CN105283540B - 人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的内向整流的电子表达 - Google Patents

人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的内向整流的电子表达 Download PDF

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Abstract

提供了用于改善iPSC衍生的心肌细胞的动作电位形态以及使用这种细胞的系统和方法。改善的形态可以包括，例如，生理静息膜电位。测量肌细胞的膜电压以及基于膜电压将合成的内向整流电流施加到心肌细胞。

Description

人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的内向整流的电子表达
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2013年5月17日的第61/824,507号美国临时申请的优先权，其公开的内容通过引用并入本文中。
关于联邦资助的声明
本发明是在来自美国国立卫生研究院的授权号为HL093631和HL062465的政府支持下完成的。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
术语“诱导多能干细胞”或iPSC是指由非多能细胞人工制备的一类多能干细胞。iPSC衍生的心肌细胞是有用的实验系统，该系统具有很大的潜能。他们为心脏修复、药物的安全性设计和测试、临床诊断和研究提供创新的人源制剂。iPSC衍生的心肌细胞提供了影响重现健康的人心肌细胞的活动的细胞的机会，否则其很少用于综合实验研究。人源iPSC衍生的心肌细胞提供了开发心功能预测工具的能力。
尽管有iPSC衍生的心肌细胞的可能性，然而已经注意到这种方法的问题，引起关于它们在研究心律失常机制和药物安全性筛选中使用的严重关注。iPSC衍生的人源心肌细胞的动作电位(AP)通常称作“不成熟表型”。缺乏预期的典型尖峰和穹顶类型的AP形态引起了对iPSC衍生的人心肌细胞用于研究Brugada综合征和其他J-波或早期复极化相关的心律失常的遗传基础的能力的严重关注。除了明显不太复杂的复极化谱之外，iPSC心肌细胞也显示自发收缩活动。这种收缩活动伴随着相应的舒张期去极化，而产生自发AP。因此，虽然可以诱导iPSC发育成心肌细胞样细胞，但是它们未能表现出使这些细胞能用在心肌细胞功能的评估中或用于作用于心肌细胞的药物的筛选中的电生理特性。
发明内容
在本公开中，我们通过在电流钳下将IK1分量以电子方式添加到人源iPSC衍生的心肌细胞中来评估减少这些心肌细胞中的内向整流电流(IK1)的作用。该方法表明了IK1的强大影响力以及在复极化和潜在地致心律失常行为方面其表达产生重要的生理差异的程度。我们证明了人工替换IK1产生具有AP的人源iPSC衍生的心肌细胞，该心肌细胞在AP行为上更接近于新分离的人源心肌细胞。
在一个方面，本公开提供了用于改善iPSC衍生的心肌细胞的动作电位形态的系统。改善的AP形态可以包括，例如，生理静息膜电位、尖峰和穹顶动作电位。该系统包括具有用于测量肌细胞的膜电压的膜片钳和与电极电子通信的生成电路。生成电路被配置为基于膜电压计算内向整流电流的值并基于计算出的值将合成的内向整流电流施加到所述肌细胞。
该方法有很多应用并使该电生理系统的综合分析成为可能，还允许筛选对心房或心室细胞缺陷特异的药物。本公开的iPSC心肌细胞可用于离子通道病的解释、药物筛选和潜在心律失常发生的评估。通过消除许多自发活动和不稳定行为的非生理性结果，该工具对研究复极化的动力学是有用的。它已应用到察看疾病状态中复极化的基因调控的研究性学习中，以及充当药物研究中的数据判读和药物性心律失常电位的安全性筛选中的辅助工具。根据所获得的数据，它也可以用来修改治疗方案。
在一个方面，本公开提供了用于在iPSC衍生的心肌细胞中产生具有改善形态的动作电位的方法。该方法包括测量肌细胞的膜电压的步骤；基于所测量的膜电压计算内向整流电流的值；以及将合成的内向整流电流施加到肌细胞从而使肌细胞产生具有改善形态的动作电位。
在一个方面，本公开提供了用于区分具有心房细胞样的电性特征的iPSC衍生的心肌细胞与表现出心室细胞样的电性特征的iPSC衍生的心肌细胞的方法。
在一个方面，本公开提供了用于筛选可以影响心房细胞或心室细胞的电性特性的候选试剂的方法。该方法包括鉴别iPSC衍生的心肌细胞是否表现出心房表型或心室表型，然后测试假定药物影响心房功能或心室功能的效果。
iPSC心肌细胞能够用于离子通道病的解释、药物筛选和潜在心律失常发生的评估。通过消除许多自发活动和不稳定行为的非生理性结果，该工具对研究复极化的动力学是有用的。它已应用到察看疾病状态中的复极化的基因调控的研究性学习中，以及充当药物研究中的数据判读和药物致心律失常电位的安全性筛选中的辅助工具。它也可以用来修改根据所获得的数据的治疗方案。
附图说明
图1：IK1电流的电子表达系统的组织。响应于肌细胞膜电位实时生成IK1，合成。对于这个研究中的所有细胞，设置电位计以提供在-75mV时150pA的标准外向电流。
图2：iPSC衍生的心肌细胞的自发AP。(A)典型的自发AP，其具有典型的起搏器型细胞的相对慢的舒张去极化和非常慢的上升冲程(dV/dtmax)。(B)不规律的和DAD样行为的实例。一般地，在电流钳期间自发活动表现出基本不规律性。这种不规律性常常显示出具有噪声行为的大部分平坦舒张间期，和在动作电位的潜在前导启动的突然自发增加。(C，D)：相同细胞中EAD样行为的实例。在c中，在约0mV单次搏动中存在AP的高电压延长。在D中，该细胞在低电压(-20至-40mV)EAD样振荡中花了很长时间。
图3.起搏静态和自发活动细胞。(A)无任何刺激下静止期细胞的典型静息电位。(B)刺激(0.5Hz 4次搏动)静止期细胞(与(A)中相同)启动复杂行为和自动节律性。(C)扩展时间范围内表现刺激性AP。(D)自发活动，在频率、舒张电位、过冲和形状上高可变性。(E)起搏(0.25Hz 4次搏动)自发活动细胞(如(D)中的肌细胞)产生更加一致的后超极化电位且改变自发活动。(F)在扩展时间范围可以更容易地看到后超极化。
图4：合成的IK1表达和起搏之前和之后的AP。(A)自发心室型细胞。这些细胞显示圆形的AP，但因为相对高的舒张电位降低了dV/dtmax而难以进行区分。AP的“肩部”被慢的IV阶段复极化所模糊。(B)(A)中的IK1的电子表达使去除INa失活的正常静息电位恢复，由此增加dV/dtmax并复位其他电流。如Ito的电流的复位产生心室肌细胞的典型的“尖峰和穹顶”形态。(C)自发搏动心房细胞样细胞，其具有难以与心室细胞或节细胞区分的形态。(D)IK1的电子表达揭示了图c中的细胞的心房性质。与心室肌细胞一样，负静息电位恢复正常dV/dt并显示心房细胞的典型的特征尖峰和低的多三角形复极化相。(E，F)在扩展时间范围(E)心房样AP和(F)心室样AP的复极化的详细信息。(G)细胞的APD30/APD90相对于APD30的比值与IK1电子表达的散点图。
图5.钙通道激动剂BayK8644的影响。(A)以4s的周期长刺激的AP。固有自动节律性使得一些AP大大地缩短并且在来自先导自发搏动的复极化过程中发生一些刺激。三个轨迹重叠。(B)相同的细胞，使用1μM BayK8644。BayK8644引起钙负荷，其终止自发活动。刺激的AP表现出具有严重缩短的复极化的异常行为和很少的再生去极化的证据。三个轨迹重叠。(C)与(A，B)相同的细胞，但具有IK1,合成的电子表达。AP具有正常的尖峰和穹顶形态和一致的APD90。在B之前记录这些轨迹。(D)与(A，B，C)相同的细胞，具有IK1,合成和1μM的BayK8644。APD被延长并且观察到交替的致心律失常性现象。一些AP被随后的刺激中断。尽管有IK1的时间不变性质，IK1的电子表达使得交替的动态现象的观察易观察。除了QT间期延长，交替的阈值变化是药物性心律失常电位的重要的细胞指数。(E)通过IK1,合成极小地改变了APD90(n＝7)。这可能看起来矛盾，但添加IK1的净效应是复极化的穹顶部分延长和复极化的最后阶段(或末尾)的速率增加。该结果只是APD90适度的改变。(F)存在/不存在BayK8644的APD90的比值表明主要增加具有IK1,合成表达的APD和异常降低不具有IK1,合成表达的APD90。
图6是描绘根据本发明的实施方式的方法的流程图。图7是描绘根据本发明的另一个实施方式的方法的流程图。图8是描绘根据本发明的另一个实施方式的方法的流程图。
具体实施方式
本公开提供了将相对于天然细胞的生理动作电位形态赋予给iPSC衍生的心肌细胞的方法。该方法包括在电流钳下将IK1分量以电子方式添加到心肌细胞中。我们表明，IK1的人工替换产生具有更接近于来自新分离的人心肌细胞的AP行为的AP的人iPSC衍生的心肌细胞。
可以通过将引入细胞或与具有重组因子的细胞接触而由非多能细胞，典型地正常体细胞或终末分化细胞，如成纤维细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等来制备iPSCs。诱导性多能干细胞可以分化成心肌细胞。例如，利用逆转录病毒转导，成熟成纤维细胞可被转染转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和/或Klf4，或者利用慢病毒转导，成熟成纤维细胞可被转染Oct4、Sox2、Nanog和Lin28。对iPSC衍生的心肌细胞的讨论，见第8415155号美国专利，其公开内容以引用的方式并入本文。
将重组因子导入体细胞之后，这些细胞可以在足以维持多能性和未分化状态的培养基中进行培养。在培养中维持iPSC的培养方法和培养基是公知的。
通过在对具有所期望表型的细胞来说富足的特殊生长环境中培养或分化，可以由未分化的干细胞获得心肌细胞谱系细胞。例如，可以通过所期望的细胞生长或通过抑制或杀死其它细胞类型来实现。详细内容可以在第8415155号美国专利中找到。这提供了iPSC衍生的心肌细胞。此外，iPSC衍生的心肌细胞也可商购。
为了记录来自iPSCs衍生的心肌细胞的电活动，可以采用全细胞电压或电流钳技术。一般地，这些技术涉及使用常规方法形成吉伽封口。
iPSC衍生的心肌细胞通常产生具有“圆拱”形态和缓慢的上升冲程的动作电位。高MDP降低dV/dtmax并且难以基于AP形态区分心室细胞和心房细胞。
参考图1，本公开可以体现为用于改善iPSC衍生的心肌细胞90的动作电位形态的系统10。改进的动作电位形态包括例如稳定的生理静息膜电位和/或生理动作电位形态。该系统10包括如现有技术已知的膜片钳12。膜片钳12为被配置为全细胞测定的单电极装置。如此，膜片钳12包括电极14。电极14可以为，例如，填充有导电溶液的玻璃微量移液器。这样的示例性电极可配置为与待测量的细胞形成吉伽封口。膜片钳12被配置为测量肌细胞90的膜电压(Vm)。
膜片钳12配置为测量心肌细胞90的活动电位。在一些实施方式中，膜片钳12配置为电流钳并经由电极14将刺激电流(ISTIM)提供给细胞90。如此膜片钳12可配置成通过以采样频率对膜电压进行采样(测量)来记录细胞90随时间的动作电位。
系统10包括与膜片钳12的电极14电子通讯的生成电路20。生成电路20配置为从电极14接受电信号，其中该电信号显示所测的膜电压。以这种方式，生成电路20接收来自电极14所测的膜电压。生成电路20配置为基于来自电极14的膜电压而计算内向整流电流(IK1)的值。例如，可以根据下式由膜电压计算内向整流电流：
根据本公开，膜电压和内向整流电流之间的其他关系将是明显的，并且应包括在一些实施方式的范围内。
生成电路20进一步配置成将合成的内向整流电流(I合成)提供给电极14。生成电路20所提供的合成的内向整流电流对应于由生成电路20计算出的IK1的值。在一些实施方式中，合成的内向整流电流等于内向整流电流的计算值(I合成＝IK1)。在一些实施方式中，I合成可以与IK1不同。例如，生成电路20还可以包括电位计22，所提供的电流(I合成)可以经衰减使得I合成<IK1。
在一些实施方式中，生成电路20包括处理器，并且该处理器被编程以计算内向整流电流的值。根据本公开显然可以使用处理器(例如，带有软件)、分立电子元件、专用集成电路，现场可编程门阵列或其组合物或其他配置来实现生成电路20。
该系统10可包括配置为将合成的内向整流电流(I合成)添加到膜片钳12的刺激电流(ISTIM)中产生输入电流(I输入)的加法电路30。在这种方式中，将合成的电流作为输入电流的分量提供给电极14。
在具有数字实现的实施方式中，可以连续地使用系统10，从而以采样频率随时间对膜电压进行重复测量，通过电极14将相应的合成的内向整流电流提供给细胞90。应当注意的是，可以实现作为根据每个时间段的合成电流随时间变化的连续电流的多个电流。
生成电路20可进一步包括用于选择地断开生成电路20以使得没有合成的内向整流电流被提供给电极14的开关24。
本公开可体现为用于产生来自iPSC衍生的肌细胞的有规律的动作电位的方法100(例如，参见图6)。该方法100包括测量103肌细胞的膜电压(Vm)的步骤。例如，膜片钳可以用于以全细胞模式测量103膜电压。基于所测量的膜电压计算106内向整流电流(IK1)的值。在一些实施方式中，根据上面的式(1)计算106出所述值。在一些实施方式中，用处理器计算106所述值。例如，计算机可以配置为接收所测量103的膜电压并编程为基于所接收的膜电压计算106内向整流电流。根据本公开，用于计算106内向整流电流的其它技术将是明显的。
该方法100还包括将合成的内向整流电流(I合成)施加109到心肌细胞从而使肌细胞产生有规律的动作电位的步骤。可经由膜片钳的电极施加109电流。合成的内向整流电流对应于所计算106的值。在一些实施方式中，所施加109的合成的电流等于所计算106的内向整流电流。在一些实施方式中，所施加109的合成电流小于所计算106的值，例如，其中使用电位计衰减电流。
在一些实施方式中，膜片钳被提供150并配置成使用电极测量103肌细胞的膜电压。膜片钳可以配置为电流钳，将刺激电流(ISTIM)施加到肌细胞。在这样的实施方式中，可以将合成的内向整流电流添加153到刺激电流中以产生经由电极施加到肌细胞中的输入电流I输入。这样，将合成的电流作为输入电流的分量施加109到肌细胞。
该方法还可以用于确定iPSC衍生的心肌细胞是否表现出心室特征或心房特征。例如，方法200可以包括在一段时间内以采样频率对iPSC衍生的肌细胞的膜电压进行采样203的步骤(参见，例如，图7)。计算206多个合成的内向整流电流的值，每个值对应于所采样203的膜电压。可以根据式(1)计算206该值。方法200包括将根据所计算206的内向整流电流的值合成的内向整流电流施加209到肌细胞的步骤。基于动作电位基于所产生的动作电位的形态可以确定212肌细胞表现出心室特征或心房特征。
如果确定212心肌细胞表现出心室特征，方法200可以包括调整215所施加209的合成的内向整流电流以使得肌细胞的动作电位与心室肌细胞的动作电位更紧密地匹配的步骤。如果确定212肌细胞表现出心室特征，方法200可以包括调整218所施加209的合成的内向整流电流以使得肌细胞的动作电位与心室肌细胞的动作电位更紧密地匹配的步骤。
本公开可以体现为用于确定用于药物开发的测试试剂的方法300(参见，例如，图8)。方法300包括提供303iPSC衍生的心肌细胞以及提供306用于施加合成的内向整流电流的系统如上述的系统10的步骤。使用系统生成309具有改善形态的动作电位图。肌细胞可以表现出心室肌细胞或心房肌细胞的动作电位。将肌细胞与测试试剂接触312。基于肌细胞的动作电位特性测试试剂被鉴定315为药物开发的候选物。例如，如果个别动作电位特性改变以使得动作电位变为差不多三角形的形状，变得延长或缩短，动作电位的规律性改变，不应期有变化，或回归曲线行为有变化，测试试剂可以鉴定315为候选物。在其它实例中，但不限于，动作电位在其持续时间、三角测量度、不应期、回归曲线斜率、交替发展的阈值或者不稳定或混沌行为的阈值方面发生变化。方法300可进一步包括使iPSC衍生的心肌细胞与第二测试剂接触318的步骤(使肌细胞与如上所述的(第一)测试试剂接触之后)。可以选择第二测试剂来使肌细胞改变的特性恢复到与第一测试试剂接触312之前的特性。
所描述的方法有许多应用。例如，一种方法将允许人电生理学系统的综合分析。iPSC心肌细胞可用于离子通道病的解释、药物筛选和潜在的心律失常发生的评估。由于省去了许多人iPSC衍生的心肌细胞的自发活动和不稳定行为的潜在混杂的非生理性结果，这种方法为研究复极化的动力学提供了有用工具。它已应用到察看疾病状态下复极化的基因调控的研究性学习以及充当药物研究的数据判读和药物致心律失常电位的安全性筛选中的辅助工具。
本公开中所描述的系统和方法可用于来自人类或其他动物包括例如哺乳动物的iPSC。
提供以下实施例以进一步说明本发明。
实施例
方法
细胞制备
根据厂商的说明书制备市售的iPSC衍生的心肌细胞(iCell Dynamics，WI)。简言之，在液氮中储存iCell心肌细胞(1ml冷冻管中冷冻保存的单细胞悬液)。在水浴(37℃)中解冻小瓶。洗涤细胞，然后用1ml RT“iCell心肌细胞铺板培养基”漂洗。添加额外的8ml铺板培养基，通过轻柔颠倒混合细胞与溶液。将心肌细胞接种到12孔板中涂有0.01％(w/v)明胶溶液的15mm盖玻片上。将心肌细胞(20000-40000/皿)接种到2ml室温铺板培养基中，进行单细胞培养，并在37℃，7％CO2下孵育2+天。通过用“iCell心肌细胞支持培养基”漂洗去除未贴壁细胞。添加额外的2ml支持培养基。每2天更换维持培养基并在1周内使用细胞。
电生理学
对iPSC衍生的心肌细胞进行电压钳。使用全细胞钳在室温记录电流。用Tyrode连续灌注记录室(300μl)中的细胞。移液器由硼硅酸盐玻璃(Flaming/Brown水平微量吸液管拉出器)制造，尖头热抛光(NARISHIGE抛光仪)。移液器含有(mM)：10NaCl、125KCl、1MgSO4、5EGTA、5ATP(Mg盐)、5Tris-磷酸肌酸、0.3GTP、10HEPES,pH7.2。细胞外溶液(mM):150NaCl、5.4KCl、0.5Na2HPO4、1MgCl2、2CaCl2、10葡萄糖、10HEPES,pH7.4。形成密封(1-10欧姆)后，抽吸和电压脉冲用来破裂补片。记录电流(Axopatch-1D，Molecular Dynamics，CA)并经由Digidata1322A接口到Pentium 4计算机(Molecular Dynamics，CA)中。PClamp9.0(Molecular Dynamics，CA)用于控制协议和数据采集。
电子界面
我们使用安装在配有2个Intel Xeon CPU E5520的Dell Precision T7500工作站上的模拟和数字I/O板PCIe-DAS1602/16(Measurement Computing Corporation)将Vm信号转变成IK1电流信号。源代码在附录中。
数据分析。
使用pClamp9(Molecular Dynamics)进行分析。针对复极化的50％(APD50)和90％(APD90)计算出动作电位时程(APD)，以ms为单位。测定AP上升冲程的最大上升率(dVm/dtmax)，以mV/ms为单位。每个AP之前记录静息膜电位。
对于自发AP，在完整AP复极化和随后的AP去极化开始之间的一段时间报告舒张特性。针对舒张期，计算出持续时间、最小/平均电位。
统计分析
结果报告为平均值±标准误差。视情况而定，采用t检验或ANOVA进行差异分析，P<0.05视为统计学显著差异。
结果
为了克服h-iPSC衍生的心肌细胞缺乏IK1，我们开发了动态钳位方法的变型以注入合成版的IK1(图1)。该系统的中心为在全细胞电压或电流钳下分离的h-iPSC衍生的心肌细胞。在常规电流膜片钳模式下用吉伽封口完成全细胞式膜片钳。从放大器输出心肌细胞的膜电压并通过根据图1所示的式子计算针对膜电位的内向整流电流的数字转换器将其送入计算机。通过电位计(用于调整幅度而不牺牲数字分辨率)将IK1,合成的计算值传递给标尺IK1，然后与来自pClamp的标准刺激输入相加。开关允许在常规电流钳和总计输入之间快速变化。当总计输入被接通时，肌细胞接收两个输入的总和：标准AP刺激电流加上来自实时电流模拟器的IK1,合成。标准电压钳电子线路可以由加法电流驱动，而无需修改常规电压钳和数据记录，仅具有较少的输入/输出通道的软件选择变化。结果是细胞行为好像其正在表达天然IK1，IK1已经被瞬间“转染”到细胞中。
iPSC衍生的心肌细胞AP的性能和变异。
来自iPSC衍生的心肌细胞的大多数报告表明它们通常是自发活动的，具有少许静止期细胞，这与我们的研究结果一致。因此，迄今为止关于iPSC衍生的心肌细胞的大多数AP研究已经报道了基于自发AP行为的分析的参数。考虑到高程度的细胞到细胞变异，在AP参数方面上，大量的细胞已用于产生统计学上显著的变化结果。高通量筛选方法甚至用于检查市售iPSC衍生的心肌细胞的细胞特性。这至少在一定程度上反映了细胞类型即心室、心房和节细胞之间的变异。然而，一些这种变异也是由自发活动细胞记录的结果造成的。自发活动细胞的平均最大舒张电位是-59±2mV(n＝33)。自发活动通常是不规律的，在从几百毫秒到8s的大范围的舒张间期上发生(平均：2068±415ms，n＝25)，对于任何给定的单细胞其包括高搏动到搏动变异(参照图2)。不足为奇的是，心率的变异伴随着AP持续时间和形状的高变异。如表1所示，自发AP倾向于具有相对短的振幅和非常慢的上升冲程(图2A，B)。这种不规律的行为往往伴随着类似EAD的自发事件以及低和高的DAD阈值(图2C，D)。
减少电活动的变异的一个策略是通过调整外界刺激的速度。这可以调整慢的自发活动并可能诱导静止期细胞的再生电行为。并非所有的iPSC衍生的心肌细胞都是自发活动的(在33个细胞测试中，8个为非自发活动的)。然而，即使非自发活动的细胞也未表现出与来自工作心肌的人源成熟心肌细胞相关的正常AP特性。缺乏自发收缩功能可能是由于稳定的正常的静息电位(大约-85mV)或可能是由于相对地去极化电位，这导致异常的静止状态。大多数非自发细胞不具有工作心肌的典型的超极化的静息膜电位，但均处于异常去极化的状态。八分之三的非自发活动细胞具有-60mV以上的静息电位，只有1个具有-70mV以下的静息膜电位。通过用电流刺激起搏可启动静止期细胞中的AP和收缩活动。诱发的AP接近于自发活动的细胞的AP。在一些静止期细胞中，起搏能引起后续一段时间的自发行为(图3A-C)，表明延迟的整流器电流产生人iPSC衍生的心肌细胞的舒张电位。自发活动组织的起搏改变搏动到搏动变异(图3D-F)并且改善一些其他参数，尤其dV/dtmax(表1)。
无论AP是否由自发活动和刺激博起所引起，与来自新分离的人心房或心室心肌细胞的AP相比较，它们已经延长了复极化(APD90分别为955±103ms(n＝38)和967±141ms(n＝30))，减弱了振幅和降低了最大上升冲程(的dV/下降速率)。它们还缺乏心室和心房肌细胞的典型的尖峰和穹顶形态。这有点令人惊讶，因为细胞一致地表达产生这种AP形态的强Ito。然而，产生这种电流的Kv4.2/4.3介导的通道都发生大量的封闭状态失活并且可能在很大程度上被自发AP和刺激AP的去极化状态灭活。同样，INa也在这些电位下失活并不能完全促进正常的快速的上升冲程或尖峰或穹顶行为。缺乏这些行为将导致非生理功能并大大降低对于任何突变通道或候选药物的药物性心律失常或抗心律失常行为的筛选的预测值。然而，当我们注入IK1,合成时，建立了稳定的静息膜电位并且AP形状和规律存在显着变化(图4)。可以清楚地看出尖峰和穹顶形态，心室样和心房样肌细胞之间的区别是非常明显的，这表明该方法允许高效区分细胞类型。图4G显示了基于动作电位的形状和持续时间将细胞分为两个不同群体。AP之间无论博起到博起还是细胞到细胞的变异降低并且AP的上升阶段的快速的上升冲程(dV/dtmax)是显着的且一致的(表1)。显然，IK1重建恢复了h-iPSC衍生的心肌细胞的许多重要特性。
复极化的药理操纵
内向整流器的重建使许多h-iPSC衍生的心肌细胞AP的性能标准化成更清楚地接近于工作心肌细胞的形式。此外，它减轻了许多与自由运转或刺激AP相关联的不受控制的性能。该性能的功能效用可以通过评估钙通道激动剂BayK-8644而看出，其增加振幅和破坏L-型钙离子通道的失活，从而导致APD极大的增加。我们检查了1μM BayK-8644对具有和不具有电子IK1的起搏的h-iPSC衍生的心肌细胞的影响(图5)。1μMBayK-8644的应用在这两种情况下产生了深远的影响。然而，在起搏的细胞中没有一致地观察道到由BayK-8644引起的AP延长。相反，由于大大缩短的AP刺激后的膜去极化，自发的完全的AP活动终止。还观察到低水平的颤动样电振荡增加。相反，当电子地插入IK1时，细胞活动规律化，变异减少和AP更生理学性并且颤动样电行为受到抑制。BayK-8644的应用则导致明显的AP延长。在缩短的起搏间隔下，一些AP延长至超过起搏频率(图5D)。当使用成对数据来观察时，在预测的致心律失常电位中的这种定性的差异是明显的(图5E)，其强调了IK1电子地表达能够提高作为用于药物安全性的工具的人iPSC衍生的心肌细胞系统的预测能力和心律失常的分子基础的研究。
虽然相对于一个或多个特定实施方式已经描述了本发明，应该理解的是，在不脱离本发明的精神和范围下可以做出本发明的其它实施方式。因此，可认为本发明仅由所附权利要求书及其合理的解释限制。

Claims (20)

1.一种用于产生改善的iPSC衍生的心肌细胞的动作电位形态的系统，该系统包含：
包含电极的膜片钳，其配置成用于测量肌细胞的膜电压(Vm)；
与所述电极电子通信的生成电路，所述生成电路配置为：
基于所述膜电压计算内向整流电流(IK1)的值；
将根据所确定的内向整流电流合成的内向整流电流提供给所述电极以产生来自所述肌细胞的具有改善形态的动作电位。
2.如权利要求1所述的系统，其中根据下式确定合成的内向整流电流的值：
3.如权利要求1所述的系统，其中所述生成电路配置为重复地计算值并以采样频率提供电流。
4.如权利要求1所述的系统，其中所述生成电路包括处理器，其被编程为：
基于膜电压计算合成的内向整流电流(IK1)的值；以及
将根据所确定的值合成的内向整流电流提供给所述电极以产生来自所述肌细胞的具有改善形态的动作电位。
5.如权利要求1所述的系统，其中所述系统配置为用于测量所述肌细胞的动作电位。
6.权利要求5所述的系统，其中所述膜片钳配置为电流钳。
7.如权利要求1所述的系统，还包括：将所述合成的内向整流电流添加至所述膜片钳的刺激电流以产生输入电流的加法电路，由此将所述合成的内向整流电路作为输入电流的分量提供给所述电极。
8.如权利要求7所述的系统，其中在所述加法电路之前所述生成电路还包括用于衰减所述合成的内向整流电流的电位计。
9.一种用于产生改善的iPSC衍生的心肌细胞的动作电位形态的方法，该方法包括以下步骤：
测量肌细胞的膜电压(Vm)；
基于肌细胞的膜电压计算内向整流电流(IK1)的值；以及
将根据所述内向整流电流的计算值合成的内向整流电流施加到肌细胞以产生具有改善形态的动作电位。
10.如权利要求9所述的方法，其中根据下式确定所述内向整流电流的值：
11.如权利要求9所述的方法，还包括随时间记录作为所述肌细胞的动作电位的膜电压的步骤。
12.一种用于确定iPSC衍生的心肌细胞是否表现出心室特征或心房特征的方法，该方法包括以下步骤：
在一段时间内以采样频率对肌细胞的膜电压(Vm)进行采样；
计算多个合成的内向整流电流(IK1)的值，每个值基于膜电压样本，根据下式计算所述值：
将根据所计算的值合成的内向整流电流施加到所述肌细胞以产生来自所述肌细胞的具有改善形态的动作电位；以及
由所产生的有规律的动作电位确定所述肌细胞是否为心室肌细胞或心房肌细胞。
13.如权利要求12所述的方法，还包括调节所施加的合成的内向整流电流，以使所述肌细胞的所述动作电位与心室肌细胞的所述动作电位更紧密地匹配的步骤。
14.如权利要求12的方法，还包括调节所施加的合成的内向整流电流，以使所述肌细胞的所述动作电位与心房肌细胞的所述动作电位更紧密地匹配的步骤。
15.一种用于鉴定用于药物开发的测试试剂的方法，包含：
a)提供iPSC衍生的心肌细胞；
b)提供权利要求1所述的系统；
c)使用b)中的系统在所述iPSC衍生的肌细胞中产生具有改善形态的动作电位图；
d)使所述iPSC衍生的心肌细胞与测试试剂接触；以及
e)如果个别动作电位的特性或动作电位的规律性发生变化，鉴别所述测试试剂为药物开发的候选物。
16.如权利要求15的方法，其中所述iPSC衍生的衍生心肌细胞表现出心房肌细胞的所述动作电位的动作电位特性。
17.如权利要求15的方法，其中所述iPSC衍生的衍生心肌细胞表现出心室肌细胞的所述动作电位的动作电位特性。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述个别动作电位在持续时间、三角测量度、不应期、回归曲线斜率、交替发展的阈值或不稳定或混沌行为的阈值方面发生变化。
19.如权利要求15所述的方法，其中步骤d)的测试试剂是第一测试试剂且进一步包括使来自步骤e)的所述iPSC衍生的肌细胞与第二测试试剂接触的步骤，所述第二测试试剂能够将已改变的特性恢复到与所述第一测试试剂接触之前的特性。
20.如权利要求15所述的方法，其中所提供的iPSC衍生的心肌细胞是人源的。
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