CN105232515A - 没食子酸乙酯用于制备治疗人结肠癌凋亡药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了没食子酸乙酯用于制备治疗结肠癌Lovo细胞凋亡药物的应用，药理学及细胞生物学实验表明，没食子酸乙酯可以有效促进结肠癌细胞Lovo染色质浓缩、磷脂酰丝氨酸外翻及细胞核内部DNA发生断裂，诱导细胞凋亡，其作用机理与提高细胞中Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9蛋白的表达水平密切相关。本发明首次揭示并量化分析了没食子酸乙酯对结肠癌细胞Lovo的凋亡诱导作用，有益于没食子酸乙酯从细胞凋亡角度研发具有抗癌活性的新药，有益于探索结肠癌疾病的防治，并为各种肿瘤的治疗提供新的思路。

Description

没食子酸乙酯用于制备治疗人结肠癌凋亡药物的应用

技术领域

本发明涉及一种没食子酸乙酯在制备治疗人结肠癌凋亡药物中的应用，属于细胞生物技术领域。

背景技术

直结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率和死亡率在全球恶性肿瘤中位居第三位，随着人类生活模式、食物结构、饮食习惯等变化，结肠癌症的发病率和死亡率均呈逐年上升趋势。面对如此严重的社会问题，如何提高结肠癌症患者的生存率已成为国内外科学工作者的重要课题。目前结肠癌在临床治疗中主要以手术为主,但为了加强治疗效果，常常需要采用中药治疗来辅助治疗，以期达到较好的治疗效果。

目前在全球范围内结肠癌的病因及发病机理尚未完全阐明,近年来比较公认的观点是肿瘤是遗传调控和环境因素共同作用而使细胞增殖与凋亡失衡所致。其中细胞凋亡不仅在肿瘤形成的不同阶段均起着十分重要的作用，同时也与肿瘤细胞放疗敏感性、化疗疗效及肿瘤细胞耐药性密切相关。诱导细胞凋亡已成为筛选抗癌药物一个重要指标.细胞凋亡也是受基因调控的精确过程,目前主要有两条途径：通过细胞膜上的死亡受体激活依赖Caspase的凋亡途径主要包括外源性的死亡受体通路和内源性的线粒体途径。死亡受体途径是细胞表面死亡受体接受外源信号，启动凋亡的一种死亡方式。Fas/TRAIL等死亡受体与相应配体结合，在连接蛋白帮助下，激活Caspase-8，将凋亡信号由细胞膜外传递到细胞浆。Caspase-8进一步活化下游的Caspase-3/Caspase-7.线粒体途径是胞质内线粒体中细胞色素C释放激活caspase-9,进而活化caspase-3促进凋亡.死亡受体途径和线粒体途径又是相关联的。McMaster大学生物化学与生物医学院的研究者们使用荧光成像技术和体外细胞培养技术研究发现tBid可与线粒体膜上的Bax结合，导致线粒体膜通透性下，细胞色素C释放，启动凋亡。而活化的Caspase-8可以剪切Bid蛋白使之裂解为tBid。由此Bid蛋白将死亡受体途径和线粒体途径巧妙相连。一旦死亡受体通路和线粒体通路被激活,凋亡的发生将是不可逆转的。

没食子酸乙酯是从狼毒大戟中获得的一种安全性较好的抗肿瘤活性化合物，刘延麟等通过急性毒性试验未测量出EG的LD₅₀值，最大安全耐受量倍数为151，相当于成人常用量的100倍以上，说明EG具有较好的安全性。我们首次发现其对结肠癌细胞Lovo、肺癌A549、口腔鳞癌Cal-27均有增殖抑制作用,其中对结肠癌细胞Lovo增殖抑制作用最佳,72小时最大抑制率可达到(74.67±0.47)％，没食子酸乙酯的提取分离方法及其对三种细胞的增殖抑制作用已在中医药信息公开发表。迄今为止,关于没食子酸乙酯诱导结肠癌细胞Lovo凋亡的作用及在药物中的应用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供没食子酸乙酯在制备治疗剂辅助治疗结肠癌药物中的应用。

本发明所述的没食子酸乙酯可以从市场购买，也可以从狼毒大戟中提取得到，还可以从其他植物中分离纯化得到，也可以通过化学合成或生物方法得到。结构如下：

进一步地，所述药物用于结肠癌疾病的治疗与辅助治疗。

进一步地，所述药物由以没食子酸乙酯为活性成分加入药学允许的赋形剂或辅料制成药物制剂，

进一步地，所述药物剂型包括注射剂、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、滴丸剂、口崩片、微丸。

经药理学实验证明，本发明所述的没食子酸乙酯可以有效促进结肠癌细胞Lovo染色质浓缩、磷脂酰丝氨酸外翻及细胞核内部DNA发生断裂，诱导结肠癌细胞发生凋亡。并且这种凋亡诱导作用，呈剂量依赖性。

经药理学实验证明，本发明所述的没食子酸乙酯可以提高Lovo细胞中Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9蛋白的表达水平，实验结果提示没食子酸乙酯诱导结肠癌细胞Lovo凋亡的作用机理与激活线粒体通路和死亡受体通路密切相关。

以上试验结果表明，本发明的没食子酸乙酯可以诱导结肠癌细胞凋亡，具有抗结肠癌的功效。

本发明的有益效果在于：本发明涉及没食子酸乙酯用于结肠癌细胞Lovo凋亡药物的应用，主要解决目前结肠癌化学治疗毒副作用严重的问题；没食子酸乙酯能有效的抑制结肠癌细胞增殖,诱导结肠癌细胞Lovo发生凋亡，并考察其作用靶点发现,其可上调caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达,此化合物诱导结肠癌细胞的作用机理与激活线粒体通路和死亡受体通路密切相关。本发明提供的没食子酸乙酯毒性小,安全性高。本发明寻找到没食子酸乙酯抑制结肠癌增殖的作用机理与作用靶点,为没食子酸乙酯作为药物进入临床提供了理论依据。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是没食子酸乙酯对结肠癌Lovo细胞具有凋亡诱导作用的可见光显微镜细胞形态变化图。

图2是没食子酸乙酯对结肠癌Lovo细胞具有凋亡诱导作用的AO/EB荧光染色图。

图3是没食子酸乙酯对结肠癌Lovo细胞具有凋亡诱导作用的流式细胞仪定量检测图。（注：M为DNAmarker，A为Control，B为EG(10μg/mL)，C为EG(20μg/mL)，D为EG(40μg/mL)）。

图4是没食子酸乙酯对结肠癌Lovo细胞具有凋亡诱导作用的DNA琼脂糖凝胶电泳图。（注：A为Control，B为EG(10μg/mL)，C为EG(20μg/mL)，D为EG(40μg/mL)）。

图5是没食子酸乙酯上调结肠癌Lovo细胞内Caspase-3蛋白表达的免疫细胞化学图。

图6是没食子酸乙酯上调结肠癌Lovo细胞内Caspase-8蛋白表达的免疫细胞化学图。

图7是没食子酸乙酯上调结肠癌Lovo细胞内Caspase-9蛋白表达的免疫细胞化学图。

具体实施方式

为进一步说明本发明的有益效果，以下提供临床前应用报告中的试验案例。

实验例：本发明没食子酸乙酯对结肠癌细胞Lovo凋亡诱导作用的研究

1.1实验材料

1.2细胞株：购自中国科学院细胞库。

1.2主要药品及试剂：没食子酸乙酯（齐齐哈尔医学院天然药物教研室提供)。DMEM培养基（购自美国Gibco公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；DMSO(二甲基亚砜)（美国Ameresco公司）；吖啶橙(AO)(上海蓝季科技发展限公司)；溴乙啶(EB)(大连保税区联合博泰生物技术有限公司)；AnnexinV-FITC试剂盒（凯基生物）；DNALadder、BeyoRedDNA上样缓冲液(6X)、细胞凋亡－DNALadder抽提试剂（离心柱式)（碧云天）。CleavedCaspase-3抗体、CleavedCaspase-8、CleavedCaspase-9抗体(CellSignalingTechnology)；兔Streptavidin-HRP(SA-HRP)系列试剂盒(康为世纪)。

1.3主要仪器及设备：荧光显微镜(中国龙宇医疗器械)；3111型CO2培养箱（Thermo公司）；BCD-243型电冰箱（中国康拜恩电冰箱总厂）；COIC型倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；PURELABPLUS超纯水系统（美国BIO-Rad公司）；5417R离心机（Eppendorf公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；流式细胞仪（美国BD公司）

1.4数据使用实验重复三次，采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，检验水平α=0.05，P＜0.05时具有统计学意义，P＜0.01时具有显著性差异。计量资料用均数±标准差()表示，如表1、表2所示。

表1、不同浓度EG作用48h后Lovo细胞凋亡率的变化(，n=3,%)

表2、不同浓度EG作用48h后活性Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9蛋白的平均光密度值()

注：与空白对照组相比较，^* P＜0.05

Note:comparedwithcontrol,^* P＜0.05

申请人采用倒置显微镜观察、AO/EB荧光染色法观察、AnnexinV-FITC/PI双染法和DNALadder琼脂糖凝胶电泳法四种不同方法从形态学和生态学共同验证了EG对Lovo细胞的凋亡诱导作用,并检测了线粒体通路和死亡受体通路中关键蛋白的表达,为其应用于临床奠定了理论依据。图1是没食子酸乙酯对结肠癌Lovo细胞具有凋亡诱导作用的可见光显微镜细胞形态变化图。图2是没食子酸乙酯对结肠癌Lovo细胞具有凋亡诱导作用的AO/EB荧光染色图。图3是没食子酸乙酯对结肠癌Lovo细胞具有凋亡诱导作用的流式细胞仪定量检测图。图4是没食子酸乙酯对结肠癌Lovo细胞具有凋亡诱导作用的DNA琼脂糖凝胶电泳图。图5是没食子酸乙酯上调结肠癌Lovo细胞内Caspase-3蛋白表达的免疫细胞化学图。图6是没食子酸乙酯上调结肠癌Lovo细胞内Caspase-8蛋白表达的免疫细胞化学图。图7是没食子酸乙酯上调结肠癌Lovo细胞内Caspase-9蛋白表达的免疫细胞化学图。

本发明的具体研究结果阐述如下：

首先倒置显微镜下观察没食子酸乙酯作用后Lovo细胞形态学变化：

倒置显微镜下观察空白对照组Lovo细胞生长旺盛，形态规整，呈不规则多边形，牢固贴壁，生长舒展，具有高折光率，视野明亮，细胞之间紧密连接，边界清晰。经EG作用后的Lovo细胞，胞间连接变少出现空隙，贴壁能力逐渐下降，随着药物浓度的增高，细胞逐渐变圆，体积变小，但细胞膜完整，折光率减弱，部分细胞漂浮，最终裂解，见图1。说明EG在体外可以显著改变Lovo细胞的形态学特征，抑制其生长。

荧光染色观察没食子酸乙酯作用后Lovo细胞形态学变化：

采用AO/EB染色，在荧光显微镜下观察细胞形态学改变，实验结果显示对照组Lovo细胞数量较多，核染色质着绿色且结构形态正常，凋亡现象很少。经EG作用后各组均出现不同形态的凋亡细胞，有染色质浓聚的早期凋亡细胞，或通透性破坏胞核被染成橘红色的晚期凋亡细胞，随着药物浓度的增高，凋亡细胞的数量和程度都明显增加，高剂量组还出现少量的体积明显变大，呈不均匀橙色荧光的坏死细胞，给药剂量的不同可能会导致药效的差异。倒置显微镜下观察和AO/EB染色结果均从形态学角度表明EG具有诱导细胞凋亡的作用，见图2。

分析：

细胞凋亡时经典特征之一是基因组DNA被断裂为长度约为n×180bp的DNA片段。DNALadder琼脂糖凝胶电泳结果显示，EG作用48h后，空白组未见梯状条带，EG低剂量组(10μg/mL)有微弱梯状条带，中剂量组(20μg/mL)和高剂量(40μg/mL)组出现明显梯状条带。随着给药剂量增高，梯状条带越发明显。我们通过琼脂糖凝胶法观察EG对Lovo细胞中DNA的影响，再次从生化学角度说明EG可以诱导Lovo细胞发生凋亡。

流式细胞分析(FCA)散点图：

采用AnnexinV-FITC与PI双染法可以定量分析细胞凋亡情况，图4为实验获得的流式细胞术双参数散点图。由图可知随着给药浓度的增加，正常细胞所占比例逐渐减少，早期凋亡数量和晚期凋亡的数量都在逐渐增加。

免疫细胞化学法检测凋亡通路相关蛋白表达变化：

采用免疫细胞化学方法检测细胞凋亡通路相关蛋白表达情况，结果显示：EG作用Lovo细胞48h后，通过倒置显微镜下观察发现视野中出现棕黄色阳性表达颗粒，且随着剂量的增加颜色逐渐加深。通过软件对图片进行统计分析可知：各给药组与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)，提示EG上调活性Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达。

Claims (4)

1.一种没食子酸乙酯用于制备治疗人结肠癌凋亡药物的应用，其特征在于：所述没食子酸乙酯，采用化学合成方法制备得到或者从植物中提取分离获得。

2.根据权利要求1所述的没食子酸乙酯用于制备治疗人结肠癌凋亡药物的应用，其特征在于：所述药物用于结肠癌疾病的治疗与辅助治疗。

3.根据权利要求1所述的没食子酸乙酯用于制备治疗人结肠癌凋亡药物的应用，其特征在于：所述药物由以没食子酸乙酯为活性成分加入药学允许的赋形剂或辅料制成药物制剂。

4.根据权利要求3所述的没食子酸乙酯用于制备治疗人结肠癌凋亡药物的应用，其特征在于：所述药物剂型包括注射剂、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、滴丸剂、口崩片、微丸。