最后确定最佳超声时间、载药量及包封率。将离心分离得到的Fe3O4β-CD-DOX用去氧蒸馏水洗2遍后冷冻干燥，冻干粉末放置于冰箱中2~8℃密封保存。载药量和包封率的计算公式如下：
根据标准曲线换算出上清液中多柔比星的浓度，计算出载药量和包封率。以时间为横坐标，载药量和包封率为纵坐标作图，如图7所示。如图7所示，当超声时间在30min内，磁性微球的载药量和包封率随时间延长不断增加，30min后，虽然载药量随时间延长继续增长，但其增长速度明显变慢。综合考虑效率与效果，最佳超声处理时间定为30min，其对应的载药量为12%，药物包封率为30%。
3.包载多柔比星的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的体外释放
精密称取冻干得到的Fe3O4β-CD-DOX10mg，加20mL蒸馏水超声分散后装入截留分子量3000Da半透膜，两端用细绳扎紧，放入盛有80mLpH=7.4PBS缓冲液的小烧杯中，水浴温度37℃，开动磁力搅拌，每隔一段时间取2mL溶液测紫外吸收，同时补充2mLPBS缓冲液。将数据输入Origin8.0中，处理得到Fe3O4β-CD-DOX的体外释放曲线（如图8所示）。
由图8可知，Fe3O4β-CD-DOX载药系统在pH=7.4PBS溶液中释放缓慢，12h累积释放率45.5%，具有缓释效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）表面修饰柠檬酸的四氧化三铁纳米微粒Fe3O4CA的制备；以FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O为铁源，以柠檬酸为稳定剂，采用超声辅助共沉淀法合成了柠檬酸修饰的四氧化三铁Fe3O4CA纳米微粒；
（2）Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备：将Fe3O4CA纳米微粒加入蒸馏水中，然后加入β-环糊精，搅拌均匀，干燥、洗涤、用强磁铁分离得到Fe3O4CA-β-CD纳米微球。
2.根据权利要求1所述的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中Fe3+与Fe2+的摩尔比为2∶1，柠檬酸的用量以质量计是铁源用量的50-100%，反应时间15min，共沉淀法制备时的陈化时间为30min，陈化温度90℃。
3.根据权利要求1所述的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中β-环糊精的用量以质量计是Fe3O4CA纳米微粒的0.8-2.6倍。
4.根据权利要求1所述的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中1gFe3O4CA纳米微粒需要蒸馏水1~2mL。
5.根据权利要求1所述的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的干燥是在105~115℃的真空干燥箱中干燥2.5~3.5h。
6.根据权利要求1所述的Fe3O4CA-β-CD纳米微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中干燥后的样品用无水乙醇和去氧蒸馏水洗3~5遍。
7.利用权利要求1~6任一所述的四氧化三铁纳米微球的制备方法制备得到的四氧化三铁纳米微球包载多柔比星的应用。
8.根据权利要求6所述的Fe3O4CA-β-CD纳米微球包载多柔比星的应用，其特征在于：将Fe3O4CA-β-CD纳米微球置于去氧蒸馏水中进行超声分散，然后加入多柔比星用超声细胞破碎仪超声处理，然后离心分离、洗涤、干燥得到装载多柔比星的四氧化三铁纳米微球Fe3O4β-CD-DOX，于2~8℃密封保存。
9.根据权利要求8所述的Fe3O4CA-β-CD纳米微球包载多柔比星的应用，其特征在于：超声分散时1gFe3O4CA-β-CD纳米微球需要去氧蒸馏水2~3mL，所述多柔比星的质量是Fe3O4CA-β-CD纳米微球质量的2~2.5倍。
10.根据权利要求8所述的Fe3O4CA-β-CD纳米微球包载多柔比星的应用，其特征在于：利用超声细胞破碎仪进行超声处理时的超声频率70kHz，超声功率为300W，超声时间10~90min。
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