CN105228648A - 快速产生改良的动物疫苗的方法 - Google Patents

快速产生改良的动物疫苗的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105228648A
CN105228648A CN201280077944.8A CN201280077944A CN105228648A CN 105228648 A CN105228648 A CN 105228648A CN 201280077944 A CN201280077944 A CN 201280077944A CN 105228648 A CN105228648 A CN 105228648A
Authority
CN
China
Prior art keywords
animal
rna
vaccine
noi
microorganism
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280077944.8A
Other languages
English (en)
Inventor
D·L·哈里斯
M·埃德曼
K·卡姆鲁
J·史密斯
J·D·洛伊
L·巴索洛梅
E·斯库拉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harrisvaccines LLC
Original Assignee
Harrisvaccines LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US13/277,076 external-priority patent/US20120107355A1/en
Application filed by Harrisvaccines LLC filed Critical Harrisvaccines LLC
Priority claimed from US13/657,898 external-priority patent/US8822427B2/en
Priority claimed from US13/657,895 external-priority patent/US10004797B2/en
Publication of CN105228648A publication Critical patent/CN105228648A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A61K39/135—Foot- and mouth-disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/18011—Nimaviridae
    • C12N2710/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/18011—Nimaviridae
    • C12N2710/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本申请描述了快速生产针对致病微生物的生物型的疫苗的方法，其中从暴露于所述微生物的动物的生物样品中获得核酸分子或其片段，基于所述目的核酸分子或其片段制备保护性分子，并将其给予已经暴露于所述微生物或处于暴露于所述微生物的风险的动物。在所述动物中获得针对所述微生物的生物型的保护性应答。

Description

快速产生改良的动物疫苗的方法
相关申请
本申请要求2011年10月19日提交的在先提交的并且共同未决的申请USSN13/277,076和2011年10月19日提交的在先提交的并且共同未决的申请USSN13/277,066的优先权，所述两个申请均要求2010年10月27日提交的USSN61/407,297、2010年12月1日提交的USSN61/418,433、2011年3月7日提交的USSN61/449,940、2011年5月10日提交的USSN61/484,255、2011年7月15日提交的USSN61/508,172和2011年8月19日提交的USSN61/525,332的优先权，所述每项申请的内容以引用的方式全文纳入本文。
关于美国联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明是在美国农业部授予的2007-33610-18035和2009-33610-20299合同和来自美国农业部的SBIR拨款的政府支持下做出。美国政府对本发明拥有一定的权利。
序列表
本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，所述序列表以引用的方式全文纳入本文。创建于2012年10月23日的所述ASCII拷贝被命名为150003RPCT.txt，其大小为110652字节。
背景技术
动物疫苗通常是通过多种途径制备。生产了用于许多不同地点的所有动物的商业开发的疫苗。这类疫苗包含抗原，并且可来源于病原体的一种生物型。通过多种分型技术能够对不同分离株进行生物分型，在所述生物分型中，可以通过特定特征而将病原体的变体区别于所述病原物种的其他成员。例如，这些变体的区别在于DNA序列、RNA序列的序列变异、致病反应、血清型等。参见Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,Thirdeditions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.2001。生物分型的另一个实例是Harris等人的美国专利7622254所记载的聚糖分型，所述专利以引用的方式全文纳入本文。在流感病毒的实例中，世界卫生组织和疾控中心通过筛选大量的在人类和动物群体中传播的流感病毒，来对所述病毒毒株进行遗传和抗原分析。当在血凝反应抑制测定中疫苗株和新出现的毒株之间存在2个单位的抗原差异时，所述疫苗株就被更新。另一方面，自体疫苗是为用于特定地点和群组的动物而产生的那些疫苗。分离病原体例如病毒，并使用全病毒来制备为在所述地点发现的生物型定制的疫苗，所述疫苗可用在暴露于这类生物型的其他地点。举例来说，可以通过分离农场中的病毒来开发兽医领域的自体疫苗，以在该农场中用作疫苗。
目前可用于动物的疫苗选择缺乏快速适应疾病新型爆发的能力。每年，畜牧动物疾病在治疗和产率损失两方面耗费了生产者数十亿美元。对于某些疾病而言，例如影响水生无脊椎动物的那些疾病，没有用于关键病原体(例如影响饲养的虾的病原体)的市售疫苗。仅猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)每年给猪饲养业带来的损失就估计为5.6亿美元。NeumannEJ,KleibensteinJ,JohnsonC,MabryJW,BushEJ,SeitzingerAH,GreenAL,ZimmermanJJ(2005),AssessmentoftheeconomicimpactofporcinereproductiveandrespiratorysyndromeonswineproductionintheUnitedStates,JournaloftheAmericanVeterinaryMedicalAssociation227:385-392。猪饲养者和兽医缺少针对PRRS的广泛有效的疫苗，这是由于缺少抵抗所述病原体的异种毒株的交叉保护商用疫苗。流感是另一个导致损失很大的疾病的实例，其影响人、鸟、猪和其它动物。在1918年流感大流行期间兽医将流感鉴定为一种猪疾病，那时在时间上密切相关的人和猪的流感爆发被联系起来。根据国际传染病学会(internationalsocietyforinfectiousdisease)的记载，所述病毒最初在1930年从猪身上分离，随后在1934年从人身上分离。基于流感病毒内部蛋白之间缺乏血清学交叉反应，将流感分成三种类型：甲型、乙型和丙型流感。通过血凝素和神经氨酸酶蛋白的抗原差异，将甲型流感病毒进一步分为多个组。已知有16种HA亚型和9种NA亚型，包括H1、H2、H3、N1和N2。由于HA和NA氨基酸序列的变化导致流感病毒频繁发生变化，而使所述病毒逃逸机体免疫应答的中和作用。例如，迄今为止在北美地区人类、家禽和猪种群中传播的更普遍的亚型是H1和H3。在2008/2009年，发现了一种新的被称为H1N1的分离株，其已在人类中导致了另一次大流行。这就是当从特定毒株制备疫苗时，所述疫苗可能不会提供保护抵抗不同毒株导致的疾病爆发的原因，因此需要每年从预测的新分离株或预期分离株重新制备疫苗。
因此，非常需要特异性针对特定地点(例如农场)中的病原体特定生物型的疫苗。存在专门生产此类自体疫苗的公司。但是，目前所有自体疫苗都是必须被灭活的全生物制剂(灭活疫苗)。简言之，将病原体从动物/农场分离、纯化、在实验室中培养、配成制剂并返回农场用于动物的疫苗接种。这些常规的自体疫苗试图解决毒株变异的问题；但是，无法以快至足以对所述疾病导致的生产和经济损失产生即时影响的速度制备所述疫苗，并且所述疫苗与用于区分感染的动物和接种疫苗的动物(DIVA)的诊断测试不相容。
由USDA兽医生物制品中心批准的商用疫苗中的疫苗株可在约12个月内被“换掉(switchedout)”。Rapp-GabrielspmVJ,SornsenS,NitzelG,etal.Updatingswineinfluenzavaccines.AASV39thAnnualMeetingProceedings2008；261:264。自体疫苗中的疫苗株能够被更快地“换掉”，可能在3-6个月之内；但是，针对有限订单的使用新的且更新的毒株制备疫苗的成本会限制其可利用性。订单大小可随着地区/邻近的自体网络而增加，但其组织和实施可能是复杂的。HenryS.,Swineinfluenzavirus-effortstodefineandimplementregionalimmunization.AASVProceedings2009；475-478。兽医/制造商可获批/生产VCPR疫苗。能够以比USDACVB批准的商用疫苗或自体疫苗更快的速度完成疫苗株的“换掉”(参见关于VeterinaryClientPatientrelationshiparrangements(VCPR)的9CFR107.1和关于自体疫苗的9CFR113.113；还可参见RyanVanderVeen,KurtKamrud,MarkMogler,etal.RapidDevelopmentofanEfficaciousSwineVaccineforNovelH1N1.PLoSCurrentsInfluenza2009November2RRN1123)。
总之，目前的疫苗至少有三个主要缺陷。
1.特异性。商用疫苗没有解决本领域中快速变化的病原体的毒株变异。毒株变异和缺少足够的交叉保护导致疫苗失效并因此导致生产/经济损失。
2.时效性。需要一年的时间来改变商用疫苗以解决毒株变异。目前的自体疫苗尝试解决特异性问题，但是从鉴定新型毒株到接种第一批动物需要数月才能制备出自体疫苗。例如，需要最长达6个月来制备目前可获得的针对PRRSV的常规灭活的自体疫苗。在此时间周期内会出现所述病原体的新毒株，因此降低了所述自体疫苗的价值/效力。因此需要一种更快速的生产自体疫苗的方法。
3.成分。所有现有的自体疫苗都是全生物的，其中整个病原体都包含在所述疫苗中。在大多数疾病中这是不必需的，因为保护作用所需的特异性抗原是已知的。此外，由于疫苗中包含整个病毒，所述疫苗与差异性诊断测试不相容。
因此，需要用于动物的改良疫苗。
本文所引用的所有参考文献以引用的方式纳入本文。通过举例说明的方式提供实例，所述实例不意欲限制本发明的范围。
发明内容
本申请提供了一种产生疫苗的方法，所述疫苗保护动物免受病原微生物的负面影响。从暴露于微生物的动物获得生物样品，从所述样品获得所述微生物的目的核酸分子或其片段，以及从所述目的核酸制备保护性分子。所述保护性分子可以是包含目的核酸分子或目的核酸分子的片段的序列，可以是由所述目的核酸分子生成的多肽或片段，或者可以是对所述目的核酸分子是反义的RNA分子或形成对应于全部或部分所述目的核酸分子的dsRNA的RNA分子。还提供了按照所述方法制备的疫苗和使用所述疫苗保护动物的方法。
附图说明
图1是自体重组蛋白疫苗制备方法的示意图。
图2是骨架生物试剂pVEKDNA质粒载体的示意图。
图3是具有自身供体基因(AutogenousDonorGene，ADG)插入片段的pVEK质粒载体的示意图。
图4是自身供体基因(ADG)/GOI和骨架生物试剂/RNA复制子构建的示意图。
图5是VEE基因组组织和复制策略的示意图。
图6是VEE复制子颗粒疫苗和包装系统的示意图。
图7是IMNV基因组转录和翻译产物的图，示出了靶向RNAi的区域，用深灰线或灰色阴影表示预测的蛋白质产物，以加粗黑线表示用于生成dsRNA的靶区域。
图8是载体pERK-3/M/GP5的图。
图9的图示出了不同处理组的总的总体肺部得分。具有不同字母的处理组具有显著差异(ANOVA,p<0.05)。
图10的图示出了不同处理组的间质性肺炎得分。具有不同字母的处理组具有显著差异(ANOVA,p<0.05)。
图11的图示出了肺淋巴样增生得分的总结。具有不同字母的处理组具有显著差异(ANOVA,p<0.05)。
图12的图示出了心脏病理学得分的总结。具有不同字母的处理组具有显著差异(ANOVA,p<0.05)。
图13的图示出了每组平均IDEXXELISAS/P效价。在激发(challenge)后的天数内，具有不同字母的组具有显著差异(ANOVA,p<0.01)。各组的柱状图以下列顺序列出：严格阴性，安慰剂，ARP，灭活的和MLV。
图14的图示出了每组10头猪中FFN效价≥4的猪的数量。在激发后的天数内，具有不同字母的组具有显著差异(Chi-square,p<0.05)。每组的柱状图以下列下顺序列出：严格阴性，安慰剂，ARP，灭活的和MLV。
图15的图示出了各组的几何平均FFN效价。在激发后的天数内，具有不同字母的组具有显著差异(ANOVA,p<0.01)。每组的柱状图以下列顺序列出：严格阴性，安慰剂，ARP，灭活的和MLV。
图16的图示出了7DPC时的活病毒滴定。具有不同字母的组具有显著差异(ANOVA,p<0.01)。
图17的图示出了通过RT-PCR检测的每组10头猪中具有PRRSV阳性血清的猪的数量。在激发后的天数内，具有不同字母的组具有显著差异(Chi-square,p<0.05)。每组的柱状图以下列顺序列出：严格阴性，安慰剂，ARP，灭活的和MLV。
图18是确定重组HA表达的蛋白质印迹。泳道1：ladder；泳道2：Vero裂解产物(阴性对照)；泳道3：重组HA(28.5μg/ml)；泳道4：重组HA(1.14μg/ml)；泳道5：重组HA(0.57μg/ml)；泳道6：重组HA(0.38μg/ml)。
图19的图示出了在接种或激发后确定的天数时测量抗FMDVA24的中和抗体的研究。每组中对照是第一柱，剂量A是第二柱，剂量B是第三柱。
图20的图示出了用2％盐水稀释的澄清接种物的系列稀释物。假接种接受等剂量的2％盐水。每次处理N＝20只虾。
图21的图示出了实施例4中实验1的结果。为虾注射2μgdsRNA构建体，并在给药后48小时用IMNV激发。每次处理N＝3组，每组20只虾。
图22的图示出了实施例4中实验2的结果。用dsRNA的连续稀释物接种虾，并在给药后48小时进行激发。每次处理N＝10只虾。
图23的图示出了实施例4中实验2的结果。为虾注射dsRNA的连续稀释物，并在给药后10天进行激发。每次处理N＝10只虾。
图24A的图示出了实施例4中实验3的结果。为虾注射0.02μgdsRNA#3、dsRNA3的5’截短物或dsRNA3的3’截短物，并在给药后10天进行激发。每次处理N＝3组，每组10只虾。
图24B的图示出了实施例4中实验3的结果，其中对虾的注射方式同图24A，但是使用dsRNA#3的其它截短物。
图25的图示出了实施例4中实验4的结果。用复制子或dsRNA接种虾，并在给药后3天进行激发。每次处理N＝3组，每组10只虾。
图26的图示出了实施例4中实验5的结果。用复制子接种虾，并在给药后3天进行激发。每次处理N＝3组，每组10只虾。
图27的图示出了实施例4中实验5的结果。用复制子接种虾，并在给药后10天进行激发。每次处理N＝3组，每组10只虾。
图28的图示出了实施例4中实验7的结果。在初次激发后的WSSV存活率。
图29：图中示出了在初次激发后21天进行的二次WSSV激发后的存活率。图30的图示出了通过注射或反向强饲法(reversegavage)进行接种之后的存活率。在接种后14天对动物进行激发。
图31的图示出了在激发后2天给予dsRNA的动物在激发之后的存活率。X轴为激发后的天数。Y轴为存活百分数。用5μgdsRNA处理dsRNA3和eGFPdsRNA组，并用等体积的无菌水处理激发对照。
图32的图示出了用含有不同溶液的饲料处理之后虾的存活百分数。X轴为用WSSV感染后的天数。Y轴为动物存活百分数。n＝30只动物。每次处理10只动物，重复3次。
图33的图示出了用不同长度的dsRNA接种(0天)后和IMNV感染(第10天)后虾的存活率。在图注中说明了IMNV基因组上的dsRNA靶位置和长度。
图34的图示出了用含有不同溶液的饲料处理之后虾的存活百分数。示出了用10病毒粒子剂量的IMNVIMJ的注射激发后20天动物的平均存活百分数。在PL9对动物进行接种，并在激发前饲养30天。
图35的图示出了用含有不同溶液的饲料处理之后虾的存活百分数。X轴为激发后的天数。Y轴为存活百分数(减去与注射水的对照相比在注射后首24小时内创伤导致的背景死亡率之后)。在接种后15天用10病毒粒子剂量的IM激发动物(PL33)。
图36的图示出了按照说明接受dsRNA和RP给药之后虾的存活率。
图37的图示出了H3和nsp2特异性IFA的成对对比。每柱代表通过在单独两天进行12次独立滴定而获得的平均效价。
图38的图示出了H3特异性(由两名不同的技术人员在单独6天内确定的47IFA效价＝94总IFA效价)和nsP2特异性(在单独4天内进行的24次独立的滴定)IFA的相同H3RP对照批次的累积平均效价。
图39的图示出了加强免疫之后19天时每种相关毒株的组平均值(HI效价倒数的以2为底的对数变换)。约4.3处的水平线表示HI效价为20。
图40的图示出了载体PVEK1K5的质粒图。
具体实施方式
本发明涉及一种用于保护动物以抵抗病原体的改良疫苗，所述疫苗能够被快速制备并解决为动物提供保护以抵抗新型或正在进化的生物型的问题。所述疫苗是新型自体疫苗，即所述疫苗由来自特定农场、牧群(flock)、畜群(herd)、池塘(pond)或地理区域存在的传染源的核酸分子制成。不必在实验室中分离所述传染源以获得基因。其是从已暴露于病原微生物的生物型的动物或动物群组中存在的微生物的核酸来制备。从中获得所述核酸分子的这类动物是生活在一种环境中的动物，在该环境中人们可以预期这些动物可能已经暴露于相同的病原体生物型。例如但不限制，当所述动物是牲畜时，发现它们可生存在大牧场(ranch)、饲养院(feedyard)、农场、牧群、池塘或区域中并且有足够多的接触，以使得本领域技术人员会预期这类动物已经与相同的病原体接触或可能与相同的病原体接触。制备所述自体疫苗之后，然后用所述疫苗接种这些动物。根据美国兽医协会(AVMA)提供的标准，被认为处于危险中的邻近或非邻近的动物群组也可被接种。参见www.avma.org/issues/policy/autogenous_biologics.asp，“GuidelinesforUseofAutogenousBiologics”(监督：COBTA；EB批准-1993年；再确认11/97；再确认4/01；修订3/06，09/11)。当提及自体疫苗时，其意指包括AVMA的这种目前定义，其中被认为处于危险中的动物可接受接种。此外，单个动物可以是制备自体疫苗的所针对的唯一动物(通常为狗、猫、马等)。目的微生物核酸分子的来源是任何便捷的生物样品，例如动物组织、体液或细胞，所述样品预期存在所述微生物的核酸，其可以是血液、皮肤、器官组织、体液等。
术语“生物分型”是指通过一种或多种特征将一种病原体与所述病原体物种的其他成员区分开。本发明特别适用于提供快速产生用于病原体的不同和/或新生物型的疫苗的方法，在一个实施方案中，本发明特别适用于当一种生物型存在于已经暴露于该生物型的动物或可能暴露于该生物型的动物的特定分组中时。使用目前的方法获得的疫苗可能无法有助于抵抗不同的或新进化的生物型。本发明提供了快速开发对新的或不同的生物型有用的疫苗的方法。通过一种或多种特征的改变就能够辨别出物种的生物型变体，所述特征例如核糖体RNA序列变异、DNA多态性、致病反应、暴露动物对特异性疫苗的应答、毒素生成的血清学分型或取决于所述病原体的许多其他可能的变异(参见，例如，Sambrooketal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdit.,ColdSpringHarborLaboratory,coldSpringHarbor,NewYork2001；DNAcloningAPracticalApproach,Vol.IandII,Glove,D.M.edit.IRLPressLtd.,Oxford,1985；HarlowandLane,AntibodiesaLaboratoryManual,ColdSpringHarborPublications,N.Y.1988)。例如但不限于，通过亚型和簇(cluster)区分流感来对流感进行生物分型。所述分类是由流感病毒的内部蛋白的差异决定，还由血凝素和神经氨酸酶蛋白的差异决定。在一个实施例中，可以使用血凝素抑制(HI)测试，其中将具有具体所示稀释度的样品施用到红血细胞并通过产生凝集作用的最大稀释度来确定效价。当流感病毒的抗体存在时，所述病毒的抗体阻止与红血细胞的粘附，并因此抑制血凝反应。结果被报告为提供可见凝集作用的最大稀释度的倒数。参见，例如，Katzetal.(2009)Morbid.Mortal.WeeklyRep.58(19)521-524。生物分型的另一个实例是聚糖分型，其中根据其糖基化方式对基因型进行分组。此类方法记载于Harris等的美国专利7622254中，所述专利以引用的方式全文纳入本文(特别参见，例如，表7的第48列和49列)。例如，根据PRRSV(猪繁殖与呼吸病毒)的毒株是欧洲还是北美毒株而对其进行分类。在分型PRRSV毒株的另一方面，开始的字母是EU(欧洲类)或NA(北美类)以指定基因型簇。EU指以在GP5的第46位、第53位或二者处的保守聚糖来表征的PRRSV的同种型。本文所使用的NA指以在GP5的第44位、第51位或二者处的保守聚糖来表征的PRRSV的同种型。每种毒株给定了一个与‘254的表7中所示的GP5氨基酸序列的胞外结构域内的糖基化位点的数量相应的编号，但是不包括位于NA毒株的第44和51位氨基酸处的高度保守的聚糖以及位于EU毒株的第46和53位氨基酸处的高度保守的聚糖。因此，NA-0指不具有聚糖的NA毒株的GP5的胞外结构域，EU-0指不具有聚糖的EU毒株的GP5的胞外结构域。例如，NA-1指具有位于GP5的胞外结构域上1个聚糖的北美毒株的GP5的胞外结构域，所述1个聚糖不包括位于NA毒株的第44和51位氨基酸处的高度保守聚糖。表1代表所述PRRSV的聚糖分型。
表1
aNA+北美，EU＝欧洲
b位于GP5的胞外结构域的聚糖数目，排除了NA毒株的位于氨基酸44和51处的高度保守聚糖以及EU毒株的位于氨基酸46和53处的高度保守聚糖。当这些聚糖不存在时，应按以下标记所述毒株：如果NA-1毒株在氨基酸44处无聚糖，将其描述为NA-1(Δ44)。
c随着预测的聚糖的数目增多，对诱导保护性(中和性)抗体的抗性和/或对所述抗体的敏感性增大。
NA-0和EU-0分别被预测为所有NA和EU毒株的亲本毒株。因此应包括所述病毒以尝试产生交叉反应性抗体。在NA-0和EU-0之后，聚糖分型可以作为异源性的预测因子，而目前对PRRSV的异源性限定较差。
在本发明中可使用能够将一种病原体与所述物种的另一病原体区分开的任何生物分型方法。
本发明人提供了一种新的产生自体疫苗的方法。在目前使用的方法中，分离全生物，然后使其减毒或灭活，用所制备的病毒接种动物。举例来说，Livingston等的美国专利4692412记载了制备针对肿瘤疾病的自体疫苗的方法，所述方法是通过将包含先祖杀囊球菌(Progenitorcryptocide)的无菌血液样品与无菌蒸馏水混合、孵育所述混合物、杀死或灭活所述混合物中的先祖杀囊球菌、微孔过滤所述混合物以除去血细胞，以及稀释过滤产物以形成疫苗。
在本发明人的目前工作中，并非使用全生物(活的或灭活的)作为疫苗，仅使用来源自病原体的一个或多个目的微生物单独基因(GOI)(其也被称为目的核酸分子(NOI)或其片段)，和/或组成自体疫苗的所述基因编码的蛋白质。令人吃惊的是，可使用所述核酸分子产生疫苗并且提供保护动物的有效疫苗。目的基因是指可代表或不代表完整基因并且由其可生成RNA干扰分子或者编码多肽或其片段的核酸分子，其当被给予动物时在动物中产生保护性和/或免疫应答。本领域技术人员了解，实际疫苗使用保护性分子并可含有目的基因或其片段，或可含有产生保护性应答的多肽或其片段，或可含有干扰RNA，或可含有其组合。因为待获得的NOI已经被鉴定(即在所述NOI被从样品中获得之前就已经被预先确定)，所以能够产生快速且有效的疫苗。
对许多病原体而言，诱导保护所需的保护性分子是已知的。首先从来自农场的诊断样品中扩增病原体的目的基因。尽管能够分离并纯化所述病原体，但是不必使用该方法。在该实施方案中，这不但消除了不必要的步骤并加速了生产过程，还不需要具有分离的病原体。可以通过使用任何可用的方法(例如PCR)，分离所述基因或分离其任何保护性部分。然后所述基因用于制备疫苗并最终用于接种已经或可能会暴露于所述病原体的动物。与目前可用的疫苗相比，这些疫苗将是更快速的、生物型特异性的并且与诊断检测兼容。这些特征使所述疫苗能够快速进入市场。举例来说，在畜牧业(例如猪产业)或水生无脊椎动物养殖业中，或在具有高水平合并的任何其他情况中甚至具有其他优势。
在一个实施方案中，通过复制子亚单位(在某些实例中被称作自体蛋白质)或复制子颗粒(在某些实例中被称作RNA颗粒)技术产生抗原来实现快速生产所述疫苗的其它优势。在使用NOI作为保护性分子或使用NOI来产生保护性分子之前，必须从疾病爆发的地点(例如单个农场或地理区域)获得所述NOI。在一个实施方案中，一旦获得遗传信息，就可使用复制子亚单位或复制子颗粒方法来产生自体疫苗。概括来说，一种方法是通过将表达NOI的复制子RNA引入培养的细胞中，来产生RNA亚单位(RS)疫苗。一旦已将携带NOI的复制子引入细胞，每个个体细胞都表达NOI。甲病毒(alphavirus)复制子载体以非常高的水平表达异源蛋白(最高达总细胞蛋白的20％)。通过裂解细胞以收集在所述细胞中表达的来源自NOI的保护性抗原。然后NOI/细胞裂解物组成自体疫苗。另一种方法是产生RNA颗粒(RP)疫苗。通过将表达外源基因的复制子RNA和两种辅助RNA引入培养的细胞中来制备RP，其中一种辅助RNA编码甲病毒衣壳蛋白，另一种编码甲病毒糖蛋白(E2和E1)。使用多种方法(例如脂转染或电穿孔)，能够将这些RNA引入细胞中。在已将所述三种RNA引入细胞中之后，所述复制子RNA按顺式自我复制，所述辅助RNA按反式自我复制。所述辅助RNA生成结构蛋白，所述结构蛋白识别复制子RNA并将其包装成RP。表达外源基因的RP组成自体疫苗。
用来产生这类复制子的方法及其变化是本领域技术人员已知的。说明性方法记载于美国专利6156558，所述专利以引用的方式全文纳入本文，以及还记载于美国专利6521235；6531135；和美国专利7442381；6541010；7045335；和5792462，所述专利全部以引用的方式全文纳入本文。
在本发明的实施方案中使用甲病毒载体和甲病毒复制子颗粒。术语“甲病毒”具有其在本领域中的常规含义，包括作为披膜病毒科(Togaviridae)成员的甲病毒属的多个种。其包括以下甲病毒：例如东方马脑炎病毒(EasternEquineEncephalitisvirus，EEE)、委内瑞拉马脑炎病毒(VenezuelanEquineEncephalitisvirus，VEE)、沼泽地病毒(Evergladesvirus)、穆坎布病毒(Mucambovirus)、皮克孙纳病毒(Pixunavirus)、西方马脑炎病毒(WesternEquineEncephalitisvirus，WEE)、辛德比斯病毒(Sindbisvirus)、南非虫媒病毒86号(SouthAfricanArbovirusNo.86)、西门利克森林病毒(SemlikiForestvirus)、米德尔堡病毒(Middelburgvirus)、切昆贡亚病毒(Chikungunyavirus)、奥尼永尼永病毒(O'nyong-nyongvirus)、罗斯河病毒(RossRivervirus)、Barmah森林病毒(BarmahForestvirus)、盖塔病毒(Getahvirus)、鹭山病毒(Sagiyamavirus)、贝巴鲁病毒(Bebaruvirus)、马亚罗病毒(Mayarovirus)、乌纳病毒(Unavirus)、奥拉病毒(Auravirus)、沃达罗河病毒(Whataroavirus)、Babanki病毒、克泽拉格齐病毒(Kyzylagachvirus)、高地J病毒(HighlandsJvirus)、摩根堡病毒(FortMorganvirus)、恩杜姆病毒(Ndumuvirus)和巴革依河病毒(BuggyCreekvirus)。病毒基因组是单链、信使有义RNA，在5'端以甲基化帽修饰，在3'端以可变长度的多聚腺苷酸区(poly(A)tract)修饰。在二十面体核衣壳中，包含单一病毒蛋白C的结构亚单位与RNA基因组相关联。在病毒粒子中，衣壳被覆盖着跨膜蛋白刺突(spike)的规则阵列的脂质包膜所包围，每种所述蛋白刺突是由两种糖蛋白E1和E2的异二聚体复合物组成。参见Pedersenetal.,J.Virol.14:40(1974)。辛德比斯病毒和西门利克森林病毒被认为是典型的甲病毒，其已被广泛研究。参见Schlesinger，TheTogaviridaeandFlaviviridae,PlenumPublishingCorp.,NewYork(1986)。VEE病毒也已经被研究。参见Davis等人的美国专利No.5185440。
如上述专利所说明的，通过使用甲病毒复制子载体来制备复制子亚单位以获得多肽，以及使用甲病毒复制子颗粒来产生保护性分子是本领域技术人员已知的方法。对所述可用的方法进行了许多改良，在本发明中可以使用任何使用复制子亚单位或复制子颗粒法的方法。在某个实施方案中，使甲病毒复制子RNA载体在宿主细胞中表达目的基因并收集表达的产物。在另一个实施方案中，将包含目的基因的复制子RNA和编码甲病毒衣壳蛋白和编码糖蛋白的两种辅助RNA一起引入细胞中。所述复制子RNA被包装成复制子颗粒。该复制子颗粒可以是保护性分子。
因此在一个实施方案中，该系统提供传染性、有缺陷的甲病毒颗粒，其中每种颗粒包含甲病毒复制子RNA，并且其中所述复制子RNA包含甲病毒包装信号、一个或多个异源RNA序列和编码至少一种甲病毒结构蛋白的序列，并且其中所述复制子RNA还缺少编码至少一种甲病毒结构蛋白的序列；其中所述群体中不包含可检测的能够复制的甲病毒颗粒，所述能够复制的甲病毒是通过培养物中受纳细胞的传代来确定的。例如，在以引用的方式全文纳入本文的美国专利6531135中，一个实施方案中示出了使用辅助细胞以在甲病毒受纳细胞中表达传染性、有复制缺陷的甲病毒颗粒的RP系统。所述辅助细胞包括(a)编码(i)至少一种甲病毒结构蛋白和(ii)不编码至少一种甲病毒结构蛋白的第一辅助RNA；以及(b)与第一辅助RNA分开的第二辅助RNA，所述第二辅助RNA(i)不编码由所述第一辅助RNA编码的至少一种甲病毒结构蛋白，并且(ii)编码所述第一辅助RNA不编码的至少一种甲病毒结构蛋白，从而使得所有的甲病毒结构蛋白在所述细胞中一起包装成甲病毒颗粒。优选地，从至少第一辅助RNA缺失甲病毒包装片段。
在制备这类复制子时，本领域技术人员可采用许多变化。例如，在所述专利记载的另一个实施方案中，辅助细胞还包括编码所述甲病毒包装片段和插入的异源RNA的复制子RNA。在所述实施方案中，其中所述辅助细胞还包含复制子RNA，可以并且优选使第一辅助RNA和第二辅助RNA同时缺失所述甲病毒包装片段。例如，在一个实施方案中，其中所述辅助细胞包含编码所述甲病毒包装片段和插入的异源RNA的复制子RNA，第一辅助RNA包含甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白，并且第二辅助RNA包含甲病毒衣壳蛋白。在一个实施方案中，所述复制子RNA、第一辅助RNA和第二辅助RNA都在不同分子上，并且被共同转染到宿主细胞中。
在其他实施方案中，所述辅助细胞包含编码甲病毒包装片段、插入的异源RNA和由所述第二辅助RNA编码的甲病毒衣壳蛋白的复制子RNA，并且所述第一辅助RNA包含甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白。因此，所述复制子RNA和第一辅助RNA在不同分子上，并且所述复制子RNA和第二辅助RNA在单独一个分子上。异源RNA包括外源RNA。
编码结构蛋白的RNA，即第一辅助RNA和第二辅助RNA，可有利地包含一个或多个减毒突变。在一个实施方案中，第一辅助RNA和第二辅助RNA中的至少一个包含至少一种减毒突变。减毒突变提供的优势是，在细胞中的RNA重组事件中，结构基因和非结构基因在一起将产生毒力降低的病毒。
另一方面，提供了制备传染性、非活的复制缺陷的甲病毒颗粒的方法。所述方法包括用复制缺陷的复制子RNA转染上述辅助细胞，在转染的细胞中产生甲病毒颗粒，然后从所述细胞中收集所述甲病毒颗粒。所述复制子RNA编码甲病毒包装片段和异源RNA。所述转染的细胞还包括上文所述的第一辅助RNA和第二辅助RNA。
另一方面，提供了用于表达传染性、非活的复制缺陷的甲病毒的一组RNA。这组RNA一起包括(a)编码启动子序列和插入的异源RNA的复制子RNA，其中从所述复制子RNA缺失编码至少一种甲病毒的结构蛋白的RNA，使得所述复制子RNA为复制缺陷的；以及(b)与所述复制子RNA分开的第一辅助RNA，其中所述第一辅助RNA反向编码从所述复制子RNA缺失的结构蛋白(所述结构蛋白包含或不包含启动子序列)。在此实施方案中，优选地，编码至少一种结构蛋白的RNA片段位于除了第一辅助RNA以外的RNA上。因此，例如，这组RNA可包括复制子RNA，所述复制子RNA包含编码甲病毒包装序列、插入的异源RNA和甲病毒衣壳蛋白的RNA，但是同时从其中缺失甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白；并且第一辅助RNA包含编码甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA。
在另一个实施方案中，这组RNA还包括与所述复制子RNA和第一辅助RNA分开的第二辅助RNA。在该实施方案中，第二辅助RNA反向编码至少一种不同于所述复制子RNA和第一辅助RNA所编码的结构蛋白的结构蛋白。因此，例如，这组RNA可包含复制子RNA，其包含编码甲病毒包装序列和插入的异源RNA的RNA；第一辅助RNA，其包含可编码启动子序列的RNA和编码甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA；以及第二辅助RNA，其包含编码甲病毒衣壳蛋白的RNA，所述复制子RNA、第一辅助RNA和第二辅助RNA位于不同的分子上，彼此反向。
另一方面，提供了在可药用载体中包含有效免疫原量的上文所述的传染性甲病毒颗粒的药物制剂。参见，例如，‘135专利第2列第10行-第11列第52行，其包括实施例1-5。
本文使用的术语“结构蛋白”或“甲病毒结构蛋白”指生成包含复制子RNA的颗粒所需的编码的蛋白质，并且包括衣壳蛋白、E1糖蛋白和E2糖蛋白。如本文所述，甲病毒结构蛋白分布在一种或多种辅助RNA(即第一辅助RNA和第二辅助RNA)中。此外，一种或多种结构蛋白可以位于与复制子RNA相同的RNA分子上，只要复制子RNA缺失至少一种结构蛋白从而使所述复制子和得到的甲病毒颗粒是复制缺陷的。本文所使用的术语“缺失的”或“缺失”是指根据标准用法，完全缺失具体所示片段或缺失具体所示片段的足够多的一部分，使所述片段失效或丧失功能。参见，例如，Temin等的美国专利No.4650764。本文使用的术语“复制缺陷”是指在辅助RNA不存在的情况下，复制子RNA不能在宿主细胞中生成颗粒。即宿主细胞中不能生成其他颗粒。复制子RNA是复制缺陷的原因在于，所述复制子RNA不包含生成颗粒所需的全部甲病毒结构蛋白(这是由于其中缺失了至少一种所需的结构蛋白)。
用于生成传染性、复制缺陷的甲病毒颗粒的辅助细胞包含上文所述的一组RNA。这组RNA主要包括第一辅助RNA和第二辅助RNA。所述第一辅助RNA包含编码至少一种甲病毒结构蛋白但是不编码所有结构蛋白的RNA。换言之，所述第一辅助RNA不编码至少一种甲病毒结构蛋白；即从第一辅助RNA缺失至少一种甲病毒结构蛋白基因。在一个实施方案中，第一辅助RNA包含编码甲病毒E1糖蛋白的RNA，从所述第一辅助RNA缺失甲病毒衣壳蛋白和甲病毒E2糖蛋白。在另一个实施方案中，第一辅助RNA包含编码甲病毒E2糖蛋白的RNA，从所述第一辅助RNA缺失甲病毒衣壳蛋白和甲病毒E1糖蛋白。在第三个优选实施方案中，第一辅助RNA包含编码甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA，从所述第一辅助RNA缺失甲病毒衣壳蛋白。
第二辅助RNA包含编码衣壳蛋白的RNA，所述蛋白与第一辅助RNA编码的结构蛋白不同。在所述实施方案中，其中第一辅助RNA包含仅编码甲病毒E1糖蛋白的RNA，第二辅助RNA可包含编码从第一辅助RNA缺失的甲病毒衣壳蛋白和甲病毒E2糖蛋白之一或二者的RNA。在所述实施方案中，其中第一辅助RNA包含仅编码甲病毒E2糖蛋白的RNA，第二辅助RNA可包括编码从第一辅助RNA缺失的甲病毒衣壳蛋白和甲病毒E1糖蛋白之一或二者的RNA。在所述实施方案中，其中第一辅助RNA包含编码甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA，第二辅助RNA可包含编码从第一辅助RNA缺失的甲病毒衣壳蛋白的RNA。
在一个实施方案中，从至少第一辅助RNA缺失包装片段或“衣壳化序列”。在一个优选的实施方案中，从第一辅助RNA和第二辅助RNA都缺失包装片段。
在一个实施方案中，其中从第一辅助RNA和第二辅助RNA都缺失包装片段，除了所述第一辅助RNA和第二辅助RNA之外，辅助细胞优选地还包含复制子RNA。所述复制子RNA编码包装片段和插入的异源RNA。所述插入的异源RNA可以是编码蛋白质或肽的RNA。所述插入的异源RNA可编码希望被宿主甲病毒受纳细胞表达的蛋白质或肽，并且包含在所述细胞中表达所述蛋白质或肽所需的启动子和调控片段。
例如，在本发明的一个优选实施方案中，辅助细胞包含一组RNA，其包括：(a)复制子RNA，其包含编码甲病毒包装序列和插入的异源RNA的RNA；(b)第一辅助RNA，其包含编码甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋的RNA；和(c)第二辅助RNA，其包含编码甲病毒衣壳蛋白的RNA，从而使得所述甲病毒E1糖蛋白、甲病毒E2糖蛋白和衣壳蛋白一起在宿主细胞中包装成甲病毒颗粒。
在其他实施方案中，复制子RNA和第一辅助RNA在不同的分子上，并且复制子RNA和第二辅助RNA共同在单独一个分子上，使得第一分子(即第一辅助RNA)包含编码至少一种但并非全部所需的甲病毒结构蛋白的RNA，和第二分子(即复制子RNA和第二辅助RNA)包含编码包装片段、插入的异源DNA和衣壳蛋白的RNA。因此，所述衣壳蛋白是由第二辅助RNA编码，但是第二辅助RNA和复制子RNA一起位于第二分子上。例如，在本发明一个优选的实施方案中，辅助细胞包括一组RNA，其包括：(a)复制子RNA，其包含编码甲病毒包装序列、插入的异源RNA和甲病毒衣壳蛋白的RNA，和(b)第一辅助RNA，其包含编码甲病毒E1糖蛋白和甲病毒E2糖蛋白的RNA，从而使得所述甲病毒E1糖蛋白、甲病毒E2糖蛋白和衣壳蛋白在宿主细胞中一起包装成甲病毒颗粒。
在本发明的一个实施方案中，编码甲病毒结构蛋白(即衣壳蛋白、E1糖蛋白和E2糖蛋白)的RNA包含至少一个减毒突变。本文所使用的短语“减毒突变”和“减毒氨基酸”指根据本领域的标准术语的这样的核苷酸突变或编码的氨基酸：由于该突变而导致在其宿主中致病的可能性降低，参见，例如，B.Davisetal.，Microbiology132(第三版，1980)，所述突变是置换突变或读码框内缺失突变。短语“减毒突变”不包括对病毒致死的突变。因此，根据该实施方案，第一辅助RNA和第二辅助RNA中至少一种包含至少一个减毒突变。在一个更优选的实施方案中，第一辅助RNA和第二辅助RNA中至少一种包含至少两个或多个减毒突变。所述多个减毒突变可以位于第一辅助RNA或位于第二辅助RNA中，或它们可以随机分布——一个或多个减毒突变位于第一辅助RNA，并且一个或多个减毒突变位于第二辅助RNA。适合的减毒突变取决于使用的甲病毒。例如，当甲病毒是VEE时，适合的减毒突变可选自E2氨基酸位置76处的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选赖氨酸、精氨酸或组氨酸作为E2第76位氨基酸；E2氨基酸位置120处的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选赖氨酸作为E2第120位氨基酸；E2氨基酸位置209的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选赖氨酸、精氨酸或组氨酸作为E2第209位氨基酸；E1第272位氨基酸处的密码子，所述位置指定减毒突变，优选苏氨酸或丝氨酸作为E1第272位氨基酸；E1第81位氨基酸处的密码子，所述位置指定减毒突变，优选异亮氨酸或亮氨酸作为E1第81位氨基酸；和E1第253位氨基酸处的密码子，所述位置指定减毒突变，优选丝氨酸或苏氨酸作为E1第253位氨基酸。
在其他实施方案中，其中甲病毒是南非虫媒病毒86号(S.A.AR86)，适合的减毒突变可选自nsP1氨基酸位置538处的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选异亮氨酸作为nsP1第538位氨基酸；E2氨基酸位置304处的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选苏氨酸作为E2第304位氨基酸；E2氨基酸位置314处的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选赖氨酸作为E2第314位氨基酸；E2氨基酸位置376处的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选丙氨酸作为E2第376位氨基酸；E2氨基酸位置372处的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选亮氨酸作为E2第372位氨基酸；nsP2氨基酸位置96处的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选甘氨酸作为nsP2第96位氨基酸；nsP2氨基酸位置372处的密码子，所述位置指定减毒氨基酸，优选缬氨酸作为nsP2第372位氨基酸。在使用其他甲病毒的实施方案中适用的减毒突变是本领域技术人员已知的。根据已知方法，通过对编码RNA的cDNA进行定点诱变而将减毒突变引入RNA。参见Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488(1985)。或者，可根据已知方法，通过取代编码RNA的cDNA中的同源限制性片段，而将突变引入RNA。
为了研发自体重组蛋白，通过聚合酶链式反应(PCR)使用特定引物扩增来源自病原体(直接或使用受影响的组织或其他样品)的基因。然后将PCR产物克隆至pVEK表达系统质粒载体中，生成重组质粒。将所述pVEK质粒载体转录生成RNA。将纯化的RNA电穿孔到Vero细胞中，导致生成自体重组蛋白。通过使用非离子去污剂裂解电穿孔后的细胞来收集所述蛋白质。图1中记载了所述生产方法的示意图。使用来源自病原(diseaseagent)的特定引物以生成cDNA自身供体基因(ADG)，其有时也被称为目的基因(GOI)。然后将ADG克隆到载体(例如本文所示的pVEK质粒载体)中，生成重组质粒。然后转录所述pVEK重组质粒，生成RNA。将纯化的RNA电穿孔到Vero细胞中，导致生成自体重组蛋白。通过细胞裂解收集所述蛋白质。疫苗本身由自体重组蛋白组成，所述重组蛋白来源于从诊断分离物获得其序列的基因。将所述蛋白质与佐剂混合。
使用名为pVEK的合成质粒载体。所述pVEK质粒载体包含来自减毒的委内瑞拉马脑炎病毒VEE病毒疫苗TC-83的非结构基因的衍生物。已经对所述pVEK质粒载体进行修饰以实现最佳供体基因表达(Kamrud,K.I.,Custer,M.,Dudek,J.M.,Owens,G.,Alterson,K.D.,Lee,J.S.,Groebner,J.L.&Smith,J.F.(2007).AlphavirusrepliconapproachtopromoterlessanalysisofIRESelements.Virology.360,376-87.Epub2006Dec6)。将所述质粒线性化并在帽类似物(Capanalog)存在的情况下使用T7表达酶(Promega,Madison,WI)从所述质粒DNA转录RNA，并且纯化RNA。通过电穿孔使纯化的RNA进入Vero细胞(衍生自Master细胞)以翻译生成自体重组蛋白。pVEK质粒载体和转录的RNA都不包含TC-83的结构的、衣壳或糖蛋白基因。
非结构基因通过形成能够转录其他自体重组基因RNA的复合体，来辅助所述自体重组蛋白的表达。Nsp1作为加帽酶，并被认为在所述复合体的结合和组装上发挥主要作用。Nsp2是RNA结合蛋白，其具有NTPase活性并可能作为RNA解旋酶发挥功能解开双链RNA(duplexRNA)。Nsp2作为非结构多聚蛋白的翻译后加工中所需的蛋白酶的发挥功能。Nsp3是功能尚未确定的磷蛋白。Nsp4已被鉴定为RNA聚合酶。Rayner,J.O.,Dryga,S.A.&Kamrud,K.I.(2002).Alphavirusvectorsandvaccination.RevMedVirol12,279-96。
pVEK载体通过包含与每种供体基因相连的内部核糖体进入位点(IRES)元件，在翻译水平控制蛋白质表达(Kamrud,K.I.,Custer,M.,Dudek,J.M.,Owens,G.,Alterson,K.D.,Lee,J.S.,Groebner,J.L.&Smith,J.F.(2007).AlphavirusrepliconapproachtopromoterlessanalysisofIRESelements.Virology.360,376-87.Epub2006Dec6)，如图2所示。所述序列与TC-83基因组序列的不同在于4个突变和不存在全部TC-83结构基因。此外，已在所述质粒骨架中插入作为选择性标记的卡那霉素抗性开放阅读框，以扩增包含所述复制子质粒DNA的大肠杆菌。还已插入了多克隆位点来代替结构蛋白基因。所得到的质粒pVEK是使用COLE1复制起点在细菌中复制，并包含5’非翻译区、TC-83非结构蛋白序列、26S启动子、多克隆位点和3’非翻译区，所有这些都位于用于体外RNA转录的T7聚合酶启动子的下游。图3示出了具有自体供体基因插入片段的pVEK质粒载体。通常使用限制性内切酶AscI和PacI以在ADG之外的合适位点特异性消化ADGcDNA，然后与pVEK质粒载体连接。图4是ADG插入pVEK质粒载体的示意图。因为电穿孔的RNA在细胞质中生成自体重组蛋白而没有任何DNA中间形式，所述自身重组蛋白质疫苗避免了染色体整合的担忧。因此不会发生细胞核重组事件。
在另一个实施方案中，制备了复制子颗粒(RP)疫苗。对疫苗研发而言，所述RP载体具有多种优势，包括准确生成天然(native)蛋白质、趋向淋巴样细胞、缺乏病毒复制和传播、诱导粘膜和全身免疫、顺序免疫的潜能，以及在动物体内缺少对VEE病毒的预存免疫，尽管动物确实对所述病毒产生免疫应答。DickermanRW,BakerGJ,OrdonezJV,chererWF(1973),VenezuelanEquineEncephalomyelitisViremiaandAntibodyResponsesofPigsandCattle,AmericanJournalofVeterinaryResearch34:357-361。VEE的复制策略与其他甲病毒的复制策略类似。StraussJ,StraussE(1994),Thealphaviruses:geneexpression,replication,andevolution,MicrobiolRev58:491-562。
从正义基因组RNA，翻译出四种非结构蛋白(nsP1–nsP4)，其发挥作用以复制全长反义RNA。所述反义RNA作为模板，用来复制额外的基因组RNA，并用来合成亚基因组信使RNA(26SmRNA)(与基因组RNA相比，其产量10倍摩尔过量)，所述信使RNA指导VEE病毒结构蛋白的合成。所述结构蛋白最初被翻译为多聚蛋白质，所述多聚蛋白质经过共翻译和翻译后切割而释放衣壳(C)蛋白和两种成熟的包膜糖蛋白(E1和E2)。由于VEE病毒是正义RNA病毒，因此VEE的全长cDNA克隆可用来生成RNA转录物，所述RNA转录物当被引入易感细胞时，其将启动完整的病毒复制周期并生成传染性病毒(DavisNL,WillisLV,SmithJF,JohnstonRE(1989),InvitrosynthesisofinfectiousVenezuelanequineencephalitisvirusRNAfromacDNAclone:analysisofaviabledeletionmutant,Virology171:189-204.)。
使用DNA质粒的定点诱变，能够产生在包膜糖蛋白中包含突变(其导致减毒表型)的VEE病毒。当将所述VEE病毒的减毒变体接种到动物中时，其不会引起疾病或显著的病毒血症，但是能够在小鼠、马和灵长类中诱导对抗随后有毒力的VEE激发的保护性免疫。(DavisN,PowellN,GreenwaldG,WillisL,JohnsonB,SmithJ,JohnstonR(1991))AttenuatingmutationsintheE2glycoproteingeneofVenezuelanequineencephalitisvirus:constructionofsingleandmultiplemutantsinafull-lengthcDNAclone,Virology183:20-31；GriederF,DavisN,AronsonJ,CharlesP,SellonD,SuzukiK,JohnstonR(1995),SpecificrestrictionsintheprogressionofVenezuelanequineencephalitisvirus-induceddiseaseresultingfromsingleaminoacidchangesintheglycoproteins,Virology206:994-1006。
同样，能够将外源基因插入cDNA质粒中以取代VEE病毒结构蛋白基因区域，并且当将来自所述质粒的RNA转录物引入细胞时，其将复制并表达所述异源基因，如图5-6的示意图所示。所述自我扩增的复制子RNA将在细胞内指导大量外源基因产物的合成，通常达到细胞总蛋白的15-20％的水平。PushkoP,ParkerM,LudwigGV,DavisN,JohnstonRE,SmithJF(1997),Replicon-HelperSystemsfromAttenuatedVenezuelanEquineEncephalitisVirus:ExpressionofHeterologousGenesinvitroandImmunizationagainstHeterologousPathogensinvivo,JournalofVirology239:389-401。
因为所述复制子RNA不包含VEE的结构基因，其为单环(single-cycle)、增殖缺陷型RNA，并且仅在引入它的细胞中复制。通过提供反式的VEE结构蛋白基因，能够将复制子RNA包装到RP中(图5)。当用复制子RNA和两种单独的辅助RNA共转染细胞时，复制子RNA被包装到RP中，所述两种辅助RNA一起编码全部(complement)的VEE结构蛋白。Pushko,如上文所述。重要的是，因为所述辅助RNA缺少衣壳化所需的包装序列，仅复制子RNA被包装到RP中。因此，所述RP具有增殖缺陷，即它们能够感染培养的或体内的靶细胞，能够高水平表达外源基因，但是缺少产生能够扩散到其他细胞的病毒颗粒所必需的VEE基因组中的关键部分(即VEE结构蛋白基因)。“断裂辅助”系统极大降低了通过RNA-RNA重组使完整基因组再生的可能性，并且通过从全部辅助RNA上去除26S启动子进一步降低了与辅助RNA进行功能性重组的可能性(Kamrudetal2010DevelopmentandCharacterizationofPromoterlessHelperRNAsforProductionofAlphavirusRepliconParticles.JournalofGeneralVirology.91:pp.1723-1727)。作为安全性的独立和其他层次，已将减毒突变整合到糖蛋白辅助中。(Pushkoetal1997)JournalofVirology239:389-401。图6表示VEE复制子颗粒疫苗和包装系统过程。通过在IRES/NOI盒上游和26S启动子下游引入间隔元件能够增加或减少目的核酸分子的表达(Kamrudetal2007,“AlphavirusRepliconApproachtoPromoterlessAnalysisofIRESElements”Virology360(2),pp.376-387.)。此外，当目的基因生成可能的毒性蛋白时，在复制子和辅助RNA经电穿孔进入细胞的同时引入亚磷酰胺吗啉代低聚物(PMO)将关闭表达。在RP包装期间，PMO阻断靶基因的翻译。
基于以下原因，本发明的疫苗是理想的：
1)所述新疫苗不包含活病毒。目前的改性活病毒(MLV)疫苗由于能够扩散、恢复毒力或与野生毒株重组而无法被用于根除尝试。其中农场活病毒被谨慎扩散并用来感染未经药物处理的动物的实践(例如用于猪PRRSV的“血清疗法”)也无法成为成功的疾病控制和根除项目的一部分。
2)所述新疫苗能够区分被感染的动物和接种的动物。目前的MLV和灭活疫苗使用全病毒。本发明不包括完整的传染源。举例来说，在RP疫苗中仅包含PRRSV的一部分，这使得能够根据血清学来区分。例如，因为核衣壳不是ARP疫苗的一部分，能够使用目前的IDEXXELISA来检测被感染的猪/畜群，结果与仅接种的猪/畜群不同。
3)所述新疫苗是自体疫苗并能够被快速制备。由于毒株/生物型变异和缺少交叉保护，自体疫苗是动物疾病治疗所需要的。如本文所示，与常规自体疫苗(3个月)相比，能够更快地制备ARP疫苗(1个月或甚至更短)，使得能够更快地做出反应。
在另一个实施方案中，可以任选地首先通过确定病原体的抗原性漂移来确定制备新型自体疫苗是否更为合适。在所述实施方案中，获取包含上述微生物的样品，并可任选地确认所述微生物的生物型。以流感为例，可确定亚型和簇。通常，流感病毒是由内部的包含分段单链RNA基因组的核糖核蛋白核心和由基质蛋白连接的外部的脂蛋白包膜组成。流感病毒的基因组是由8个片段的线性(-)链核糖核酸(RNA)组成，所述RNA编码免疫原性血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白，以及6种内部核心多肽：核衣壳核蛋白(NP)；基质蛋白(M)；非结构蛋白(NS)；和3种RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)蛋白。在复制期间，基因组病毒RNA在宿主细胞的细胞核中被转录为(+)链信使RNA和(-)链基因组cRNA。所述8种基因组片段的每一种均被包装到核糖核蛋白复合体中，所述复合体除了RNA之外还包含NP和聚合酶复合体(PB1、PB2和PA)。正如已经提到的，根据流感病毒内部蛋白之间的血清交叉反应性的缺失，将流感分成三种类型：甲型流感、乙型流感和丙型流感。根据血凝素和神经氨酸酶蛋白的抗原性差异，将甲型流感病毒进一步分组。下文表2示出了亚型和进一步分类为簇的实例。因为HA和NA氨基酸序列的变化，流感病毒的血凝素抗原在抗原特异性方面频繁改变。
表2
在本发明的一个实施方案中，获得抗血清并确定其是否是相同的生物型——在该实例中其是否以与利用现有疫苗获得的标准物相同的反应方式。对流感而言，通过以血凝素抑制试验为标准进行测量，如以下所述。如果其以相同方式反应，则能够使用现有疫苗，如果不匹配，则可制备新疫苗。这是一种测量漂移(即抗原成分的变化)的方法。这种方法比测定转变(变为新亚型的主要变化)更有效。通过测定抗原成分，病毒可仍然落入相同簇的范围内，但表现出充分的漂移而使新疫苗会更有效。虽然这是通过流感病毒的实例来说明的，显然能够将所述方法应用于任何微生物。
除了确定是否能够有效使用现有疫苗或是否应该研发新疫苗以在微生物改变后提供保护，还可通过持续监测目的动物组的生物型的任何改变(转变或漂移)、目的核酸的变化或病原体的其他变化来进一步辅助所述疫苗的快速和有效制备。确定生物型变化的方法将在下文中讨论。在一个实例中，确定使用所述生物样品的抗原应答与对已知标准物的比较。在另一个实例中，确定了具有已知序列的NOI的同源性。例如但非限制性的，在一个实施方案中，从动物获得生物样品，并且获得病原微生物的核酸序列。必要时扩增所述核酸，并且将其序列与获得的现有序列和/或与所述病原体的已知序列进行比较。在一个实施方案中，可以将所述序列与可从此类序列的数据库中获得的序列进行比较。如果所述序列不同于已知序列，则表示可能需要制备新疫苗。在另一个实施方案中，通过使用所述样品来评估与标准物和已知应答相比的抗原应答，从而确定所述抗原应答。此类监测能够提供制备新疫苗并适应微生物变化中的所需的早期检测。
所获得的样品可以是可包含病原微生物的序列的任何样品。如本文所述，所述样品可以来自血清、样品、鼻腔擦拭物(nasalswab)、组织样品等，以及来自活体动物和死亡动物。可获得生物样品并通过任何便利的方法检测序列。在本发明的一个实施方案中，一种成本合理、易于实施的持续监测方法可以是采集动物的口腔液体(oralfluid)。例如但非限制性的，在一个实施方案中，通过为猪提供绳子而获得猪的唾液。猪将咀嚼绳子，可采集并分析其唾液(参见，例如，Prickettetal.(2008)“DetectionofPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfectioninporcineoralfluidsamples:alongitudinalstudyunderexperimentalconditions”J.VetDiagn.Invest.20:156.)。这是快速便利的采集可含有病原体序列的样品的方法的许多实例中的一种。对致病微生物的持续监测提供了许多优势。
在另一个实施方案中，能够进一步定制疫苗以提供自体疫苗，所述自体疫苗具有针对动物群组所暴露的病原体生物型的保护性，即以对紧急情况做出反应的速度被研发，和/或还考虑了当多个动物群组可能接触时另一动物群组可能暴露于病原体生物型。
例如但非限制性的，可通过获得来自动物群组中的一个动物的生物样品，以及与已知NOI相比的NOI和/或与已知标准物相比的血凝素抑制测定结果，来制备流感疫苗。
在一个实施方案中，疫苗的制备可仅基于来自生物样品的NOI，可包括HI测定，或者包括二者。这使得可以响应于紧急情况而对疫苗研发进行改变。当动物正在表现出疾病征象时，可在一周之内快速制备仅基于来自生物样品的NOI的保护性分子。当情况不太紧急时，可花费时间来进行HI测定以使疫苗研发更有选择性。
例如但非限制性的，测定抗原应答时，当传播中的毒株和现有疫苗株之间有两个以上抗原单位差异时，用新毒株代替目前的疫苗株。例如但非限制性的，在测定对流感的血凝素抑制反应时，当HI测定为320倒数效价时，160HI效价时有一个抗原单位的差异，80HI效价时有两个单位的差异。当所述差异为两个或多个抗原单位时，制备新疫苗。
以下表格示出了使用两种不同的H1β簇分离株抵抗相同的两个抗血清对照样品而获得的HI结果，所述抗血清对照样品来自2009年从农场X分离的β亚型。所述同源分离株与分离株A和B的同源性分别为97％和96％。分离株A与同源β分离株具有相同的针对对照抗血清的HI效价。但是，使用分离株B而获得的效价大于2个抗原单位，因此表明使用所述同源β分离株制备的疫苗可能无法针对分离株B产生有效保护。在这种情况下，应从分离株B制备用于特定动物畜群的自体疫苗。当所述畜群有足够多的接触时，疫苗将包括β亚型保护性分子以及从农场B获得的保护性分子。
表3
这使得甚至能够进一步改良疫苗。
当将疫苗给予生活在一起的同一组动物时，所述疫苗对该组动物肯定有效。当另一组动物与一组动物或来自所述动物的生物样品有足够多的接触时，可制备进一步定制的疫苗。
在一个实施方案中，当预测两组动物之间相互暴露时，从第一组动物的至少一只动物获得样品，并确定其生物型，然后将其与来自第二组动物的至少一只动物的样品进行对比。当存在相似的抗原反应或NOI使得可期待两种微生物会产生交叉保护时，可基于所述NOI来制备单一保护性分子。当两种NOI不同时，可制备两种保护性分子，其中一种基于一个NOI，另一种基于第二个NOI。所述保护性分子可以以单一疫苗的形式提供，或分开给予，同时或依次分开给予，给药形式可以采用任何便利的形式。
例如但非限制性的，能够制备保护畜群(通常被定义为生活在一起的一组动物)中动物的定制疫苗。在一个实例中，从两个畜群中获得生物样品，所述两个畜群是分开的但是由于使用共同的运输区域预计会暴露于轮状病毒微生物。轮状病毒的VP7蛋白是外壳的主要糖蛋白。参见，例如，Sabara等的美国专利6086880。从每个畜群采集生物样品并通过PCR获得轮状病毒C和轮状病毒B的VP7基因的NOI。畜群I和畜群II之间的轮状病毒C的VP7NOI具有97％的同源性。畜群I和畜群II之间的轮状病毒B的VP7NOI具有69％的同源性。制备来自VP7轮状病毒C的NOI的一种保护性分子，以及来自轮状病毒B的每个VP7基因的两种保护性分子。给予两个畜群全部三种保护性分子，以为两组提供定制保护。
本发明能够应用于在动物中产生有害影响的任何微生物/病原体，所述微生物/病原体不限于任何特定的这类微生物或动物。具体而言，本发明提供了进行免疫以抵抗病原生物对动物的感染、或预防病原生物对动物的感染、或减轻由病原生物对动物的感染引起的症状的方法。因此当提及微生物时，其意指包括任何致病原(disease-causingagent)，例如病毒、细菌、真菌或原生动物寄生虫。本发明的疫苗提供了针对疾病的保护，即针对所有或一些对动物健康的有害影响的保护。
具体而言，本发明提供了进行免疫以抵抗病原生物对动物的感染(例如由病毒、细菌、真菌或原生动物寄生虫引起的感染)、或预防病原生物对动物的感染、或减轻由病原生物对动物的感染引起的症状的方法。
本发明的方法可用于脊椎动物，其包括但不限于人类、犬(例如，狗)、猫(例如，猫)、马(例如，马)、牛(例如，牛)、绵羊(例如，绵羊)、山羊(例如，山羊)、猪类动物(例如，猪)和兔子；以及禽类，其包括但不限于鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦和平胸类鸟(鸵鸟、鸸鹋、鹤鸵等)；以及家养皮毛动物，例如雪貂、水貂、鼬类(mustilid)；以及鱼类例如有鳍鱼、甲壳类动物和其他水生动物。有鳍鱼包括所有脊椎鱼类，其可以是硬骨鱼或软骨鱼。有鳍鱼的其他实例包括鲑科鱼，包括鲑鱼和鳟鱼种，例如银鲑(Oncorhynchuskisutch)、溪红点鲑(Salvelinusfontinalis)、褐鳟(Salmotrutta)、大鳞鲑(Oncorhynchustshawytscha)、马苏鲑(Oncorhyncusmasou)、细鳞鲑(Oncorhynchusgorbuscha)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、北极红点鲑(Salvelinusalpinus)和大西洋鲑鱼(Salmosalar)。但是，容易染病的任何其他鱼类物种均可受益，例如观赏鱼种、锦鲤、金鱼、鲤鱼、鲶鱼、黄尾鱼(yellowtail)、海鲷、海鲈、梭子鱼、大比目鱼、黑线鳕鱼、罗非鱼、大菱鲆、狼鱼等。甲壳类动物的实例包括但不限于蛤、龙虾、虾、螃蟹和牡蛎。其他养殖的水生动物包括但不限于鳗鱼、乌贼和章鱼。非限制性实例包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)、1型牛疱疹病毒(BHV1)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、3型牛副流感病毒(PI-3)、腺病毒、牛支原体、艰难梭菌、肠毒性大肠杆菌、溶血性巴氏杆菌、牛海绵状脑病、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、钩端螺旋体病(例如，问号钩端螺旋体血清变型哈尔乔型)、网尾线虫(肺蠕虫)、昏睡嗜血杆菌、溶血性巴氏杆菌、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、假性狂犬病病毒、猪水疱病病毒(SVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪环状病毒1和2(PCV)、猪流感病毒(SIV)；以及布鲁杆菌，其任选地细分为流产布鲁杆菌和马尔他布鲁杆菌；猫疱疹病毒(FHV)、猫嵌杯样病毒(FCV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、狂犬病病毒、犬疱疹病毒(CHV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒、犬钩端螺旋体、出血性黄疸钩端螺旋体、感冒伤寒性钩端螺旋体、博氏疏螺旋体、支气管败血性博德特氏杆菌、马动脉炎病毒(EAV)和马疱疹病毒(1型或4型)。
本发明还可用于无脊椎动物，在一个实施方案中用于水生无脊椎动物。在本文所提供的实例示出了将本发明用于虾，其被认为特别适用于保护虾(软甲亚纲，其包括十足目(包括枝状鳃亚目(Dendrobranchiates)例如对虾)和囊鳃总目(Carideans)例如虾)免受疾病或病症。但是，其他无脊椎动物特别是水生(淡水或海洋)无脊椎动物被认为从本发明所提供的针对疾病和病症的保护中受益，所述水生无脊椎动物的非限制性实例包括甲壳纲(例如，龙虾、螃蟹、虾、小龙虾)、软体动物门(例如，乌贼、蛤、章鱼、蜗牛、鲍鱼、贻贝)、多孔动物门(海绵)、刺胞动物门(例如，水母和海葵)、栉水母门、棘皮动物门和水生蠕虫。如本文所阐述的，本发明特别适用于具有商业价值的水生无脊椎动物，并且特别适用于养殖的水生无脊椎动物(与海洋中野生生物相对)。如本文所示，可以通过浸没、口服递送等，将本发明的核酸分子和/或多肽或其片段递送到所述动物的消化道(在给予后，在整个消化道或消化道的一部分能够发现所述核酸或多肽或其片段)。与例如注射的方法相比，这极大地有助于将疫苗递送至动物，并提供了对动物进行疫苗接种的实用且有效的方法，特别是对大批动物的大规模疫苗接种。
显然，本发明最适用于这样的实施方案，其中所述动物聚集在大牧场、饲养院、农场、池塘或区域中。但是，其还适用于治疗个体动物。例如，在宠物业中，猫或狗可暴露于特定的微生物生物型，并且制备针对侵袭所述动物以及同窝幼畜或暴露于所述微生物的其它动物的生物型提供保护的疫苗。同样的方法可应用于人类。
本发明的方法包括干扰致病原的核酸分子表达或致病原的核酸分子的方法。当提及干扰表达时，意指核酸分子的表达被抑制、被中断或者被干扰，使得可以保护动物免受疾病。在一个实施方案中，所述方法使用与致病原的核酸分子(靶核酸分子)互补的反义RNA。反义RNA是与靶标(通常是靶核酸分子的信使RNA(mRNA))互补的RNA。“反义”意欲表示与靶核酸分子的5’至3’正常方向的相反方向的序列。当反义RNA被递送到细胞中时，反义RNA序列的表达阻止了所述靶核酸分子编码的蛋白质的正常表达。当提及RNA是互补序列时，意指包括：用于反义抑制的多核苷酸可对应于编码靶多肽的序列的互补序列的全部或一部分，靶多肽转录物的5'和/或3'非翻译区的互补序列的全部或一部分，或者编码靶多肽的转录物的编码区和非翻译区的互补序列的全部或一部分。互补核酸分子是与全部或一部分靶核酸分子的mRNA转录物互补的核酸分子。此外，反义多核苷酸可以与靶序列完全互补(即与靶序列的互补序列100％相同)或部分互补(即与靶序列的互补序列不到100％相同)。可使用反义抑制来抑制相同细胞中多个蛋白质的表达。此外，可使用反义核苷酸的部分来中断靶核酸分子的表达。通常可使用具有至少10个核苷酸、20个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、500、550或更多以及其中间的任何数量的核苷酸的反义序列。所述序列可以与信使RNA的任何序列互补，即其可以邻近5'端或加帽位点、在加帽位点下游、在加帽位点和起始密码子之间，以及可以覆盖全部或仅一部分非编码区，可以跨越(bridge)编码区和非编码区，与全部或部分编码区互补，与编码区的3'端互补，或与mRNA的3'非翻译区互补。所述反义序列可以与唯一序列(uniquesequence)或重复序列互补以增强结合可能性。因此，所述反义序列可涉及与唯一序列、重复序列的单独一个单元或重复序列的多个单元的结合。制备反义核酸分子的方法是已知的。参见，例如，Shewmaker等的美国专利5759829，其以引用的方式纳入本文。
在本发明的另一个实施方案中，使用RNA干扰，并且在一个优选的实施方案中，使用双链RNA分子(dsRNA)。在此方法中，总体上根据靶核酸分子的序列制备部分或完全为双链的RNA。所述dsRNA制备方法的细节可因本领域技术人员的理解而有所不同，其包括，例如但不限于，Graham等的美国专利6573099中的方法，其中使用了两个拷贝的对应于靶序列的序列；或者是Fire等的美国专利6326193中的方法(二者均以引用的方式纳入本文)，其中第一链是对应于靶核酸的RNA序列，第二链是与靶序列互补的RNA序列，每一个以引用的方式全部纳入本文。这些链彼此杂交以形成抑制性dsRNA。对应于靶核酸分子的链可对应于靶核酸分子的全部或部分，只要能够形成dsRNA。当所使用的链是靶核酸的互补(反义)序列时，所述链可以与靶核酸分子的全部或部分互补，只要形成的dsRNA能够干扰靶核酸分子。dsRNA启动这样的反应：其中RNAseIIIDicer酶将dsRNA加工成约21-23个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)，其形成破坏同源mRNA的RNA诱导的沉默复合体RISC(参见，Hammond,S.M.etal.,Nature(2000)404:293-296)。当提及靶核酸分子时，其指其表达被干扰的病原体(diseaseagent)的核酸分子或其片段。通常可使用具有至少10个核苷酸、20个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、300、500、550或更多以及其中间的任何数量的核苷酸的序列。
本发明人已经示出了能够用于本发明的dsRNA序列的实例，并已发现所述dsRNA的片段可用于提供保护性应答。例如，干扰IMNV并提供保护性应答的dsRNA#3是380个碱基对的序列。但是，所述dsRNA的片段提供保护性应答。因此，当提及本发明的dsRNA时，还包括提供所述保护性应答的dsRNA的片段。
如以下所述，本发明人还证实了可以将致病原的编码多肽的核酸分子或其片段给予动物，并且观察到保护性应答。
一旦获得遗传信息，就可以提供核酸分子或所述靶核酸分子的反义RNA或dsRNA作为疫苗。
在一个实施方案中，可给予动物“裸”核酸分子或“裸”dsRNA或反义分子，即不需要以常规表达盒或载体的形式提供所述dsRNA或反义分子。可通过任何便利的方法(例如以下所述的引物扩增和逆转录)制备所述分子。
在另一个实施方案中，可以由任选地包含其他组分的表达盒或载体来递送保护性分子。在另一实施方案中，可以通过复制子颗粒来递送保护性分子。在另一个实施方案中，将疫苗递送到动物消化道以提供保护。
在一个实施方案中，本发明的疫苗包括保护性分子。在另一个实施方案中，通过制备dsRNA来制备疫苗，然后将所述dsRNA直接引入动物细胞或将其置于载体或表达盒中并引入细胞。本发明人已经发现，能够直接将dsRNA引入细胞并产生保护性应答。能够通过DNA载体来递送dsRNA，然后所述载体从被一些细胞DNA-依赖性RNA聚合酶识别的启动子开始生成dsRNA。在另一个实施方案中，可使用复制子颗粒技术来制备疫苗。当反义RNA被用作疫苗时，不囿于任何理论，认为所述反义RNA随后在引入其的细胞中形成dsRNA。
在引入保护性分子之前，鉴定致病原中的待表达或抑制的核酸序列(靶核酸分子或靶基因)。所述保护性分子可表达、抑制任何所述靶核酸分子，或与任何所述靶核酸分子竞争结合位点，所述保护性分子在被时，保护动物免受致病原的影响。在本发明中可使用任何这类保护性分子。
本文所使用的术语核酸或多核苷酸是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。用来制备疫苗的保护性序列可以是从样品获得的相同序列，或者指根据从样品获得的序列以合成方法产生的序列。因此，所述术语包括RNA和DNA，其可以是基因或其部分、cDNA、合成的多聚脱氧核糖核酸序列等，其可以是单链或双链的，以及DNA/RNA杂交分子。此外，本文使用的所述术语包括能够从细胞中分离的天然存在的核酸分子，以及能够例如通过化学合成方法或通过酶学方法(例如通过聚合酶链式反应(PCR))制备的合成分子。除非具体限定，所述术语包括核酸，其包含与参考核酸具有类似结合特性并以与天然存在的核苷酸的类似方式代谢的天然核苷酸的已知类似物。除非另有说明，具体的核酸序列还隐含地包括其保守性修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列，以及明确说明的序列。具体而言，可通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残置换的序列而实现简并密码子置换(Batzeretal.(1991)NucleicAcidRes.19:5081；Ohtsukaetal.(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；Cassoletal.(1992)；Rossolinietal.(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。术语核酸可以与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。
本文所使用的“多肽”通常指肽和蛋白质。在一些实施方案中，多肽可以为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸，或更多，或介于其中间的任何数量。通常认为肽具有超过50个氨基酸。当提及本发明的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“同源物”意指保留了与所述多肽基本上相同的生物功能或活性，即作为抗原和/或提供针对疾病的治疗和/或提供针对疾病的保护的多肽。可以根据保留所述多肽的一种或多种生物活性(即作为抗原和/或提供针对病原体的治疗和/或提供针对病原体的保护)的能力，来选择所述片段、衍生物和同源物。本发明的多肽疫苗可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。本领域技术人员了解，可以通过宿主细胞中的基因表达所述保护性多肽，裂解细胞并将多肽本身用于疫苗。或者可将目的核酸分子或复制子颗粒用于疫苗。
因此当提及保护性分子时，其指核酸分子、多肽或其片段，当当其被给予动物时，产生针对所述微生物的保护性应答。通过所述自体方法来制备所述保护性分子。那么保护性分子可以是在微生物中发现的目的基因，其为直接获得或从目的核酸分子(如合成方法)制备；其生成的多肽；使用目的核酸分子获得的干扰RNA；生成干扰RNA的核酸分子；包括或生成以上任何物质的复制子颗粒；或者组成疫苗的以上任何物质的组合。动物可以产生或不产生应答的抗体，但是由于被给予疫苗，所述动物的发病率或死亡率将降低，这在下文进一步描述。
本文提供了有价值的自身方法产生的疫苗的实例，其中使用致病微生物的目的基因的一部分来制备生物型特异性疫苗。一个这样的实例是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的疫苗。PRRSV的基因组长度为15kb，包含编码RNA依赖性RNA聚合酶的基因(ORF1a和ORF1b)和编码结构蛋白的基因(ORF2至7)。ORF5编码主要包膜糖蛋白，其被命名为GP5。ORF2、ORF3和ORF4分别编码命名为GP2、GP3和GP4的糖蛋白。所述糖蛋白在PRRSV的Lelystad病毒分离株的纯化病毒粒子中较少。GP5蛋白的长度约为200个氨基酸，分子量为25kDa，并且在内质网(ER)中与由ORF6编码的基质蛋白M形成二硫键交联的异源二聚体。M蛋白的长度约为190个氨基酸，19kDa，是非糖基化的。核衣壳蛋白N是由ORF7编码。对来自欧洲和北美的PRRSV分离株的基因组序列和其与单克隆抗体的反应性的分析证明，它们代表两种不同的抗原类型。来自这些大陆的分离株在遗传上是不同的，其一定在很久之前就已经从共同的祖先分出(diverge)。
一种这类有效的多肽及其编码序列的实例记载于Harris等的美国专利7622254，所述专利以引用的方式全文纳入本文。其中记载了猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)的保护性抗原决定簇(PAD)，其提供了针对PRRSV感染的治疗和针对PRRSV感染的保护。其中鉴定出：糖蛋白5(GP5)、基质(M)蛋白或者PRRSV的GP5和M蛋白通过二硫键连接的异源二聚体产生提供针对PRRSV感染的保护的PAD。连接M蛋白和GP5蛋白的二硫键产生自M蛋白的半胱氨酸氨基酸(在北美PRRSV毒株中位于位置9，在欧洲PRRSV毒株中位于位置8)和GP5蛋白的半胱氨酸氨基酸(在北美PRRSV毒株中位于位置48，在欧洲PRRSV毒株中位于位置50)。还示出了包含抗原序列的一个或多个分离的多肽，所述抗原序列包含猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)的糖蛋白5(GP5)，其中所述GP5蛋白具有不同的天冬酰胺氨基酸N-糖基化模式，所述天冬酰胺位于北美PRRSV毒株GP5蛋白的位置1-44，或位于欧洲PRRSV毒株GP5蛋白的位置1-46。在另一个实施方案中，记载了包含抗原序列的分离的多肽，所述抗原序列包含猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)的基质(M)蛋白。另一实施方案示出了所述抗原序列包含PRRSV的GP5序列和基质蛋白(M蛋白)，其中所述GP5蛋白通过二硫键与所述M蛋白连接而使得产生GP5-M异源二聚体，所述二硫键产生自M蛋白的半胱氨酸氨基酸(在北美PRRSV毒株中位于位置9，在欧洲PRRSV毒株中位于位置8)和位于北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置48处的半胱氨酸氨基酸或位于欧洲PRRSV毒株中位置50处的半胱氨酸氨基酸。在本发明的一方面，所述PAD包含GP5-M异源二聚体，所述GP5-M异源二聚体包含GP5的胞外结构域和M的胞外结构域。展示了用于制备针对PRRSV的一种或多种保护性抗原决定簇(PAD)的抗体的方法，用于制备针对PRRSV的至少一种PAD的疫苗的方法，免疫接种猪的方法，用于预防或治疗猪的PRRSV感染的方法，以及用于检测针对动物中PRRSV的至少一种保护性抗原决定簇PAD的抗体的方法。
在本发明的一个实施方案中，利用所述的制备自体疫苗的方法，能够使用PRRSVGP5-M蛋白的共表达来制备有效的针对PRRSV的疫苗。美国猪兽医协会(AASV)最近发表从美国根除PRRSV的立场声明(positionstatement)，如果没有允许区分接种动物和感染动物的安全、有效的疫苗，根除PRRSV是不可能的。复制子颗粒(RP)是所述共表达的一种有效方法的实例。使用MLVPRRSV疫苗具有恢复毒力和与野生病毒重组的风险，因此与不适合根除计划。还可获得PRRSV的常规灭活疫苗。但是这些疫苗需要用3个月来制备，并且因为其包含全病毒而不适合鉴别诊断测试。RP提供了相对于常规疫苗的多种其他优势，包括：不能够复制并引发疾病；同时诱导细胞免疫和体液免疫；能够快速地被纳入疫苗的新的野生毒株；用于顺序免疫的潜能；在存在母体抗体干扰的情况下有效。
本发明人已经证明ARP疫苗方法的可行性，并且验证了这种自体疫苗的制备方法针对PRRSV是安全且有效的。
在另一个实施方案中，流感病毒的多肽提供了免受所述疾病的保护。因此，可分离任何保护性分子并将其用于本发明的方法中，所述保护性分子包括被发现适用于对动物产生保护性作用的多肽、保护性片段、编码多肽或保护性片段的核酸序列或者干扰RNA。流感病毒的基因组由8个片段的线性(-)链核糖核酸(RNA)组成，所述RNA编码免疫原性血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白，以及6种内部核心多肽：核衣壳核蛋白(NP)；基质蛋白(M)；非结构蛋白(NS)和3种RNA聚合酶(PA、PB1、PB2)蛋白。在复制期间，基因组病毒RNA在宿主细胞(例如，动物细胞、细菌、昆虫、酵母、植物、真菌或任何便利的细胞)的细胞核中被转录为(+)链信使RNA和(-)链基因组cRNA。所述8个基因组片段中的每一个都被包装到核糖核蛋白复合体中，所述复合体除了所述RNA之外还包含NP和聚合酶复合体(PB1、PB2和PA)。本领域技术人员已知并且会鉴别可用于在动物中产生保护性应答的流感病毒分离株的许多实例。许所述多实例中的一个是Luke等的美国专利7537768中记载的编码血凝素和核蛋白多肽的核酸分子。在以下实施例中，使用编码血凝素的核酸序列来为被暴露的动物提供保护。在Erdmanetal.,(2010)Vaccine28:594-596中记载了使用复制子颗粒来表达来自H3N2毒株的人HA基因。构建了包含来自A/Wyoming/2/2003(H3N2)毒株的HA基因的甲病毒复制子质粒，并使用它对猪进行免疫。在接受所述RP的猪中诱导了强劲(robust)的血凝素抗体应答。
因为具有对用于虾(特别是养殖虾)的疫苗的需求，本发明特别适用于保护虾免受疾病。本文和美国专利申请“Methodsandcompositionstoprotectaquaticinvertebratesfromdisease”USSN13/277066，美国公开号20120108649中公开了使用NOI、dsRNA和反义RNA来保护免遭致病微生物导致的疾病，所述专利申请要求提交于2001年12月1日的USSN61/418433、提交于2011年3月7日的USSN61/449940、提交于2011年5月10日的USSN61/484255、提交于2011年7月15日的USSN61/508172和提交于2011年8月19日的USSN61/525332的优先权。所述每项专利内容以引用的方式全文纳入本文。还记载了并在以下实施例中示出了所述NOI和保护性分子的自身来源。
不意欲进行限制，水生无脊椎动物中的致病原的实例包括小RNA病毒目(Picornavirales)病毒，例如Marnavirdae和双顺反子病毒科(Dicistroviridae)；嵌杯病毒科(Caliciviridae)，例如能够感染无脊椎动物的圣米格尔海狮病毒(SanMiguelsealion，SMSV)；野田村病毒科(Nodaviridae)，例如感染虾的南美白对虾野田村病毒科(PenaeusvannameiNodaviridae，PvNV)；感染虾和对虾的虹彩病毒属(Iridovirus)；棒状套病毒科(Ronivirdae)，例如侵袭虾、对虾和磷虾的黄头病毒(YellowHeadVirus，YHV)；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，例如影响虾的毛利病毒(Mourilyanvirus，MoV)；双RNA病毒科(Birnaviridae)，例如能够影响牡蛎的传染性胰腺坏死病毒(IPNV)；导致牡蛎面盘病毒病(Oystervelarvirusdisease，OVVD)的二十面体病毒(icosahedralvirus)；感染牡蛎并导致诺卡菌病(nocardiosis)的诺卡菌属(Nocardiasp.)细菌；感染双壳类(bivalve)的鳗弧菌(Vibrioanguilarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和塔氏弧菌(V.tubiashii)；感染蜗牛的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)；感染双壳软体动物的立克次体族(Rickettsiae)、衣原体科(Chlamydiae)和支原体(Mycoplasma)；感染蛤的毛霉亮发菌(Leucothrixmucor)；感染海蜗牛(oysterdrill)的密尔福海壶菌(Haliphthorosmilfordensis)；感染蛤的细囊霉属(Leptolegnia)或Leptoleginellamarina；感染软体动物的海水拍琴虫(Perkinsusmarinus)子粘变体和拍琴虫(Perkinsusatlanticus)；感染软体动物的单孢子虫属(Haplosporidiumsp.)、Bonamiasp.和米查尼线虫属(Minchiniasp.)；感染乌贼、裸鳃亚目和章鱼的破囊壶菌属(Thraustochytrid)；以及感染扇贝的Perkinsusquqwadi。虾中致病原的实例包括白斑综合征病毒(WhiteSpotSyndromeVirus,WSSV)、Taura综合征病毒(TSV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)、传染性皮下组织和造血组织坏死病毒(IHHNV)、南美蓝对虾浓核病毒(Penaeusstylirostrisdensovirus，PstDV)、对虾的杆状病毒(BP)、对虾的弹状病毒(Rhabdovirusofpenaeidshrimp，RPS)、鳃联病毒(Gill-associatedvirus，GAV)、黄头病毒(YHV)、淋巴器官相关病毒(LOVV)、淋巴细小病毒样病毒(LPV)、肝胰腺细小病毒样病毒(HPV)、斑节对虾浓核病毒(Penaeusmonodondensovirus，PMDV)、杆状病毒中肠腺坏死病毒(BMN)、斑节对虾杆状病毒(Monodonbaculovirus，MBV)、呼肠孤样病毒(Reolikevirusdisease，REO)、弹状病毒(RPS)、罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachiumrosenbergiinodavirus，MrNV)、Laem-Singh病毒(LSNV)、Mourlyan病毒(MoV)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血性弧菌(Vibroparahaemolyticus)、鳗弧菌(Vibrioanguillarinum)、对虾弧菌(Vibriopenaeicida)、坏死性肝胰腺炎细菌(NHPB)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、螺原体属(Spiroplasma)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcusspp.)、纤毛虫、簇虫、寄生蠕虫、镰刀菌属(Fusariumspp.)、微孢子虫(Microsporidia)和单孢子虫(Haplosporidia)。
例如，所述疾病之一是白斑综合征病毒(WSSV)。已证明WSSV包膜蛋白的蛋白亚单位疫苗可以在虾和螯虾(crayfish)中有效提供针对WSSV感染的保护。WSSV包含4种主要包膜蛋白，其与其他病毒蛋白质无已知的同源性；所述蛋白质包括VP28、VP26、VP24和VP19。VP28位于外膜上，参与进入细胞的过程(McClennen,C.WhiteSpotSyndromeVirus,TheEconomic,EnvironmentalandTechnicalImplicationsontheDevelopmentofLatinAmericanShrimpFarming.MasterofArtsinLawandDiplomacyThesis.2004,http://fletcher.tufts.edu.)。已证明VP28抗血清在体内能够中和病毒(McClennen，见上文)。最近的研究表明，所述四种主要包膜蛋白通过几种配对蛋白质相互作用和一种自联作用(self-association)(VP28)结合以形成复合体(Zhou,Q.,Xu,L.,Li,H.,Qi,Y.-P.,Yang,F.,2009.FourMajorEnvelopeProteinsofWhiteSpotSyndromeVirusBindToFormAComplex.JournalofVirology83,4709-4712.)。
传染性肌坏死病毒(IMNV)是虾中的另一种疾病，所述病毒是无包膜、小(40nm)二十面体、单一片段的dsRNA病毒，其为全病毒科(Totiviridae)的成员(Poulos,B.T.,Tang,K.F.J.,Pantoja,C.R.,Bonami,J.R.,Lightner,D.V.,2006.Purificationandcharacterizationofinfectiousmyonecrosisvirusofpenaeidshrimp.JournalofGeneralVirology87,987-996.)。
IMNV基因组包含两个开放阅读框(ORF)。Nibertetal,(2007)JournalofGeneralVirology88:1315-1318，Poulosetal(2006)提交的GenBank登录号AY570982，由Senapinetal(2007)提交的GenBank登录号EF061744公开了IMNV基因组。所述两个GenBank序列相差一个核苷酸，其中Poulos等的序列为7560bp，Senapin等的序列额外插入了腺嘌呤并且长度为7561bp。Poulos等的序列以SEQIDNO:66表示，Senapin的序列以SEQIDNO:67表示。Senapin的序列在基因组序列的7431bp位置处插入一个腺嘌呤核苷酸。由Poulos等的序列的ORF1序列编码的多肽以SEQIDNO:68表示，由Senapin的序列的ORF1序列编码的多肽以SEQIDNO:69表示。由Poulos等的ORF2序列编码的多肽以SEQIDNO:70表示(GenBankNo.AAT67231.1)，由Senapin等的序列编码的多肽以SEQIDNO:71表示(GenBankABN05325.1)。本研究不以差异区域为目标。所述ORF1编码主要衣壳蛋白(SEQIDNO:66或67的核苷酸136-4953，被鉴定为SEQIDNO:72)，ORF2(核苷酸5241-7451，SEQIDNO:73)编码736个氨基酸的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)(Poulosetal.，2006，上述；还参见Nibert，2007，上述)。ORF1编码包含所述主要衣壳蛋白N端序列的179kDa蛋白质(1605个氨基酸)。所述衣壳是直径约为400埃的等轴物(isometric)。最近对IMNV基因组的研究揭示出，“2A样”切割和“变化的七聚体”可有助于衣壳蛋白-RdRp融合蛋白和ORF1的三种切割蛋白的形成。将所述三种切割蛋白描述为“肽1”、“肽2”和“肽3”。关于所述蛋白质的作用存在一些推测。跨越碱基136-415的“肽1”(SEQIDNO:74，10kDa，ORF1的N端的93个氨基酸区域)与已知的dsRNA结合蛋白具有序列相似性，可能参与宿主免疫抑制(Tangetal.,2008Infectiousmyonecrosisvirushasatotivirus-like120-subunitcapsid,butwithfibercomplexesatthefivefoldaxes.PNAS105:17526-17531.)。“肽2”为32kDa、284个氨基酸的产物，跨越碱基415-1266(SEQIDNO:75)，“肽3”为38kDa、327个氨基酸的产物，跨越1267-2247(SEQIDNO:76)，所述“肽1”、“肽2”和“肽3”共同代表ORF1的前704个氨基酸，推测其为变性凝胶上可见的候选的次要蛋白质，但是这实际上仍然是推测(Tangetal.，2008，上述)。
跨越病毒基因组全长的三个靶区域被选择作为制备dsRNA的初始目标。参见图7，IMNV基因组转录和翻译产物图(从上述Nilbert(2007)修改而来)表示出RNA干扰的靶区域。预测的蛋白质产物以深灰线表示(肽1-3)，或者以灰色阴影表示(主要衣壳蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶)。制备dsRNA的靶区域和对应的核苷酸区域以加粗黑线表示。根据肽1(136-415)和肽2(415-1266)编码区制备的较长的dsRNA包含两个重复区域，其在两端各截短约100bp(SEQID2和SEQID3)。将在肽1编码区内制备的较短的dsRNA放大(左下)。
首先是对应于ORF1框1的N端区域的序列，预测其包含两个共翻译切割产物，所述序列跨越肽1和肽2(dsRNA95-474，本文中为SEQIDNO:1)。此外，选择主要衣壳蛋白(MCP)的一部分(dsRNA3764-4805，本文中为SEQIDNO:4)和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)(dsRNA5518-6388，本文中为SEQIDNO:5)的一部分来制备dsRNA。肽1(93个氨基酸)和肽2(284个氨基酸)分别由IMNV基因组ORF1框1内的核苷酸136-415(SEQIDNO:74)和415-1266(SEQIDNO:75)编码，其功能仍未确定。肽1与之前记载的dsRNA结合蛋白具有序列同源性。IMNV的主要衣壳蛋白(909个氨基酸)由ORF1框1内的核苷酸2227-4953(SEQIDNO:77)编码。RNA依赖性RNA聚合酶(736个氨基酸)由ORF2框3内的核苷酸5241-7451(SEQIDNO:78)编码。将非特异性对照dsRNA设计为对应于增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的外源序列。在IMNV基因组中区域内设计编码肽1的较短dsRNA(图7)。从初始dsRNA95-474(SEQIDNO:1)的5’端或3’端截短100bp，制备两种dsRNA——5’端截短之后为bp194-474(SEQIDNO:2)，3’端截短之后为bp95-376(SEQIDNO:3)。序列dsRNA#3(SEQIDNO:1)为从获自感染的虾的IMNV病毒分离的克隆的亚组，其序列可在SEQIDNO:80中找到。
显然本领域技术人员了解，当使用RP或RS技术时，任何多肽、其片段或编码其的核酸序列都可用于本发明的方法。
“载体”是任何将核酸转移至宿主细胞中的工具。载体可以是可连接另一DNA片段以使所述连接片段复制的复制子。“复制子”是作为DNA或RNA在体内复制的自体单位发挥作用，即能够在其自身控制下复制的任何遗传元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括将核酸引入体外、离体或体内细胞中的病毒或非病毒工具。病毒载体包括甲病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒(Epstein-Barr)、狂犬病病毒、水疱性口炎病毒和腺病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒、脂质体、荷电脂质(细胞转染剂)、DNA-或RNA蛋白复合体和生物聚合物。除核酸以外，载体还可包含一个或多个调控区域和/或用于选择、测定和监控核酸转移结果(转移到哪种组织、表达的持续时间等)的选择性标记。
“盒”指能够在特异的限制性位点被插入到载体中的DNA片段。所述DNA片段编码目的多肽或生成RNA，并且设计所述盒和限制性位点以保证所述盒插入适合的阅读框以进行转录和翻译。
当将核酸分子插入细胞中时，就可以将核酸分子引入细胞中。将外源或异源DNA或RNA引入细胞内时，所述细胞被所述DNA或RNA“转染”。
当被转染的DNA或RNA引起表型变化时，细胞被外源或异源DNA或RNA“转化”。转化的DNA能够被整合(共价连接)到组成细胞基因组的染色体DNA中。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当所述核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上相同的序列。因为遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG全部编码氨基酸精氨酸。因此，在密码子指定为精氨酸的每个位置，能够将密码子改变为任何所述相应的密码子而不改变其编码的多肽。所述核酸变异是“沉默置换”或“沉默变异”，其为一种“保守修饰的变异”。除非另有说明，本文所述的编码多肽的每个多核苷酸序列还记载了每种可能的沉默变异。因此，沉默置换是每个编码氨基酸的核酸序列的隐含特征。本领域技术人员了解，通过标准技术能够修饰核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。在一些实施方案中，优选对编码保护性多肽的核苷酸序列进行优化，以在用来产生所述多肽或RNA的特定宿主细胞(例如，酵母、哺乳动物、植物、真菌等)中表达。
对于氨基酸序列，本领域技术人员应了解，核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单一取代、缺失或增加——其使所述编码的序列中的单个氨基酸或小部分氨基酸改变、增加或缺失——是“保守修饰的变体”，其在本文中被称为“变体”，所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸置换。提供功能上相似的氨基酸的保守性置换表格为本领域所熟知。参见，例如，Davisetal.，"BasicMethodsinMolecularBiology"Appleton&Lange,Norwalk,Conn.(1994)。所述保守修饰的变体为额外的且不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。
以下8组各自包含相互保守性置换的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,1984,Proteins)。
所述分离的变体蛋白质能够被从天然表达所述变体蛋白质的细胞中纯化、从经过改造以表达所述变体蛋白质的细胞(重组体)中纯化，或使用已知的蛋白质合成方法合成。例如，将编码变体多肽的核酸分子克隆到表达载体中，将所述表达载体引入宿主细胞并且在宿主细胞中表达变体蛋白质。然后通过使用标准蛋白质纯化技术的适合的纯化方案，从细胞中分离所述变体蛋白质。以下详细描述了多种所述技术。
当氨基酸序列至少是蛋白质的最终氨基酸序列的一部分时，所述蛋白质包含所述氨基酸序列。在这种情况下，蛋白质可以是原始多肽、变异多肽和/或具有额外的氨基酸分子，例如与其天然相连的氨基酸残基(连续编码序列)或异源氨基酸残基/肽序列。所述蛋白质能够包含几个额外的氨基酸残基或者包含几百或更多额外的氨基酸。
能够将本发明中使用的变异蛋白质连接至异源序列以形成嵌合或融合蛋白质。所述嵌合或融合蛋白质包含与异源蛋白质框内融合的变异蛋白质，所述异源蛋白质的氨基酸序列与所述变异蛋白质基本上异源。所述异源蛋白质能够融合于所述变异蛋白质的N端或C端。
通过标准重组DNA技术能够制备嵌合或融合蛋白质。例如，根据常规技术将编码不同蛋白质的DNA片段框内连接在一起。在另一个实施方案中，通过常规技术(包括自动DNA合成设备)能够合成融合基因。此外，使用锚定引物能够进行基因片段的PCR扩增，所述引物在两个连续基因片段之间产生互补突出端(overhang)，随后基因片段经退火和重新扩增而生成嵌合基因序列(参见Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,1992)。此外，已编码融合部分(例如，GST蛋白)的许多表达载体是市售的。能够将编码变异蛋白质的核酸克隆到所述表达载体中，以使得所述融合部分与变异蛋白质框内连接。
有时多肽包含20种氨基酸(通常被称为20种天然氨基酸)以外的氨基酸。此外，许多氨基酸(包括末端氨基酸)可被天然过程(例如加工或其他翻译后修饰)或本领域公知的化学修饰技术来修饰。在多肽中天然存在的常见修饰被记载于基础文本、详细的专著和研究文献中，其为本领域技术人员所熟知。因此，本发明的变异肽还包含衍生物或类似物，其中被置换的氨基酸残基并非由遗传密码编码，其中包含取代基团，其中成熟多肽与另一化合物(例如提高所述多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合，或者其中额外的氨基酸(例如前导或分泌序列或用于所述成熟多肽纯化的序列或前蛋白序列)与成熟多肽融合。
已知的修饰包括但不限于，乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ羧基化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转运RNA介导的向蛋白质增加氨基酸(例如精氨酰化和泛素化)。
除了包括所述片段和由所述片段组成的蛋白质和肽之外，本发明还提供了本发明的变异蛋白质的片段，只要所述片段发挥抗原作用和/或提供如本发明所提供的针对感染的治疗和/或提供如本发明所提供的针对感染的保护作用。
术语“生物样品”指通常包含抗体或微生物颗粒的动物体液或组织。在本领域中所述组分是已知的，其包括但不限于血液、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、呼吸道，肠道或泌尿生殖道的分泌物，眼泪、唾液、乳、白细胞和骨髓瘤。
本文所使用的术语“抗体”与本领域中公认的定义一致：其为哺乳动物生物体应答于抗原激发而生成的多亚单位蛋白质。本发明的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及所述抗体的片段，其包括但不限于Fab或F(ab')hd2和Fv片段。
本文所使用的术语“亚单位(subunit)”指微生物的一部分，其提供保护并且自身可为抗原性的，即能够诱导动物的免疫应答。所述术语应当被理解为包括通过重组和生物化学方法获得的亚单位。
本文所使用的术语“分离株”指从特定来源获得的病毒。分离株可与术语“毒株”互换使用。
本文所使用的术语“疫苗”指包含至少一种保护性分子以及可能但不必需的一种或多种其他组分的药物组合物，所述保护性分子诱导动物体内的保护性应答，所述其他组分增强所述活性组分的活性。疫苗还可包含药物组合物中常见的组分。换言之，疫苗的免疫活性组分可包括所述微生物的适合元件(亚单位疫苗)，这些元件可通过以下方法来制备：通过破坏整个生物或所述微生物的生长培养物，然后通过纯化步骤获得想要的结构；或者通过适当地操作合适的系统(例如但不限于细菌、昆虫、哺乳动物或其他物种)而诱导合成过程，再加上随后的分离和纯化步骤；或者使用适合的药物组合物，通过直接引入遗传物质，在需要疫苗的动物体内诱导所述合成过程(多核苷酸疫苗)。疫苗可包括上述元件中的一种或同时包括多种。
本文所使用的术语“保护”、“保护作用”、“保护性免疫”或“保护性免疫应答”意欲指宿主动物建立了对本发明的疫苗或多肽的主动的免疫应答，使得当其暴露于疾病激发时，所述动物能够对抗感染。因此，保护性免疫应答将降低因宿主动物暴露于微生物导致的发病和死亡的发生率。所述动物在随后暴露于致病原时将被保护。在一个实施方案中，通过在暴露于致病原之后给予疫苗或多肽来治疗已经暴露的动物，从而保护所述动物。在这种情况下，也表现出发病率和死亡率的降低。本领域技术人员会了解，在商用动物环境下，可以通过评估疫苗接种对整个畜群的影响来评估保护性免疫应答的产生，例如，少数接种的动物仍然会发病和死亡。此外，保护还包括与在未受到保护的类似动物中由分离株通常所导致的那些变化或症状相比(即相对于适合的对照)，任何总体或组织病理学变化(例如，肺损伤)和/或流感疾病的症状的严重性的降低。因此，保护性免疫应答将减轻疾病的症状，其根据疾病有所不同。例如，当提及流感症状减轻时，所述量度包括但不限于与对照猪相比以下临床征象或症状的减少：咳嗽、喷嚏、呼吸异常、鼻和眼流出物、脓性粘液、抑郁、憔悴、脱水、总体肺损伤和显微结构的肺损伤、急性炎症、水肿、和坏死、发热、食欲减退、间质性肺炎、肺泡壁增厚、充血、血栓、出血、和坏死、体重降低、体重增加的速度降低、嗜睡、呼吸窘迫、“呼吸困难”(用力呼气)、发热、被毛粗糙(roughenedhaircoat)、喷嚏、咳嗽、眼水肿、结膜炎、总体肺损伤和显微结构的肺损伤、心肌炎、淋巴结炎、脑炎和鼻炎。
在一些实例中，动物未必会产生能够被测定的抗体，但是疾病发病率和/或死亡率有所降低并且在暴露于微生物后感染的效价也降低。
本文所使用的“免疫原性有效量”指可有效减少、消除、治疗、预防或控制感染、疾病、紊乱或病症的症状的量。
在一个实施方案中，本发明涉及包含微生物多肽或其片段的多肽。本发明人认为，所述多肽可以是多肽的同源物、衍生物或变体，或者其免疫活性或功能片段。所述多肽可以是分离的、合成的或者使用本文所述的编码多肽的核酸进行重组表达的。
本发明还提供了可编码本发明的多肽或RNA的分离的和/或重组的核酸。此外，根据本领域的总体情况应理解，本发明包括多肽的核苷酸或氨基酸序列的其他等价序列。例如，本发明包括从微生物分离出的氨基酸序列中或由从微生物分离出的核酸序列表达的氨基酸序列中的一些缺失、插入和置换，除非所述突变使多肽失去诱导保护性应答的能力。
本发明的核酸包括编码完整多肽或生成RNA序列的那些核酸，以及编码所述多肽或RNA的亚序列(subsequence)或生成干扰RNA的片段的那些核酸。例如，本发明包括编码非全长但是具有针对感染的保护性活性的多肽或RNA的核酸。本发明不但包括包含本文所示出的核苷酸序列的核酸，还包括与示例性实施方案基本上相同、相当或基本上互补的核酸。例如，本发明包括的核酸包含与本文示出的核苷酸序列至少约70％相同的核苷酸序列，更优选与示例性核苷酸序列至少75％相同，仍然更优选至少80％相同，更优选至少85％、86％、87％、88％、89％相同，仍然更优选至少90％、91％、92％、93％、94％相同，甚至更优选至少95％、96％、97％、98％、99％、100％(或之间的任何百分数)相同的核苷酸序列。可按照前述对所述核苷酸序列进行修饰，只要所编码的任何多肽或所生成的任何RNA或dsRNA能够诱导产生保护性应答。
示出了所生成的dsRNA序列可包含截短片段。所述片段可以是9个或更多个碱基对，可以是10个碱基对，11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、72、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000个或更多或之间任何数量的碱基对，只要在给予动物时可见保护性应答。根据本发明的一个实施方案，不希望囿于任何理论，使用至少9个碱基对以提供序列特异性，使得干扰靶分子。记载了细胞小RNA(miRNA)的详细记载的RNA干扰(RNAi)的作用机制，其与上述dsRNA的作用相关。miRNA5’端7-8个核苷酸(有时被称为种子序列(seedsequence))参与与靶mRNA的3’非翻译区中的核苷酸的Watson-Crick碱基配对(Lewis,B.P.,C.B.Burge,andD.P.Bartel.2005.)。侧翼通常为腺苷的保守种子配对表明，几千个人类基因是miRNA的靶标(Cell120:15-20)。RNA诱导的沉默复合体(RISC)当碱基完美配对时切割靶mRNA，当不完美配对时靶mRNA发生翻译失活，在未降解mRNA的情况下使蛋白质表达受到影响(Bartel,D.P.2004.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction.Cell.116:281-97.)。很有可能相同的基于RISC的活性是上述dsRNA为动物提供保护的机制。在一个优选的实施方案中使用至少20个碱基，在另一个优选的实施方案中使用至少30个碱基，其还辅助转运到细胞中。在另一个优选的实施方案中，使用长度至少为50bp或更长的dsRNA实现了更高的效率。
________________________________________
为了检验所述片段，使用AEM(抗病毒效应分子)开发的方法是许多可利用的方法之一。根据针对IMNV的AEM开发的成功，所述方法通常按照以下步骤进行：确定用于AEM开发的长靶区域；使用已建立的疾病激发模型，根据激发后的存活率来测定针对疾病的保护；通过将dsRNA设计为在经验证的、较长AEM内的逐步更短的靶区域，在标准疾病生物测定中评估长度较短的dsRNA(如下文实施例4中举例描述)。
在一个实例中，为每个目的靶标设计一组含有5’T7启动子序列的PCR引物，以生成扩增子序列AS的约400bp的部分。通过在基因组和转录组序列中进行筛选，过滤掉被PCR引物涵盖的扩增子序列，以预测脱靶效应并使可能的脱靶效应最小。从来自合并的幼体和成体RNA的全身cDNA生成PCR产物。使用AmbionMegascript体外转录试剂盒，从所述产物制备dsRNA并且每个反应获得50-100μg高质量dsRNA。通常从单次体外转录反应中获得50-100μg的dsRNA产率。应当注意的是，制备dsRNA的整个过程——从制备含有5’T7启动子序列的基因特异性引物到生成产物——通常为3天(包括引物合成和O/N运输)。用异源dsRNA比eGFP(heterologousdsRNAtoeGFP)作为用于引发dsRNA反应的生理影响的对照。使用经验证的靶标的连续截短的区域，重复所述过程。使用引物组、通过任何可用的方法测定基因抑制，所述方法包括对全身或特定组织RNA提取物进行的定量RT-PCR或RT-PCR、核酸杂交或RNA印迹法，所述引物组延伸到制备dsRNA的引物组所涵盖的区域之外，或被从制备dsRNA的引物组所涵盖的区域中完全除去。
可利用本领域技术人员已知的方法获得核酸。能够克隆或通过体外方法扩增适合的核酸(例如，cDNA、基因组或亚序列)，所述体外方法例如使用适合的引物的聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)或自主序列复制系统(SSR)。多种克隆和体外扩增方法为本领域技术人员所熟知。足以通过许多克隆操作指导本领域技术人员的技术和说明的实例参见BergerandKimmel,GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology152AcademicPress,Inc.,SanDiego,Calif.(Berger)；Sambrooketal(2001)MolecularCloning--ALaboratoryManual(第三版)卷1-3,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress,NY,(Sambrooketal.)；CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等,eds.,CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons,Inc.,(1994Supplement)(Ausubel)；Cashionetal.,美国专利5017478；以及Carr,欧洲专利0246864。足以通过体外扩增方法指导本领域技术人员的技术的实例参见Berger,Sambrook,Ausubel,Mullisetal.,(1987)美国专利号4683202；PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(Innisetal.,eds)AcademicPressInc.SanDiego,Calif.(1990)(Innis)；Amheim&Levinson(1990年10月1日)C&EN36-47；TheJournalOfNIHResearch(1991)3:81-94；(Kwohetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173；Guatellietal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,1874；Lomelletal.(1989)J.Clin.Chem.,35:1826；Landegrenetal.,(1988)Science241:1077-1080；VanBrunt(1990)Biotechnology8:291-294；WuandWallace(1989)Gene4:560；以及Barringeretal.(1990)Gene89:117。克隆体外扩增核酸的改良方法记载于Wallace等的美国专利号5426039。能够通过上述任何适合的方法来制备核酸或所述核酸的亚序列，所述方法包括，例如，适合序列的克隆和限制性(restriction)。
能够使用“密码子优化”来优化用于在动物中表达的序列，其被定义为通过用动物基因中较常使用或最常使用的密码子替换天然序列中至少一个、多于一个或显著数量的密码子，修饰核酸序列用于在目的动物(例如，猪)的细胞中增强表达。不同物种表现出对特定氨基酸的某些密码子的特定偏好。
一方面，本发明涉及包含密码子优化的编码区的核酸片段的多核苷酸，其可生成RNA，编码多肽或其片段、变体或衍生物，密码子使用被改造以适合于在给定动物的细胞中优化表达。通过将在目的宿主的基因中优选使用的密码子引入DNA序列来制备所述多核苷酸。还提供了包含密码子优化的编码区的核酸片段及其片段、变体或衍生物的构建体、载体和宿主细胞，以及使用所述多核苷酸表达构建体、载体和宿主细胞来治疗或预防动物疾病的多种方法。
在一个实施方案中，可以使用多肽及其同源物、片段或其他衍生物或变体，或者表达其的细胞作为抗原，来生成其抗体。本发明包括，例如单克隆抗体和多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体以及Fab片段。因此，本发明还包括制备针对上述的一种或多种多肽的抗体的方法，所述方法包括提供多肽及其生物功能同源物、衍生物或变体，和以足以诱导免疫应答的量将所述多肽给予动物受试者，以生成针对所述多肽的抗体。因此，本发明包括通过给予动物所述核酸分子和/或多肽或其组合来制备抗体的方法。
然后可通过使用载体、质粒或构建体等将核酸引入原核或真核宿主细胞。典型的表达盒包含与核酸可操作地连接的启动子。所述表达盒通常被包含于表达载体中，所述表达载体被引入适合的宿主细胞，所述宿主细胞包括例如细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。在本发明中能够使用组成型或调控型启动子。适用于真核宿主细胞的启动子为本领域技术人员所熟知。通过本领域技术人员已知的方法能够将本发明的表达载体转移到所选的宿主细胞中，所述方法包括例如，磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、转介(transvection)、微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕标记(scrapeloading)、弹道引入、感染或其他方法(参见MoleculeCloning:ALaboratoryManual,第二版，卷1-3,ed.Sambrooketal.,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。通过例如由包含于质粒中的基因(例如amp、gpt、neo和hyg基因)所赋予的抗生素抗性，能够对转化的细胞进行选择。
在一个实例中，可以由重组载体、病毒载体或病毒表达所述保护性分子。另一方面，表达所述保护性分子的重组载体、病毒载体或微生物本身可作为疫苗组分来充当保护性试剂或充当佐剂并引起或增强保护性应答。例如，适合的重组病毒载体包括但不限于腺病毒、痘病毒、杆状病毒、假狂犬病病毒(PRV)、委内瑞拉马脑炎(VEE)载体(例如毒株V3526或TC-83)和来自VEE的病毒复制子颗粒(VRP)、马动脉炎病毒(EAV)或传播性胃肠炎病毒(TGE)。用于将所述序列插入到病毒载体中并使病毒DNA中发生醚改变(etheralteration)(例如，插入接头序列等)的技术是本领域技术人员已知的(参见，例如，上述的MolecularCloning:ALaboratoryManual)。在一个实施方案中，所述疫苗不包含活的病原微生物。
核酸分子可以与编码多肽或生成RNA的cDNA5'末端的适合的启动子和所述cDNA3'末端的终止信号和poly(A)信号可操作地连接。本文所使用的术语“可操作地连接”意指包含表达控制序列(例如，转录启动子和终止序列)的核酸分子位于载体或细胞中，使得所述核酸分子生成的多肽或RNA的表达是由表达控制序列调控。克隆和可操作地连接所述序列的方法为本领域所熟知。适用于表达抗原的启动子的实例包括但不限于巨细胞病毒早期(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子，以及诱导型启动子例如金属硫蛋白启动子。启动子的其他实例包括T7噬菌体启动子、T3噬菌体启动子、β-半乳糖苷酶启动子和Sp6噬菌体启动子。含有终止和poly(A)信号的DNA的实例是SV40晚期poly(A)区域。适用于制备抗原的病毒表达系统的另一个实例是可从Invitrogen获得的Sindbis表达系统。这些市售的表达载体和系统的使用为本领域所熟知。本发明的疫苗还可包含多个拷贝的一种保护性分子或保护性分子的组合。
在另一个实施方案中，制备复制子颗粒(RP)疫苗。对疫苗研发而言，所述RP载体具有多种优势，包括准确生成天然蛋白质、趋向淋巴样细胞、缺少病毒复制和传播、诱导粘膜和全身免疫、顺序免疫的潜能，以及在动物体内缺少对VEE的预存免疫，尽管它们确实在免疫上对病毒产生应答(DickermanRW,BakerGJ,OrdonezJV,ChererWF(1973),VenezuelanEquineEncephalomyelitisViremiaandAntibodyResponsesofPigsandCattle,AmericanJournalofVeterinaryResearch34:357-361.)。
在一个任选的实施方案中，可以在疫苗中提供佐剂。佐剂增强抗原的免疫原性，但其自身未必具有免疫原性。佐剂的作用是通过将所述抗原保持在给药部位附近以产生促进抗原缓慢、持续释放到免疫系统细胞的贮存库作用(depoteffect)。佐剂还能够将免疫系统细胞吸引到抗原贮存库并刺激所述细胞以诱发免疫应答。免疫刺激试剂或佐剂已被使用多年，以提高宿主对例如疫苗的免疫应答。本发明的疫苗可与佐剂结合使用，所述佐剂例如脂多糖、氢氧化铝和磷酸铝(明矾)、与膜蛋白抗原复合(免疫刺激复合物)的皂苷、具有矿物油的pluronic聚合物、矿物油中灭活的分枝杆菌、弗氏完全佐剂、细菌产物(例如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS))，以及脂质A和脂质体。理想佐剂的所需要的特征可包括：(1)没有毒性；(2)能够刺激长期持续的免疫应答；(3)制备的简易性和长期贮存的稳定性；(4)能够对通过多种途径给予的抗原引起CMI和HIR；(5)同其他佐剂的协同性；(6)能够选择性地与抗原呈递细胞(APC)群相互作用；(7)能够特异性地引起适合的辅助性T细胞1型(TH1)或TH2的细胞特异性免疫应答；以及(8)能够选择性地提高适合的针对抗原的抗体同种型水平(例如IgA)。本发明所使用的佐剂不需要具备上述所有特征才能用于本发明。
可使用的另一种佐剂是大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)。已经使用LT来辅助预防大肠杆菌诱导的腹泻(参见，例如，Limjuco等的美国专利4285931和4220584)。但是，由于LT的早期分离，已经发现其应用由于毒性而受到极大的限制，避免将其作为佐剂，除非通过一些方式对其进行修饰以降低毒性。参见，Zhangetal.(2009)Vet.Rex.Commun.33:735-747DOI10/1007/s11259-009-9222-7。因此，已经尝试通过改变肠毒素的序列或通过截短来避免毒素问题。参见，例如，Piazzaetal.，美国专利7291588。在本发明中，本发明人发现，可使用非突变的LT作为没有毒性的佐剂。所述非突变LT既未被截短又未突变。因此提供了无毒性作用的佐剂，并且制备成本降低。
制备所述疫苗的手段和方法为本领域技术人员已知，已知对所述制备方法的许多变化和途径，并有望对其进行进一步开发。以下举例说明了可用于制备并给予所述疫苗的多种方法中的一些。制备并给予本发明的疫苗的多种方法的一个实例的讨论记载于Harrisetal.，美国专利7622254，所述专利以引用的方式全文纳入本文。
在本发明的一个实施方案中，提供了鉴定病毒的保护性序列或引起保护的核酸的方法。此方法还包括所述保护性分子的片段、衍生物或同源物。一方面，所述方法包括给予测试动物所述序列。随后用传染量的致病微生物激发实验组和对照组动物。确定是否提供了保护的各种方法和技术对本领域技术人员而言是已知的，所述方法和技术包括但不限于，例如，观察测试和对照动物之间在疾病症状上的差异。与对照动物相比,在测试组动物中观察到的任何症状的减轻表明所述保护性分子提供了针对疾病的一定程度的保护。与对照组动物中观察到的那些症状相比,在测试动物中观察到的类似症状或任何症状的增加表明所述保护性分子未提供保护。
另一方面，确定所述保护性分子是否提供了针对感染的保护，包括通过电子显微镜术或抗体或测定(例如，可使用荧光聚焦中和(FFN)测试或蛋白质印迹法)来确定在测试动物中激发疾病是否存在。可使用PCR方法来确定所述保护性分子是否存在。RNA印迹法能够检测诊断序列的存在。另一方面，ELISA或类似的测定(例如血凝素抑制测定)是能够确定所述保护性分子是否有效的多种不同测定类型。ELISA或酶联免疫吸附测定法从1971年开始成为已知方法。溶解于缓冲液中的抗原通常包被于塑料表面。当加入血清时，抗体能够与固相上的抗原结合。当与酶缀合时，能够说明所述抗体是否存在。加入适合的底物能够检测结合缀合物的量，能够对所述缀合物进行定量。常用的ELISA测定使用生物素化的抗蛋白质多克隆抗体和碱性磷酸酶的缀合物。例如，用于定量测定蛋白质水平的ELISA可以是抗体夹心式测定法，其使用市售的多克隆兔抗体。所述抗体与碱性磷酸酶缀合，用于检测。在另一个实例中，检测胰蛋白酶或胰蛋白酶原的ELISA测定使用生物素化的抗胰蛋白酶或抗胰蛋白酶原多克隆抗体和链霉亲和素-碱性磷酸酶的缀合物。
显然，本领域技术人员可获得许多所述方法以确定所述保护性分子是否提供保护，以及是否在给予动物的水平下提供保护。
本发明人还认为，可使用多种载体和病毒来递送本发明的来自微生物的分离序列。可用生理可接受的赋形剂和/或佐剂将所述疫苗组合物引入动物体内。可用的赋形剂(vehicle)为本领域所熟知，其包括例如水、缓冲水、盐水、甘氨酸、透明质酸等。对获得的水溶液进行包装以原样使用或进行冻干，在给药前将所述冻干制品进行复水，如上所述。所述组合物可包含接近生理条件所需的可药用辅助性物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸山梨聚糖、三乙醇胺油酸酯等。在本发明的一个实施方案中，将所述保护性分子包封以使得获得的组合物防水。在一个实施方案中，所述分子与粘合剂结合，所述粘合剂辅助所述分子与饲料的结合，特别适用于口服给药。所述防水粘合物质可以是具有所述特性的任何物质。实例包括但不限于琼脂糖或其他糖化合物、白蛋白、海藻酸盐或任何类似的组合物。
在另一个实施方案中，可以使从特定毒株或生物型分离出的保护性分子与其他毒株或生物型或疾病的其他序列和组分结合，以获得针对多种微生物的保护。可依次、渐进(progressively)或交替给予，或以混合物的形式同时给予所述不同的微生物序列或组分。可需要依次或渐进给予本发明的疫苗组合物以引起足够水平的针对多种微生物毒株的免疫。可实施本发明的疫苗组合物的单次或多次给药。可需要进行多次给药以引起足够水平的免疫。通过测定中和性分泌和血清抗体的量来监测诱导的免疫水平，如有需要，调节剂量或重复接种以保持所需的保护水平。
可以以任何适合的方式“给予”所述保护性分子，所述方式包括但不限于，通过浸泡在包含所述保护性分子的组合物或物质中(例如，对于虾而言，在虾周围的液体中提供疫苗),进行肠道外给药(通过皮下或肌肉内注射到动物的器官或体腔)、反向强饲法(直肠给药)，以及口服(口服或摄取饲料)、以及经皮肤或通过换气。在一个实例中，不意欲成为限制，可给动物喂食表达所述保护性分子的细菌毒株。在一个实例中，细菌可被修饰为RNase缺陷型，并用诱导型启动子驱动的质粒转染，所述质粒生成所述保护性分子。使所述细菌失活并喂食给动物。可通过任何方式给予所述疫苗，所述方式包括但不限于注射器、喷雾器(nebulizer)、喷雾器(mister)、无针头注射设备或微粒轰击基因枪(生物弹道轰击)，通过脂质体递送系统、裸递送系统、电穿孔、病毒、载体、病毒载体或可摄取的递送系统，其中在饲料或水中或以其他任何适合的方式所述保护性分子被消耗。口服或浸泡给药在易于给药和给予动物组保护性分子的能力方面具有优势。以与剂量相符的方式，以治疗上有效、具有免疫原性和保护性的量给予免疫原制品和疫苗。
给药量取决于待治疗的受试者，包括例如，个体免疫系统做出保护性应答的能力。适合的初次给药和加强给药剂量的方案也是可变的，但是可包括初次给药，然后再给药。例如，可能需要提供疫苗的初次给药然后进行额外剂量的给药。在一个实例中，不意欲成为限制，可通过使动物浸泡在包含生成保护性分子的复制子颗粒的溶液中并口服给予所述保护性分子来实现增强的保护性应答。对提供有效量的保护性分子的需求还需要与提供更大量保护性分子的成本相平衡。成本合理的疫苗是其中制备疫苗的成本低于使用疫苗所获得的价值的疫苗。可通过本领域技术人员可获得的任何方法来测量和确定任何本发明的组合物和疫苗的功效。例如，当所述方法中包括对靶分子的干扰时，可使用引物组、通过定量RT-PCR或RT-PCR、核酸杂交、全身或特异性组织RNA提取物的RNA印迹法来测定靶分子抑制，所述引物组延伸到制备dsRNA的引物组所包含的区域之外或被从所述区域完全除去。
本发明人发现，在一个实施方案中，一种直接而快速的方法是对样品的候选疫苗组合物进行蛋白质印迹分析，以对所述样品中多肽或其片段进行定量。本领域技术人员有多种可用的选择，快速制备的需求可决定哪种是优选。在一个实施方案中，将多肽的含量与已知对来自其他生物型的类似多肽有效的标准量进行比较，并且制备疫苗，其中所制备的多肽的水平至少为该标准量或更高，或者用测试动物测试所述疫苗。
作为疫苗功效的一个量度，可对从接种后的个体收集的样品进行ELISA，以确定包含序列、衍生物、同源物、变体或其片段的疫苗是否产生了抗多肽的抗体。测量所述个体样品中参考抗多肽的抗体。症状的分析和动物体重增加的测量也证明了在特定剂量存在的情况下可减轻疾病的影响。荧光聚焦中和测定是另一种检测血清中和抗体和分析疫苗和特定剂量效力的测定。
例如，当对给予流感疫苗的动物进行测试时，通过对接种后血清进行血凝素抑制测定来测量抗体应答也可有效确定疫苗功效。可收集血清并测定效价，所述效价为血凝反应被抑制的最大稀释度的倒数，如以下实例所述。还可使用给予疫苗后的其他量度来确定功效，病理评估、病原体分离、症状测定、以及动物的总体健康和体重增加。
因此，还可定量(例如，对流感而言，与适合的对照组相比实变肺组织的百分数下降)或定性(例如，从血液中分离流感病毒，通过免疫过氧化物酶测定法检测肺、扁桃腺或淋巴结组织样品中的流感病毒抗原等)评估本发明疫苗的功效。可定量(例如，体温/发热)、半定量(例如，呼吸窘迫的严重性)或定性(例如，一种或多种症状是否存在，或一种或多种症状的严重性减轻，所述症状例如肺炎、肺损伤等)评估流感疾病的症状。显然，本领域技术人员有许多不同的可用的选择来测定疫苗的功效。对本发明而言，可以在水生无脊椎动物中实现对疾病的保护，并且所提供的保护的持续时间比在此类动物身上已经实现的保护持续时间更长。使用本发明已经实现了在至少一次激发或暴露于所述致病微生物之后的保护时间超过7天，已经实现了保护期限至少为两周，至少为20天，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60天或更长时间。当将本发明用于其他动物时，也能提供所述保护期限。在一个实施方案中，本文还表明保护性应答对所述疾病比对另一种疾病具有特异性，从而证实了特异性记忆。
在另一个实例中，可制备多个范围的剂量并测定保护性应答。可将候选疫苗配制成两种或三种或更多不同的剂量以确定最小保护性剂量。例如，当使用RP时，除了测定IFA效价，还可使用qPCR测定以确定存在于疫苗中的基因组当量(equivalent)的数量，并与IFA效价比较以获得GE:RP比例。所述测定还可以帮助确保均一性。在另一个实例中，所述测试表明，猪流感有效剂量为约1×108RP/2ml剂量。其他实例表明，RP效价的猪流感病毒(SIV)的有效剂量为≥5×107/2ml。猪流感病毒(SIV)疫苗的GE:RP比例范围为1-20.64。有效剂量包括5×105/2ml。在另一个非限制性实例中，可制备两个或三个或多个剂量范围，如以下与虾相关的实例中所述，在激发后测定发病率和死亡率。在一个优选的实施方案中，所选的剂量是为动物提供保护并且成本合理的剂量。
在一个实施方案中，当使用复制子颗粒时，使用测定目的核酸分子或其片段(NOI)的量的方法。如本文所述，复制子颗粒包括非结构蛋白(nsp)以复制全长反义RNA，其作为模板复制额外的基因组RNA以及复制编码NOI的亚基因组RNA。所述非结构序列(如上述nsp1-4)通过形成能够转录自体重组基因RNA的复合体来辅助自体重组蛋白的表达。在表达NOI的过程中，如上文所述所有复制子将产生nsp1-4。因为非结构蛋白在所有复制子颗粒中表达，在没有方法或试剂来检测复制子上所编码的特定的NOI时，可通过检测非结构蛋白来确定复制子颗粒的效价。这允许获得确定任何NOI复制子颗粒效价的方法，而不需要准备分析每个NOI的单独方法。这与疫苗的快速制备特别相关。在一个实施方案中，可使用专门针对非结构蛋白的测定，并与RNA效价或复制子颗粒效价相关联。可使用任何检测非结构蛋白的方法，本领域技术人员已知并可开发多种方法。非限制性实例包括直接或间接的免疫荧光测定(参见，例如，Kamrudetal(2008)PLoSOne3(7)；Paradis等(2007)CanVetJ.48(1):57-62)、定量PCR(上述Innisetal)或流式细胞术(参见，Ormerod,M.G.(edit)(2000)FlowCytometry–apracticalapproach，第三版，OxfordUniversityPress)。此外，可检测存在于所述复制子颗粒中的任何非结构蛋白，例如nsp1、nsp2、nsp3或nsp4。在一个优选的实施方案中，检测nsp2。使用所述方法提供了一种统一、快速和便利的确定NOI复制子颗粒效价的方法，所述方法可用于制备含有所需剂量的NOI复制子颗粒的疫苗。所述方法可与其他方法(例如qRT-PCR、ELISA、抗体结合等)一起使用以分析目的核酸的存在。在另一个实施方案中，滴定法和qPCR一起使用以定量RNA拷贝数并产生基因组当量:复制子颗粒(GE:RP)比例以监测一致性和剂量。
使用预期可引发保护性应答的至少1:40的血凝素效价时的情况下，通过改变剂量能引发保护性应答(PotterCW,OxfordJS.Determinantsofimmunitytoinfluenzainfectioninman.BrMedBull1979；35:69-75.)例如，本发明人在本文中确定，当提供含有重组血凝素多肽的疫苗时，以μg/ml测量的有效量是0.38μg/ml至1.14μg/ml的浓度。当作为裂解的Vero细胞的稀释率测定时，HA的有效量为至少1:150。在另一个实施方案中，优选浓度为裂解产物：液体/缓冲液为1:50至1:150，并且在另一个优选的实施方案中，为1:60至1:75。过于稀释以致无法提供保护性应答的浓度为1:150以上。在所述优选的范围中提供了成本效益。对PRRSV而言，使症状减轻的成本合理的剂量为1e8/ml(在PBS中)。在多个使用dsRNA的实验的其中之一中，所制备的疫苗具有0.02μg、0.2μg和2.0μg，并且即使在最低、成本最合理的剂量时仍能提供保护。制备了以下FMDV剂量：其范围为包含FMDV衣壳和3C蛋白水解酶编码区的RP的5×108至1×109IU/ml，并测量了保护性应答。
因此，本发明人已证明保护性分子的自体疫苗在保护动物免受致病微生物影响的方面是有效的。
以下实施例以举例说明的方式提出，并不意欲限制本发明的范围。
实施例1
本实施例描述了一种制备自体复制子颗粒(一些从业者还将ARP称为RNA颗粒或复制子颗粒)的方法。在第一个实验中，证实了RP疫苗能够在体内生成外源抗原，所述外源抗原在猪体内引起诱导的免疫应答。
所得到的猪为2周龄，对其进行称重、加标签并将其随机分成两组，每组8只猪(表4)。在免疫接种前，收集血清以确保猪没有流感抗体。
表4：设计在猪中的复制子颗粒(RP)概念验证实验。猪接受空RP或表达流感病毒血凝素(HA)蛋白的RP。
分组(n) 处理(途径) 剂量 接种程序
1(8) RP(IM)(阴性对照) 108 第0天初次接种，第14天加强
2(8) HA RP(IM) 108 第0天初次接种，第14天加强
在整个研究过程中收集血清，用于使用A/Wyoming/03/2003病毒的血凝抑制测定(HI)。在实验开始之前所有的猪都是HI阴性，组1的猪在研究期间保持阴性(未显示个体猪的数据)。但是在组2中诱导了了稳定而持久的针对HA蛋白的抗体应答(表5)。所述应答在初始剂量后开始出现，并在第二剂量后快速升高。到第21天，所有的猪都具有1280至5120的效价，并且在到第62天实验结束之前一直保持这一水平。尽管在该实验中未用有毒力的病毒激发猪，但是根据之前的研究和通常公认的保护性水平(>40)，所述HI抗体的水平已经具有保护性。
表5：用表达流感病毒HA蛋白的RP免疫的猪的HI结果(倒数效价)(>40被认为是阳性的)。在第0天和第14天对猪进行免疫。实验在第62天结束。
猪# 第9天 第13天 第21天 第28天 第41天 第51天 第62天
4 10 320 2560 2560 2560 2560 1280
8 10 80 2560 5120 2560 2560 2560
11 10 40 2560 2560 2560 2560 1280
18 10 40 2560 2560 2560 2560 2560
20 40 20 5120 2560 5120 5120 5120
25 20 80 2560 2560 5120 5120 5120
26 10 80 2560 5120 2560 2560 2560
30 10 40 5120 2560 2560 2560 2560
本发明人成功地证明，能够制备共表达PRRSVGP5和M蛋白并且形成异源二聚体的RP疫苗。ErdmanMM,HarrisDL,KamrudKI.Repliconparticleco-expressionofPRRSVGP5andMproteins.ProcCRWAD2006.在体外成功表达之后，进行猪实验以确定GP5-MRP疫苗是否在猪体内诱导免疫应答。从PRRSV阴性来源中获得2-3周龄的猪。对猪进行加标签、称重并将其随机分成两组(每组8只)(表6)。在接种前收集血清以确保猪没有针对PRRSV的抗体。
表6：之前的PRRSVRP概念验证研究。用空RP或共表达PRRSVGP5和M蛋白的RP对猪进行接种。
组(n) 处理(途径) 剂量 接种程序
1(8) RP对照(IM) 108 第0天初次接种，第14天加强
2(8) GP5-M RP(IM) 108 第0天初次接种，第14天加强
在第48天，用2ml106TCID50的同源PRRSV毒株(HLV013)经肌肉内途径对全部猪进行激发。在激发之前任何一组在Marc145细胞上都没有病毒中和抗体，尽管蛋白质印迹法表明存在针对PRRSV蛋白质的抗体。在激发之后，接种组8只猪中的3只和对照组8只猪中的0只在7天内具有中和效价。在激发后14天对所有猪进行尸体剖检。在尸体剖检中，接种组8只猪中的5只和对照组8只猪中的4只具有中和效价。但是，与对照组的几何平均效价(GMT＝9.5)相比，接种组的几何平均效价(GMT)更高(GMT＝27.8)。肺灌洗的病毒滴定表明，8只对照猪中的7只是病毒阳性，而8只接种猪中仅有4只是病毒阳性。肺损伤得分表明，与对照组相比(平均得分为22.3)，接种组(平均得分为16.3)的总体病状较少。
结果和成就
ARP疫苗构建
整个疫苗开发过程，从PRRSV阳性血清样品到配制的GP5和M单启动子ARP疫苗，共需3周时间，制备GP5/M双启动子ARP疫苗还要额外的一周。因为在本实验中开发速度对本发明人来说很重要，本发明人选择通过共注射GP5和M单启动子ARP来进行实验，因为它们花费更少的制备时间并且具有更少的技术挑战。但是，单启动子和双启动子方法都是可行的选择，并且都比需要进行病毒分离和生长的新型常规自体疫苗研发通常花费的时间更短。
可对样品进行PCR，以提供PRRS的阳性诊断并生成制备ARP疫苗所需的基因的cDNA。此外，整个过程有望在比猪养殖者得到常规自体疫苗通常所需的时间较短的时间内完成。
为了研发新型ARP疫苗，确定一个大型猪养殖者，其具有患有临床PRRSV的猪。将来自患病动物的血清样品送到爱荷华州立大学。使用RT-PCR以确认诊断并生成用于疫苗制备的靶基因的cDNA。使用特异性引物以扩增PRRSVGP5和M基因，分别为ORF5和6。尽管制备所述疫苗不需要分离活病毒，但是分离活病毒用于制备常规灭活自体疫苗，并且用于对猪进行激发。所述分离株被称为PRRSV毒株Pennway。
将所述PRRSVGP5和M基因克隆到复制子载体中，所述载体是基于被称为TC-83的VEE的活减毒疫苗株(图8)。通过IFA和蛋白质印迹法来分析所述GP5和M复制子载体以证实所需蛋白质的表达。通过将所述复制子与辅助RNA进行共电穿孔而将所述复制子包装到颗粒中以制备ARP。从培养液中收集ARP，通过抗原特异性IFA测定ARP制品的感染效价，并在CPE(细胞病变)测定中测试以确保不存在能够复制的病毒。
疫苗制剂
安慰剂疫苗由2ml无菌PBS(HyCloneLaboratories)组成。
ARP的初始效价对于GP5ARP来说为2.11e9/ml，对于MARP来说为3.56e9。使用PBS将每种ARP稀释到效价为1e8/ml。每个剂量由用相同注射器共同注射的1mlGP5ARP和1mlMARP组成。
灭活的PRRSV疫苗来自用于制备ARP疫苗的相同毒株。使所述病毒在Marc-145细胞中生长至85％CPE，并从上清液中收集所述病毒。确定所述病毒效价为2.7e5TCID50/ml。在65℃下加热90分钟使所述病毒灭活。将制品的样品接种到Marc-145细胞上以证实没有活病毒。通过每个剂量添加1.6ml裂解产物和0.4ml佐剂，配制裂解产物和Emulsigen-D佐剂(MVPlaboratories,Ralston,NE)。
所述PRRSVMLV疫苗是InglevacPRRSATP(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc)。根据生产商的指示——指示给予2ml单个剂量的疫苗——使用所述疫苗。
猪实验
从爱荷华州农场获得3周龄猪，所述农场根据临床征象和血清学没有PRRSV感染历史。在猪耳处加标签、对猪进行称重并将其随机分成5组(每组10只猪)，每只猪都在爱荷华州立大学的BSL-2动物设施中。表7给出了对各组的描述，表8示出了接种-激发研究的时间轴。组1包含严格阴性对照的猪，其既未接种也未激发。组2、3、和4的所有猪在第0天经肌肉内(IM)接种，第28天重复一次。组2接受安慰剂疫苗，组3接受ARP疫苗，组4接受灭活的PRRSV疫苗。组5在第0天接受1个剂量的MLV疫苗。
表7：PRRSV接种-激发研究中各组
组 猪(n) 处理 途径 PRRSV激发
1 10 严格阴性 NA NA
2 10 安慰剂 IM IN
3 10 ARP PRRSV GP5-M IM IN
4 10 灭活的PRRSV IM IN
5 10 MLV PRRSV IM IN
PRRSV＝猪繁殖与呼吸综合征病毒；M＝基质蛋白；GP5＝糖蛋白5；ARP＝自身复制子颗粒；MLV＝改性活病毒；NA＝不适用；IM＝肌肉内；IN＝鼻内。
在第56天，用2ml1×105TCID50/ml的有毒力的PRRSV毒株Pennway经鼻内对猪进行激发。在激发之后，对猪进行临床征象(包括呼吸窘迫、嗜睡和躺卧(recumbancy))监测，但是未注意到任何征象。在激发后21天对猪施安乐死术，进行尸体剖检，并收集组织用于实验室测试，所述测试包括定量总体肺损伤得分、组织病理学、IDEXXELISA、病毒滴定和病毒中和。
表8:接种-激发实验的时间进程
病理学
在尸体剖检中，由不了解处理过程的委员会认证的兽医病理学家确定总体病理肺损伤，如之前在HalburPG,PaulPS,MengXJ,LumMA,AndrewsJJ,RathjeJA.ComparativepathogenicityofnineUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isolatesinafive-week-oldcesarean-derived,colostrum-deprivedpigmodel.JVetDiagnInvest1996；8:11-20中所记载。
简言之，为每个肺切片编号，肺得分代表有肺炎迹象的肺叶的百分数。然后将每个肺叶得分加在一起，获得那只猪的总体肺得分。在此实验中，肺部病状相对较轻，其在图9中总结为按组计的总体肺得分。还进行了肺部和心脏切片的组织病理，如上述Halbur等人所记载。
所述结果总结在图10-12中。间质性肺炎为使用0(正常)至6(严重且弥散性)的范围的每只猪4个不同切片的平均值。结果表明，各组间没有统计学差异。在相同切片上检查肺淋巴样组织增生，范围从0(正常)至6(严重增生)。结果表明，与严格阴性对照组相比，安慰剂组和灭活疫苗组具有统计学上(p<0.05)更多的增生。未注意到其他统计学差异。检查心脏切片的感染征象，范围从0(正常)到3(严重心肌炎)。结果表明，各组间没有统计学差异。
尽管本发明人所进行的其他测定显示出成功激发，但病理学结果显示出较少的统计学差异。由于多种原因(包括毒株差异)，PRRSV研究中诱导的损伤和临床征象可以差异较大，或者如本文所示几乎不存在差异。这使得其他方法(例如以下所述的病毒血症和抗体测定)被认为是评估PRRSV疫苗的黄金标准。
IDEXXHerdChekPRRS2XRELISA
IDEXXELISA检测针对PRRSV核衣壳(N)蛋白的抗体。所述抗体在对PRRSV的早期应答中占有优势，尽管其不提供针对疾病的保护。之前的工作也将S/P(样品/阳性，IDEXXELISA通常使用的样品信号与背景的比例)效价与病毒血症的水平相关联，通过这种方式能够使用效价来比较不同组之间的感染水平。JohnsonW,RoofM,VaughE,Christopher-HenningsJ,JohnsonCR,MurtaughM.Pathogenicandhumoralimmuneresponsetoporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)arerelatedtoviralloadinacuteinfection.VeterinaryImmunologyandImmunopathology2004；102:233-47。
在激发后第0、7、14和21天，从所有猪身上采集血清样品。将样品送到南达科他州立大学进行测试。S/P比例≥0.40被认为是阳性。图13中所示为表示为每组的平均S/P比例的结果。所述结果表明，在激发当天，组1-4的所有猪都保持阴性。这确保本发明人在实验期间没有横向引入活病毒。在激发当天，组5中的所有猪是IDEXX阳性，这在预料之中，因为N蛋白是MLV疫苗的主要部分。在激发之前ARP组的所有猪保持阴性，强调了这种疫苗可以与IDEXXELISA结合使用以区分感染的动物和接种的动物(DIVA)的想法。到激发后第14天，组2-4发生血清转化。但是，在尸体剖检过程中，ARP组仍然显著低于其他处理组，表明ARP组的感染水平较低。这种对比无法在MLV组进行，因为此组动物在激发之前即为阳性。严格阴性组在整个研究中保持阴性。
荧光聚焦中和测定
荧光聚焦中和(FFN)测定检测了针对PRRSV的血清中和抗体。在激发后第0、7、14和21天从所有猪采集血清样品。将样品送到南达科他州立大学进行测试，如前所述。所使用的测试病毒是PRRSV毒株Pennway，倒数效价≥4被认为是阳性。图14中总结了每组中阳性猪的数量。在激发当天，任何组都没有阳性猪。但是在激发之后，通过尸体剖检表明，与灭活组和安慰剂组相比，ARP和MLV组有更多的猪为阳性。在严格阴性组中，所有的猪在整个研究中保持阴性。因为ARP和MLV组的阳性猪更多，这两组的平均中和效价比其他处理组高并不奇怪，如图15所示。
尽管本发明人之前的研究表明，表达的PRRSVGP5和M能够在激发之前诱导中和抗体，但是并未在该研究中观察到。但是这可能是由于在本研究中使用的GP5的糖基化导致的。这是一种从野生毒株中制备的新型疫苗，其倾向于被高度糖基化。尽管在激发之前没有中和抗体，本发明人确实注意到ARP组的初次接种效应(primingeffect)与MLV组类似，这可通过激发后两组之间的差异证明。
活病毒滴定法
如前所述，测试在激发后第0、7、14和21天时的血清样品，以及在尸体剖检时采集的支气管肺泡灌洗(BAL)液中活PRRSV的存在。简言之，在含有汇合的Marc-145细胞的96孔板上将样品稀释10倍。将每种临床样品分4份放置在平板中。在37℃和5％CO2中孵育平板7天，或直到观察不到新的CPE。使用Reed-Muench方程计算TCID50/ml效价。检测极限是5.6e1TCID50/ml。
在激发后第0天，所有组都是活病毒阴性的，严格阴性组在整个研究过程中保持阴性。到激发后第7天，在4个经激发的组中检测到病毒，并且注意到病毒血症有显著差异(图16)。在激发后第14天和第21天，血清中没有可检测到的活病毒。
BAL液(支气管肺泡灌洗液)的测试表明，组2和5中仅有一个阳性样品，组3和4中仅有两个阳性样品(未显示数据)。
RT-PCR
如前所述，在激发后第0、7、14和21天时对采集的血清样品进行RT-PCR。简言之，使用QiagenVirusSpin试剂盒提取病毒RNA。然后使用PRRSV编码N蛋白的ORF7基因的特异性引物对所述提取物进行测试，重复两次。结果总结为每组中阳性猪的数量(图17)。
虽然PCR是检测病毒血症的另一种测定，但是PCR与活病毒滴定结果不匹配并不奇怪。一种方法检测活病毒，而另一种方法仅检测核酸，所述核酸在活病毒不存在时也可能存在。PCR结果表明，到激发后14天，ARP和MLV组与安慰剂组相比患病毒血症的猪显著更少。
实施例2
在本实验中，甲病毒复制子来自甲病毒委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的TC-83毒株。在之前的研究中，表达来自人H5N1分离株的HA基因的VEEV复制子疫苗保护鸡免受致死性激发。Schultz-CherryS,DybingJK,DavisNL,WilliamsonC,SuarezDL,JohnstonR,PerdueML.Influenzavirus(A/HK/156/97)hemagglutininexpressedbyanalphavirusrepliconsystemprotectschickensagainstlethalinfectionwithHongKong-originH5N1viruses.Virology.2000Dec5；278(1):55-9.PubMedPMID:11112481。最近，本发明人的团队首次在猪中评估VEEV复制子颗粒疫苗。ErdmanMM,KamrudKI,HarrisDL,andSmithJ,2010,“AlphavirusRepliconParticleVaccinesDevelopedforUseinHumansInduceHighLevelsofAntibodiestoInfluenzaVirusHemagglutinininSwine:Proofofconcept”,Vaccine28:594-596。本研究的目的是在接种-激发模型中评估作为猪疫苗的复制子表达的重组新型H1N1HA蛋白。
材料和方法
新型H1N1HA复制子亚单位疫苗的制备
从全球共享禽流感数据倡议(GISAID)数据库获得血凝素(HA)核苷酸序列。商业公司(DNA2.0,MenloPark,CA,USA)合成所述基因，其5’和3’末端分别有经改造的独特AscI和PacI限制性位点。将HA基因克隆到pVEK(TC-83)复制子载体的AscI/PacI位点(HooperJW,FerroAM,GoldenJW,SilveraP,DudekJ,AltersonK,CusterM,RiversB,MorrisJ,OwensG,SmithJF,andKamrudKI,2009,“MolecularSmallpoxVaccineDeliveredbyAlphavirusRepliconsElicitsProtectiveImmunityinMiceandNon-HumanPrimates”Vaccine13(13))，并如以上所述选择经优化的构建体。(KamrudKI,CusterM,DudekJM,OwensG,AltersonKD,LeeJS,GroebnerJL,SmithJF.AlphavirusrepliconapproachtopromoterlessanalysisofIRESelements.Virology.2007Apr10；360(2):376-87.Epub2006Dec6.PubMedPMID:17156813；PubMedCentralPMCID:PMC1885372.)。然后对所述HA基因进行测序，以保证在克隆过程中保持了恰当的序列。如以上所述，体外制备RNA转录物(Kamrudetal(2007))。在电穿孔杯(cuvette)中将复制子RNA和Vero细胞混合，并施加冲击(pulse)。过夜孵育细胞，然后使用RIPA缓冲液(Pierce,Rockford,IL,USA)裂解细胞。通过蛋白质印迹法测试所得裂解产物的蛋白质表达，并通过新型H1N1HA特异性的ELISA确定HA蛋白浓度。将裂解产物稀释到特定的HA浓度，并为疫苗添加佐剂Emulsigen-D(MVPTechnologies,Omaha,NE,USA)。
蛋白质印迹分析
通过在12％SDS-PAGE凝胶上进行电泳(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分离包含重组HA蛋白的Vero细胞裂解产物，然后将其转移到PVDF膜(Invitrogen,Carlsbad,CA)。所使用的梯度(ladder)是SeeBluePlus2预染标准品(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。转移后，在室温下用5％脱脂奶粉封闭膜。将膜与猪抗HA多克隆抗体孵育2小时，冲洗3次，然后用山羊抗猪IgG辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(ImmunoJacksonResearchLaboratories,Inc,WestGrove,PA,USA)孵育1小时，冲洗3次。使用TMB底物(KPL,Gaithersburg,MD,USA)进行检测。
动物研究
获得3周龄猪，其未感染猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。将猪随机分成4组，每组5只猪。在接种之前采集血清并通过针对新型H1N1A/加利福尼亚/04/2009毒株的同源血凝抑制(HI)测定对其进行测试以确定阴性的抗体状态。在整个研究中采集血清并通过所述相同的HI测定对其进行测试，以监测接种后的血清转化。接着进行初次接种/加强接种方案。第0天给予约4周龄的猪第一剂量疫苗。在第21天对猪进行加强接种，在第47天进行激发，在第52天进行尸体剖检。猪接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)(组1)或不同浓度的新型H1HA重组蛋白(组2-4)。使用剂量为2×105TCID50/ml的有毒力的A/加利福尼亚/04/2009(CDC#2009712047)经气管内对猪进行激发。从激发当天开始并持续直到激发后5天研究结束，每天采集鼻擦拭物以分离活病毒。在激发前不久对猪进行称重，尸体剖检时对猪进行再次称重，以确定平均每日体重增加。在尸体剖检时，由委员会认证的兽医病理学家确定总体肺损伤实变。将肺组织固定于福尔马林中，用于SIV免疫组织化学(IHC)和组织病理学分析。从肺采集支气管肺泡灌洗液(BALF)用于活病毒分离。所述动物研究获得爱荷华州立大学动物保护机构与使用委员会的批准。
总体肺损伤评分，组织病理学和SIV免疫组织化学
一名对各组处理不知情的委员会认证的兽医病理学家进行总体肺损伤评分、组织病理学分析和SIV免疫组织化学(IHC)分析。在尸体剖检时，目测评估受到肺炎影响的每个肺叶，并根据每个肺叶占肺总体积的加权比例计算整个肺的总的百分数(HalburPG,PaulPS,FreyML,LandgrafJ,EernisseK,MengXJ,LumMA,AndrewsJJ,RathjeJA.ComparisonofthepathogenicityoftwoUSporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusisolateswiththatoftheLelystadvirus.VetPathol.1995Nov；32(6):648-60.PubMedPMID:8592800)。采集来自气管和全部肺叶的组织样品，并将其固定在10％福尔马林中。按照常规方式处理组织并用苏木精和伊红染色。根据Vincent等所使用的方法对肺样品进行评分(VincentAL,MaW,LagerKM,JankeBH,WebbyRJ,García-SastreA,RichtJA.EfficacyofintranasaladministrationofatruncatedNS1modifiedliveinfluenzavirusvaccineinswine.Vaccine.2007Nov19；25(47):7999-8009.Epub2007Sep29.PubMedPMID:17933442；PubMedCentralPMCID:PMC2099695)。根据Vincent等所记载的方法进行猪流感病毒IHC(VincentLL,JankeBH,PaulPS,HalburPG.Demonstrationofswineinfluenzavirusinformalin-fixed,paraffin-embeddedtissuesbyuseofanimmunohistochemicaltest.Proceedingsofthe14thIPVSCongress.1996；97)。由爱荷华州立大学兽医诊断实验室实施全部组织制备和染色。
活病毒分离
从鼻擦拭物和对支气管肺泡灌洗液样品(BALF)所进行的活病毒分离确定活病毒效价。简言之，解冻鼻擦拭物和BALF样品并离心以除去细胞碎片。在96孔板中用包含1％杀抗生素-抗真菌素(Gibco,Carlsbad,CA,USA)和1％L-谷氨酰胺(Mediatech,Manassas,VA,USA)的Dulbecco’sModifiedEagleMedium(DMEM)(Gibco,Carlsbad,CA,USA)将所获得的上清液稀释10倍。在制备稀释物后，从每个孔中转移100μl到含有单层猪睾丸(ST)细胞的96孔板的各个孔中。在37℃孵育板直至观察不到进一步的CPE，孵育时间通常为3-5天。呈现CPE的孔被认为是阳性的，并使用Reed-Meunch的TCID50/ml方法计算效价(ReedLJandMuenchH.Asimplemethodofestimationof50％endpoints.AmericanjournalofHygiene.27；493-497.1938)。
血凝抑制测定
明尼苏达大学兽医诊断实验室按照标准实验室方案进行血凝抑制(HI)测定，以测定针对流感病毒的抗体。简言之，用破坏受体的酶处理血清，加热灭活，用20％火鸡红细胞吸附，并离心。然后在V型孔微量滴定板中用包含4-8凝集单位的A/California/04/2009的等体积溶液连续稀释上清液，并在室温下孵育板，然后加入0.5％火鸡红细胞。效价被定义为血凝反应被抑制的最大稀释率的倒数。
直接抗原捕获ELISA
通过用捕获缓冲液(50mM碳酸盐/碳酸氢盐,pH9.6)稀释将未知样品、阴性对照和纯化的新型H1蛋白(ProteinSciences,Meriden,CT,USA)直接捕获到NUNCMaxisorp(Rochester,NY,USA)96孔微孔板中，并在4℃下过夜孵育(100μl/孔)。用冲洗缓冲液(20mM磷酸盐缓冲盐水，0.05％吐温-20，pH7.2)冲洗微孔板4次。在37℃下用溶于捕获缓冲液中的1.25％脱脂奶粉封闭所述板1小时(200μl/孔)。在冲洗4次之后，将猪抗HA多克隆抗体加入到孔中(100μl)并在37℃下孵育1小时(在包含1.25％NFDM的冲洗缓冲液中以1/500稀释)。在4次冲洗之后，将标记的山羊抗猪IgG-HRP(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA,USA)加入到孔中(100μl)并在37℃下孵育1小时(在包含1.25％NFDM的冲洗缓冲液中以1/2000稀释)。进行4次最终冲洗，然后加入100μlTMB底物(KPL,Gaithersburg,MD,USA)并在37℃下孵育20分钟。在620nm测定吸光度值并用纯化的新型H1蛋白绘制标准曲线。使用所述标准曲线的线性回归分析来计算在未知样品中新型H1的浓度。
统计学分析
使用单因素方差分析(ANOVA)来分析同源HI效价、宏观和组织病理学肺评分、IHC和BALF结果、log10转换的鼻擦拭物病毒效价和ADG(JMP8.0.1,SASInstituteInc.,Cary,NC,USA)。将统计学显著性设定为p<0.05。
结果
疫苗制备
根据之前所列出的方法，将新型H1N1HA插入到甲病毒复制子平台中。插入后的核苷酸测序确认在整个克隆过程中保持了正确的HA基因序列。对蛋白质裂解产物进行的蛋白质印迹确定了在用于动物研究的疫苗制剂中所使用的所有不同的HA剂量下新型HA蛋白的表达。通过新型HAELISA确定HA的浓度，并将其稀释到特定的HA浓度(表9)。参见图18。
表9：新型H1N1重组HA疫苗研究的设计。猪接受假疫苗(PBS，组1)或不同剂量的HA抗原(组2-4)。在第0天和第21天以2ml剂量通过肌肉内途径给予所有疫苗。
抗体效价
通过同源HI测定测试接种后血清的特异性抗体应答。在一个剂量之后在接种的猪中未见到血凝抑制效价，但是在加强接种后第7天和第14天除了组2中的一只猪之外所有的猪都是阳性(≥1:40)(未显示数据)。在激发当天，组2-4的同源HI效价显著高于组1(表10)。
表10：血清抗体效价、平均宏观和微观肺状况、免疫组织化学(IHC)和平均每日体重增加(ADG)的总结。
组织病理学
a同源HI效价的几何平均值
b组平均值±标准误差
c0-3，组平均值±标准误差
d每组的阳性样品的数量
e激发后的ADG(以磅计)，组平均值±标准误差
*数值与同一列中的未接种组(组1)具有显著差异，p<0.05
病理学评估
在尸体剖检中，肺表现出主要位于颅腹肺叶(cranioventrallobe)的宏观暗紫红实变损伤。与组1的猪相比，取自组2-4的肺表现出明显较低的损伤评分和实变(表10)。与未接种组相比，所有接种组的病理学评分也显著降低(表10)。取自未接种组1的猪的肺切片有约50％的导气管受到细支气管上皮破坏和细支气管周淋巴细胞成套(cuffing)的影响。接种组2-4表明，仅偶尔有受到轻微成套影响的气道。还在肺切片上进行猪流感病毒IHC。取自未接种组1的猪的全部5个肺都是流感病毒抗原阳性，而接种组2-4中总共仅有2只猪是阳性。此外，对在尸体剖检中取自各猪的气管样品进行SIVIHC(未显示数据)。虽然在所有的组中都有阳性气管IHC样品，但是在接种组和未接种组之间没有显著差异。阳性气管IHC结果与之前所报道的关于雪貂中新型H1N1的发病测的结果相关(MunsterVJ,deWitE,vandenBrandJM,HerfstS,SchrauwenEJ,BestebroerTM,vandeVijverD,BoucherCA,KoopmansM,RimmelzwaanGF,KuikenT,OsterhausAD,FouchierRA.Pathogenesisandtransmissionofswine-origin2009A(H1N1)influenzavirusinferrets.Science.2009Jul24；325(5939):481-3.Epub2009Jul2.PubMedPMID:19574348)。
病毒分离
在激发后第1天，从鼻擦拭物中未检测到活流感病毒(表11)。在激发后第2天，在组1、3和4中检测到活流感病毒，尽管平均组病毒效价之间没有显著差异。在激发后第3天，组2和4的效价明显低于组1。在激发后第4和第5天，组2-4全部表现出低于组1的效价。在激发期间，来自组2任何猪的鼻擦拭物中都未检测到活病毒。同样，各组之间阳性BAL样品的数量显著减少(表11)。到激发后第5天，总共仅有3只经接种的猪的BAL样品中有可检测到的活病毒，而未接种组的全部5只猪都是病毒分离物阳性的。
平均每日体重增加
在激发当天对所有猪进行称重，在尸体剖检时再次称重。组3和4在激发后的5天期间平均每日体重增加(ADG)显著高于组1。组2确实比组1表现出更高的ADG，但是并非显著更高(p＝0.08)。
表11：来自鼻擦拭物和支气管肺泡灌洗(BAL)的活病毒分离物的总结。
a激发后鼻擦拭物中的Log10平均病毒效价±标准误差
b每组阳性BAL样品的数量
c激发后的天数(DPC)
*数值与同一列中的未接种组(组1)具有显著性差异，p<0.05
设计类似实验，其不包括流感病毒激发或相关分析；仅在经接种的动物中测定以这种方式制备的重组HA疫苗的免疫原性。对于这项研究，使用上述方法将其他4种流感病毒(H1-β、H1-δ、H1-γ和H3)的HA基因插入到甲病毒复制子平台中。插入后的核苷酸测序确认在整个克隆过程中保持了正确的HA基因序列。对用每种HA构建体制备的蛋白质裂解产物进行蛋白质印迹，以确认HA蛋白的表达(未显示数据)。在本实验中，使用所获得的HA疫苗的不同稀释物来接种各组猪(下表12和表13记载了使用的疫苗和方案)；用来为猪进行接种的稀释物如表14所示。使用上述方法，通过同源HI效价来分析不同重组HA疫苗所诱导的免疫应答，其中最终效价表示为能够在测定中抑制病毒的血凝作用的最终血清稀释率的倒数。对在本研究中测定的HI效价的总结如表14所示。
表12
天 任务
第-7天 采集血液，处理w/抗生素，加标签，随机化
第0天 对猪进行免疫
第21天 采集血液，用加强疫苗剂量处理
第28天 采集血液，用于血清学分析
第35天 采集血液，用于血清学分析
第42天 采集血液，用第二加强疫苗剂量处理
第57天 对动物施安乐死术，采集大体积的血液样品
表13：疫苗方案
抗原 稀释率(1ml剂量) 剂量的# 动物的#
重组-βHA 1:60 3 2
重组-βHA 1:75 3 3
重组-δHA 1:60 3 2
重组-δHA 1:75 3 3
重组-γHA 1:60 3 2
重组-γHA 1:75 3 3
重组-H3 HA 1:60 3 2
重组-H3 HA 1:75 3 3
阴性对照1 1:10 3 2
阴性对照2 1:10 3 2
表14.增强后21天的HI效价
疫苗：稀释率 倒数HI效价
H1-β1:60 160
H1-β1:60 10
H1-β1:75 160
H1-β1:75 160
H1-β1:75 320
H1-δ1:60 160
H1-δ1:60 80
H1-δ1:75 80
H1-δ1:75 160
H1-δ1:75 320
H1-γ1:60 320
H1-γ1:60 40
H1-γ1:75 160
H1-γ1:75 80
H1-γ1:75 10
H3 1:60 320
H3 1:60 40
H3 1:75 320
H3 1:75 160
H3 1:75 320
讨论
新型H1N1在人群中的爆发突出强调了流感病毒所具有的动物传染病的潜能。即使在近十年的大流行之前，仍有许多流感从猪传播到人的报道病例。因此，对所述动物传染病威胁的部分控制是对猪进行接种以抵抗猪流感病毒。在本研究中，本发明人证明了能够多快制备基于甲病毒复制子表达系统的有效的猪流感疫苗，以对新型动物传染病毒株爆发做出反应。本实验报道了使用通过甲病毒复制子表达系统制备的重组蛋白质对猪进行免疫。最近，用所述系统制备的复制子颗粒(RP)疫苗被用来在猪中诱导针对猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保护(ErdmanMM,KamrudKI,HarrisDL,SmithJ.2010,AlphavirusVectorVaccinesDevelopedforUseinHumansInduceHighLevelsofAntibodiestoInfluenzaVirusHemagglutinininSwine:ProofofConcept.Vaccine28:594-596；BosworthB,ErdmanM,StineD,HarrisI,IrwinC,JensM,LoynachanA,OwensG,KamrudK,HarrisDL.2010,Virus-likerepliconparticlevaccineprotectspigsagainstinfluenza.ComparativeImmunology,MicrobiologyandInfectiousDiseases33(2010)e99–e103.)。第一个概念验证研究证明，给予猪的复制子颗粒疫苗能够诱导针对人流感毒株的高抗体HI效价。使用表达进化枝IVH3N2SIV分离株的HA基因的RP疫苗的后续研究证实，给予猪的流感HARP疫苗不但能够诱导抗体应答，还能够提供显著的针对同源病毒激发的保护。不同于这些早期研究，本研究使用甲病毒复制子表达系统以体外生成重组HA蛋白；但是证明了具有针对病毒激发的类似的抗体应答和保护。
所述结果证明，用A/加利福尼亚/04/2009对猪进行流感感染能够引起与SIV的其他毒株相当的临床症状和总体损伤(VincentAL,MaW,LagerKM,JankeBH,WebbyRJ,García-SastreA,RichtJA.EfficacyofintranasaladministrationofatruncatedNS1modifiedliveinfluenzavirusvaccineinswine.Vaccine.2007Nov19；25(47):7999-8009.Epub2007Sep29.PubMedPMID:17933442；PubMedCentralPMCID:PMC2099695；VincentAL,LagerKM,MaW,LekcharoensukP,GramerMR,LoiaconoC,RichtJA.Evaluationofhemagglutininsubtype1swineinfluenzavirusesfromtheUnitedStates.VetMicrobiol.2006Dec20；118(3-4):212-22.Epub2006Aug1.PubMedPMID:16962262；SretaD,KedkovidR,TuamsangS,KitikoonP,ThanawongnuwechR.Pathogenesisofswineinfluenzavirus(Thaiisolates)inweanlingpigs:anexperimentaltrial.VirolJ.2009Mar25；6:34.PubMedPMID:19317918；PubMedCentralPMCID:PMC2678088.)。与以前研究不同，本研究的几只猪(主要是未接种组中)表现出临床征象，主要是咳嗽和打喷嚏。这种差异可能归因于在以前研究中使用小规模的猪模型(ItohYetal.Invitroandinvivocharacterizationofnewswine-originH1N1influenzaviruses.Nature.2009Aug20；460(7258):1021-5.PubMedPMID:19672242；PubMedCentralPMCID:PMC2748827)。在本研究中，疫苗给药诱导了特异性的抗体效价，减少了宏观和组织病理学肺损伤，并且减少了鼻和肺中的病毒载量。还证明了经接种的猪的平均每日体重增加高于未接种的猪。这些结果证明，当所述重组新型HA蛋白被用作针对新型H1N1猪流感的疫苗时是有效的。
本研究还表明，使用甲病毒复制子表达系统能够快速并灵活地制备疫苗。从在GISAID数据库检索到新型HA序列到给予猪第一疫苗剂量，需要花费不到两个月。用于制备流感疫苗的常规方法花费长得多的时间，并且取决于在含胚的卵或组织培养细胞中的病毒复制以及随后的灭活。在面对流感大流行时，在阻止进一步传播并减少动物传染病可能性方面，快速转变是重要的。甲病毒复制子平台允许快速插入任何流感HA(或其他)基因，由于流感病毒中持续的抗原转变和漂移，而使其成为颇具吸引力的流感疫苗技术。
获得来自某地点的动物的组织或体液，猪在所述地点已经暴露于流感病毒。使用如实施例1所述的RT-PCR方法来分离病毒的HA。将编码HA的序列引入载体中，并使被复制子感染的vero细胞裂解以制备HA抗原(以及与适合的佐剂混合)，或者在另一个实验中，使用实施例1中所述的步骤来制备RP疫苗。给予猪疫苗，并测定发病率和死亡率结果。
实施例3
口蹄疫(FMD)是偶蹄(clovenhoofed)动物的高度传染性疾病，其通过接触和飞沫(aerosol)快速传播(BachrachHL.Foot-and-mouthdisease:world-wideimpactandcontrolmeasures.In:KurstakE,MaramoroschK,editors.Virusesandenvironment.NewYork:AcademicPress；1978.p.299–310.)。FMD在台湾、日本、韩国、英国和荷兰(FMD已绝迹几十年的国家)的爆发导致显著不利的经济后果，包括大量动物的屠宰和出口市场的损失。即使是2007年夏天在英国的非常有限的FMD爆发——其原因是FMDV从包括动物健康政府研究所和Merial疫苗生产实验室的Pirbright实验室泄漏——也导致显著的经济损失(约1亿美元)。这些爆发说明了无FMD国家(例如美国)对这种疾病的易感性。疾病控制方案包括限制动物移动、屠宰感染和暴露的动物，以及在一些情况下进行接种。但是，作为通过化学方法灭活的活病毒制剂的现有疫苗有许多缺陷，包括不能够诱导快速保护。
通过将衣壳-3C蛋白酶盒工程化改造到复制子载体中并生成能够用来对牛进行免疫的RP，来制备共表达FMDV衣壳和3C蛋白酶编码区的RP疫苗。参见GenBank登录号AY593768(2005)。所述衣壳-3C蛋白酶盒是从USDA、ARS、ARS、NAAPlum岛动物疾病中心外国动物疾病研究部门获得。这些疫苗接种的数据在图19和表15中示出。
表15FMDV激发后5天的损伤得分
用1×109IUA24RP接种一次的牛在FMDV激发之后表现出几乎完全的免于全身疾病的保护(一只动物的一只蹄出现损伤，而其他所有动物都保持无症状)。接受5×108IU的A24RP的一半动物被保护而免于显著的全身疾病。剂量A：1×109IU。剂量B：5×108IU。激发前柱图上方的数字表示#阳性动物/总#动物。对在接种后第0、7、14和21天采集的血清进行病毒中和测定。结果如下所示。剂量最高组的所有动物到第7天都出现FMDV中和抗体，该情况一直保持到激发当天(第21天)。
本文记载了两种候选的针对口蹄疫病毒(FMDV)的快速反应疫苗方法。第一种由包装进颗粒(RP)中的表达FMDV基因的复制子RNA组成。使用自身来源制备如上文所述的类似的RP，并按照以下方法对动物进行免疫。纯化的RP代表疫苗。第二种由蛋白质裂解物组成，所述裂解物通过以下方法制备：将表达FMDV基因的复制子RNA引入细胞；在生成疫苗抗原后通过裂解被转染的细胞来收获重组亚单位(RS)裂解物疫苗。两种基于复制子的方法都能够区分经接种的动物和被感染的动物。
制备共表达FMDV衣壳和FMDV的3C蛋白酶编码区的复制子载体。所述FMDV蛋白质的表达生成病毒样颗粒(VLP)，因为3C蛋白酶加工外壳蛋白，使其自我包装成抗原性VLP。P1-2A衣壳编码区、2B编码区和完整的3C蛋白酶编码区将被表达(MoraesMP,MayrGA,MasonPW,GrubmanMJ.Earlyprotectionagainsthomologouschallengeafterasingledoseofreplication-defectivehumanadenovirustype5expressingcapsidproteinsoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)strainA24.Vaccine2002；20:1631–9.)。因为大多数FMDV非结构蛋白未包含于被工程化改造进复制子载体的基因中，因此能够明确地区分用所述疫苗接种的动物和被感染的动物。
选择以最高相对水平表达并产生最高效价RP的复制子克隆。使用在产率和表达分析中与FMCV的全部7种血清型交叉反应的单克隆抗体。
第一种方法是通过将表达FMDV衣壳和3C蛋白酶编码区的复制子RNA引入培养的细胞中来制备RNA亚单位(RS)疫苗。一旦将携带FMDV基因的复制子引入细胞中之后，每个单独的细胞均表达所述FMDV蛋白质。通过裂解细胞产生FMDV蛋白质裂解物来收获在细胞中表达的FMDV蛋白质，所述裂解物构成RS疫苗。简言之，在体外从复制子质粒制备RNA转录物(PromegaRiboMAX转录系统)，并通过离心柱(spin-column)(凝胶结合和洗脱)或尺寸排阻色谱法来纯化所述RNA转录物，然后进行琼脂糖凝胶分析以评估完整性，并且通过紫外(UV)吸光度进行定量。在电穿孔室中混合特定质量数量的复制子RNA和认证的Vero细胞，并在转染效率和蛋白质表达的最优条件下进行冲击。将经电穿孔的细胞悬浮液接种到单个内含含有血清的培养基的转瓶中，并在37℃、5％CO2中孵育18-24小时。孵育之后，用胰蛋白酶处理细胞并通过离心使细胞沉淀。然后通过将细胞沉淀重新悬浮于哺乳动物细胞裂解缓冲液(RIPA裂解和提取缓冲液，ThermoScientific)来裂解细胞。通过蛋白质印迹分析测试所得裂解产物的功效以确定蛋白质表达。
在RS功效测定中，使用特异性针对FMDVVP2衣壳蛋白的蛋白质印迹的密度测定法来确定FMDV抗原的相对浓度。相对抗原浓度与总细胞蛋白质浓度相关，所述总细胞蛋白质浓度是通过BCA蛋白质测定试剂(双金鸡宁酸，Pierce,Rockford,IL)法和牛血清白蛋白标准曲线来确定。FMDV抗原的最大浓度是基于可能的最小制剂稀释率和与测试动物的实际接种相关的体积限制。除了浓度最高的FMDV抗原剂量以外，还配制了FMDV抗原裂解物的其他两种稀释物。所述其他两种稀释物代表最高剂量的1:5和1:10稀释物。
第二种方法是制备FMDVRP疫苗。通过电穿孔将表达FMDV基因的复制子RNA和两种辅助RNA引入Vero细胞来制备FMDVRP疫苗。然后在电穿孔后约18小时从细胞中收获FMDVRP；当通过接种将所述RP引入动物时，所述RP表达FMDV衣壳和3C蛋白酶编码区。简言之，如上文所述，在体外从复制子和辅助质粒制备RNA转录物，并通过离心柱(凝胶结合和洗脱)或尺寸排阻色谱法来纯化所述RNA转录物，然后进行琼脂糖凝胶分析以评估完整性，并且通过紫外(UV)吸光度进行定量。在电穿孔室中混合特定质量数量的复制子和辅助RNA以及认证的Vero细胞，并使用多个电穿孔参数进行冲击，所述多个电穿孔参数用于确定转染效率和RP产率的最优的条件。将经电穿孔的细胞悬浮液接种到包含无血清培养基的单个转瓶中，并在37℃、5％CO2中孵育18-24小时。孵育后，将来自多个转瓶的培养基和细胞合并，并将其泵过带电的深度过滤器。使用高NaCl浓度的缓冲液从细胞和过滤器上洗脱RP，并将RP保存于-80℃直至使用。通过抗原特异性IFA来测定RP制品的感染效价，并在CPE测定中以确定的MOI进行测试，以确保不存在可检测的能够复制的病毒(RCV)。从CPE测定获得阴性结果以后，所述RP制品被认为不含有可检测的RCV，随后可在BL1实验室条件下进行处理。
在IFA测定的基础上，使用功效测定来确定的RP效价，并使用qRT-PCR分析来确定与每个RP相关的RNA的数量。确定RNA拷贝总数有助于确保疫苗的各系列之间的一致性。用于计算功效的方法是基于特异性针对疫苗H3抗原的IFA。观察并定量H3阳性细胞。在10X放大率下目视观察IFA组织培养平板的单个孔，并使用每个格栅(grid)视野包含20-50个H3阳性细胞的孔。计算每个孔的5个视野的总数。以相同方式计算重复的孔。使用10个读数的平均值来计算功效，或RP/ml。通过将10个计数的平均值代入以下方程来确定H3阳性细胞的总数：功效＝(平均值)×(稀释率)×(100)/(0.12)，其中平均值代表样品的10个阳性H3细胞读数的平均值，稀释率代表用于计算平均H3阳性细胞的孔，100是一个常数，其代表组织培养板的孔的表面积，0.12是一个常数，其代表被测试的RNA颗粒疫苗的体积(ml)。
使用特异性针对FMDVVP2衣壳蛋白的蛋白质印迹的密度测定法来确定FMDV抗原的相对浓度。相对抗原浓度与总细胞蛋白质浓度相关，所述总细胞蛋白质浓度是使用BCA蛋白质测定试剂(双金鸡宁酸，Pierce,Rockford,IL)法和牛血清白蛋白标准曲线确定。FMDV抗原的最大浓度是基于可能的最小制剂稀释率和与测试动物的实际接种相关的体积限制。除了浓度最高的FMDV抗原剂量以外，还配制FMDV抗原裂解物的其他两种稀释物。所述其他两种稀释物代表最高剂量的1:5和1:10稀释物。
动物
物种/品种/品系：牛，对品种或品系无限制
性别：无限制
大概的初始年龄：接种时为3-6月龄。没有体重限制和/或体重(第0天)。
大概的数量：包含10只
供应来源/起源：动物来自于商业农场或生产系统
鉴定：通过有唯一编号的耳部标签来鉴定每只动物。
适应/适应环境：在给予用于研究的兽医产品(IVP)之前适应≥5天
管理/圈养：根据研究地点的标准程序对动物进行喂食和喂水。根据研究地点的机构动物保护与使用委员会(IACUC)的许可和研究地点的设施规章对动物进行管理。
排除：研究中仅招收临床上健康的动物。在给予IVP之前，根据研究者和/或参与实验的兽医的判断，将不适合的动物排除在研究之外。从研究中排除任何动物的原因将包含于最终报告中。
分配：在给予IVP之前，在分配计划中记录每个招收的动物的鉴定编号。
表16用于研究的兽医产品
表17激发
表18实验组
免疫和激发
在第0天，从所有牛采集血液(基线)。在第0天用测试品(T02，T03)对牛进行一次免疫或假免疫(T01)。在第7天和第14天，从所有牛(T01-T03)采集血液并测试针对FMDVA24的血清病毒中和(SVN)抗体的存在。根据OIE指南，用FMDV血清型A24CruzerioSGD毒株对牛进行激发。对于激发给药，给每只动物施用镇静剂，然后在其舌的上表面的多个位点处进行皮内接种(共0.5-1.0ml)。
由于目前在美国没有获批的FMDV疫苗，因此RP或RS疫苗特别有用。实际上，美国不得不依赖于来自其他国家的来源，这些疫苗可能不会对美国的毒株或生物型有效。在本发明中，基于美国的FMDV可以是生物型，并且可快速制备疫苗。
从某地点的动物获得组织或体液，所述地点的动物暴露于FMDV病毒。使用如实施例1所述的RT-PCR方法来分离所述病毒的FMDV衣壳和3C蛋白酶编码区。将所述序列引入载体，并使被所述载体感染的vero细胞裂解，或者在另一个实验中使用实施例1中所述的操作方法来制备RP疫苗。给予动物疫苗，并测定发病率和死亡率结果。
实施例4
以下说明使用干扰RNA，并将其自身来源化作为动物疫苗。在以下实验中，使用养殖虾作为目的核酸来源来制备IMNV疫苗和WSSVVP28疫苗，在测序之前首先在未患病动物中扩增。
RNAi序列的测定
为了评估对IMNV做出反应的诱导RNAi的备选序列，体外合成对应于病毒基因组区域的dsRNA。通过使用商用核酸纯化试剂盒(QiagenRNeasyMini)提取病毒RNA来制备用于体外转录的模板DNA。使用从可获得的序列(GenBank登录号EF061744)设计的特异性寡核苷酸引物来制备IMNV基因组的cDNA(Senapin,S.,Phewsaiya,K.,Briggs,M.,Flegel,T.W.,2006.Outbreaksofinfectiousmyonecrosisvirus(IMNV)inIndonesiaconfirmedbygenomesequencinganduseofanalternativeRT-PCRdetectionmethod.Aquaculture266,32-38.)。根据生产商的使用说明，通过将5μlRNA提取物加到反应混合物中并在50℃下孵育60分钟，进行逆转录(ThermoscriptRTInvitrogen)。逆转录之后，将模板cDNA(约50ng)加到PCRmaster混合物(PuReTaqReady-To-GoPCRBeads)中，并使用针对IMNV基因组特定区域的寡核苷酸引物(表19)来进行热循环。循环条件是：95℃4分钟；随后进行35个循环，每个循环为94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟；最后72℃延长10分钟。
在实验1-3中使用的dsRNA序列(参见最后的序列列表)：
dsRNA#3(SEQIDNO:1)
dsRNA#35’截短物(SEQIDNO:2)
dsRNA#33’截短物(SEQIDNO:3)
dsRNA#2(SEQIDNO:4)
dsRNA#1(SEQIDNO:5)
GFPdsRNA(SEQIDNO:6)
表19寡核苷酸引物序列
然后将产物克隆到pCR4.0载体(ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒，Invitrogen)中并转化至大肠杆菌(TOP10,Invitrogen)。将来自所述转化体的质粒制品作为模板来源，用于体外dsRNA合成。按照生产商的说明使用AmbionRNAi试剂盒来制备dsRNA。简言之，在一个DNA模板的5’末端能够使用反向的(opposing)T7RNA聚合酶，或者使用有两个模板的位于待转录区相反末端的单个T7启动子，或者使转录生成互补RNA分子的两个模板退火。用于转录的DNA模板是使用所述引物序列扩增的具有加入的T7启动子序列的PCR产物(参见，例如，Ujvari,AandMartin,CT.IdentificationofaMinimalBindingElementwithintheT7RNAPolymerasePromoter.J.Mol.Biol.(1997)273,775-781；Sousaetal.(2003)“T7RNApolymerase”ProgNucleicAcidResMolBiol73:1-41.)。PCR循环条件是：95℃反应4分钟；随后进行35个循环，每个循环为94℃30秒、61℃30秒、72℃1分钟；最后72℃延长10分钟。然后37℃下过夜(16小时)孵育所述克隆以形成dsRNA。然后将dsRNA产物与DNaseI和RNase孵育1小时，并利用所提供的柱进行纯化。通过凝胶电泳，与分子量梯度(pGEMladder,Promega)对比来确定dsRNA合成，并通过分光光度计法(BioRadSmartSpec)对产物进行定量。
动物饲养
从虾改良系统(ShrimpImprovementSystems，PlantationKey,Florida)获得无特异性病原体(SPF)的后期幼体并在生物安全动物培养设施中进行饲养。将动物放置在包含人工海水(CrystalSeaMarineMix)、牡蛎壳气升式生物滤器和活性炭滤器的1000LPoly水槽中。用商用生长饮食(commercialgrowoutdiet，Rangen35/10,Buhl,Idaho)喂养动物，直到其体重为5克。
制备病毒接种物
使用Hasson等的方法(Hasson,K.W.,Lightner,D.V.,Poulos,B.T.,Redman,R.M.,White,B.L.,Brock,J.A.,Bonami,J.R.,1995.TaurasyndromeinPenaeusvannamei:demonstrationofaviraletiology.DiseaseofAquaticOrganisms23,115-126)的修改方法来说明病毒接种。简言之，从虾改良系统获得完全冷冻的动物，所述动物是通过PCR检验为IMNV感染阳性的。从所述动物去除尾部肌肉，在TN缓冲液(0.02MTns-HCl,0.4MNaCl,pH7.4)中按1:3稀释并在无菌韦林氏搅切器(Waringblender)中匀浆5分钟。将浸渍物放置于离心管中，并以4000g离心。然后除去上清液，再以15000g离心30分钟。进行最终离心步骤：以25000g离心60分钟。在无菌的2％盐水中以1:10稀释上清液，并过滤通过0.2μm注射器式滤器(Whatman)。然后将所得澄清物等分存于冷冻管中，在-80℃下冷冻保存，用于激发研究。
激发剂量测定
通过在无菌2％盐水中将所制备的贮存病毒稀释10倍和100倍来制备接种稀释系列。将贮存病毒、10倍稀释物和100倍稀释物注射到各组动物的第三腹节中，每组有20只未经处理的SPF动物，每只重5-8克。每天两次测定动物的死亡率。所有的剂量在不同时间点导致100％死亡率。要导致100％死亡率，贮存浓度需2天，10倍稀释物需7天，100倍稀释物需12天(图20)。将贮存病毒的100倍稀释物用作所述激发实验的病毒激发剂量。
组织病理学
将在死亡之前发现的垂死动物固定在Davidson’s固定剂中24小时，然后将其转移到70％EtOH。在石蜡中包埋组织，切片并用苏木精和伊红染色，评估IMNV损伤的存在。
动物接种
通过在无RNase的水中将dsRNA稀释到特定的浓度来制备双链RNA(dsRNA)。使用结核菌素注射器将50μl注射到动物的第三腹节的肌肉中。
研究设计#1
将20只重5-7克的SPF动物幼体贮存于包含合成海水和牡蛎壳气升式生物滤器的200升水槽中，使其适应环境72小时。适应之后，通过与异源dsRNA对照相比，评估对应于IMNV基因组3个不同片段的4个不同的dsRNA构建体。将总量为2μg的体外合成的dsRNA接种到随机水槽的动物中。接种之后48小时，用IMNV对动物进行激发。每天计数动物的死亡率。固定垂死的动物用于组织病理学分析。处理之后，对dsRNA#3接种和激发之后存活下来的动物(n＝16)再饲养60天，然后用未稀释的病毒贮存物(stock)再次进行激发。
研究设计#2
将10只重5-7克的动物贮存于包含合成海水的200升水槽中，使动物适应环境72小时。适应之后，6个实验组接受剂量为2、0.2或0.02μg的dsRNA构建体(dsRNA#2或dsRNA#3)，对照组接受2μg异源eGFPdsRNA对照。然后将所述各组分成两组，一组接种后2天进行激发，另一组接种后10天进行激发。每天评估死亡率，固定垂死的动物用于组织病理学分析。
结果
实验#1
两种dsRNA构建体证明针对IMNV激发的保护。在接种后第30天，dsRNA#2(SEQIDNO:4)有62％存活率(38％死亡率)，相比之下未接种的对照仅有3％存活率(97％死亡率)。dsRNA#3(SEQIDNO:1)的效果更强，有80％以上的存活率(图21)。根据单因素方差分析(OnewayANOVA)，然后使用SPSS软件进行Tukey’s多重比较检验，计算被注射了dsRNA#2和dsRNA#3注射的动物与对照之间的显著性差异(P<0.05)。用dsRNA#1、dsRNAGFP或2％盐水注射的动物之间没有出现显著性差异。未激发对照在整个研究中保持100％存活率。接受非序列特异性dsRNA的动物与未接种组有类似的死亡率。
dsRNA#3(SEQIDNO:1)组的存活动物在用100倍高的病毒浓度进行第二次激发(在初次激发之后60天)之后有100％(16/16)存活率。这说明即使第一次和第二次激发之间有较长一段时间，针对激发的保护仍然强劲。
实验#2
构建体dsRNA#3(SEQIDNO:1)即使在最低剂量以及接种与激发之间最长间隔的情况下仍表现出极好的保护，存活率为80％(图23)。相比之下，低剂量的dsRNA#2(SEQIDNO:4)似乎对存活率的影响很小，激发后存活率为10％至30％。但是，在48小时激发时，未接种组在每个组中都没有存活，非序列特异性给药组有10％存活率(图22)。未激发的对照存活率为100％。30天之后，根据单因素方差分析，然后使用SPSS软件进行Tukey’s多重比较检验，注意到被注射了dsRNA#2和dsRNA#3的动物与对照之间存在显著性差异(P<0.05)。用dsRNA#1、dsRNAGFP或2％盐水对照注射的动物之间没有出现显著性差异。
实验#3
为了确定是否需要完整的dsRNA#3序列以提供上述保护，对作为全长dsRNA#3的简单截短物的两种其他dsRNA(dsRNA#35’截短物和dsRNA#33’截短物)进行检验。如上所述，使用重5-7克的动物以检验新的dsRNA#3序列(使用2μg每种dsRNA)。当在接种后第10天给予0.02μg剂量的构建体dsRNA#33’截短物(SEQIDNO:3)时，其表现出100％保护性(图24A)。当在接种后第10天进行激发时，dsRNA#35’截短物(SEQIDNO:2)和初始dsRNA#3(SEQIDNO:1)在第25天(激发后第15天)表现出90％保护性。
这些实验表明，优选的序列对RNAi引发成分的剂量和持续时间的影响非常大，所述RNAi引发成分是通过以下所述载体系统递送。
利用上述相同的方法，进一步的截短也表现出保护性(图24B)。一段154bp序列(dsRNA#3223-376,SEQIDNO:61)表现出100％保护性，一段82bp序列(dsRNA#3194-275,SEQIDNO:56)表现出100％保护性，一段57bp序列(dsRNA#3219-275,SEQIDNO:51)表现出73％保护性。
复制子颗粒
如上所述制备复制子颗粒。
甲病毒复制子概念验证
通过将来自商用合成基因序列(GeneArt)的基因克隆到现有的甲病毒骨架载体中，制备表达WSSV和IMNV的结构蛋白和反义序列的甲病毒复制子颗粒。利用来自泰国的毒力WSSV分离株的序列(AF369029.2GI:58866698)，制备目的WSSV基因——在本发明中为VP19、VP28和VP19的互补序列。在IMNV的情况下，序列来自从GenBank下载的可获得的印度尼西亚分离株的序列(EF061744.1GI:124303516)，以及跨度为已公开序列的95-474碱基的区域的反向互补序列。设计基因构建体以同时在5’和3’末端包含适合的限制性位点，从而有助于将其克隆到复制子质粒中。将保护性分子插入到复制子载体中之后，对插入产物进行测序以确认构建体的种类(爱荷华州立大学DNA测序设施)。通过使用市售的体外转录试剂盒(RiboMAXT7Express,Promega)的失控(run-off)转录，使复制子质粒DNA线性化并用来制备RNA转录物。使用相同的失控转录方法来制备包含靶基因(VP28、VP19、VP19反义、IMNV-dsRNA#3的ssRNA)的复制子RNA和编码VEE衣壳或糖蛋白基因的两种辅助RNA。在电穿孔室将特定质量数量(之前优化)的复制子和辅助RNA与Vero细胞混合，并使用之前优化的方波电穿孔参数进行冲击。将经电穿孔的细胞悬浮液接种到包含无血清培养基的转瓶中，并在37℃下和在5％CO2中孵育18-24小时。从培养液中收集复制子颗粒(RP)，并通过抗原特异性IFA测定RP制品的感染效价，用致细胞病变效应(CPE)测定进行检验以确保不存在可检测的能够复制的病毒。通过尺寸排阻/离子交换过滤来纯化RP。通过IFA测定纯化的大RP的效力(感染效价)，制成制品并于-80℃下冷冻。
用于复制子质粒中的序列插入物(参见最后的序列列表)：
VP28(SEQIDNO:29)；
VP19(SEQIDNO:30)，其编码蛋白质，还可被转录生成dsRNA；
VP19-反义(SEQIDNO:31)；
VP19-IR(生成dsRNA的反向重复DNA)(SEQIDNO:32)；
转录生成dsRNA#3反义链的DNA(SEQIDNO:33)；
红色荧光蛋白(RFP)(SEQIDNO:34)
测定所制备的RP制品的效价(IU/ml)。所制备的RP制品的IU/ml效价的代表性实例为VP-19RP＝1.4E8IU/ml、VP-28RP＝1.2E8IU/ml、VP19-反义RP＝5.86E7IU/ml、IMNVRNA3反义＝3.49E8IU/ml。通过证明不存在可检测的能够复制的病毒，RP制品全部通过了CPE测定。在释放测定之后，所述RP被认为适用于以下所述研究。对于实验#5而言，制备另一组反义VP19复制子，使得效价增加1.26E8IU/ml。利用感染了WSSV的毒力毒株(DonLightner,UniversityofArizona)的凡纳滨对虾(L.vannamei)的SPF贮存物来扩增WSSV制品，将其用作激发的贮存病毒。将50只重约12克的虾幼体经口暴露于垂死的虾的被感染的组织，所述垂死的虾是通过PCR检验为WSSV阳性(所使用的被感染的组织在使用前贮存于-80℃)。在TN缓冲液(0.02MTris-HCl,0.4MNaCl,pH7.4)中将被感染的组织按1:3稀释并在无菌韦林氏搅切器匀浆5分钟。将浸渍物放置于离心管中，以4000g离心。然后取出上清液，再以15000g离心30分钟。进行最终离心步骤：以25000g离心60分钟。在无菌的2％盐水中以1:10稀释上清液，并过滤通过0.2μm注射器式滤器(Whatman)。然后将所得澄清物等分存于冷冻管中，-80℃冷冻保存，用于激发研究。然后通过用病毒接种物在2％盐水中的连续稀释物接种SPF动物，对激发剂量进行优化。1份接种物和10000份2％盐水的激发剂量在激发后14天导致10-20％存活率，将所述激发剂量用于所述研究中的病毒激发剂量。
病毒激发：在最初用RP注射后3天，通过注射对实验动物进行激发。在21天的时期内观察实验组和对照组的死亡率。在实验结束时，在冰浆中将剩余的个体镇静并实施安乐死，在Davidson’s固定剂中整个固定，并用于组织学分析。如有需要，取鳃组织样品并在-20℃下冷冻以用于PCR检测。
实验#4实验设计
将约5克重的SPF凡纳滨对虾幼体放置于16个水槽中，所述水槽各包含10只动物和盐度为30ppt、温度保持在25℃的合成海水(CrystalSeaMarineMix)。为每个实验组提供3个重复的水槽。将50μlRP注射到实验动物的腹窦中，所述RP表达浓度为10E8IU/ml的VP28(SEQIDNO:28)或VP19(SEQIDNO:30)，或浓度为10E7IU/ml的VP19反义(SEQIDNO:31)。为假注射对照组注射50μl用作对照的细胞培养基。VP19裸双链RNA(SEQIDNOs:49和50)被用作阳性疫苗对照，因为其在之前的实验中提供100％保护。
实验#5实验设计
将约5克重的SPF凡纳滨对虾幼体放置于15个水槽中，所述水槽各包含10只动物和盐度为30ppt、温度保持在25℃的合成海水(CrystalSeaMarineMix)。将50μlRP注射到实验动物的腹窦中，所述RP表达浓度为10E8IU/ml的VP19，或浓度为10E7IU/ml的VP19反义。为假注射对照组注射50μl用作对照的细胞培养基。VP19裸双链RNA被用作接种后10天的阳性疫苗对照，因为其在之前的实验中提供100％保护。
实验#6实验设计
将SPF幼体和后期幼体(postlarvae)放置于培养皿中，所述培养皿包含25ml海水和10E7IU/ml表达RFP报告蛋白质的RP。在室温下进行浸没暴露2小时。然后将动物转移到包含海水和砂滤多孔石的500ml烧瓶中。在暴露后24、48和72小时处死整个幼体，并使用落射荧光显微术评估荧光。将对照动物浸没于包含细胞培养基的水槽中，并使用相同方法进行评估。使用本研究来确定a)RP的感染性是否在通过消化道时保持完整；以及b)RP是否能够感染幼体和后期幼体动物并在动物体内表达外源蛋白质。
实验#7
将约5克重的SPF凡纳滨对虾幼体放置于水槽中，所述水槽各包含10只动物和盐度为30ppt、温度保持在25℃的合成海水(CrystalSeaMarineMix)。为了评估被给予特异性dsRNA或非特异性dsRNA的动物中免疫应答的持续时间，通过肌肉内注射(5μg)给予动物特异性(VP19或VP28)或非特异性(eGFP)dsRNA，并在给药后第3天进行激发。初次激发中仅观察到较低的死亡率，在初次激发21天后进行第二次激发。
实验#8
为了比较递送方法并确定通过口服递送的序列是否具有保护性，将约5克重的SPF凡纳滨对虾幼体放置于水槽中，所述水槽各包含10只动物和盐度为30ppt、温度保持在25℃的合成海水(CrystalSeaMarineMix)。使实验动物禁食24小时，注射5μgdsRNAVP19，或用在无菌水中稀释的5μgVP19dsRNA进行反向强饲法(灌肠剂)。在给予疫苗后第14天对动物进行激发。
结果
实验#4
在激发后第21天，VP19dsRNA(对照)、VP19RP、VP19反义RNA-RP或VP28RP分别表现出100％、70％、40％和40％的存活率。阳性对照组表现出20％存活率(图25)。本研究证明，VP19dsRNA和由RP表达的VP19提供针对WSSV的致死性保护。在实验1和实验7中可以看出，观察到最长达至少24天的保护。参考图21、22、23和24B。提供了最长达至少30天和至少40天的保护。重复本研究并评估接种后所述保护的持续时间。
实验#5
对于接种后第3天进行激发的组而言，VP19RP、VP19反义-RP和阳性对照组在激发后第14天分别表现出5％、35％和0％的存活率，如图26所示。对于接种后第10天进行激发的组而言，VP19dsRNA(对照)、VP19RP和VP19反义RNA-RP在激发后第21天分别表现出95％、5％和60％的存活率，如图27所示。对于接种后10天组的阳性对照组表现出20％的总体存活率。参见图26和图27。
实验#6
在对照组和实验组中，由于肠组织中存在自身荧光，在幼体期后期难以评估荧光。相比之下，在用RFPRP接种后48和72小时，与对照组相比所评估的幼体期(糠虾和海蟹幼体)在肠和鳃中表现出强的特异性RFP荧光。这表明蛋白质能够被递送到水生无脊椎动物的消化道，幼体动物的浸没接种为复制子颗粒提供了可行的递送系统。
实验#7
在第21天的激发之后，在VP19(100％存活)、VP28(83％存活)、非特异性dsRNA(33.3％存活)和未接种对照组(20％存活)之间观察到存活率差异(图28、29)。这表明特异性和非特异性dsRNA之间在保护性应答持续时间上的差异。
实验#8
通过肌肉内途径和反向强饲法给予VP19dsRNA的动物证明了与对照相比的保护(存活率分别为95％和100％)(图30)。
实验#9
实验设计：
将3-5克SPF生长线动物(growthlineanimal)贮存于200L水槽中，使动物适应24小时。所述水槽装备了已经在含有氨的LT水槽中成熟的牡蛎壳气升式生物滤器。将动物分成3组：一组接受dsRNA382bpdsRNA片段，一组接受作为异源dsRNA对照处理的eGFP(绿色荧光蛋白质(GFP))基因(Sheenetal.，PlantJ.(1995)8(5):777-84)，一组接受作为无dsRNA处理的无菌水。用IMNV进行激发后第2天，dsRNA处理组接受100μl包含5μg体外合成的dsRNA的注射液。在dsRNA接种前2天，用IMNV澄清液的1:100稀释液对动物进行激发。在30天内，每天对各组进行计数并评估死亡率。将垂死的动物于Davidson’s溶液中固定，用于组织病理学分析，并取肌肉组织用于qPCR分析。在实验结束时将动物冷冻于-80℃下。
用于制备dsRNA#3的引物是SEQIDNO:59和SEQIDNO:60，其用来制备SEQIDNO:56。用来制备GFP的引物包括SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，SEQIDNO:6是制备用于对照的GFPdsRNA的DNA。
表20
处理 虾数量 重复次数 激发时间间隔
dsRNA#3 2dpc 10 3 -2天
dsRNA#3 2dpc 10 -2天
dsRNA#3 2dpc 10 -2天
eGFP 2dpc 10 3 -2天
eGFP 2dpc 10 -2天
eGFP 2dpc 10 -2天
激发对照 10 3 -2天
激发对照 10 -2天
激发对照 10 -2天
结果
接受dsRNA382bp处理的动物在用IMNV进行激发后表现出50％存活率。相比之下，接受作为对照的eGFPdsRNA或无菌水的动物表现出0％存活率(图31)。
结论
用IMNV感染后第2天给予时，dsRNA#382bp能够成功降低死亡率。
实验#10
实验动物
将重3-5克的无特异性病原体(SPF)的凡纳滨对虾幼体贮存于200L水槽(10只动物/水槽)中，使动物适应48小时。每个水槽包含人工海水，以及牡蛎壳生物滤器和活性炭。
饲料配方
使用VP19dsRNA(参见上文，SEQIDNO:30)或IMNVdsRNA3(未截短，SEQIDNO:1)来制备壳聚糖包封的颗粒。将0.2克壳聚糖溶解于100ml乙酸钠缓冲液中。然后将1.0ml所述溶液转移至有99ml50mM乙酸钠缓冲液的新瓶中(1:100稀释率)，得到0.002％(w/v)壳聚糖溶液。将120μg每种dsRNA(VP19和dsRNA3)溶解在硫酸钠溶液(0.2M乙酸钠和0.2M乙酸)中，总体积为300μl。将300μldsRNA溶液与300μl0.002％壳聚糖溶液合并。在55℃水浴中加热所述溶液1分钟，快速涡旋旋转30秒。然后以13200g离心试管10分钟。离心后，通过移液使溶液重新悬浮，并使溶液覆盖于1克磨碎的饲料上方。首先加入全部600μl壳聚糖-dsRNA溶液，然后加入600μl琼脂糖。然后用移液器吸头混合所述饲料以产生均匀混合的团块，其在几分钟之后成为固体。
实验设计
表21
3天之后，用100μl在2％无菌盐水中稀释的0.2μm过滤的WSSV澄清液(WSSV1:1×105)对每个处理组的虾进行激发。每天喂食10％生物量并每天进行10％水交换以除去蜕皮、过量的食物和粪便物质。在21天内观察死亡率，将死亡动物的样品冷冻于-80℃下以进行进一步检测。
结果
用WSSV进行激发之后，用被VP19dsRNA覆盖的饲料处理的动物表现出67％存活率。此外，用被含有VP19dsRNA的壳聚糖纳米颗粒覆盖的饲料处理的组在WSSV激发之后表现出33％存活率。接受假处理饲料(阳性对照)的动物在激发后有0％存活率(参见图32)。
实验#11
HV156:dsRNA持续时间
本实验说明了dsRNA82(194-275)(SEQIDNO:56)和dsRNA3(95-474)(SEQIDNO:1)在接种后30天的接种功效。
将3-5克SPF生长线动物贮存于15×200L水槽中，使动物适应24小时。所述水槽装备了已在含有铵的LT水槽中成熟的牡蛎壳气升式生物滤器。dsRNA处理组接受包含2.0μgdsRNA的100μl注射液(DE3发酵生产批次(lot)，参见Timmonsetal(2001)Gene263:103-112)。在本方法中使用DE3(指大肠杆菌DE3HT115)，其中已经用T7聚合酶和生成dsRNA的质粒转染所述细菌，然后灭活所述细菌，使其在无RNase的水中稀释。在给予dsRNA之后30天，通过注射用致死剂量的IMNV对动物进行激发。在激发后21天内每天评估各组并且评估临床征象和死亡率。
表22
结果
在第51天结束所述研究(激发后21天)。结束时，处理组的存活率明显高于(使用单因素方差分析，然后进行Tukey’sHSD，P<0.0001)对照。被给予dsRNA3的动物在给予dsRNA3之后有100％存活率，被给予dsRNA82的动物的平均存活率为93.33％(90％、90％和100％)。假给药对照在结束时的平均存活率为6.67％(0％、10％和10％)(图33)。
结论
在DE3大肠杆菌中制备的dsRNA3和dsRNA82生产批次给药后最长达30天时具有针对致死性IMNV激发具有高度保护性。
实验#12
目标：确定dsRNA诱导的、灭活的DE3大肠杆菌能否预防由IMNV导致的死亡，并确定PL9中的dsRNA82喂食能否防止由IMNV导致的死亡。
给动物喂食含有45μgdsRNA82(每次喂食15μg，3天300PL)的制备饲料，或以0.1克细胞(每次喂食，共3次喂食300PL)的速率喂食灭活的DE3生物质。在用dsRNA喂食3天之后，在激发之前在正常条件下再饲养动物20天。为了用IMNV进行激发，将动物分成3个重复组，每个水槽中的10只动物为一个重复组，并通过肌肉内注射10个IMNV的病毒粒子进行激发。参见图34的结果。
结论：以dsRNA82/Ag覆盖的饲料喂食的PL9动物的存活率显示出统计学上显著的增加(55％)(P<0.05)，与仅以琼脂糖覆盖的饲料相比(10％)。
实验#13
目标：确定生成dsRNA380的诱导及灭活的DE3大肠杆菌能否预防由IMNV导致的死亡，并确定PL15-PL18中的dsRNA380喂食能否预防由IMNV导致的死亡。
方法：饲料制品使用0.2克与20μl液体dsRNA混合的干饲料的混合物，以及随后的20μl2％琼脂糖混合物的上部覆盖混合物(topcoatmixture)。喂食时的剂量水平为60μgdsRNA380或0.1克当量生物质细胞(300ng/PL)。测定饲料消耗，约80％的饲料被消耗。在激发前再饲养动物15天。为了用IMNV进行激发，将动物分成3个重复组，每个水槽中的10只动物为一个重复组，并通过肌肉内注射用10个IMNV的病毒粒子进行激发。阴性对照组由2％盐水的安慰剂IM注射和无处理的严格阴性对照构成。结果如图35所示。
结论：dsRNA380生物质处理组表现出刚超过30％的存活率，而上部覆盖液体的dsRNA表现出刚超过20％的存活率。对照组动物的存活率低于10％。
实验#14
目标：当以浸没的方式用生成dsRNA的RP喂养之前或之后进行加强时，确定用IMNV进行激发后dsRNA#3(380bp)喂食对虾的影响。
目标：确定dsRNA诱导的、灭活的DE3大肠杆菌能否预防由IMNV导致的死亡。
将250只幼体期后期20(PL20)的动物放置于10L水缸(aquaria)中，使动物适应24-48小时。在免疫前使动物禁食8-12小时。用虾饲料喂食动物，所述虾饲料上部覆盖以生成380bpdsRNA#3的灭活的DE3生物质细菌或纯化的dsRNA#3。在连续的两天对动物进行免疫。在2小时范围内进行每日接种；在所述时间范围内以15分钟间隔向水槽内加入饲料，以增大所有饲料都被消耗的可能性。用于上部覆盖饲料的灭活DE3生物质的量应该使得生物质中dsRNA的总量等于直接用于上部覆盖饲料的纯化的dsRNA#3的量。根据这一标准，每次喂食动物接受20μgdsRNA#3。
通过将250只动物放置于250ml包含2e6IURP/ml的水中，进行RP接种。使用两种RP(每种浓度为2e6RP/ml)。一种RP(Pep3正义RP)生成正义IMNVPep3RNA(SEQIDNO:76)，另一种RP(Pep1反义RP，dsRNA#3的反义RNA，其为SEQIDNO:1的互补序列)生成反义IMNVPep1RNA。在用上部覆盖的饲料接种前24小时(初免)或用上部覆盖的饲料接种后24小时(加强)，将动物浸没在RP中。阴性对照由安慰剂激发(2％盐水组)或不接受注射的严格对照构成。
示出用10IMNV病毒粒子进行注射激发之后第14天的存活率。从图36中可以看出，首先用RP对动物进行初免，然后用生物质或dsRNA上部覆盖的饲料进行加强，获得的存活率高于用dsRNA喂食接种然后用RP进行加强。初免(prime)表示在喂食dsRNA之前将动物浸没在RP中。加强(Boost)表示在喂食dsRNA之后将动物浸没在RP中。误差柱表示各重复之间的标准误差。
实施例5
本实验表明能够利用nsP2特异性测定(此处为免疫荧光测定或IFA)来同样确定所有复制子颗粒(RP)疫苗的效价。除nsP2特异性IFA以外，可使用疫苗基因特异性qRT-PCR来确定同一性和RNA拷贝数(基因组当量)。
方法和结果
使用如实施例2中所述方法来制备流感H3RP疫苗。检测H3IFA测定对照RP的许多重复样品。对所述样品共进行47次滴定，并由两名不同的技术人员读取，总计94次滴定。比较历史数据和从相同的H3RP参考批次获得的现有nsP2IFA效价。此外，还通过在IFA测定中使用两种不同的抗体来检测相同的RP批次，进行成对对比。
如下所示进行H3特异性IFA。简言之，IFA在48孔组织培养平板形式中使用融合的Vero细胞。在所述平板中共接种5×106Vero细胞，并将平板放置于37℃/5％CO2培养箱中直到所有孔都形成融合的单层(通常需6-8小时)。在培养基中制备范围从1:400至1:97,656.25的H3RP疫苗样品的稀释物。在所有平板上使用已知的阳性对照RP样品。使RP样品在37℃/5％CO2培养箱中孵育18-24小时以使蛋白质表达。在此期间，所述RP将生成SIVHA蛋白。然后将所述细胞用等体积的丙酮/甲醇溶液固定。在除去固定液之后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，向每个孔中加入特异性针对H3的一级小鼠抗流感单克隆抗体。在孵育和另一次PBS冲洗之后，加入FITC标记的抗小鼠IgG。在另一次孵育步骤和用PBS最终冲洗之后，用荧光显微镜检查平板。使用标准化的视野大小，对荧光细胞进行计数并测定每毫升的功能性RP值。这将代表RP效力。缺陷型RP不会导致H3的表达，这使得所述测定成为疫苗效力的精确模型。使用以下方程计算RP浓度：
其中平均值代表样品的10个阳性H3细胞计数的平均值；
其中稀释率代表对其中的平均H3阳性细胞进行计数的孔；
其中100是代表培养物平板中孔的表面积的常数；
其中0.12是代表测试的RNA颗粒疫苗的体积(ml)。
实施nsP2特异性IFA，但步骤中有少量变化，以适应所使用的物质的具体情况。使用山羊抗nsp2抗体和二级抗山羊荧光抗体。稀释量取决于，例如，所使用的nsp2抗体的批次，并可随着批次的变化而改变。
使用H3和nsP2IFA抗体测定的效价的成对对比结果如图37和表22所示。完成H3RP对照的6次独立的滴定，并且同时通过H3和nsP2特异性IFA测试全部6次滴定。在第二天重复所述测试，每种抗体共进行12次独立的滴定。通过成对t检验，观察到用H3和nsP2特异性抗体IFA获得的RP效价之间没有显著性差异(p>0.05)。
表22来自图37中所示的成对对比的原始数据。通过成对t检验分析时，观察到两个IFA之间没有显著性差异(p>0.05)。
在另外两天，完成相同的H3对照RP批次的另外12次滴定，并使用nsP2特异性IFA测定效价。因此，在不同的4天完成了共24次独立的nsP2IFA滴定。结果如图38所示。将所述效价与之前获得的相同H3RP对照批次的94个效价对比。使用ANOVA分析时，从两次不同的IFA测试获得的效价之间没有显著性差异(p>0.05)。
结论
所包含的数据支持以下结论：在定量IFA中，使用目的基因或NOI或NOI特异性一级抗体而获得的RP效价与使用复制子或nsP2特异性一级抗体而获得的效价相同。可单独使用nsP2特异性IFA和/或用于定量基因组当量和确定基因同一性的目的基因qRT-PCR一起使用。
实施例6
在本效力测定实验中使用上述IFA。所述效力测定的第二方面是对疫苗的定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析，以确定每个系列中的RNA拷贝数。确定RNA的总拷贝数有助于确保疫苗从系列之间的一致性。本发明人已经开发了允许对系列中RNA基因组定量的特异性针对复制子nsP2基因的qRT-PCR分析，并且当将其与H3特异性IFA效价比较时，能够计算基因组当量(GE)与RP效价的比例(GE:RP)。
使用适合的t检验对本报告每个部分中所获得的效力测定值进行统计学分析。对于给定的检验统计量，将测定或技术人员之间的显著性差异定义为p<0.05。当p值大于0.05时，结论为测定或技术人员之间不存在统计学上的差异。
特异性和选择性
通过测试在整个制备过程中使用的各种培养基和其他非特异性RP制剂，评估IFA效力测定选择性检测H3阳性细胞而不被交叉反应性物质影响的能力。疫苗稀释剂(RP稀释剂)由磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及5％(w/v)蔗糖和1％(v/v)正常猪血清组成。还将一般生长培养基、OptiPro培养基和5％蔗糖缓冲液作为样品进行测试，因为在制备过程中使用了这些试剂，其可导致基质效应。还将3种非特异性RP试剂包括在内以进一步说明该测定的选择性。所述3种样品包括表达猪流感病毒核蛋白(NP)和H1基因以及虾传染性肌坏死病毒pep3(IMNVpep3)基因的RP。分别在两天对所有样品进行测试。使用任何样品均未观察到可检测的荧光，表明所述样品基质不会对所述系列的效力值带来任何阳性信号，所述测定与非特异性RP制剂也没有任何交叉反应性。
分析灵敏度
所述效力测定的检出限(LOD)因为其设计可从理论上获得。方案A指定在每个格栅视野中需要观察平均20-50个H3阳性细胞。当所述测定中最小样品稀释率为1:400并且H3阳性细胞的最低数量为20时，理论LOD为6.67×106RP/ml[(20×400×100)/(0.12)]。对来自两个不同系列、被配制为接近LOD的实验样品进行测试，并由两名技术人员读取平板以评估所述测定在此理论极限处的灵敏度。预测结果为6.67×106RP/ml。真实结果为7.13×106RP/ml和6.19×106RP/ml，因为误差百分数分别为6.85％和-7.25％。由于IFA测定的设计，可通过改变初始的RP稀释方案来降低LOD。
所述效力测定的定量限(LOQ)也可从理论上获得。因为最大样品稀释率为1:97,656.25，并且H3阳性细胞的最大数量为50，理论LOQ是4.07×109RP/ml[(50×96,656.25×100)/(0.12)]。对被配制为接近LOQ的实验样品进行测试，并由两名技术人员读取平板以评估此理论极限。预测结果为4.07×109RP/ml。真实结果为4.65×109RP/ml和3.84×109RP/ml，因此误差百分数分别为14.17％和-5.57％。由于IFA测定的设计，可通过改变初始的RP稀释方案来增加LOQ。
本测定在每个样品板上使用一般生长培养基作为阴性对照。未观察到可检测的荧光，因此没有背景作用，使得不可能测量信号/背景(S/B)。对于成功的效力测试而言，标准之一是在阴性对照中没有荧光。
qPCR基因组分析
通过定量RT-PCR(qRT-PCR)，进行定量与每个RP系列相关的RNA基因组数量的测定。简言之，使用QiagenViralRNAMiniKit来提取复制子RNA。在具有CFX96检测系统的BioRadC1000热循环仪上实施标准一步qRT-PCR方案。通过荧光探针检测扩增，所述荧光探针被设计为可与两个引物之间的复制子上nsP2基因的一个区域退火。将5’报告染料(6-FAM)和3’猝灭染料(BHQ-1)连接到nsP2探针上。报告和猝灭染料的邻近导致在扩增之前报告荧光受到抑制。在靶区域的成功扩增之后，DNA聚合酶的5’外切核酸酶活性将报告染料从杂交的探针上释放，产生荧光信号。使用纯化的复制子pVEKRNA来产生所述测定的标准曲线，测量每个RP样品最多达30个PCR循环的荧光信号，并将其与标准物的荧光信号比较以对每个RP样品中的RNA拷贝进行定量。将每个RP系列的RNA拷贝与IFA效价比较并用来确定RNA基因组当量与RP效价的比例(GE:RP)。
不同的复制子通常产生不同的GE:RP比例，但是使用相同复制子生成的RP批次通常产生同等的GE:RP比例。因此，能够使用GE:RP比例来监测各个产物的一致性。
以不同的剂量配制H3RP疫苗的两个不同系列(091410和092810)，并通过H3特异性IFA和qPCR测定来测试。还测试了另两种H3系列(020711和021511)。通过两名不同的技术人员分别在两天进行qPCR测定。使用学生t检验，观察到两名技术人员的结果之间没有统计学上的显著差异。此外，提取来自RP另一批次的6个样品(111710A-F)，并在qRT-PCR测定中分三次重复测试。所使用的批次的IFARP效价为5.85×107/ml。
来自所使用的H3RP的5个不同批次的数据表明，在所有H3RP批次之间GE:RP比例保持一致，并且此比例不随特定的RP批次的效价而改变。为进行比较：样品091410A的IFA效价为1.20×109，其为样品021511效价(其IFA效价为3.55×107)的34倍。尽管所述批次的IFA效价显著不同，其GE:RP比例相对类似(15.42和13.21)。
表24.一个H3系列的多个重复的qRT-PCR和GE:RP结果。
系列 GE/ml GE:RP
111710 A 6.57E+08 11.23
111710 A 9.55E+08 16.32
111710 A 7.1E+08 12.14
111710 B 6.6E+08 11.28
111710 B 1.12E+09 19.15
111710 B 6.71E+08 11.47
111710 C 9.94E+08 16.99
111710 C 8.96E+08 15.32
111710 C 7.28E+08 12.44
111710 D 1.11E+09 18.97
111710 D 7.23E+08 12.36
111710 D 6.54E+08 11.18
111710 E 7.22E+08 12.34
111710 E 6.8E+08 11.62
111710 E 9.12E+08 15.59
111710 F 7.26E+08 12.41
111710 F 8.88E+08 15.18
111710 F 8.11E+08 13.86
平均值 13.88
系列释放(serialrelease)
用于计算效力的方法是基于特异性针对疫苗H3抗原的IFA。观察到H3阳性细胞并对其进行定量。在10X放大率下目视观察IFA组织培养平板的各个孔，并使用每个格栅视野包含20-50个H3阳性细胞的孔。计数每个孔的总共5个视野。以相同方式计算重复孔。使用10个读数的平均值来计算效价，或RP/ml。通过将10个计数的平均值代入以下方程来确定H3阳性细胞的总数。
效力＝(平均值)×(稀释率)×(100)/(0.12)
其中平均值代表样品的10个阳性H3细胞计数的平均值；
稀释率代表其中对平均H3阳性细胞进行计数的孔；
100是代表组织培养平板孔的表面积的常数；
0.12是代表被测试的RNA颗粒疫苗的体积(ml)的常数。
这些结果表明，使用抗原特异性IFA和qRT-PCR能够分别对特定的功能性RP和复制子基因组进行定量。因此，为了疫苗系列的成功释放，IFA效价和qRT-PCR值必须落入通过经验确定的范围内。
所述疫苗的有效剂量是1×108RP/2ml剂量，或5×107RP/ml。可包括过量剂量(overage)以进一步增强效力，如效力确认所示。每种疫苗的最优RP效价和GE:RP比例不同，研究表明可精确计算这一值。例如，在本实例中分析剂量的标准规定在冷冻/解冻周期之后RP效价在≥5×107RP/ml时是最优的，GE:RP比例为1.0-20.64。
实施例7
研究设计：12组猪(每组5只)分别以不同剂量接受不同的HARP疫苗，如下表所示。通过肌肉内途径给予猪两次注射，时间间隔为3周，注射体积为2ml。采集血清用于HI测试。
表25
结果：获得预采血(prebleed)、加强免疫当天(仅初次免疫)、加强免疫后6天和加强免疫后19天血清的HI效价。对采自接受广泛传播的HARP的猪的血清还进行针对异源HVγSIV毒株的测试，对采自接受δ1HARP的猪的血清还进行针对异源δ2SIV毒株的测试。此外，对采自接受δ1HARP的猪的血清还进行针对异源δ1毒株的测试。参见图39，图中示出增强免疫后第19天的效价。
结论：诱导针对剂量低至5e5/剂量的所有不同HARP的HI效价，观察到RP剂量和HI抗体水平之间具有相关性。
实施例8
从农场Y的被感染的猪获得肺组织的生物样品。在爱荷华州立大学诊断实验室对H1N2猪流感病毒(SIV)的血凝素基因进行测序(SEQIDNO:81)。在所述天然序列的5’和3’末端添加适合的限制性位点序列，以帮助将合成基因克隆到甲病毒复制子载体中。然后对所述序列进行密码子优化和从头合成(SEQIDNO:82)。使用适合的限制性位点酶，将所述自身基因克隆到甲病毒复制子载体中。对适合大小的插入片段进行进一步选择(downselect)并测序以保证适合的序列。将包含具有正确HA序列的质粒的转化的大肠杆菌进一步扩增，并使用商用试剂盒(Qiagen)纯化质粒DNA(pVEK1K5，图40)。通过核酸内切酶消化使纯化的DNA线性化并使用RNAT7表达系统(Promega)进行转录。使用商用离心柱(Qiagen)对转录后的RNA进行纯化。将纯化的RNA保存于-80℃，直至用于电穿孔。
将Vero细胞与HARNA和RP制备所必需的两种甲病毒辅助RNA(衣壳和糖蛋白RNA)混合。在各个杯中对3种RNA和Vero细胞进行共同电穿孔，并将其接种回到转瓶中进行过夜孵育。孵育后，用荷电的深度过滤器(Cuno)收集RP，用蔗糖缓冲液冲洗，并使用高NaCl浓度的缓冲液洗脱。使用致细胞病变效应(CPE)测定来测试RP中是否存在能够复制的病毒，所述测试由Vero细胞培养物中RP的盲目传代(blindpassage)组成。此外，使用nsp2特异性IFA测试RP的效力，表示为RP/ml。使用所述效价将RP配制成剂量为5e5/ml，总计为1e6RP/剂量。RP被配制到5％蔗糖和1％猪血清的最终溶液中。
通过肌肉内注射将疫苗给予4个不同剂量组中的5只猪。一组被给予的疫苗剂量滴定为1e6，另一组剂量滴定为1e7，第三组为5e5，第四组为5e6。测定HI抗体水平。
对来自农场Z的一个母猪畜群的仔猪进行鉴定，所述仔猪已被暴露于轮状病毒，其中所选的动物表现出感染征象(包括死亡)。从被感染的动物获得生物样品，通过PCR从所述生物样品中获得轮状病毒的VP7基因。用所述VP7基因制备复制子颗粒疫苗，在42天后将疫苗递送到农场Z。完成通过注射对整个畜群的接种，并在21天后对整个畜群给予加强剂量。3周之后，在产仔前6周和3周对母猪进行接种。对哺乳期的猪而言，轮状病毒是严重问题，因此监测仔猪的死亡率。测量值表明，与接种相关的死亡率的统计学上显著性降低，如通过用于统计过程控制图的方法所检测的。接种前时期平均值与接种后时期平均值相比较的平均值分析(ANOM)表明，差异是显著的(α＝0.05)。在接种前的平均哺乳期(pre-weaning)死亡率为7.6％，接种后死亡率降至6.4％。在100天后可持续观察到死亡率的降低。将今年相同的10周内的死亡率与前两年未接种时的死亡率相比，也观察到死亡率显著降低。
实施例9
在制备系统中农场特异性RP疫苗的疾病诊断、基因序列获得、疫苗制备、使用和统计分析
从农场中被感染的动物获得组织(例如，肺、扁桃体、鼻擦拭物、血清、粪便内容物、肠道组织等)的生物样品。一旦已经通过诊断方法鉴定侵袭农场的病原体之后，州或地区或国家诊断实验室可对能够诱导保护性免疫应答的相关目的基因进行测序。来自生物样品的可能的病原体和被测序的相关目的基因的实例包括：流感病毒(例如血凝素基因)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(例如GP5基因)和轮状病毒(例如VP7基因)。通过PCR将适合的限制性位点序列改造到所述基因序列的5’和3’末端，以帮助克隆天然基因序列或已进行密码子优化和从头合成的基因序列。然后使用经改造的限制性位点将所述基因克隆到甲病毒复制子载体中。通过限制性分析来分析各个克隆，然后进行测序以保证在整个克隆过程中保持适合的序列。然后用包含农场特异性病原体基因的复制子质粒转化的大肠杆菌被进一步扩增，并使用市售的试剂盒(如Qiagen)纯化质粒DNA。通过核酸内切酶消化使纯化的DNA线性化，并使用RNAT7表达系统(Promega)通过体外转录生成RNA。然后使用市售的离心柱(Qiagen)对转录后的RNA进行纯化。将纯化的农场特异性复制子RNA保存于-80℃，直至用于电穿孔。
为了制备RP，将Vero细胞与农场特异性复制子RNA和RP制备所必需的两种甲病毒辅助RNA(衣壳和糖蛋白RNA)混合。在杯中将3种RNA和Vero细胞合并，并进行电穿孔。一旦在RNA已经被电穿孔到细胞中之后，将细胞接种到转瓶中以进行过夜孵育。孵育后，用荷电深度过滤器(Cuno)收集RP，用蔗糖缓冲液冲洗，并使用高NaCl浓度的缓冲液洗脱。使用致细胞病变效应(CPE)测定来测试RP中是否存在能够复制的病毒，所述测试由Vero细胞培养物中RP的盲目传代组成。此外，使用nsp2特异性IFA测试RP的效力，效价表示为RP/ml。使用所述效价将RP配制成剂量为5e5/ml，总计为1e6RP/剂量。RP被配制到5％蔗糖和1％常规血清的最终溶液中(血清来源取决于所述病原体基因的物种来源)。
在农场上干预之后(包括给予农场特异性疫苗)用于评估动物性能(performance)的统计过程控制(SPC)图
在食品动物生产系统中每天收集动物性能(生产)数据，并由在所述系统内部工作的管理人员进行分析。必须将动物健康保持高水平以获得高水平的动物性能。
猪生产系统可由指定给不同龄的猪的若干不同地点组成。在系统中，母猪农场生产断奶的猪，其被从母猪农场被送到另一个地点(off-sitelocation)以继续生长。所述母猪农场的种群可多达10000只(或更多)动物，其每年生产最多达240000只(或更多)猪。当疾病感染这些农场上的猪时，死亡损失在经济上是毁灭性和非可持续性的。因此，保证猪的健康对于所述系统的经济上存活率而言至关重要。
通过适合的生物修复(bioremediation)(例如，由被证明在农场上存在的目的病原体制备的农场特异性疫苗)实现健康猪生长管理。为了将保护性抗体和/或细胞转移到后代，在产仔前2-3周将所述疫苗给予母猪。或者在某些情况下，所述后代可接受农场特异性疫苗以被保护抵御目的病原体。通过死亡或淘汰猪的水平的减少程度或通过对关键生产参数的管理分析而确定的其他关键生产度量标准，评估所述疫苗的益处。使用分析的结果来鉴定生产改善的区域，限定改善何时发生并对所达到的改善量进行定量。
使用统计过程控制(SPC)(Wheeler,D.J.(1995).AdvancedTopics inStatisticalProcessControl.ThePowerofShewhart'sCharts.Knoxville,TN,SPCPress.)图来确定根据在计算的极限内的数据模式分布的规则，对象是否已经符合其以下定义、测量方法和数据评估(操作性定义，(Wheeler,D.J.andS.R.Poling(1998).BuildingContinual Improvement.AGuideforBusiness.Knoxville,TN,SPCPress.))。
为了通过SPC正确地分析数据，对数据进行合理地亚分组(Wheeler，1995，如上所述)。为了进行亚组(subgroup)内的联合(association)，用一些合理的标准来构建亚组。两种最常见的SPC图是单值和移动极差(XmR)图，以及均值和极差图。每个所述SPC图由两个图组成：位置图(单值(X)或亚组均值)和离散图(移动极差(mR)或极差(R))。
数据离散度是估计标准偏差(σ)并因此计算1-、2-和3-sigma极限的基础。按照如下方法计算位置图和离散图的极限：
R图：
其中A2、D4和D3由亚组大小(n)确定，并总结在表26中。
表26.计算极限的SPC表系数
n A2 D3 D4 E2
2 1.880 -- 3.268 2.660
3 1.023 -- 2.574 1.772
4 0.729 -- 2.282 1.457
5 0.577 -- 2.114 1.290
6 0.483 -- 2.004 1.184
7 0.419 0.076 1.924 1.109
8 0.373 0.136 1.864 1.054
9 0.337 0.184 1.816 1.010
10 0.308 0.223 1.777 0.975
11 0.285 0.256 1.744 0.945
12 0.266 0.283 1.717 0.921
13 0.249 0.307 1.693 0.899
14 0.235 0.328 1.672 0.881
15 0.223 0.347 1.653 0.864
XmR图：
均值的上控制限＝
均值的下控制限＝
其中E2＝2.660和D4＝3.268是由两点移动极差确定，因此亚组大小＝2。
使用所述极限来评估数据分布模式(代表经济上有意义的过程变化)，如下所示(Wheeler，1995，如上所述)：
●规则1，1个数据点位于3-sigma极限之外；
●规则2，3个连续数据点中的2个位于2-sigma极限之外并且位于均值的同一侧；
●规则3，5个连续数据点中的4个位于1-sigma极限之外并且位于均值的同一侧；
●规则4，8个连续数据点位于均值的同一侧。
所述制备系统包括：
1.从被证明来自农场被感染的猪的目的病原体(例如，轮状病毒、流感病毒或猪繁殖与呼吸综合征病毒)获得基因序列。
2.从所述目的基因制备农场特异性疫苗。
3.在获得所述序列4-6周之后，将所述疫苗注射到动物体内以诱导免疫力。
4.建立预期的时间框架，在此时间框架内有望实现改善。
5.从农场系统收集生产数据并进行SPC分析；所述数据包括哺乳期死亡率、淘汰率、断奶后(post-weaning)死亡率和/或其他已被确定为对农场系统来说经济上重要的度量标准。
6.根据上述规则，使用SPC分析来说明对农场系统的益处。
7.持续监测所述农场以确定病原体基因序列是否已经发生改变。
序列列表
SEQIDNO:1产生dsRNA#3(380bp)的DNA
SEQIDNO:2产生dsRNA#35’截短物的DNA
SEQIDNO:3产生dsRNA#33’截短物的DNA
SEQIDNO:4产生dsRNA#2的DNA
SEQIDNO:5产生dsRNA#1的DNA
SEQIDNO:6产生GFPdsRNA的DNA
SEQIDNO:7引物eGFPT7F
SEQIDNO:8引物eGFPT7R
SEQIDNO:9引物Pep195F
SEQIDNO:10引物Pep1474R
SEQIDNO:11引物Pep195T7F
SEQIDNO:12引物Pep1474T7R
SEQIDNO:13引物Capsid4F
SEQIDNO:14引物Capsid4R
SEQIDNO:15引物Capsid4T7F
SEQIDNO:16引物Capsid4T7R
SEQIDNO:17引物RdRP1F
SEQIDNO:18引物RdRP1R
SEQIDNO:19引物RdRP1T7F
SEQIDNO:20引物RdRP1T7R
SEQIDNO:21引物VP19T7F
SEQIDNO:22引物VP19T7R
SEQIDNO:23引物VP28F
SEQIDNO:24引物VP28R
SEQIDNO:25引物VP28AscIF
SEQIDNO:26引物VP28PacIR
SEQIDNO:27引物AscPep1antiF
SEQIDNO:28引物PacPep1antiR
SEQIDNO:29编码VP28并且被转录生成dsRNA的DNA
SEQIDNO:30编码VP19并且被转录生成dsRNA的DNA
SEQIDNO:31VP19反义DNA
SEQIDNO:32生成dsRNA的VP19-反向重复DNA
SEQIDNO:33被转录生成dsRNA#3–ssRNA的DNA
SEQIDNO:34编码RFP的DNA
SEQIDNO:35+ssRNA3
SEQIDNO:36-ssRNA3
SEQIDNO:37+ssRNA35’截短物
SEQIDNO:38-ssRNA35’截短物
SEQIDNO:39+ssRNA33’截短物
SEQIDNO:40-ssRNA33’截短物
SEQIDNO:41+ssRNA#2
SEQIDNO:42-ssRNA#2
SEQIDNO:43+ssRNAdsRNA1
SEQIDNO:44-ssRNAdsRNA1
SEQIDNO:45eGFP+ssRNA
SEQIDNO:46eGFP-ssRNA
SEQIDNO:47VP28+ssRNA
SEQIDNO:48-ssRNAVP28
SEQIDNO:49VP19+ssRNA
SEQIDNO:50VP19–ssRNA
SEQIDNO:51dsRNA#3219-275序列
SEQIDNO:52dsRNA#3219-275+RNA序列
SEQIDNO:53dsRNA#3219-275-RNA序列
SEQIDNO:54T7dsRNA#3219正向引物
SEQIDNO:55T7dsRNA#3275反向引物
SEQIDNO:56dsRNA#3194-275序列
SEQIDNO:57dsRNA#3194-275+RNA序列
SEQIDNO:58dsRNA#3194-275-RNA序列
SEQIDNO:59T7dsRNA#3194正向引物
SEQIDNO:60T7dsRNA#3275反向引物
SEQIDNO:61dsRNA#3223-376序列
SEQIDNO:62dsRNA#3223-376+RNA序列
SEQIDNO:63dsRNA#3223-376–RNA序列
SEQIDNO:64T7dsRNA#3223正向引物
SEQIDNO:65T7dsRNA#3376反向引物
SEQIDNO:66IMNV基因组-Poulos
SEQIDNO:67IMNV基因组-Senapin
SEQIDNO:68IMNV多肽——Poulos等的ORF1
SEQIDNO:69IMNV多肽——Senapin等的ORF1
SEQIDNO:70IMNV多肽——Poulos等的ORF2
SEQIDNO:71IMNV多肽——Senapin等的ORF2
SEQIDNO:72IMNVORF1(SEQIDNO:66的核苷酸136-4953)
SEQIDNO:73IMNVORF2(SEQIDNO:66的核苷酸5241-7451)
SEQIDNO:74编码肽1的IMNV核苷酸序列(SEQIDNO:66的136-415)
SEQIDNO:75编码肽2的IMNV核苷酸序列(SEQIDNO:66的415-1266)
SEQIDNO:76编码肽3的IMNV核苷酸序列(SEQIDNO:66的1267-2247)
SEQIDNO:77编码主要衣壳蛋白质的IMNV核苷酸序列(SEQIDNO:66的2227-4953)
SEQIDNO:78编码RNA依赖性RNA聚合酶的IMNV核苷酸序列(SEQIDNO:66的5241-7451)
SEQIDNO:79dsRNAPep1474T7F
SEQIDNO:80IMNV病毒的克隆分离株的序列
SEQIDNO:81流感病毒的克隆分离株的序列
SEQIDNO:82优化后序列81

Claims (31)

1.一种生产疫苗以保护动物抵御微生物的生物型的方法，所述方法包括：
a)鉴定所述微生物的目的核酸分子或其片段(NOI)，所述NOI已知能够生成保护性分子；
b)从至少一只动物获得生物样品，其中所述动物已暴露于所述微生物；
c)从所述样品获得所述微生物的所述NOI，而不需要分离所述微生物；
d)从所述NOI制备保护性分子，所述保护性分子选自：
(i)包含所述NOI的序列或其片段的核酸分子；
(ii)由所述NOI表达的多肽或其片段；
(iii)至少一种RNA分子，所述RNA分子包含对应于全部或部分所述NOI并且形成dsRNA的序列；
(iv)至少一种RNA分子，所述RNA分子对于全部或部分所述NOI是反义的；
(v)产生(iii)或(iv)的核酸分子；以及
(vi)包含或产生(i)-(v)中任一项的RNA颗粒；
e)产生包括所述保护性分子的疫苗，其中所述疫苗不包括所述微生物或者可复制或活的致病微生物；以及
f)提供在所述疫苗中的所述保护性分子，其量为当被给予动物时保护所述动物抵御所述微生物的所述生物型。
2.权利要求1的方法，其中在从获得所述样品时起的一个月或更短时间内制备所述疫苗。
3.权利要求1的方法，其中在从获得所述样品时起的7天或更短时间内制备所述疫苗。
4.权利要求1的方法，还包括将包含所述NOI的甲病毒复制子载体引入宿主细胞，从所述NOI表达多肽或其片段，以及从所述宿主中提取所述多肽或其片段，其中所述提取的多肽或其片段包括所述保护性分子。
5.权利要求4的方法，其中所述载体包括委内瑞拉马脑炎(VEE)载体，所述宿主包括Vero细胞，并且所述多肽或其片段是通过裂解所述Vero细胞来提取的。
6.权利要求1的方法，其中所述保护性分子包括RNA颗粒，并且所述RNA颗粒包含所述NOI或其片段。
7.权利要求1的方法，其中所述保护性分子包括RNA颗粒，并且所述RNA颗粒生成dsRNA分子。
8.权利要求1的方法，所述方法还包括通过确定RNA颗粒(RP)效价的量来确定保护性分子的量，并且以当被给予时保护所述动物的RP效价提供所述保护性分子。
9.权利要求8的方法，所述方法还包括确定所述保护性分子的基因组当量，测定所述基因组当量：RNA颗粒效价(GE:RP)比例，并以当被给予时保护所述动物的GE:RP比例提供所述保护性分子。
10.权利要求1的方法，其中通过选自以下的方法获得所述NOI：对所述样品中的所述NOI的聚合酶链式反应和合成所述NOI。
11.权利要求1的方法，所述方法还包括确定所述微生物的生物型，并且如果所述微生物的生物型不同于存在针对其的疫苗的微生物生物型，则产生所述疫苗。
12.权利要求1的方法，其中从其获得生物样品的所述至少一只动物是暴露于第一微生物的第一多种动物中的第一动物，针对所述第一微生物产生了第一保护性分子，所述第一多种动物已经或即将充分暴露于第二多种动物的至少一只动物或生物样品，所述第二多种动物暴露于第二微生物，使得所述第一和第二多种动物处于暴露于在另一多种动物中存在的微生物的风险，所述方法还包括：
a)从所述第二多种动物中的至少一只动物获得生物样品；
b)从由所述第二多种动物中的至少一只动物的所述生物样品获得的NOI来制备第二保护性分子，而不需要分离所述第二微生物；以及
c)提供在所述疫苗中的所述第二保护性分子，其量为当被给予动物时保护所述动物抵御所述第二种微生物的生物型。
13.权利要求1的方法，所述方法还包括在一段时间内获得生物样品，从所述样品获得NOI并将在后获得的NOI与在先获得的NOI比较，当所述在后获得的NOI与所述在先获得的NOI不同时产生所述疫苗。
14.权利要求1的方法，其中所述动物选自猪、牛、犬、猫、马和水生无脊椎动物。
15.一种保护动物抵御微生物的生物型的方法，所述方法包括：
a)鉴定微生物的目的核酸分子或其片段(NOI)，所述NOI已知能够产生保护性分子；
b)从至少一只动物获得生物样品，其中所述动物已暴露于所述微生物；
c)从所述样品获得所述微生物的所述NOI，而不需要分离所述微生物；
d)从所述NOI产生保护性分子，所述保护性分子选自：
(i)包含所述NOI的序列或其片段的核酸分子；
(ii)由所述NOI表达的多肽或其片段；
(iii)至少一种RNA分子，所述RNA分子包含对应于全部或部分所述NOI并且形成dsRNA的序列；
(iv)至少一种RNA分子，所述RNA分子对于全部或部分所述NOI是反义的；
(v)产生(iii)或(iv)的核酸分子；以及
(vi)包含或生成(i)-(v)中任一项的RNA颗粒；
e)产生包括所述保护性分子的疫苗，其中所述疫苗不包括所述微生物或者可复制或活的致病微生物；
f)提供所述保护性分子，其量为以当被给予动物时保护所述动物抵御所述微生物的生物型。
g)将所述保护性分子给予至少一只动物；
h)在所述动物中产生针对所述微生物的生物型的保护性应答。
16.权利要求15的方法，所述方法还包括给予动物所述保护性分子，所述动物选自(i)从其中获得所述生物样品的所述动物；(ii)与从其中获得所述生物样品的所述动物一起生活的动物；以及(iii)已充分暴露于或将要充分暴露于(i)或(ii)中的所述动物或生物样品以处于暴露于所述微生物的生物型的风险的动物。
17.权利要求15的方法，所述方法还包括将包含所述NOI的甲病毒RNA载体引入宿主细胞，从所述NOI表达多肽或其片段，以及从所述宿主中提取所述多肽或其片段，其中所述提取的多肽或其片段包括所述保护性分子，并被给予所述动物。
18.权利要求17的方法，其中所述载体包括委内瑞拉马脑炎(VEE)载体，所述宿主包括Vero细胞，并且所述多肽或其片段是通过裂解所述Vero细胞来提取的。
19.权利要求15的方法，其中所述保护性分子包括RNA颗粒，并且所述RNA颗粒包含所述NOI或其片段。
20.权利要求15的方法，其中所述保护性分子包括RNA颗粒，并且所述RNA颗粒生成dsRNA分子。
21.权利要求15的方法，所述方法还包括通过确定RNA颗粒(RP)效价的量来确定保护性分子的量，并且以当被给予时保护所述动物的RP效价提供所述保护性分子。
22.权利要求21的方法，所述方法还包括确定所述保护性分子的基因组当量，测定所述基因组当量：RNA颗粒效价(GE:RP)比例，并以当在疫苗中被给予时保护所述动物的GE:RP比例提供所述保护性分子。
21.权利要求15的方法，其中通过选自以下的方法获得所述NOI：对所述样品中的所述NOI的聚合酶链式反应和合成所述NOI。
22.权利要求15的方法，所述方法还包括确定所述微生物的生物型，并且如果所述微生物的生物型不同于存在针对其的疫苗的微生物生物型，则给予所述保护性分子。
23.权利要求15的方法，其中将所述保护性分子给予多个动物，所述多个动物与从其中获得所述生物样品的所述动物一起生活。
24.权利要求15的方法，其中将所述保护性分子给予单个动物，并且其中所述单个动物是从其中获得所述生物样品的动物。
25.权利要求15的方法，其中从其中获得所述生物样品的所述动物是暴露于第一微生物的第一多种动物中的第一动物，针对第一微生物产生了第一保护性分子，所述第一多种动物已经或即将充分暴露于第二多种动物的动物或其生物样品，所述第二多种动物暴露于第二微生物，使得所述第一和第二多种动物处于暴露于另一多种动物中存在的微生物的风险，所述方法还包括：
a)从所述第二多种动物中的至少一只动物获得生物样品；
b)从由所述第二多种动物的所述至少一只动物的所述生物样品获得的NOI产生第二保护性分子，而不需要分离所述第二微生物；
c)提供所述第二保护性分子，其量为当被给予动物时保护所述动物抵御所述第二微生物的生物型；以及
d)将所述第一和第二保护性分子给予所述第一和第二多种动物。
27.权利要求15的方法，所述方法还包括在一段时间内获得生物样品，从所述生物样品获得NOI，并将在后获得的NOI与在先获得的NOI比较，当所述在后获得的NOI与所述在先获得的NOI不同时产生所述疫苗。
28.权利要求15的方法，其中所述动物选自猪、牛、犬、猫、马和水生无脊椎动物。
29.一种保护动物抵御微生物的生物型的疫苗，所述疫苗包括：
a)选自以下的保护性分子：
(i)包含已知能够生成保护性分子的目的核酸分子或其片段(NOI)的序列，所述NOI是从已经暴露于所述微生物的动物的样品中获得；
(ii)由所述NOI表达的多肽或其片段；
(iii)至少一种RNA分子，所述RNA分子包含对应于全部或部分所述NOI并且形成dsRNA的序列；
(iv)至少一种RNA分子，所述RNA分子对于全部或部分所述NOI是反义的；
(v)产生(iii)或(iv)的核酸分子；以及
(vi)包含或产生(i)-(v)中任一项的RNA颗粒；
b)所述疫苗不包括所述微生物或者可复制或活的致病微生物；
c)其中所述微生物是一种生物型，与给予所述保护性分子时所获得的保护性应答相比，可获得的疫苗在被给予动物时不产生针对所述生物型的应答或产生降低的保护性应答；以及
d)给予所述保护性分子，其量为当被给予时保护所述动物抵御所述微生物的生物型的量。
30.权利要求29的疫苗，其中所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂包括非突变型大肠杆菌不耐热肠毒素。
CN201280077944.8A 2011-10-19 2012-10-23 快速产生改良的动物疫苗的方法 Pending CN105228648A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/277,076 US20120107355A1 (en) 2010-10-27 2011-10-19 Method of rapidly producing improved vaccines for animals
US13/277,066 US8828961B2 (en) 2010-10-27 2011-10-19 Methods and compositions to protect aquatic invertebrates from disease
US13/657,898 US8822427B2 (en) 2010-10-27 2012-10-23 Methods and compositions to protect aquatic invertebrates from disease
PCT/US2012/061431 WO2013066665A1 (en) 2011-10-19 2012-10-23 Method of rapidly producing improved vaccines for animals
US13/657,895 US10004797B2 (en) 2010-10-27 2012-10-23 Method of rapidly producing improved vaccines for animals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105228648A true CN105228648A (zh) 2016-01-06

Family

ID=48192618

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280077944.8A Pending CN105228648A (zh) 2011-10-19 2012-10-23 快速产生改良的动物疫苗的方法

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN105228648A (zh)
BR (2) BR112015009300A2 (zh)
WO (2) WO2013066665A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106957926A (zh) * 2017-04-14 2017-07-18 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种能同时检测和鉴别古典猪瘟、非洲猪瘟和猪水泡病的检测试剂盒及引物和探针

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019121414A1 (en) * 2017-12-20 2019-06-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Detection of modified live swine influenza virus vaccines

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101184839A (zh) * 2005-04-08 2008-05-21 纳斯泰克制药公司 用于呼吸道病毒感染的RNAi治疗
WO2012058072A1 (en) * 2010-10-27 2012-05-03 Harrisvaccines, Inc Method of rapidly producing vaccines for animals

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4692412A (en) 1972-10-06 1987-09-08 Livingston Virginia W Method of preparing an autogenous vaccine
US4220584A (en) 1978-01-30 1980-09-02 Merck & Co., Inc. E. coli enterotoxin vaccine for veterinary and human use
US4285931A (en) 1978-01-30 1981-08-25 Merck & Co., Inc. E. coli enterotoxin vaccine for veterinary and human use
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US6086880A (en) 1985-12-26 2000-07-11 The University Of Saskatchewan Rotavirus peptide compositions and methods of use
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
GB8612087D0 (en) 1986-05-19 1986-06-25 Ici Plc Hybridisation probes
US5017478A (en) 1987-07-16 1991-05-21 Berlex Laboratories, Inc. Transfected cells containing plasmids having genes oriented in opposing directions and methods of using
US5185440A (en) 1989-06-20 1993-02-09 North Carolina State University cDNA clone coding for Venezuelan equine encephalitis virus and attenuating mutations thereof
US5426039A (en) 1993-09-08 1995-06-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol
US5792462A (en) 1995-05-23 1998-08-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Alphavirus RNA replicon systems
GB9622660D0 (en) 1996-10-31 1997-01-08 Biocine Spa Immunogenic detoxified mutant toxin
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
ES2330202T5 (es) 2001-09-06 2014-01-20 Alphavax, Inc. Sistemas vectores basados en replicones de alfavirus
DK1608762T3 (da) 2003-03-20 2014-04-07 Alphavax Inc Forbedrede alphavirusreplikoner og hjælperkonstrukter
JP5331340B2 (ja) 2004-05-18 2013-10-30 バイカル インコーポレイテッド インフルエンザウィルスワクチン組成物、及びその使用方法
EP1962900A2 (en) 2005-11-29 2008-09-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Identification of protective antigenic determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) and uses thereof
MX2008011728A (es) * 2006-03-15 2008-12-10 Intervet Int Bv Virus de enfermedad de newcastle recombinante que expresa hemaglutinina h5 de virus de influenza aviar.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101184839A (zh) * 2005-04-08 2008-05-21 纳斯泰克制药公司 用于呼吸道病毒感染的RNAi治疗
WO2012058072A1 (en) * 2010-10-27 2012-05-03 Harrisvaccines, Inc Method of rapidly producing vaccines for animals

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106957926A (zh) * 2017-04-14 2017-07-18 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种能同时检测和鉴别古典猪瘟、非洲猪瘟和猪水泡病的检测试剂盒及引物和探针

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013066665A1 (en) 2013-05-10
BR112015009300A2 (pt) 2018-05-15
WO2013103434A1 (en) 2013-07-11
BR112015009103A2 (pt) 2017-07-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9650634B2 (en) Methods and compositions to protect aquatic invertebrates from disease
US10004797B2 (en) Method of rapidly producing improved vaccines for animals
McLoughlin et al. Alphavirus infections in salmonids–a review
Armesto et al. A recombinant avian infectious bronchitis virus expressing a heterologous spike gene belonging to the 4/91 serotype
Ilouze et al. The outbreak of carp disease caused by CyHV-3 as a model for new emerging viral diseases in aquaculture: a review
CN108064165A (zh) 猪流行性腹泻病毒株和由其产生的免疫原性组合物
Kapczynski et al. Homologous and heterologous antigenic matched vaccines containing different H5 hemagglutinins provide variable protection of chickens from the 2014 US H5N8 and H5N2 clade 2.3. 4.4 highly pathogenic avian influenza viruses
CN104962581B (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒p72蛋白的重组病毒疫苗株
CN109439634A (zh) 伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其应用
Tan et al. Infectious bronchitis virus poly-epitope-based vaccine protects chickens from acute infection
Lee et al. Live recombinant NDV-vectored H5 vaccine protects chickens and domestic ducks from lethal infection of the highly pathogenic H5N6 avian influenza virus
CN105247043A (zh) 鳞片脱落疾病(sdd)致病病毒及其衍生物
Foster Viruses as pathogens: animal viruses affecting wild and domesticated species
CN103468647B (zh) 猪流感h1n1和h3n2亚型的二价灭活疫苗
CN105228648A (zh) 快速产生改良的动物疫苗的方法
CN116769735A (zh) 一种甲病毒减毒株的构建方法及应用
CN106916832B (zh) O型口蹄疫病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用
Rimstad Vaccination against infectious pancreatic necrosis
US8822427B2 (en) Methods and compositions to protect aquatic invertebrates from disease
Rice Investigating pathogenicity of Spring Viraemia of Carp virus (SVCV) and the development of diagnostic tools
CN103865890A (zh) 一种用于预防病毒性心肌炎的重组病毒及其疫苗和应用
Kapczynski et al. Efficacy of recombinant H5 vaccines delivered in ovo or day of age in commercial broilers against the 2015 US H5N2 clade 2.3. 4.4 c highly pathogenic avian Influenza virus
CN104109655B (zh) H7亚型禽流感疫苗和诊断试剂所需种毒的制备方法
Dey et al. Newcastle disease virus
Bich et al. Molecular characterization of infectious bronchitis virus (IBV) isolated from commercial chicken farms

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160106

RJ01 Rejection of invention patent application after publication