CN105256029A - Chst6基因在制备检测斑块状角膜营养不良制品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种CHST6基因在制备检测斑块状角膜营养不良诊断制品中的应用，本发明提供了CHST6基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行斑块状角膜营养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行CHST6基因突变位点的快速检测。

Description

CHST6基因在制备检测斑块状角膜营养不良制品中的应用
技术领域
本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种N-乙酰氨基葡萄糖-6-转磺酶(CHST6)在制备检测斑块状角膜营养不良基因诊断制品中的应用。
发明背景
斑状角膜营养不良(macularcornealdystrophy,MCD)是一种常染色体隐性遗传病，以双侧角膜基质进行性雾状混浊及中央角膜变薄为特征，在临床上较为少见，但发病较严重，早期即明显影响视力。患者通常在10岁以前就双眼较对称发病，视力下降，约在20岁时病情已比较明显，有畏光、流泪及视力下降的症状，角膜病变初期表现为角膜中央浅基质层的细小云雾状浑浊，有的为半透明环状。以后这些细小浑浊逐渐融合为多形、不规则的灰白样，随病情进展向角膜周边延伸和角膜深基质层发展。当角膜混浊的区域向表面扩展形成凸出角膜表面呈结节状，造成角膜不规则散光，而当混浊区域向弹力层发展时，裂隙灯下可见角膜后有大量的内皮赘疣。与其他的角膜营养不良不同，斑块状角膜营养不良在病程发展至晚期，均可出现角膜变薄。
当视力下降明显、影响工作与生活时，可行板层或穿透性角膜移植术进行治疗，但术后都存在复发的可能。根据ELISA法检查病人血清中硫酸角质素(keratansulfate,KS)抗原浓度的高低及对角膜组织的免疫组化检查，将斑状角膜营养不良分为三型，I型患者的血清和角膜中没有KS的免疫反应，ⅠA型患者的血清中没有KS的免疫反应，但角膜中存在KS的免疫反应，而II患者血清和角膜中都存在KS的免疫反应。
斑块状角膜营养不良发病较早，病情逐渐进展，常双眼发病，对视力影响严重，常合并角膜上皮糜烂而有刺激症状，除了角膜移植手术，目前尚无更好的治疗方法，而手术供体匮乏，术后并发症多并且容易复发，加之手术费用昂贵，给患者家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。建立斑块状角膜营养不良的相关的基因突变检测系统，并应用于临床工作和优生优育，有助于遗传性斑块状角膜营养不良的基因诊断和相应的基因治疗，有助于突变基因携带者的检出，有助于通过产前检查降低疾病的发生率，有助于有效地控制这种疾病的发生。
发明内容
本发明的目的是提供一种CHST6基因在制备检测斑块状角膜营养不良诊断制品中的应用，从而弥补现有技术的不足。
申请人从一个5代呈常染色体隐性遗传的斑块状角膜营养不良家系中，对该家系全部成员进行了CHST6基因的测序，找到了该家系的致病基因CHST6存在遗传上的致病突变，从而促成了本发明。
本发明首先提供CHST6基因新的用途，是在制备用于检测斑块状角膜营养不良诊断制品中的应用；
上述的诊断制品，作为实施例的优选，是检测斑块状角膜营养不良的引物或探针。
上述的引物对，其引物信息如下：
CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAATSEQIDNO:1
CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCCSEQIDNO:2
CHST6-1F:GCCCCTAACCGCTGCGCTCTCSEQIDNO:3
CHST6-1R:GGCTTGCACACGGCCTCGCTSEQIDNO:4
CHST6-2F:GACGTGTTTGATGCCTATCTGCCTTGSEQIDNO:5
CHST6-2R:TCCGTGGGTGATGTTATGGATSEQIDNO:6
本发明还提供一种用于检测斑块状角膜营养不良的试剂盒，包含有上述的引物对中的两种或几种。
本发明还提供一种与斑块状角膜营养不良疾病相关的SNP位点，为CHST6基因编码区域由起始密码子起第463-464位碱基。
其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：
CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAATSEQIDNO:1
CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCCSEQIDNO:2
CHST6-2F:GACGTGTTTGATGCCTATCTGCCTTGSEQIDNO:5
CHST6-2R:TCCGTGGGTGATGTTATGGATSEQIDNO:6。
本发明还提供另外一种与斑块状角膜营养不良疾病相关的SNP位点为CHST6基因编码区域由起始密码子起第250-272位碱基。
其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：
CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAATSEQIDNO:1
CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCCSEQIDNO:2
CHST6-1F:GCCCCTAACCGCTGCGCTCTCSEQIDNO:3
CHST6-1R:GGCTTGCACACGGCCTCGCTSEQIDNO:4。
本发明提供了CHST6基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行斑块状角膜营养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行CHST6基因突变位点的快速检测。
附图说明
图1：实施例1的斑块状角膜营养不良家系内患者CHST6测序图，其中A：参考序列；B：患者。该家系中三名患者CHST6基因编码区域由起始密码子起第463-464位碱基发生了纯合突变，其碱基CG发生缺失。
图2：实施例2的斑块状角膜营养不良家系内患者CHST6测序图，其中A：参考序列；B：正常人。该家系中三名患者CHST6基因编码区域由起始密码子起第250-272位碱基发生了纯合突变，其碱基AGCGCCGCAACGCTGCACATGGC发生缺失。
具体实施方式
申请人在一个斑块状角膜营养不良家系中发现CHST6基因的突变位点，并证实该基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本发明。
CHST6基因位于染色体16q22，可转录成大约1188bp的mRNA(NCBI登录号为NM_021615.4)，直接翻译形成395个氨基酸组成的蛋白质。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：从斑块状角膜营养不良家系中筛选CHST6基因的突变位点
1、提取外周血基因组DNA：
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取第一个家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。
加入180μLTE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。
加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
加入l/10体积3mol/L、pH5.2醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。
向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μLTE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。
对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。
2、直接测序法寻找该家系内患者CHST6基因的突变
PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：
(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，57℃40se，72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。
(2)反应体系：(TAKARALATaqpolymerase)
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与该CHST6引物的扩增反应。
PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAAT,CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCC,CHST6-2F:GACGTGTTTGATGCCTATCTGCCTTG,CHST6-2R:TCCGTGGGTGATGTTATGGAT，在该家系中八名患者CHST6基因编码区域由起始密码子起第463-464位碱基发生了纯合突变，其碱基CG发生缺失(图1)。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。该突变为一新生突变。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，该突变导致了CHST6蛋白长度截短，从而引起了患者斑块状角膜营养不良的发生。而在200例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
通过上述的分析，证明CHST6基因可以用来检测患者是否具有潜在患斑块状角膜营养不良的危险。通过将检测者的CHST6基因的各外显子片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。
根据CHST6的基因组序列设计扩增其各外显子的引物对，其正反引物的序列信息如下：
CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAAT
CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCC
CHST6-1F:GCCCCTAACCGCTGCGCTCTC
CHST6-1R:GGCTTGCACACGGCCTCGCT
CHST6-2F:GACGTGTTTGATGCCTATCTGCCTTG
CHST6-2R:TCCGTGGGTGATGTTATGGAT；
分别应用上述的每一对引物进行CHST6基因的检测。
实施例2：从斑块状角膜营养不良家系中筛选CHST6基因的突变位点
收集斑块状角膜营养不良家系：在山东省眼科研究所暨青岛眼科医院收集诊断明确的斑块状角膜营养不良的家系。
提取外周血基因组DNA：
分别抽取斑块状角膜营养不良家系中所有成员的外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，应用实施例1中说述的常规酚氯仿法从家系内各成员外周血中提取基因组DNA。
PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：
(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，57℃40se,72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。
(2)反应体系：(TAKARALATaqpolymerase)
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板分别与CHST6基因的4对引物的扩增反应。
PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对该家系三名成员的基因组DNA模板分别与CHST6基因的4对引物的扩增产物进行测序，其中用引物对CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAAT,CHST6-R:
TGTCTTAAGGCCACATTTCC,CHST6-1F:GCCCCTAACCGCTGCGCTCTC,CHST6-1R:GGCTTGCACACGGCCTCGCT，在患者中检测到了CHST6基因的纯合突变：CHST6基因编码区域由起始密码子起第250-272位碱基发生了纯合突变，其碱基AGCGCCGCAACGCTGCACATGGC发生缺失(图2)，该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，该突变导致了CHST6蛋白长度截短，从而引起了患者斑块状角膜营养不良的发生。而在200例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
上述的检测结果表明CHST6基因的突变位点能够用于检测斑块状角膜营养不良。

Claims (8)

1.一种CHST6基因的应用，其特征在于，所述的应用是CHST6基因在制备用于检测斑块状角膜营养不良诊断制品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断制品为PCR检测引物或探针。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的引物的序列信息如下：一种用于检测斑块状角膜营养不良的引物对，所述的引物对的信息如下：
CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAATSEQIDNO:1、
CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCCSEQIDNO:2、
CHST6-1F:GCCCCTAACCGCTGCGCTCTCSEQIDNO:3、
CHST6-1R:GGCTTGCACACGGCCTCGCTSEQIDNO:4、
CHST6-2F:GACGTGTTTGATGCCTATCTGCCTTGSEQIDNO:5、
CHST6-2R:TCCGTGGGTGATGTTATGGATSEQIDNO:6。
4.一种与斑块状角膜营养不良疾病相关的SNP位点，所述的SNP位点为CHST6基因编码区域由起始密码子起第463-464位，其碱基CG发生缺失。
5.一种检测权利要求4所述的SNP位点的方法，其特征在于，是用核苷酸序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的引物检测的。
6.一种检测权利要求4所述的SNP位点的方法，其特征在于，是用核苷酸序列为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的引物检测的。
7.一种用于检测权利要求4所述的SNP位点的引物对，其特征在于，所述的引物对的核苷酸序列为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。
8.一种用于检测权利要求4所述的SNP位点的引物对，其特征在于，所述的引物对的核苷酸序列为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。
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WO2009100159A2 (en) * 2008-02-04 2009-08-13 Bipar Sciences, Inc. Methods of diagnosing and treating parp-mediated diseases

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