CN105274005A - 一株产紫杉醇的烟曲霉真菌tms-26 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株生产紫杉醇的曲霉属真菌烟曲霉TMS-26，该菌株能够在液体发酵的情况下产生紫杉醇。该菌株于2014年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，保藏编号:CCTCC？M2014258。该菌株在PDA液体培养基、28℃、160r/min、暗培养10-12d条件下紫杉醇产量最高可达到696.24μg/L。本发明提供的新菌株，为应用于工业化大规模生产的优良菌株的选育提供了良好的研究基础，应用前景广阔。

Description

一株产紫杉醇的烟曲霉真菌TMS-26

技术领域

本发明提供一株可生产紫杉醇的菌株，属于应用微生物学科领域。

背景技术

紫杉醇(Taxol，商品名Paclitaxel)，分子式C₄₇H₅₁NO₁₄，是一种从裸子植物红豆杉属中分离提纯的天然次生代谢产物。经研究发现，紫杉醇能够作用于细胞微管(Microtubule),导致细胞有丝分裂异常或停止，能够阻止癌细胞增殖。这种独特的作用机理使紫杉醇具有优秀的抗癌作用。而且紫杉醇是一种纯天然的药物，高效、低毒、广谱，一经问世，就成为全球销量最大的天然抗癌药物，尤其是对于对癌症发病率较高的卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等疗效独特。

目前紫杉醇的生产方法有五种：分别为红豆杉组织直接提取法，化学全合成法，化学半合成法，红豆杉细胞悬浮培养法和微生物发酵法等。微生物发酵法具有易于实现规模化快速化生产；菌种选育速度快，产量相对容易快速提高；生产技术相对成熟，转产风险较小，生产成本相对低廉；生态效益、经济效益以及社会效益好等众多优点。目前国内外研究已分离得到大量能够产紫杉醇的植物内生真菌菌株，主要包括树状多节孢属(Nodulisporiumsylviforme)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsisspp.)、真菌头孢霉属(Cephalosporiumspp.)、轮柄梳霉属(Martensiomycesspp.)以及无孢菌群(Myceliasterlia)等。然而所得到的菌株紫杉醇产量普遍较低，无法达到工业化生产所需的最低要求，因此，选育紫杉醇高产菌株已成为当前研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一株能够高产紫杉醇的菌株——曲霉属烟曲霉(Aspergillusfumigatus)TMS-26菌株。

本发明曲霉属烟曲霉TMS-26菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，地址:湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号:CCTCCM2014258，保藏日期:2014年6月15日。

本发明曲霉属烟曲霉TMS-26菌株的菌落特征为:在PDA培养基上28℃倒置暗培养生长速度较快，3d后菌落直径约为3.3cm，6d后菌落直径达7.5cm，菌落呈规则圆形，质地致密，向四周辐射状平铺生长，初期为白色绒毛状菌丝，后期菌落中央颜色变深，并在菌落表面由中央向外附着一层网状白色菌丝，菌落由中央向四周的颜色变化规律为：白色-蓝绿色-灰白色-白色，其中蓝绿色部分为菌丝表面附着的蓝绿色分生孢子，白色部分为无色菌丝，菌落背面随着培养时间延长逐渐变为黄褐色，菌落无渗出物。

本发明从陕西关中地区生长的曼地亚红豆杉根、茎、叶和树皮中获得一系列内生真菌菌株，经分离筛选后，得到一株紫杉醇产量较高的菌株，编号为26^#菌株。经过形态学鉴定、菌株18SrDNA序列(GenBank序列登录号：KJ746594)和ITS序列(GenBank序列登录号：KJ716967)比对分析，将其鉴定为曲霉属烟曲霉变种，命名为烟曲霉TMS-26。经过查阅已发布产紫杉醇内生真菌菌株的文献，了解到该种属菌株分离自曼地亚红豆杉且能够产紫杉醇为首次报道。实验结果表明:原始菌株在PDA液体培养基，pH自然，温度28℃，摇床转速160r/min的条件下培养10～12d，其紫杉醇产量最高能够达到696.24μg/L。本菌株优化前紫杉醇产量在已报道产紫杉醇菌株中属较高水平，为其在今后菌种改造，发酵培养条件优化，选育能够适用于工业化大规模生产紫杉醇的菌株提供了可能和基础。

附图说明

图1是烟曲霉TMS-26菌株的菌落形态照片；

图2是烟曲霉TMS-26菌株的扫描电镜照片；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述。

实施例1

曼地亚红豆杉产紫杉醇内生真菌的筛选

(1)培养基

PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，自来水1000mL，pH自然。

PDA液体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL，pH自然。

上述培养基均为121℃高压灭菌30min后备用。

(2)菌株的分离纯化

本试验外植体材料来自于西北农林科技大学博览园引种栽培的9年生曼地亚红豆杉。将采集而来的曼地亚红豆杉根、茎、叶以及树皮放入流动自来水中冲洗3～5min，除去尘埃杂物，然后再用无菌水冲洗三次，转移至洁净工作台内，用无菌滤纸吸干表面水分。然后进行外植体表面消毒处理，先用75％的乙醇浸泡30s，完成后用无菌水冲洗3～5次，接着再用0.1％的升汞溶液浸泡10min，完成后用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面水分。外植体消毒完成后，使用无菌的解剖剪和解剖刀将根茎以及树皮小段沿中心均匀剖成两半，然后剪切成0.5×0.5cm左右的小块，叶片剪切成0.5cm左右长度的小段并从中间剖成两半，然后按外植体部位分别接种于已经准备好的PDA固体培养基上，每皿均匀接三块外植体，每个部位的外植体接三皿，共接十二皿。接入标记完成后将其倒置于28℃电热恒温培养箱中黑暗培养3～7d，每天观察记录菌丝生长情况。

当接种于PDA固体培养基中的曼地亚红豆杉外植体长出菌丝后，根据所长出的菌落颜色、形态以及分泌物的不同，挑取不同菌落菌丝的尖端分别划线法接种于新的PDA固体培养基上，28℃倒置于电热恒温培养箱中黑暗培养3～7d，每天观察记录菌丝生长情况，当有不同颜色或形态的菌落生长出来以后，继续以菌丝顶端纯化法进行纯化操作直至各个菌落为单一纯培养为止，然后将纯化后的单一菌株分别编号记录，并使用试管斜面保藏法保藏于4℃冰箱中备用。

实施例2

产紫杉醇菌株的筛选

(1)菌株液体发酵

将所保藏的菌种活化，活化完成后，在洁净工作台中用无菌手术刀片切取0.5×0.5cm大小生长均匀的带培养基菌块儿，然后分别接入装有50mLPDA液体培养基的100mL三角瓶中，用封口膜封好，每个菌株做三个平行。接种完成后，将接种后的三角瓶放入恒温振荡器中发酵培养，培养条件为28℃、160r/min暗培养10～12d，培养过程中每天观察记录各菌株的生长情况。待瓶中发酵液较为粘稠，色泽加深，且菌丝球开始裂解之时终止发酵，将其取出用于下一步实验。

(2)发酵液中紫杉醇的提取

将发酵培养完成的发酵液置于-20℃冰箱中冷冻12h，然后置于35℃水浴锅中使其完全溶解，重复冻融操作三次。将冻融后的发酵液进行抽滤，滤液用等体积的二氯甲烷120r/min震荡萃取3次，分液，合并收集二氯甲烷相。过滤后的菌丝体用液氮进行冷冻研磨，研磨完成后用十倍体积的二氯甲烷120r/min震荡浸提3次，过滤，合并收集二氯甲烷相。然后将萃取滤液所得的二氯甲烷相和浸提菌丝体所得的二氯甲烷相合并，再用等体积的蒸馏水反提一次，分液，收集二氯甲烷相。然后将所得二氯甲烷相于旋转蒸发仪中40℃减压蒸干，用色谱级甲醇溶解蒸干后所得的固体残留物，定容至4mL，然后再用0.22μm的微孔过滤器进行过滤，除去大部分固体杂质后于-20℃冰箱中黑暗保存备用。

(3)发酵液中紫杉醇的检测

首先采用薄层层析(TLC)的方法对发酵提取液中是否含有紫杉醇进行初步定性的检测，然后对疑似含有紫杉醇的发酵提取液进行高效液相色谱法检测(HPLC)和液质联用色谱法检测(LC/MS/MS)，对发酵液中的紫杉醇进行精确定量和结构确认。

对于通过薄层色谱法检测后得出的疑似产紫杉醇的菌株，需要通过对其发酵提取物进行高效液相色谱法检测，来确认这些菌株是否能够产紫杉醇，并使用外标法通过紫杉醇标准曲线来计算以确定其产量，从而得到紫杉醇高产菌株。

标准曲线的建立：精确称取5mg紫杉醇标准品，将其溶解于5mL色谱级甲醇中，配制成1mg/mL的标准品溶液，然后逐级稀释得到2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、24μg/mL的梯度紫杉醇标准溶液，再按以下高效液相色谱法检测条件进行检测，得到紫杉醇的保留时间和梯度峰面积值，利用所得对应的紫杉醇标准品浓度和峰面积值建立标准曲线。

本次高效液相色谱法检测条件为：色谱柱为C18反向柱(4.5×150mm，5μm)，紫外检测波长为227nm，进样量为5μL，流动相为甲醇：水(V：V)＝68:32，流速为：1mL/min，柱温为室温。

本试验菌株发酵液中紫杉醇含量的计算公式如下：

$\mathrm{C\μg}/L=\frac{\mathrm{c\μg}/\mathrm{mL}\×4\mathrm{mL}}{\frac{50\mathrm{mL}}{1000\mathrm{mL}/L}}$

其中：C为菌株的紫杉醇产量，单位为μg/L；c为菌株发酵提取物样品高效液相色谱法检测所得产量，单位为μg/mL。

根据上一步高效液相色谱法检测结果，得到紫杉醇高产菌株，为了进一步确认紫杉醇高产菌株所产紫杉醇的结构，采用液质联用色谱法(LC/MS/MS)对高产菌株发酵提取物进行检测，检测条件如下：

本次质谱检测过程中，试验发现在紫杉醇的二级质谱检测中，紫杉醇加钠峰所产生质荷比为308.10的碎片子离子和紫杉醇加氢峰所产生质荷比为286.30的碎片子离子的检测灵敏度最高，故在本次检测中，选择m/z876.60/308.10和m/z854.70/286.30的两对子母离子对为特征检测对象，使用电喷雾(ESI)离子源，正离子多反应监测(MRM)扫描模式，气帘气流速(CUR)为20L/min，碰撞气流速(CAD)为5L/min，离子源电压(IS)为5000V，离子源温度(TEM)为500℃，离子源气流速1(GS1)为50L/min，离子源气流速2(GS2)为60L/min，去簇电压(DP)为37V，调焦电压(FP)为400V，入口电压(EP)为10V，碰撞电池出口电压(CXP)为4V。

实施例3

菌种的鉴定

观察PDA平板上高产菌株的菌落形态，并用光学显微镜和扫描电子显微镜观测菌株的菌丝和孢子形态，将所得高产菌株的形态学特征在魏景超老先生所著的《真菌鉴定手册》中比对，得到高产菌株的初步分类鉴定结果。然后再PCR扩增所得高产菌株的18SrDNA序列和ITS序列并进行分析，基本过程如下：

CTAB法提取菌株的总基因组DNA，以丝状真菌通用引物：

18SrDNA序列：

18S-NS1：5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'，

18S-NS8：5'-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3'。

ITS序列：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3',

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

扩增菌株的18SrDNA序列和ITS序列。并送交英潍捷基(上海)生物技术有限公司进行双向测序，测序完成后，将所得序列上传至GenBank数据库，并获得序列登录号(菌株18SrDNA序列登录号为KJ746594；ITS序列登录号为KJ716967)。而后将所得序列分别输入GenBank数据库中进行BLAST检索比对，并分别进行聚类分析，选择下载比对结果中同源性较高的序列，与所得的菌株18SrDNA序列和ITS序列分别形成数据集，再利用系统发育分析和统计分析软件MEGA5.2按照邻接法(Neighbor-Joiningmethod)进行聚类并构建系统发育树，经过自举法检验(重复1000次)，最后得到系统发育树。最后，综合菌株18SrDNA序列和ITS序列分析的结果，得出26^#菌株分子生物学分类鉴定的最终结果。

综合传统形态学分类鉴定结果和现代分子生物学分类鉴定结果，最终得出26^#菌株应该被分类鉴定为曲霉属烟曲霉变种。结合其分离纯化的来源，将其命名为：烟曲霉TMS-26。

Claims (2)

1.一株产紫杉醇的烟曲霉真菌(Aspergillusfumigatus)TMS-26，保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学)，地址:湖北省武汉市武昌珞珈山，保藏编号:CCTCCM2014258。

2.如权利要求1所述烟曲霉真菌TMS-26在生产紫杉醇中的应用。