CN105254719A - 金黄色葡萄球菌trap蛋白的cd4+t细胞表位鉴定及其重组表位疫苗 - Google Patents

金黄色葡萄球菌trap蛋白的cd4+t细胞表位鉴定及其重组表位疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位，氨基酸序列如SEQ？NO:1和SEQ？NO:2所示。该表位产生了较强的TRAP抗原特异性的CD4+T细胞增值，同时分泌了高水平的细胞因子IFN-γ和IL-17，暗示筛选的两个TRAP优势表位属于Th1和Th17型，且SEQ？NO:2特异性CD4+T细胞分泌的IL-17高于TRAP全蛋白。本发明还提供了两种TRAP蛋白的CD4+T细胞表位和TRAP蛋白的B细胞表位串联而成的重组表位疫苗PT，该疫苗产生了特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答，且对于金黄色葡萄球菌感染的保护效果高于TRAP全蛋白，因此该表位可应用于金黄色葡萄球菌疫苗的开发。

Description

金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位鉴定及其重组表位疫苗
技术领域
本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位鉴定及其重组表位疫苗，能够引起小鼠的特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，并对金黄色葡萄球菌感染具有良好的免疫预防作用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一种常见的革兰氏阳性条件致病菌，可引起人的毒素性疾病、化脓性疾病、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，严重者可致败血症、脓毒症等全身性感染。S.aureus也可引起动物感染，尤其是奶牛乳房炎的重要病原菌。目前，全世界每年有几百万S.aureus感染的报道，对于S.aureus感染的治疗主要依赖抗生素。虽然过去抗生素在治疗和控制S.aureus感染方面发挥了重要作用，但由于抗生素的普遍和大量使用导致了耐药菌株出现，目前临床上耐药S.aureus引发的感染已成为难以解决的棘手问题。因此，寻找一种抗S.aureus感染的新方法至关重要，而使用免疫制剂-疫苗是防治S.aureus感染一种理想途径。目前为止，所研究的S.aureus疫苗保护效果均不够理想，其主要原因之一是在过去的疫苗研究中只考虑了体液免疫应答作用而忽视了以CD4+T细胞为主的细胞免疫应答，特别是Th1和Th17细胞免疫应答的作用。
TRAP(targetofRNAIIIactivatingprotein)是一种葡萄球菌中高度保守的蛋白，由167个氨基酸组成，在DNA抗氧化损伤中发挥重要作用。免疫研究表明，TRAP蛋白免疫小鼠和牛均获得良好的保护效果，由此说明TRAP是一个良好的S.aureus疫苗的候选抗原。但TRAP蛋白的CD4+T细胞表位在诱导特异性免疫应答中的作用及其制备的表位疫苗诱导的免疫保护作用未不清楚。因此，我们对S.aureusTRAP蛋白CD4+T细胞表位进行了鉴定，并将其与TRAP蛋白的B细胞表位制备成重组表位疫苗，我们的研究表明CD4+T细胞表位和B细胞表位能够在小鼠体内引起特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，有助于抵抗S.aureus的感染，有利于进一步开发S.aureus疫苗。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位。
本发明的第二目的是提供另一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位。
本发明的第三目的是提供上述两种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位与TRAP蛋白的B细胞表位串联而成的重组表位疫苗PT。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位，其氨基酸序列如SEQNO:1所示。
上述的金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗中的应用。
二、一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位，其氨基酸序列如SEQNO:2所示。
上述的金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗中的应用。
首先利用生物信息学方法预测S.aureusTRAP的CD4+T细胞表位，通过分析表位预测结果和蛋白质二级结构确定符合条件的5条候选表位多肽序列，并送公司合成表位多肽。
本发明所述的抗原表位SEQNO:1(20NPTHQLFQFSASDTSVIFEE39)和SEQNO:2(94RNFGGFKSYRLLRPAKGTTY113)产生了较强的TRAP抗原特异性的CD4+T细胞增值，同时分泌了高水平的细胞因子IFN-γ和IL-17，IL-4的分泌水平一般，暗示筛选的两个TRAP优势表位属于Th1和Th17型，且SEQNO:2特异性CD4+T细胞分泌的IL-17高于TRAP全蛋白，暗示其可能是特异性Th17型细胞表位。
三、一种重组表位疫苗PT，由上述的两种TRAP蛋白的CD4+T细胞表位和TRAP蛋白的B细胞表位串联而成，每个表位的C末端用GPGPG间隔序列隔开。
上述的重组表位疫苗PT产生了特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答，且对于S.aureus感染的保护效果好于TRAP全蛋白，可用于S.aureus的抗感染免疫，用于制备治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗。
采用上述技术方案的积极效果：本发明的S.aureusTRAP蛋白的CD4+T细胞抗原表位可产生特异性的细胞免疫应答，而CD4+T细胞应答在S.aureus感染的机体免疫炎性损伤和抗感染免疫保护中发挥重要作用，因此可用于制备治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗；本发明构建的含有S.aureusTRAP蛋白的CD4+T细胞表位和B细胞表位的重组表位疫苗PT能够在小鼠体内引起特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，对S.aureus感染的小鼠具有良好的保护效果，有利于S.aureus疫苗的进一步开发。
附图说明
图1为TRAP氨基酸序列的蛋白质二级结构预测结果。
图2为TRAP抗原表位多肽体外刺激小鼠特异性CD4+T细胞的增值结果。A:BALB/c，B:C57BL/6。
图3为TRAP抗原表位多肽体外刺激小鼠特异性CD4+T细胞的细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-17的检测结果。A:BALB/c，B:C57BL/6。
图4为TRAP抗原表位SEQNO:1和SEQNO:2体内刺激小鼠特异性CD4+T细胞的增值结果。A:BALB/c，B:C57BL/6。
图5为TRAP抗原表位SEQNO:1和SEQNO:2体内刺激小鼠特异性CD4+T细胞的细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-17的检测结果。A:BALB/c，B:C57BL/6。
图6为表位重组蛋白PT的构建和表达。A：表位重组蛋白PT的构建示意图和氨基酸序列；B：重组蛋白纯化后的SDS-PAGE分析。M：蛋白质分子量Marker；1:表位重组蛋白PT的纯化结果；2：重组蛋白TRAP的纯化结果；3：PET32a蛋白的纯化结果。
图7为重组表位疫苗PT免疫小鼠的特异性淋巴细胞的增值结果。A:BALB/c，B:C57BL/6。
图8为重组表位疫苗PT免疫小鼠的特异性淋巴细胞的细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-17的检测结果。A:BALB/c，B:C57BL/6。
图9为重组表位疫苗PT免疫小鼠血清的IgG水平。A:BALB/c；B:C57BL/6。
图10为重组表位疫苗PT的免疫保护效果。A:BALB/c；B:C57BL/6。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。
本发明中生物材料的来源：
1、TRAP蛋白的B细胞表位：公开在ANovelPeptideScreenedbyPhageDisplayCanMimicTRAPAntigenEpitopeagainstStaphylococcusaureusInfections,GuangYang,YapingGao,JieDong,ChuanLiu,YanningXue,MingFan,BeifenShenandNingshengShao,TheJournalofBiologicalChemistry,Vol280,No29,IssueofJuly22,pp27431-27435,2005。
2、候选表位多肽为委托上海楚肽生物科技有限公司合成。
实施例1S.aureusTRAP的CD4+T细胞表位的预测
CD4+T细胞表位只能与MHCⅡ类分子结合，并共同被T细胞抗原受体特异性识别，从而诱导相应效应T细胞产生免疫应答。根据CD4+T细胞表位与MHCⅡ类分子的结合能力，基于矩阵的T细胞表位预测算法(Matrix-basedTcellepitopeselectionalgorithms)和人工神经网络法(Artificialneuralnetworks，ANN)等进行S.aureusTRAP的CD4+T细胞表位预测，一般认为多肽与MHCⅡ结合的半数抑制浓度(IC50)＜500nM时两者具有较好的亲和力(表1)。同时，利用在线网站预测其蛋白质二级结构(图1)，一般认为转角和无规则卷曲的结构与表位形成密切相关，结合CD4+T细胞表位预测结果和蛋白质的二级结构，确定符合条件的5条候选表位多肽序列(表2)。
表1预测的TRAP表位多肽与不同MHCII等位基因的亲和力
实施例2候选表位多肽的合成
利用固相多肽合成技术合成5条S.aureusTRAP的候选表位多肽，合成的多肽N端乙酰化，羧基末端，纯度达到95％以上(表2)。多肽以70mM溶解于体积比为3:1的DMSO和ddH2O中。
表2候选TRAP抗原表位多肽的合成
实施例3S.aureusTRAP的CD4+T细胞表位的初步筛选
考虑小鼠MHCⅡ分子的多态性，实验选用无特定病原体的BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)两种小鼠模型，以PBS为对照组，S.aureusTRAP重组蛋白为免疫组，每组10只小鼠，1mg/mLTRAP重组蛋白与弗氏佐剂1:1混合，乳化后腿部肌肉注射100μL，二周后相同方法进行二免，二免一周后分离小鼠脾脏的淋巴细胞，免疫磁珠分选其中的CD4+T细胞，合成的候选表位多肽体外刺激免疫小鼠的CD4+T细胞，利用CCK8检测CD4+T细胞的增殖水平(图2)，ELISA或ELISPOT方法检测CD4+T细胞的细胞因子(IFN-γ，IL-4，IL-17)分泌水平(图3)，综合分析CD4+T细胞的增殖和细胞因子分泌水平，初步筛选出2个能够显著增强CD4+T细胞效应的表位TRAP20-39和TRAP94-113。
实施例4S.aureusTRAP的CD4+T细胞表位的鉴定
将初步筛选的CD4+T细胞表位TRAP20-39和TRAP94-113单个或混合免疫BALB/c和C57BL/6小鼠，免疫程序同上，二免一周后，检测该表位体内刺激小鼠的CD4+T细胞的增殖水平和细胞因子分泌水平，以进一步确定不同表位的协同作用(图4，图5)。结果表明：混合免疫组对CD4+T细胞的特异性免疫应答无协同作用，TRAP20-39单个免疫组对C57BL/6小鼠产生了良好的CD4+T细胞的特异性免疫应答，而TRAP94-113单个免疫组对BALB/c和C57BL/6两种小鼠均产生了坚强的CD4+T细胞的特异性免疫应答。同时，如图5所示，TRAP94-113特异性CD4+T细胞分泌的IL-17高于TRAP全蛋白，暗示其可能是特异性Th17型细胞表位。
实施例5TRAP20-39和TRAP94-113的氨基酸序列的同源性分析
将鉴定的CD4+T细胞表位TRAP20-39和TRAP94-113的氨基酸序列进行BLAST分析，2个表位序列与多数相关S.aureus菌株的同源性均可达到100％，具体见表3。说明该表位在多数S.aureus菌株中高度保守。
表3TRAP20-39andTRAP94-113的氨基酸序列的同源性分析结果
实施例6表位重组蛋白PT的构建和表达
表位重组蛋白PT包含2个鉴定的CD4+T细胞表位TRAP20-39和TRAP94-113，以及实验室前期鉴定的1个TRAP蛋白的B细胞表位，每个表位的C端用GPGPG间隔序列隔开，以避免交互表位的产生。PT的构建及其氨基酸序列见图6，根据氨基酸序列优化密码子核苷酸序列，两端加上BamHI和HindIII酶切位点，送上海生工进行基因的合成。将合成的基因与PET32a表达载体进行连接，转化E.coliBL21(DE3)后，利用IPTG进行重组蛋白的诱导表达，将表达的重组蛋白进行Ni树脂柱纯化，获得纯化的目的蛋白PT，利用相同方法纯化TRAP重组蛋白和PET32a蛋白(图6)。
实施例7重组表位疫苗PT的细胞免疫应答
将纯化后的表位重组蛋白PT、TRAP重组蛋白、PET32a蛋白分别以1mg/mL重组蛋白与弗氏佐剂1:1混合，乳化后免疫BALB/c和C57BL/6小鼠，腿部肌肉注射100μL，每组5只小鼠，三周后相同方法进行二免，二免一周后分离小鼠脾脏的淋巴细胞，纯化蛋白分别体外刺激免疫小鼠的淋巴细胞，利用CCK8检测淋巴细胞的增殖水平(图7)，结果显示：PT组和TRAP蛋白组的结果无显著差异。ELISA或ELISPOT方法检测细胞因子(IFN-γ，IL-4，IL-17A)分泌水平(图8)，结果显示：除BALB/c中PT免疫组的IL-17A的分泌水平显著高于TRAP蛋白组外，其他几种细胞因子的分泌水平无显著差异，说明重组表位疫苗PT产生的细胞免疫应答与TRAP蛋白组的水平相当。
实施例8重组表位疫苗PT的体液免疫应答
采用间接ELISA方法对PT、TRAP、PET32a免疫小鼠的二免二周后的血清IgG水平进行检测。PT和TRAP免疫组均产生了针对TRAP的特异性抗体，并且PT产生的抗体水平略高于TRAP蛋白(图9)。
实施例9重组表位疫苗PT的免疫保护作用
免疫组及对照组小鼠在加强免疫两周后，5×108cfu的S.aureusNewman进行腹腔攻毒，攻毒后每日观察小鼠的死亡情况，记录时间为两周，致死性攻毒结果如图10。PT和TRAP免疫组的保护率显著高于PET32a对照组，其中PT免疫的BALB/c小鼠的免疫保护率为70％，TRAP免疫组为60％；PT免疫的C57BL/6小鼠的免疫保护率为80％，TRAP免疫组为70％。结果表明：重组表位疫苗PT免疫的BALB/c和C57BL/6小鼠对于S.aureusNewman的致死性感染具有比TRAP全蛋白更好的保护效果。

Claims (6)

1.一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位，其氨基酸序列如SEQNO:1所示。
2.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗中的应用。
3.一种金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位，其氨基酸序列如SEQNO:2所示。
4.权利要求3所述的金黄色葡萄球菌TRAP蛋白的CD4+T细胞表位在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗中的应用。
5.一种重组表位疫苗PT，其特征在于：由权利要求1所述的TRAP蛋白的CD4+T细胞表位、权利要求3所述的TRAP蛋白的CD4+T细胞表位和TRAP蛋白的B细胞表位串联而成，每个表位的C末端用GPGPG间隔序列隔开。
6.权利要求5所述的重组表位疫苗PT在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的疫苗中的应用。
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