CN105241635A - 用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本案涉及用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，包括：1)将基底层浸入硅烷化试剂中进行硅烷化处理，在基底层表面形成硅烷层；2)将硅烷层浸入荧光染料溶液中进行荧光染料修饰，在硅烷层表面形成荧光染料层；3)采用电子束光刻法对荧光染料层进行等间距曝光，使得未被曝光的部分形成等间距排列的荧光染料线条，而被曝光部分的荧光染料失效，形成惰性层；4)在荧光染料线条和惰性层的表面旋涂透明保护层。本案的制备工艺简单，反应条件温和无污染，工艺重现性好；通过精确调整荧光纳米标准板的结构尺寸，实现荧光线条结构的整齐排列，直观地反应出系统的分辨能力；同时，这种结构的标准板能够实现批量制作，稳定性高，分辨率高。

Description

用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法
技术领域
本发明涉及一种荧光纳米标准板的制备方法，特别涉及一种用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法。
背景技术
长期以来，光学显微成像技术在人类探索微观世界的过程中一直发挥着重要作用。然而，受阿贝衍射极限的约束，传统光学显微技术无法将生命科学研究带到纳米尺度。随着荧光显微成像学的不断发展和完善，使得突破衍射极限成为可能。近年来，涌现出了许多超分辨荧光显微技术，如单分子定位显微术(SingleMoleculeLocalizationMicroscopy，SMLM)、结构光照明显微术(StructuredIlluminationMicroscopy，SIM)以及受激发射损耗显微术(StimulatedEmissionDepletion，STED)等。这些荧光显微成像技术将科学研究带入“纳米”领域，让人类能够“实时”观察活细胞内的分子运动规律，为疾病研究和药物研发带来革命性变化。与其他技术相比，STED基于共聚焦显微技术，通过把被激发的荧光物质限制在小于衍射极限的范围内来实现超高分辨率，成像速度快，可以观察活细胞内实时变化的过程。
分辨率是评价光学显微系统最重要的标准，不同于普通光学显微系统，超分辨荧光显微系统的分辨率并不能直接给出，而是需要借助测试标准板进行复杂的图像处理，与光学系统参数(如光源波长、强度等)、数据处理技术及荧光染料种类等因素密切相关，而这些都大大提高了对测试标准板的要求。因此，准确表征超分辨荧光显微系统的分辨率显得非常重要。但在现有技术中，标准板的结构及尺寸难以得到可重复性的精确加工，荧光线条的排列不够整齐，制造工艺复杂，无法实现批量化生产，而这种加工的难度主要是源自对标准板的结构设计还不够科学合理，一些工艺环节的排布上也未能做到尽善尽美。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其通过对板材结构的重新设计和对工艺细节的重新设计，可用于超分辨荧光显微系统分辨率的测定，且制备工艺简单，产品稳定性高，可重复使用，易于批量生产。
本发明采用的技术方案如下：
一种用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，包括：
步骤1)将基底层浸入硅烷化试剂中进行硅烷化处理，在所述基底层表面形成硅烷层；
步骤2)将所述硅烷层浸入荧光染料溶液中进行荧光染料修饰，在所述硅烷层表面形成荧光染料层；
步骤3)采用电子束光刻法对所述荧光染料层进行等间距曝光，使得未被曝光的部分形成等间距排列的荧光染料线条，而被曝光部分的荧光染料失效，形成惰性层；
步骤4)在所述荧光染料线条和惰性层的表面旋涂透明保护层。
优选的是，所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其中，所述基底层为硅或氮化硅。
优选的是，所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其中，所述基底层为硅。
优选的是，所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其中，所述硅烷化试剂为3-氨丙基三乙甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷。
优选的是，所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其中，所述透明保护层的厚度为30～100nm。
优选的是，所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其中，所述荧光染料为异硫氰酸荧光素或荧光蛋白ATTO488。
优选的是，所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其中，所述荧光染料为异硫氰酸荧光素。
本发明的有益效果是：本案提及的标准板的制备工艺简单，反应条件温和无污染，工艺重现性好；通过对标准板结构的改进，使得其可用于超分辨荧光显微系统分辨率的精确测定；通过精确调整荧光纳米标准板的结构尺寸，实现荧光线条结构的整齐排列，直观地反应出系统的分辨能力；同时，这种结构的标准板能够实现批量制作，操作简易方便，稳定性高，可重复使用，分辨率高。
附图说明
图1为采用本发明所述的制备方法制得的荧光纳米标准板的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
参照图1，本案提出一实施例的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，包括：
步骤1)将基底层1浸入硅烷化试剂中进行硅烷化处理，在基底层1表面形成硅烷层2；
步骤2)将硅烷层2浸入荧光染料溶液中进行荧光染料修饰，在硅烷层2表面形成荧光染料层；
步骤3)采用电子束光刻法对荧光染料层进行等间距曝光，使得未被曝光的部分形成等间距排列的荧光染料线条3，在其下方则是未受影响的硅烷层2部分，基底层1也未因曝光发生变化；但由于电子束的能量密度很高，在被曝光的部分中荧光染料与硅烷发生了反应形成一个整体，长时间的照射使得该部分的荧光染料失效，不能再产生荧光，从而形成惰性层4；
步骤4)在荧光染料线条3和惰性层4的表面旋涂透明保护层5。透明保护层5是透明高分子材料，它的作用是保护荧光染料，它自身不产生荧光。
在上述实施例中，基底层1优选为硅或氮化硅，最优选为硅。
在上述实施例中，硅烷化试剂优选为3-氨丙基三乙甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷。
在上述实施例中，透明保护层5的厚度优选为30～100nm。研究表面，透明保护层5的厚度对标准板分辨率的测量精度有一定的影响，既要同时兼顾保护作用，又要避免对荧光产生干扰，若超出该优选的范围，将导致标准板的测量精度偏离最优值。
在上述实施例中，荧光染料优选为异硫氰酸荧光素或荧光蛋白ATTO488，最优选为异硫氰酸荧光素。异硫氰酸荧光素与此结构的标准板匹配度最好，两者配合协调，可使标准板获得最佳的分辨率测试精度。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.一种用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，包括：
步骤1)将基底层浸入硅烷化试剂中进行硅烷化处理，在所述基底层表面形成硅烷层；
步骤2)将所述硅烷层浸入荧光染料溶液中进行荧光染料修饰，在所述硅烷层表面形成荧光染料层；
步骤3)采用电子束光刻法对所述荧光染料层进行等间距曝光，使得未被曝光的部分形成等间距排列的荧光染料线条，而被曝光部分的荧光染料失效，形成惰性层；
步骤4)在所述荧光染料线条和惰性层的表面旋涂透明保护层。
2.根据权利要求1所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，所述基底层为硅或氮化硅。
3.根据权利要求2所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，所述基底层为硅。
4.根据权利要求1所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，所述硅烷化试剂为3-氨丙基三乙甲氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷。
5.根据权利要求1所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，所述透明保护层的厚度为30～100nm。
6.根据权利要求1所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，所述荧光染料为异硫氰酸荧光素或荧光蛋白ATTO488。
7.根据权利要求6所述的用于测试分辨率的荧光纳米标准板的制备方法，其特征在于，所述荧光染料为异硫氰酸荧光素。
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