CN105267982A

CN105267982A - 一种rhHER2抗体与MMAE偶联物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105267982A
Application number: CN201510817394.4A
Authority: CN
Inventors: 谢秋玲; 熊盛; 洪岸
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2016-01-27

Abstract

本发明公开了一种rhHER2抗体与MMAE偶联物及其制备方法与应用。本发明通过用三(2-羧乙基)膦盐酸盐还原rhHER2抗体，再将还原后的HER2抗体与MMAE的偶联，得到rhHER2抗体与MMAE偶联物。本发明制备方法简单，得到的rhHER2抗体与MMAE偶联物抗肿瘤效果强。

Description

一种rhHER2抗体与MMAE偶联物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种抗体-小分子化合物偶联物(ADC)，特别涉及一种rhHER2抗体与MMAE偶联物及其制备方法与应用。

背景技术

抗体药物偶联物(Antibody-DrugConjugate，ADC)是将具有特异性识别的单克隆抗体和高效杀伤力的小分子化合物通过一个具有连接功能的连接子连接在一起，形成的抗体药物复合物。既能避免单克隆抗体后期产生的耐药性导致的疗效不佳，又能克服小分子损伤正常组织引起的副作用等缺点。目前有三个ADC药物已经获得了美国FDA批准上市，一个是gemtuzumAbozoGamicin(商品名Mylotarg，麦罗塔)，是由重组人源化lgG4单克隆抗体(吉妥珠单抗)与细胞毒抗肿瘤抗生素刺孢霉素(calicheamicin)偶联而成。这个药物已于2010年被撤出市场；另一个药物是bren-tuximabvedotin(商品名Adecetris)，由CD30的单克隆抗体cAC10与MMAE相偶联所构成，用于治疗复发性霍奇金淋巴瘤(HL)和复发的系统性间变性大细胞淋巴瘤(sALCL)。另一个药物是人表皮生长因子受体2(HER2)抗体与美登素衍生物DM1偶联的药物trastuzumabemtansine(简称T-DM1，商品名Kadcyla)，用于治疗晚期转移性乳腺癌。

ADC药物由三部分组成：抗体、小分子化合物和连接子。抗HER2人源化单克隆抗体作为肿瘤治疗药物在临床试验和后续应用中均取得了确切的疗效，是目前最常用的ADC药物的抗体。MMAE是除TM1之外的另一种最常使用的ADC荷载的化合物，它是一种细胞有丝分裂的抑制剂，来源于尾海兔毒素家族。MMAE本身对肿瘤的抑制作用并不高，但令人惊奇的是，MMAE与单克隆抗体，如anti-CD30抗体cAC10连接构成ADC后则具有很好的疗效。连接子是ADC药物的重要组成部分，因为不同的连接子会影响到ADC药物的许多性质，如药物在体内的半衰期、药代动力学以及药物的旁观者效应(bystandereffect)。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种rhHER2抗体与MMAE偶联物的制备方法。

本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的rhHER2抗体与MMAE偶联物。

本发明的再一目的在于提供所述rhHER2抗体与MMAE偶联物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种rhHER2抗体与MMAE偶联物的制备方法，包括如下步骤：

(1)用三(2-羧乙基)膦盐酸盐还原rhHER2抗体；

(2)还原后的HER2抗体与MMAE的偶联，得到rhHER2抗体与MMAE偶联物。

步骤(1)中所述的还原的条件优选为：三(2-羧乙基)膦盐酸盐和rhHER2抗体按摩尔比1～4：1配比，于37℃还原30～120min；更优选为：三(2-羧乙基)膦盐酸盐和rhHER2抗体按摩尔比3：1配比，于37℃还原30min。

步骤(2)中所述的偶联的条件优选为：MMAE与还原后的HER2抗体按摩尔比1～2：1配比，于0～37℃反应30～120min；更优选为：MMAE与还原后的HER2抗体按摩尔比1.5～2：1配比，于0℃反应120min。

步骤(2)中所述的MMAE为含有连接子MC-Val-Cit-PAB的MMAE。

一种rhHER2抗体与MMAE偶联物，通过上述制备方法得到。

所述的rhHER2抗体与MMAE偶联物特别适用于制备抗肿瘤的药物。

所述的肿瘤优选为乳腺癌。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供的制备方法简单，得到的rhHER2抗体与MMAE偶联物抗肿瘤效果强。

附图说明

图1是抗体还原程度与还原剂量的关系图。

图2是还原程度与还原时间的关系图。

图3是PH-MMAE结构图。

图4是检测ADC的SDS-PAGE图；其中，泳道1和2为还原条件下的PH-MMAE和抗体(PH)，泳道M为标准蛋白，泳道3和4分别为非还原条件下的抗体(PH)和PH-MMAE。

图5是PH-MMAE和PH亲和力比较结果图。

图6是PH-MMAE对BT-474细胞生长的抑制结果图。

图7是PH-MMAE对SK-BR-3细胞生长的抑制结果图。

图8是PH-MMAE对MDA-MB-231细胞生长的抑制结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、抗体的还原

方法

1.1还原剂加入量优化

三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)简称为TCEP，是一种常用的高效还原剂，被广泛用于蛋白质二硫键的还原。本研究选用TCEP作为抗体的还原剂，通过优化还原剂与抗体的投料比，获得既不破坏抗体活性又能提高偶联物活性的最佳还原剂量。分别选用TCEP/rhHER2抗体(简称PH，已在“抗人表皮生长因子受体2人源化单克隆抗体在中国仓鼠卵巢细胞中的表达、纯化及活性测定.黄鹂等,中国药学杂志：2012,47(11)：884-888”公开，其氨基酸序列同罗氏曲妥珠)的摩尔比＝1、2、3、4，在37℃水浴条件下，水浴120min，测定各自样品中的巯基含量。

1.2还原时间优化

在摩尔比＝3，37℃水浴条件下，还原时间分别30min、60min、90min、120min，测定各自样品中巯基含量。

1.3还原产物鉴定(DTNB法)

Ellman试剂，又称DTNB，常用于定量检测游离巯基含量。含巯基化合物能与DTNB与反应，使DTNB的二硫键断裂，形成黄色化合物2-硝基-5-硫代苯甲酸(TNB)，其在412nm处有特定的吸收。利用已知含量的巯基化合物作为标准品，绘制标准曲线，将样品测量值与标准曲线对比即可定量样品中巯基的量。

①常温下，将L-cys(L-半胱氨酸)标准溶液用0.25MTris-HCl稀释成浓度分别为5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml。

②取10μl样品与190μlDTNB分析试剂混匀，静止10min。选用200μlDTNB分析试剂作为空白对照。

③使用酶标仪测定样品在412nm处吸光值。

结果：

1.1还原剂加入量优化

实验分别选取还原剂(TCEP)与rhHER2抗体的投料摩尔比为1、2、3、4，还原后运用DTNB法，测定还原样品中巯基含量，根据巯基含量判断抗体还原程度。根据还原剂量与抗体还原程度的关系(如图1所示)，在还原剂与抗体(PH)的投料摩尔比为3时，毒素分子偶联数N趋近于4。由于Hollander等研究发现，在体外实验中，抗体偶联毒素分子数越多，对细胞生长抑制作用就越好；但体内实验表明当偶联的毒素分子数为4时，效果反而比偶联上6-8个毒素分子的生物活性更高，因此建议将平均偶联分子数控制在4左右。因此本实验选择TCEP和PH的摩尔比为3时为最佳还原剂加入量。

1.2还原时间优化

为了验证还原程度与还原时间的关系，研究设计在最佳的还原剂加入量条件下TCEP/PH＝3，检测不同还原时间对抗体还原的影响。设置还原时间分别为30min、60min、90min、120min，运用DTNB法测定样品中巯基含量，同样选择用N＝PH-SH/PH来表征还原程度。结果如图2所示：在还原30min内，还原程度已经达到峰值，随着还原时间的增加，还原程度反而有所降低。这可能是因为巯基的性质非常活泼，容易被溶液或空气中的氧化物质氧化，随着暴露在空气中时间增长，造成巯基的氧化。据此，选择最优的还原时间为30min。

2、HER2抗体与MMAE的偶联

连接小分子毒素的连接子带有马来酰亚胺基团，该结构中的双键比较活泼，可与游离巯基进行加成反应，从而将小分子毒素与含有游离巯基的化合物偶联在一起,形成偶联物。

方法：

2.1偶联方法确立

①将抗体溶液均分成A、B、C3个组，每组3个平行，共计9支样品。按照TCEP/PH＝3，37℃水浴条件下还原30min，测定各组样品中的巯基含量。

②A组还原结束后放置常温下。

③B组还原结束后用巯基含量10倍的碘乙酰胺封闭巯基30min后添加带有连接子的小分子毒素MMAE，投料比(摩尔比)为MMAE/PH-SH＝2，常温下反应120min。

④C组还原结束后添加带有连接子的小分子毒素MMAE，投料比为MMAE/PH-SH＝2，常温下反应120min。

⑤测定各组巯基含量。

⑥因为小分子毒素在248nm处有特异性吸收，偶联结束后，测定残留毒素分子在248nm处的吸光值。

2.2偶联温度优化

取抗体PH(10mg/ml)溶液900μl，分装在9支EP管中，均分成A、B、C共计3组，每组3管，每管100μl。选用TCEP/PH＝3，37℃水浴条件下，还原时间30min，测定每管中巯基的含量。小分子毒素加入量为MMAE/PH-SH＝2，A、B、C组分别在0℃、常温25℃、37℃条件下偶联120min。

2.3MMAE加入量优化

选用已与连接子MC-Val-Cit-PAB连接好的MMAE(购买的成品)与PH偶联。取抗体PH(10mg/ml)溶液900μl，分装在9支EP管中，均分成A、B、C三组，每组3管，每管100μl。选用TCEP/PH＝3，37℃水浴条件下，还原时间30min，测定每管中巯基的含量。A、B、C三组分别选用MMAE/PH-SH＝1、2、3在0℃冰上偶联120min。

2.4偶联时间优化

取抗体PH(10mg/ml)溶液1200μl，分装在12支EP管中，均分成A、B、C、D四组，每组3管，每管100μl。选用TCEP/PH＝3，37℃水浴条件下，还原时间30min，测定每管中巯基的含量。小分子加入量为MMAE/PH-SH＝2，偶联条件为0℃冰上，A、B、C、D四组偶联时间分别为30min、60min、90min、120min。

通过优化的制备条件所制备的ADC，具体结构如图3所示，命名为PH-MMAE。

结果：

为了探索抗体偶联的方法与条件，本研究首先验证了偶联方法的可行性。将PH还原后，分成3组：A组不做任何处理，置于常温下；B组选择用10倍巯基含量的碘乙酰胺封闭后与MMAE偶联；C组与MMAE偶联；3组样品偶联前后的自由巯基含量如表1所示：、

表1

注：^*表示偶联后，残留小分子在248nm处吸光强弱

结果表明：A组中，抗体还原后暴露在空气中，巯基化学性质比较活泼，容易被空气等氧化，因此巯基含量与偶联前会有所降低，这与之前的实验结果是一致的；B组中，抗体还原后，用碘乙酰胺封闭抗体还原后游离的巯基。MMAE与抗体偶联后，通过检测残留MMAE的吸光值，与偶联初时添加的MMAE的吸光值接近，说明抗体的巯基被封闭后，MMAE不能与其偶联；C组中，抗体还原后，MMAE与之偶联，偶联后检测不到残留的巯基，残留MMAE吸光值明显降低。表明MMAE与巯基反应，已经偶联到抗体上。

2.1偶联温度优化

为了探讨在偶联过程中温度对于偶联物组成成分与偶联率的影响，设置在37℃、25℃、冰上0℃三个温度进行研究。实验结果表明：在三种温度下，PH-MMAE的偶联率均为60％左右，没有显著差异。理论上偶联后的样品为一混合物，含有未偶联上毒素分子的抗体和偶联上2、4、6、8个毒素分子的抗体，而偶联上4个毒素分子时活性较高。在0℃冰上制备的ADC中含有偶联上2-4个毒素分子的比例较37℃、25℃高，此外低温有助于保持抗体的生物活性，因此本研究选择偶联温度为0℃冰上。

2.2MMAE加入量优化

在前面的实验中，选择MMAE与抗体还原的巯基投料摩尔比为2时，偶联反应完全。为了优化生产工艺，节约生产成本，提高MMAE的利用率，对偶联过程中MMAE加入量进行优化。选择MMAE与抗体还原的巯基投料摩尔比为1、1.5和2三个梯度，均在优化的还原时间、还原剂加入量、偶联温度下进行。实验结果表明：当MMAE加入量与抗体还原巯基摩尔比为1:1时，偶联率仅为40％；摩尔比为1:1.5和1:2时，偶联率提高到60％左右。因此必须在MMAE过量的情况下才能获得较高偶联率的PH-MMAE。但1:1.5与1:2两组样品的偶联率无显著差异，因此选择1:1.5为适宜的MMAE与抗体还原巯基投料摩尔比。

2.3偶联时间优化

设置偶联时间梯度，分别为30min、60min、90min、120min、150min五个梯度。实验结果显示：偶联30min偶联率仅约为40％；偶联60min约为60％；90min可达到80％。之后偶联时间的延长偶联率变化较小，90min与120min偶联率相差3％，120min与150min相差仅约为0.6％，因此本研究选择最优的偶联时间为120min。

3、PH-MMAE的纯化与检测

3.1纯化方法

流动相：20mMPB，pH7.2；

保存液：20mMPB，0.05％叠氮化钠，pH7.2。

SuperdexG25脱盐柱；流速：1ml/min；进样体积：500ul，检测波长为280nm。

采用注射进样，在SuperdexG25脱盐柱上大分子蛋白质先流出，小分子物质流出时间长，因而样品中的小分子物质得以去除。

3.2HPLC检测

流动相A：1.5M(NH₄)₂SO₄，25mMKH₂PO₄，pH7.0；

流动相B：25mMKH₂PO₄与异丙醇(25％V/75％V)，pH7.0；

保存液：超纯水。

疏水层析柱(TSKgelButyl-NPR)；流速：0.8ml/min；进样体积：30μl；洗脱：2-12min线性洗脱，检测波长分别为280nm和248nm。

①打开Ultimate3000变色龙工作站，将流动相替换为流动相A，排尽管路中的气泡，正确装柱后，调节流速至0.8ml/min，压力上限设置119bar。

②流动相A平衡柱子30min，待基线平直，压力稳定后运行进样程序。

③程序运行结束后对所获色谱图作积分处理，根据面积归一划法，计算偶联物占整个样品的比例及组成分布。

④所有样品分析结束，用保存液保存色谱柱。

3.3SDS-PAGE检测

(1)配制分离胶和浓缩胶，非还原样品(8％分离胶)；还原处理样品(12％分离胶)，浓缩胶均为5％。

(2)样品处理，加入5×loadingBuffer(5倍浓度上样缓冲液)，100℃水浴处理5min，还原处理样品加热前加入5％β-巯基乙醇。

(3)按Bio-Rad蛋白电泳操作指南装配好电泳装置，灌注适量1倍电泳稀释液。

(4)微量进样器进样，上样量保持在2-10μg之间，以90v进行浓缩胶电泳，随后调节电压至120V跑完分离胶。

(5)经染色、脱色后，用Bio-Rad凝胶成像仪采集SDS-PAGE图像，利用image凝胶成像软件对电泳条带进行分析。

结果

3.1SDS-PAGE检测

PH偶联上MMAE后，分子量发生改变，在SDS-PAGE凝胶电泳条件下，条带出现的位置将会出现差异。图4表明：PH-MMAE在还原条件下被还原成2条带，分别对应抗体的重链和轻链，与抗体(PH)比较，PH-MMAE的重链和轻链位置略高，说明ADC的重链和轻链上均偶联上了MMAE。非还原条件下PH-MMAE形成多条条带，其中150KDa左右处的条带根据理论分子量推测为完整抗体(H2L2)；125Kda、100Kda、75Kda、50Kda和25KDa处的条带分别对应抗体的(H2L)、(H2)、(HL)、(H)和(L)。与还原电泳的结果一样，PH-MMAE在不同位置的条带都略高于抗体条带，说明分子量略大于抗体，表明这些片段均偶联上MMAE。

3.2HPLC检测

MMAE含有较多的疏水基团，在高盐条件下，疏水基团暴露，与疏水纯化柱上的介质结合，从而将带有偶联上MMAE的PH-MMAE分离出来。由于偶联的分子数不等，PH-MMAE中各组分的疏水性能会有所差异，根据这一特点将PH-MMAE中各组分分离开。制备的PH-MMAE为含有偶联不同数量MMAE的抗体混合物，其组成成分应为含有0-8个MMAE分子的抗体。HPLC检测PH-MMAE共有5个峰，而抗体(PH)仅有1个峰。表明毒素分子确实偶联到抗体上，但形成了小分子数量不同的不同组分。通过积分分析，在最适的还原条件和偶联条件下，偶联率达80％以上，与巯基检测方法得出的结果一致。

4、PH-MMAE抑制乳腺癌细胞的检测

方法：

4.1不同细胞株HER2表达量测定

为了检测不同的乳腺癌细胞株HER2的表达情况，选用抗HER2的荧光标记抗体与之结合，抗体与HER2结合后细胞会带上荧光。利用流式细胞仪检测细胞表面荧光强度，根据荧光的强弱判断HER2表达量的多少。

①用0.25％胰酶(含0.53mMEDTA)消化BT-474、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞株；

②PBS离心洗涤细胞两次，加入20μl的荧光标记流式抗体(抗HER2的阳性抗体)到10⁶个肿瘤细胞(0.5ml体积)充分混匀，20-25℃避光孵育20分钟，选用和不与HER2结合的阴性抗体作为阴性对照；

③用PBS洗涤2遍；

④加入0.5ml的PBS溶液(1％多聚甲醛)充分混匀，上流式细胞仪分析细胞表HER2的表达。

4.2抗体药物偶联物亲和力测定

①接种：取对数生长期的BT-474细胞计数，用含体积百分比10％胎牛血清的1640培养基重悬密度至1×10⁶细胞/ml，接种于96孔板，1×10⁴细胞/孔，细胞贴壁后，使其丰度为70-90％，细胞过夜生长。

②固定：次日弃掉培养基，200μl/孔加入0.25％戊二醛RT25min加0.1mol/L甘氨酸，200μl/孔，RT30min。

③封闭：用PBST洗涤液洗板3次，300μl/孔加入0.1％BSA封闭液封闭，RT60min。

④样品处理

用0.1％BSA样品稀释液将待检样品、阴性和阳性对照品从起始浓度5.0μg/ml，2倍比稀释5个浓度，终浓度为0.15625μg/ml。

用洗涤液将封闭好的96孔板洗板2次，每孔加入100μl稀释好的待检定样品、阴性和阳性对照品。空白对照仅加入等体积样品稀释液，每个样品设3个复孔。轻拍板子使样品混匀，室温放置60min。

⑤二抗：用洗涤液将加样的96孔板洗板2次，加入稀释比例为1:1000的三羊抗人IgG(H+L)/AP100ul/孔，室温放置60min。

⑥显色：PBS洗板3次，显色液200μl/孔，避光RT20min。

⑦终止：终止液100μl/孔。

⑧检测：酶标仪405nm处读数。

4.3竞争性抑制

竞争性抑制实验是为了验证抗体药物偶联物与抗体是否共同竞争HER2靶点，改造后的抗体药物偶联物是否仍具有抗体活性，同时也可以间接证明抗体药物偶联物具有靶向性。

取对数生长期的SK-BR-3细胞，弃去培养基，用PBS缓冲液清洗残留培养基，0.5ml胰酶消化，随后用4ml含10％胎牛血清的1640培养基终止消化，吹打均匀。

血球计数板法进行细胞计数，1000rpm离心5min，含10％胎牛血清的1640培养基重悬。10000个/孔接种于96孔板，37℃5％CO₂细胞贴壁生长过夜。

SK-BR-3乳腺癌细胞在100ng/mlPH-MMAE作用同时，分别添加1-5倍浓度的PH作用于细胞，37℃、体积分数为5％的CO₂条件下进行常规贴壁培养72h。

WST-8能被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为黄色甲臢染料，颜色的深浅与细胞的增殖成正比，而与细胞毒性成反比，其在450nm处有特异性吸收。其准确度和灵敏度远高于MTT法。

样品作用结束后，10ul/孔加入WST-8显色液，作用2小时后，酶标仪在450nm处读数。

4.4细胞毒性实验

为了检测抗体药物偶联物对HER2表达量不一样的肿瘤细胞生长抑制情况，同时对比两种不同连接子所偶联的抗体药物偶联物的生物活性差异，选用HER2高表达的BT-474、中表达的SK-BR-3、低表达的MDA-MB-231细胞作为研究对象，通过CCK法检测其对细胞生长的抑制作用。

取对数生长期的BT-474、MDA-MB-231、SK-BR-3细胞，弃去培养基，用PBS缓冲液清洗残留培养基，0.5ml胰酶消化，随后用4ml含10％胎牛血清的1640培养基终止消化，吹打均匀。血球计数板法进行细胞计数，1000rpm离心5min，含10％胎牛血清的1640培养基重悬。10000个/孔接种于96孔板，37℃5％CO₂细胞贴壁生长过夜。

取PH、PH-MMAE溶液，用含10％胎牛血清的1640培养基稀释。添加不同浓度的药物，作用于含有细胞的96孔板，37℃、体积分数为5％的CO₂条件下进行常规贴壁培养72h。

WST-8显色，450nm吸光值读数，方法同竞争性实验。

4.5细胞凋亡检测

(1)接种：取对数生长期的BT-474细胞计数，以2×10⁵细胞/孔接种到六孔板中，体积为1.8ml，细胞贴壁后，细胞过夜生长。

(2)给药：分别将PH、PH-MMAE用含10％胎牛血清的1640培养基稀释至终浓度为2.5ug/ml。将PH、PH-MMAE加入各孔，空白对照添加等体积的含10％胎牛血清的1640培养基，终体积为2ml。在37℃、体积分数为5％的CO2条件下进行常规贴壁培养24h、48h、72h。

(3)细胞处理

①取给药后的细胞，收集上清，用PBS缓冲液清洗残留培养基，用不含EDTA的胰酶消化细胞，收集消化下来的细胞。

②1000rpm离心3min。

③弃上清，用PBS缓冲液重悬细胞，1000rpm离心3min，重复两次。

细胞计数，用AnnexinVBindingSolution调整细胞浓度为1×10⁶细胞/ml。

④从1×10⁶细胞/ml的细胞悬液中取100μl加入到EP管中，每管分别添加5μl凋亡早期染料AnnexinV-FITC和凋亡晚期染料PIsolution。

⑤室温下避光孵育15min。

⑥孵育结束后每管添加300μlAnnexinVBindingSolution终止染色。

(4)流式细胞仪检测

①开机，连接系统，用清洗液清洗管道，然后用ddH₂O冲洗管道。

②选择模板，调节电压和电流。

③进样检测。

④软件分析。

4.6细胞周期检测

(2)给药：分别将PH、PH-MMAE用含10％胎牛血清的1640培养基稀释至终浓度为2.5μg/ml。将PH、PH-MMAE加入各孔，空白对照添加等体积的含10％胎牛血清的1640培养基，终体积为2ml。在37℃、体积分数为5％的CO₂条件下进行常规贴壁培养24h、48h、72h。

(3)细胞处理

②1000rpm离心3min。

④细胞计数，用PBS缓冲液调整细胞浓度为1×10⁶细胞/ml。

⑤从1×10⁶细胞/ml的细胞悬液中取300μl加入到EP管中，每管添加700μl-20℃预冷的无水乙醇，在4℃冰箱过夜固定。

⑥1000rpm离心3min。

⑦弃上清，用PBS缓冲液重悬细胞，1000rpm离心3min，重复两次。

⑧每管分别添加100μl细胞周期检测试剂盒。

⑨室温下避光孵育15min。

(4)流式细胞仪检测

①开机，连接系统，用清洗液清洗管道，然后用ddH2O冲洗管道。

②选择模板，调节电压和电流。

③进样检测。

④软件分析。

结果：

4.1乳腺癌细胞HER2表达量测定

人类表皮生长因子受体2(HER2)在肿瘤细胞中存在过表达，但在不同的肿瘤细胞中表达量不一样。检测几种常见的乳腺癌细胞中HER2的表达情况。结果如表2所示，带有荧光标记的抗HER2能与细胞表面的HER2受体特异性结合。细胞表面表达HER2越多，结合上的抗体越多，抗体越多荧光强度也就越强。因此荧光强度与HER2表达量成正比，即荧光强度越强HER2表达越高。乳腺癌细胞BT-474、SK-BR-3、MDA-MB-231细胞株，均有一定量的HER2表达，但表达量有较大差异，其中BT-474为HER2高表达细胞株，SK-BR-3为HER2中表达细胞株，MDA-MB-231为HER2低表达细胞株。

表2常见细胞系中HER2荧光强度

4.2与HER2亲和力检测

在PH-MMAE制备过程中，抗体被还原，抗体的分子结构发生了一定的改变，为了验证这些改变是否会对抗体与与HER2受体结合能力产生影响，我们检测了其与BT-474细胞株的亲和能力，选用PH作为阳性对照，IgG1kappa作为阴性对照。结果表明(图5)：PH-MMAE对HER2阳性细胞表现出了较高的亲和力，与PH没有显著性差异，表明在最优条件下制备的PH-MMAE对HER2的结合能力未收到明显影响。

4.3竞争性抑制

抗体药物偶联物(ADC)既具有抗体的活性又具有毒素分子活性，当过量加入非偶联的抗体(PH)，将靶点封闭时，ADC的活性受到抑制，从而可以表明ADC的作用位点是与抗体相一致，也间接证明ADC的靶向性。实验结果表明：随着PH浓度的不断加大，PH对PH-MMAE的竞争越来越明显。当PH浓度为PH-MMAE浓度5倍时，PH-MMAE活性被抑制达30％。因为大量的抗体分子将HER2靶点封闭，PH-MMAE无法结合到靶点上去，无法进入细胞，从而活性受到抑制。

4.4细胞毒性实验

为了获得PH-MMAE对乳腺癌细胞株的生长抑制作用效果，选用HER2高表达细胞株BT-474、中表达细胞株SK-BR-3、低表达细胞株MDA-MB-231为作用对象，并与裸抗PH进行比较。如图6～8所示，PH-MMAE对HER2高、中、低表达的细胞均有较明显的生长抑制作用。对于HER2高表达的BT-474细胞，抗体(PH)和PH-MMAE均表现出较高的生物活性，但PH-MMAE的IC50小于PH，生长抑制效果也较PH明显。当相同剂量的PH-MMAE作用于HER2中低表达SK-BR-3和MDA-MB-231时，其抑制细胞生长的的能力较PH提高了5倍以上。

4.5PH-MMAE诱导BT-474细胞凋亡

为了解PH-MMAE诱导乳腺癌阳性细胞BT-474凋亡情况，给药24h、48h、72h后分别测定PH-MMAE和PH诱导细胞凋亡的效率，并比较两者间的差异。AnnexinV/PI双染结果显示：PH-MMAE和PH在24h内诱导细胞凋亡的差异不太明显，48h后诱导细胞凋亡的能力增强，72h后PH-MMAE诱导细胞凋亡的效率约为40％，PH仅为20％左右，PH-MMAE诱导细胞凋亡的能力较PH提高了2倍。随着PH-MMAE作用细胞时间的延长，细胞凋亡的数量增加。

4.6PH-MMAE对细胞周期的影响

为了解PH-MMAE对乳腺癌阳性细胞BT-474细胞周期的影响，给药24h、48h、72h后别测定PH-MMAE和PH处理下细胞周期中各组分的含量，并比较两者间的差异。实验结果表明：PH-MMAE和PH作用于BT-474细胞均能促进处于细胞周期中G2期的细胞比例增。在PH-MMAE和PH作用BT-474细胞24h后，PH-MMAE处理组G2期细胞数量较PH组有所增加；48h后，PH-MMAE处理组处于G2期的细胞数量增加明显；72h后，PH-MMAE处理组中G2期的细胞比例约为21％，PH组仅约为9％，前者约为后者的2.5倍。PH-MMAE和PH作用细胞72h后，细胞在细胞周期的分布表明：PH-MMAE和PH均能让处于G1期的细胞数量降低，S期细胞数量趋于稳定，G2期细胞数量大幅增加，G2期细胞的细胞比例为19.28％，是为PH处理后的2倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种rhHER2抗体与MMAE偶联物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)用三(2-羧乙基)膦盐酸盐还原rhHER2抗体；

2.根据权利要求1所述rhHER2抗体与MMAE偶联物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的还原的条件为：三(2-羧乙基)膦盐酸盐和rhHER2抗体按摩尔比1～4：1配比，于37℃还原30～120min。

3.根据权利要求2所述rhHER2抗体与MMAE偶联物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的还原的条件为：三(2-羧乙基)膦盐酸盐和rhHER2抗体按摩尔比3：1配比，于37℃还原30min。

4.根据权利要求1所述rhHER2抗体与MMAE偶联物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的偶联的条件为：MMAE与还原后的HER2抗体按摩尔比1～2：1配比，于0～37℃反应30～120min。

5.根据权利要求2所述rhHER2抗体与MMAE偶联物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的偶联的条件为：MMAE与还原后的HER2抗体按摩尔比1.5～2：1配比，于0℃反应120min。

6.根据权利要求1～5任一项所述rhHER2抗体与MMAE偶联物的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的MMAE为含有连接子MC-Val-Cit-PAB的MMAE。

7.一种rhHER2抗体与MMAE偶联物，其特征在于：通过权利要求1～6任一项所述的制备方法得到。

8.权利要求7所述的rhHER2抗体与MMAE偶联物在制备抗肿瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的rhHER2抗体与MMAE偶联物在制备抗肿瘤的药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为乳腺癌。