CN105255875B - 一种用于hla基因分型的试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于HLA基因分型的试剂盒和一种HLA基因分型的方法，所述试剂盒包括用于扩增HLA‑B基因的2号外显子和3号外显子的引物，和用于扩增HLA‑B基因的4号外显子的引物；所述用于扩增HLA‑B基因的2号外显子和3号外显子的引物包括由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列组成的扩增引物对；所述用于扩增HLA‑B基因的4号外显子的引物包括由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物序列组成的扩增引物对。采用本发明的分型方法和试剂盒能够使分型流程更加简单，在降低成本的同时增加分型分辨率和准确率，从而进一步应用到科研和临床工作中去。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒和方法，具体涉及一种用于HLA基因分型的试剂盒和方法。
背景技术
现已有PCR扩增联合Sanger测序对HLA基因进行分型的方法。以HLA-B基因分型为例，该方法的实现方案：首先，设计特异性引物扩增HLA-B基因的2号和3号外显子，为了避免引物的偏倚性，一般会设计多对引物。其次利用sanger测序技术对PCR产物进行测序，获得含有双等位基因信息的测序结果。再者通过公司专用的软件(技术参数保密)对数据进行分析，从而获取样本的HLA-B分型结果，分辨率4-6位不等。
上述技术的缺点有下面几点(以HLA-B基因分型为例)：1、PCR特异性引物方面：现有的引物设计比较繁杂，需要多对引物进行扩增单一外显子，成本高，增加实验的复杂度。2、分型准确率方面：只依赖2、3号外显子序列信息进行分型，分型结果分辨率低。3.数据分析：公司的分型软件技术参数保密，不能够对其采取的策略进行评价和优化。
导致上述缺点的原因：1、设计多对引物进行PCR扩增目的片段，是因为设计者未充分利用1000genome和UCSC网站上snp数据库的信息，设计无偏倚性扩增的引物。2、只依赖2、3号外显子序列信息进行分型，是因为设计者没有考虑周全，忽视了HLA-B基因其他外显子也会影响分型结果。3、数据分析技术参数保密，是因为公司需要通过该软件进行营利运转，我们无法获取技术参数，因此也没有办法去评价。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于HLA基因分型的试剂盒，本发明还提供了一种HLA基因分型的方法。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于HLA基因分型的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的引物，和用于扩增HLA-B基因的4号外显子的引物；
所述用于扩增HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的引物包括由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列组成的扩增引物对；
所述用于扩增HLA-B基因的4号外显子的引物包括由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物序列组成的扩增引物对。
本发明还提供了一种HLA基因分型的方法，所述方法包括：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)分别采用由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列组成的扩增引物对和由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物序列组成的扩增引物对，对待测样本DNA进行PCR扩增，得到含有HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的第一扩增片段和含有HLA-B基因的4号外显子的第二扩增片段，然后分别纯化含有HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的第一扩增片段和含有HLA-B基因的4号外显子的第二扩增片段；
(3)将步骤(2)纯化后的第一扩增片段和第二扩增片段分别进行测序；
(4)将步骤(3)中的测序结果与数据库中HLA基因的外显子标准序列进行对比，确定HLA基因的型别。
优选地，所述步骤(4)中数据库为国际组织IMGT数据库。
优选地，如果比对后出现模棱两可的分型结果，则将步骤(2)中的第一扩增片段和第二扩增片段分别进行T-A克隆，然后进行测序比对，确定HLA基因的型别。
优选地，如果比对后出现模棱两可的分型结果，则针对步骤(2)中的第一扩增片段和第二扩增片段分别设计allele特异性的引物进行区分，然后进行扩增后测序比对，确定HLA基因的型别。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种用于HLA基因分型的试剂盒和一种HLA基因分型的方法，与现有技术相比，其优势：
(1)PCR特异性引物方面：现有的引物设计比较繁杂，需要多对引物进行扩增单一外显子，成本高。针对每一个外显子本发明最多只需一对引物就可以成功扩增出无偏倚性的目的片段。
(2)分型准确率方面：本发明联合2、3、4外显子(必要时加入1和5号外显子)的等位基因信息进行分型，与现有的只依赖2、3号外显子进行分析，分型更加准确，分辨率更高。
(3)数据分析：本发明采用脚本从sanger测序结果中获取等位基因信息，联合使用2、3、4号外显子等位基因信息和IMGT/HLA数据库中4007条参考序列(最新版本号3.22.0)两两组合后的数据信息，将两者进行比对，找到对应样本的HLA-B传统分型结果，分辨率有4-8位不等。
(4)后期处理：对一些依然模棱两可的分型结果，进一步通过T-A克隆或者设计等位基因特异性引物加以区分，从而保证分型结果的准确性和高分辨率。
采用本发明的分型方法和试剂盒能够使分型流程更加简单，在降低成本的同时增加分型分辨率和准确率，从而进一步应用到科研和临床工作中去。
附图说明
图1为本发明所述实施例1中分型结果；
图2为本发明所述实施例2中扩增HLA-B的2、3、4号外显子的电泳图；
图3为本发明所述实施例2中的测序峰图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例以HLA-B基因分型为例，进行HLA基因分型。
一、样本DNA的准备：
抽取2ml全血，用试剂盒QIAamp DNA Mini Kit Cat.No.51304抽提DNA，A260/280＝1.7～2.0。
二、扩增HLA-B的2、3、4号外显子：
1、扩增2号和3号外显子的引物序列：
F1:CGGGAGGGAAATGGCCTCTG(SEQ ID NO.1)
R1:TTCAACGGAGGGCGACATTCTA(SEQ ID NO.2)
2、扩增4号外显子的引物序列：
F2:TGTCCTGTCCATTCTCAGGC(SEQ ID NO.3)
R2:TTCCCTGAGAAGAGATATGACCC(SEQ ID NO.4)
3、PCR反应体系和条件：
(1)反应体系：使用高保真DNA聚合酶GXL DNA PolymeraseCat.No.R050A；如下表1：
表1反应体系
| 试剂 | 使用量 | 终浓度 |
| 5xPrimeSTAR GXL缓冲液 | 4μL | 1x |
| dNTP Mixture(2.5mM) | 1.6μL | 200μM |
| 正向引物 | 6pmol | 0.3μM |
| 反向引物 | 6pmol | 0.3μM |
| 模板 | 100ng | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | 0.8μL | 1U/20μL |
| 灭菌蒸馏水 | 补足到20μL |
(2)反应条件：
4、进行DNA电泳质检目的条带(片段大小符合预期、条带单一、亮度适中)
片段大小：扩增exon2和exon3的片段1长度为1018bp
扩增exon4的片段2长度为409bp
三、sanger测序：对获得的两个PCR产物片段进行sanger测序。片段1双向测序，分别获得exon2和exon3的序列信息；片段2正向测序，获得exon4的序列信息。公司会返还ab1格式的峰图文件。
四、应用HLA专业软件进行分型：
(一)将ab1文件转换为含有简并形式的fasta序列文件：
将exon2、3、4外显子的序列从测序结果中截取出来，以下面的格式合并2、3、4号外显子的序列(/代表双峰)：
>exon2
GCTCCCACTCCATGAGGTATTTCC/TACACCG/TCCA/GTGTCCCGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCG/ACC/AGTGGGCTACGTGGACGACACC/GCT/AGTTCGTGAGGTTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGG/AA/GA/TGGA/CGCCC/GCGGGCGCCG/ATGGATAGAGCAGGAGGGGCCGGAGTATTGGGACCGGA/GAG/CACACAGATCTG/CCAAGA/GCCAAG/CG/ACACAGACTG/TACCGAGAGAGCCTGCGGAC/ACCTGCT/GCC/GGCTACTACAACCAGAGCGAGGCCG
>exon3
GGTCTCACAT/CCC/ATCCAGAA/GG/TATGTATGGCTGCGACGTGGGGCCGGACGGGCGCCTCCTCCGCGGGTAT/CG/CACCAGG/TC/ACGCCTACGACGGCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAGGACCTGAGCTCCTGGACCGCG/CGCGGACACGGCGGCTCAGATCACCCAGCGCAAGTGGGAGGCGGCCCGTGAGGCGGAGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCC/GA/TGTGCGTGGAGTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGACGCTGCAGCGCGCGG
>exon4
ACCCCCCAAAGACACAC/TGTGACCCACCACCCCATCTCTGACCATGAGGCCACCCTGAGGTGCTGGGCCCTGGGCTTCTACCCTGG/CGGAGATCACACTGACCTGGCAGCGGGATGGCGAGGACCAAACTCAGGACACC/TGAGCTTGTGGAGACCAGACCAGCAGGAGATAGAACCTTCCAGAAGTGGGCAGCTGTGGTGGTGCCTTCTGGAGAAGAGCAGAGATACACATGCCATGTACAGCATGAGGGGCTGCCGAAGCCCCTCACCCTGAGATGGG
(二)、将第(一)步中获得的序列与HLA-B数据库进行两两比对，从数据库中获取与目的序列一样的候选序列，再将候选序列两两组合获取跟目的序列完全一致的组合。该组合就是我们要的分型结果。
1.如果可以成功分型，结果会以图1的形式导出。
2.输出分型结果：上图结果应为B*27:04:01；B*40:01。
五、结果分析：
1、如果结果文件为空，说明我们一开始输入的简并形式序列有错误(原因可能是测序质量不好，有些双峰不能清晰地辨别)，这种情况需要返回最初去修改含有简并形式的fasta序列文件。
2、如果获得的分型中含有ambiguity，我们可以做T-A克隆或者设计allele特异性的引物进行区分。
(1)T-A克隆：将ambiguity的序列提取出来，找到区分ambiguity的位点，如果是在2和3号外显子区，将片段1与PMD18T-vector连接、转化、涂板、挑单克隆测序；如果在4号外显子区，将片段2与PMD18T-vector连接、转化、涂板、挑单克隆测序。对于单个个体来说，染色体是成对出现的，sanger测序产生的峰图也只是反映了两条染色体的序列组合情况，经过挑单克隆测序，我们可以获取单条染色体的序列信息，从而找到区分ambiguity的位点，获得更精确的分型。
(2)设计allele特异性的引物：对于2、3、4号外显子序列完全一样的ambiguity分型，我们需要将ambiguity序列提取出来，在其他外显子区查找区分ambiguity的位点，确定位点位置后，针对该位点设计特异性的引物，进行PCR和DNA电泳，分析特异性引物是否可以扩增出目的条带。举个简单的例子，如果ambiguity分型结果为分型1或者分型2，那么有目的条带为分型1，没有目的条带则为分型2。
本发明所述T-A克隆的详细步骤：
一、扩增可以区分ambiguity的片段(3号外显子为例)
选用LA taq货号：TaKaRa DRR002A(可以加polyA尾，便于后续的与T载体连接)
反应体系：
反应条件：
二、纯化PCR产物：
切胶回收试剂盒：OMEGA Gel Extraction Kit D2500-02
步骤如下：
1、1％agarose gel DNA电泳后，在紫外灯下将目的条带切下，称重放入EP管中备用(小于200mg最佳)。
2、加入1倍体积(1mg对应1μL)的XP2，60度水浴7min，每2-3min震荡混匀。
3、将2中液体转移至分离柱中，13000g离心1min，弃液。
4、向柱中加入300μL的XP2，13000g离心1min，弃液。
5、向柱中加入700μL SPW washbuffer，13000g离心1min，弃液。
6、13000g空离2min，将柱子放在1.5ml的EP管上。
7、向柱中加入15-30μL的elution buffer，静置2min，13000g离心1min。
8、Nanodrop检测DNA浓度和质量，OD值1.8-2.0。
三、与T载体连接
T载体为PMD-18-T vector，货号：TaKaRa D101A
连接体系为
16℃，30min
计算公式：ng＝nmols*660*插入片段bp数
载体50ng约0.03pmol,插入片段一般为载体的2～10倍。
四、转化、涂板
1、将大肠杆菌DH5α冰上解冻备用，备42℃水浴。
2、将5ul的连接产物加入到50ul的DH5α中混匀，冰上静置30min。
3、将2中的混合物放入42℃水浴锅中热激90s，立即放冰上2min。
4、向3中的混合物中加1mL的LB，37℃摇床摇1h。
5、将摇好的菌液4000rpm 2min离心，留取400ul上清，其他弃掉，吹打混匀后取200ul涂板。
6、放37℃温箱过夜，约12h。
五、一个菌板对应一个样本，将每个做好克隆的菌板挑3个克隆送公司单向测序。
实施例2
本实施例通过实施例1中所述方法对16例样本进行HLA-B传统分型，分型结果跟博奥公司的分型结果完全一致。
以针对24号样本进行HLA-B基因分型为例：
一、样本DNA的制备：提取DNA浓度45ng/μL，约50μL，260/280＝1.88
二、扩增HLA-B的2、3、4号外显子：按上述条件PCR后，电泳图如图2所示，该图列出了24、25、26、27号四个样本PCR产物的电泳结果，与目的条带大小一致。
三、送sanger测序。获得含有双峰的峰图，如图3所示。
四、应用我们的自写软件对HLA-B进行分型：
获得的候选序列有下面几种组合：
分型1B*58:41；B*40:49
分型2B*58:61；B*40:87:02
分型3B*58:01:01；B*40:01
五、进行T-A克隆：将ambiguity的序列提取出来，找到区分ambiguity的位点，该位点存在于2和3号外显子区，因此扩增2号和3号外显子与PMD18T-vector连接、转化、涂板、挑单克隆测序。
六、确定分型：根据T-A克隆的结果我们确定该样本的正确分型结果是：分型3B*58:01:01；B*40:01，与公司分型结果一致。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种用于HLA基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的引物，和用于扩增HLA-B基因的4号外显子的引物；
所述用于扩增HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的引物包括由SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的引物序列组成的扩增引物对；
所述用于扩增HLA-B基因的4号外显子的引物包括由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物序列组成的扩增引物对。
2.一种HLA基因分型的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提取待测样本的DNA；
(2)分别采用由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列组成的扩增引物对和由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物序列组成的扩增引物对，对待测样本DNA进行PCR扩增，得到含有HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的第一扩增片段和含有HLA-B基因的4号外显子的第二扩增片段，然后分别纯化含有HLA-B基因的2号外显子和3号外显子的第一扩增片段和含有HLA-B基因的4号外显子的第二扩增片段；
(3)将步骤(2)纯化后的第一扩增片段和第二扩增片段分别进行测序；
(4)将步骤(3)中的测序结果与数据库中HLA基因的外显子标准序列进行对比，确定HLA基因的型别。
3.根据权利要求2所述的HLA基因分型的方法，其特征在于，所述步骤(4)中数据库为国际组织IMGT数据库。
4.根据权利要求2所述的HLA基因分型的方法，其特征在于，如果比对后出现模棱两可的分型结果，则将步骤(2)中的第一扩增片段和第二扩增片段分别进行T-A克隆，然后进行测序比对，确定HLA基因的型别。
5.根据权利要求2所述的HLA基因分型的方法，其特征在于，如果比对后出现模棱两可的分型结果，则针对步骤(2)中的第一扩增片段和第二扩增片段分别设计allele特异性的引物进行区分，然后进行扩增后测序比对，确定HLA基因的型别。
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