CN105223283B - 神经生长因子含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种神经生长因子含量的测定方法，其为使用高效液相凝胶色谱对制剂中的神经生长因子含量进行测定的方法，色谱条件为：(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为10000～500000道尔顿，孔径为200～300埃；(2)流动相：浓度为0.1～0.5M的缓冲液，pH值为6.5～7.2；(3)柱温：20～40℃；(4)流速：0.5～1.0ml/min；(5)检测波长：205～220nm，其中，所述流动相含有以体积百分数计为5～20％的水溶性有机溶剂。本发明的神经生长因子含量的测定方法，通过在流动相中加入一定量的水溶性有机溶剂，有效提高了色谱仪和色谱柱的使用寿命，同时提高了神经生长因子和辅料的分离度。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方法，具体地说，涉及一种使用高效液相凝胶色谱测定制剂中神经生长因子含量的方法。
背景技术
神经生长因子(NGF)是神经系统最主要的活性成分之一，它能维持交感神经和感觉神经细胞的生存，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用，对保护神经系统的正常功能具有重要作用。
现有的含有人血清白蛋白作为稳定剂的NGF制剂，由于制剂中NGF的含量较低，而人血清白蛋白与NGF均为蛋白质，且人血清白蛋白在制剂中的浓度明显高于NGF，因而严重影响了NGF的准确定量。目前常用于生物制品中蛋白质含量测定的方法如Lowry法、紫外吸收法、Bradford法、酶联免疫吸附(ELISA)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法等均不能有效排除这种干扰，且无法进行准确的定量测定。
专利ZL200510130348.3公开了一种测定神经生长因子含量的方法，该方法使用摩尔浓度为0.07～2.0mol/L的盐溶液或缓冲液作为流动相，能够较准确地测定制剂中NGF的含量。但是，该方法会腐蚀色谱仪和凝胶色谱柱，缩短色谱仪和凝胶色谱柱的使用寿命，进而增加实验成本。
有鉴于此，需要一种能够有效延长色谱仪和色谱柱使用寿命，同时有效测定制剂中神经生长因子含量的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人对使用高效液相凝胶色谱测定制剂中神经生长因子含量的测定方法进行了深入研究，结果发现，通过在流动相中加入特定的有机成分，能够有效提高色谱仪和色谱柱的使用寿命，同时还能够提高NGF和辅料的分离度，从而改进了神经生长因子含量的测定方法。
即，本发明的目的是提供一种神经生长因子含量的测定方法。
为了实现上述目的，本发明的一个实施方式为神经生长因子含量的测定方法，其为使用高效液相凝胶色谱对制剂中的神经生长因子含量进行测定的方法，色谱条件为：(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为10000～500000道尔顿，孔径为200～300埃的凝胶色谱柱；(2)流动相：浓度为0.1～0.5M的缓冲液，pH值为6.5～7.2；(3)柱温：20～40℃；(4)流速：0.5～1.0ml/min；(5)检测波长：205～220nm，其中，所述流动相含有以体积百分数计为5～20％，优选为10～15％，更优选为15％的水溶性有机溶剂。
作为本发明中所使用的水溶性有机溶剂，例如可以使用乙腈、甲醇或异丙醇，优选使用乙腈。作为本发明中所使用的缓冲液例如可以为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，优选为磷酸钠(钾)盐缓冲液或醋酸钠(钾)盐缓冲液。
本发明中通过在流动相中添加水溶性有机溶剂，能够保证色谱柱的压力低，峰形好，提高了神经生长因子和辅料的分离度，并且，还能够有效提高色谱仪和色谱柱的使用寿命。
进而，本发明中，所述流动相的pH值优选为6.8。
此外，在本发明的上述色谱条件中，所述凝胶色谱柱的孔径优选为300埃。
作为本发明中所使用的凝胶色谱柱，例如可以使用TSK G3000SW xl SEC(TOSOH，日本)、SHODEX Protein KX-804(SHODEX，日本)、BSA-7(MN，德国)或Phenomenex K3(Phenomenex，美国)，该色谱柱的分子量范围在10000～500000道尔顿、孔径为300埃。
此外，在本发明的上述色谱条件中，所述柱温优选为30℃。
此外，在本发明的上述色谱条件中，所述流速优选为0.6～0.8ml/min，更优选为0.6ml/min，在该流速下能够使NGF和辅料完全分离，从而更准确地测定制剂中NGF的含量。
此外，在本发明的上述色谱条件中，所述检测波长优选为214nm。
本发明的神经生长因子含量的测定方法是使用高效液相色谱法中的凝胶色谱法对制剂中的NGF含量进行定量测定的方法，其基本原理是通过流经色谱柱的各种物质的分子量差异将其分离，分子量越大，保留时间越短，由于每种物质在一定条件下具有特定的保留时间，因此可通过色谱图上的保留时间获知目的峰的位置和相关参数，并通过上述参数计算得到的目标物质的含量。
通过实验，进一步确定了本发明的较佳实施方式，其中，流动相pH值为6.8，流动相中水溶性有机溶剂的体积百分比为15％，流速为0.6ml/min，检测波长为214nm。
本发明的使用高效液相凝胶色谱来测定神经因子含量，可以使用外标法对制剂进行测定，所述外标法包括如下步骤：
选择合适的浓度，配制对照溶液和样品溶液，在选定的色谱条件下进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
本发明具有如下有益效果：
本发明的神经因子含量的测定方法是使用高效液相凝胶色谱来测定制剂中神经因子含量的方法，其通过在流动相中加入一定量的有机成分，有效提高了色谱仪和色谱柱的使用寿命，同时提高了NGF和辅料的分离度，回收率合格在95％～105％之间，且重复性良好。
附图说明
图1为本发明比较例1的测定方法测得的神经因子含量的色谱图。
图2为本发明实施例1的测定方法测得的神经因子含量的色谱图。
图3为本发明实施例2的测定方法测得的神经因子含量的色谱图。
图4为本发明实施例3的测定方法测得的神经因子含量的色谱图。
图5为本发明实施例4的测定方法测得的神经因子含量的色谱图。
图6为本发明实施例5的测定方法测得的神经因子含量的色谱图。
图7为本发明实施例6的测定方法测得的神经因子含量的色谱图。
图8为本发明实施例7的测定方法测得的神经因子含量的色谱图。
图9为本发明试验例3中使用流动相1测定神经因子含量时，进样数为600针时的色谱图。
图10为本发明试验例3中使用流动相1测定神经因子含量时，进样数为1000针时的色谱图。
图11为本发明试验例3中使用流动相2测定神经因子含量时，进样数为600针时的色谱图。
图12为本发明试验例3中使用流动相2测定神经因子含量时，进样数为1000针时的色谱图。
具体实施方式
下面，结合实施例和比较例对本发明的具体实施方式进一步进行说明，以便更清楚地描述本发明的优点和特点。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下实施例及比较例中所使用的试剂，除非特别说明均为从正规渠道常规购得，且除乙腈为色谱纯级以外，其他均为分析纯级。
比较例1：使用不含有水溶性有机溶剂的流动相测定神经生长因子制剂中的NGF含量
一、色谱条件
1)仪器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪(TOSOH，日本，下同)；
2)凝胶色谱柱：TSK G3000SWxl SEC(TOSOH，日本，下同)，7.8×300mm，孔径为300埃(5μm)；
3)流动相：0.25M磷酸钠盐缓冲液，pH值为6.8，
4)柱温：30℃；
5)流速：0.8ml/min；
6)检测波长：214nm；
7)进样量：20μl。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：取浓度已知的NGF原液(舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：Y110502，浓度：0.43mg/ml)，使用上述作为流动相的0.25M磷酸钠盐缓冲液进行稀释，配制成NGF的浓度为50μg/ml的溶液，作为对照溶液。
2、样品溶液的制备：另取神经因子制剂一支(市售苏肽生(商品名)，30μg/支，下同)，加入0.6ml作为流动相的0.25M磷酸盐缓冲液配制成样品溶液。
3、测定结果：将对照溶液和样品溶液在上述色谱条件下进行检测，记录色谱图(图1)，根据色谱图获取保留时间、峰面积等参数。按外标法以峰面积根据下述公式(1)计算神经因子制剂中NGF的含量，对照溶液重复检测2次，样品溶液重复检测6次，结果如表1所示，其中，C对表示对照溶液的NGF浓度。
含量(％)＝C对×样品溶液目标峰面积/对照溶液目标峰面积/50×100％(1)
表1
表2
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 比较例1 | 12.183 | 872722 | 2.87 | 1.535 | 9464 |
实施例1：使用添加有甲醇的流动相来测定神经生长因子制剂中的NGF含量
一、色谱条件：
1)仪器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪；
2)凝胶色谱柱：TSK G3000SWxl SEC，7.8×300mm，孔径为300埃(5μm)；
3)流动相：甲醇与0.25M磷酸盐缓冲液以体积比20:80混合的混合溶液，pH值为6.5，
4)柱温：20℃；
5)流速：0.8ml/min；
6)检测波长：214nm；
7)进样量：20μl。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：取含量已知的NGF原液(舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：Y110502，浓度：0.43mg/ml)，使用上述作为流动相的混合溶液进行稀释，配制成NGF的浓度为50μg/ml的溶液，作为对照溶液；
2、样品溶液的制备：另取神经因子制剂一支，加入0.6ml作为流动相的混合溶液溶解配制成样品溶液。
3、测定结果：将对照溶液和样品溶液在上述色谱条件下进行检测，记录色谱图(图2)，根据色谱图获取保留时间、峰面积等参数。按外标法以峰面积根据上述公式(1)计算神经因子制剂中NGF的含量，对照溶液重复检测2次，样品溶液重复检测6次，结果如表3所示。此外，NGF与辅料的分离度考察结果如表4所示。
表3
表4
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 实施例1 | 13.057 | 1036159 | 2.35 | 1.29 | 8037 |
从图2及表3、表4可以看出：该测定方法的重复性良好，测定多份样品的含量时，结果准确可靠。
实施例2：使用添加有异丙醇的流动相来测定神经生长因子制剂中的NGF含量
一、色谱条件：
1)仪器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪；
2)凝胶色谱柱：TSK G3000SWxl SEC，7.8×300mm，孔径为300埃(5μm)；
3)流动相：异丙醇与0.1M磷酸钠盐缓冲液以体积比5:95混合的混合溶液，pH值为7.2，
4)柱温：30℃；
5)流速：0.8ml/min；
6)检测波长：220nm；
7)进样量：20μl。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：取含量已知的NGF原液(舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：Y110502，浓度：0.43mg/ml)，使用上述作为流动相的混合溶液进行稀释，配制成NGF的浓度为50μg/ml的溶液，作为对照溶液；
2、样品溶液的制备：另取神经因子制剂一支，加入0.6ml作为流动相的混合溶液溶解配制成样品溶液。
3、测定结果：将样品溶液在上述色谱条件下进行检测，记录色谱图(图3)。根据色谱图获取保留时间、峰面积等参数，按外标法以峰面积根据上述公式(1)计算神经因子制剂中NGF的含量，对照溶液重复检测2次，样品溶液重复检测6次，结果如表5所示。此外，NGF与辅料的分离度考察结果如表6所示。
表5
表6
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 实施例2 | 12.722 | 937441 | 2.20 | 1.18 | 7994 |
从图3及表5、表6可以看出：该测定方法的重复性良好，测定多份样品的含量时，结果准确可靠。
实施例3：使用SHODEX色谱柱来测定神经生长因子制剂中的NGF含量
一、色谱条件：
1)仪器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪；
2)凝胶色谱柱：SHODEX Protein KW-804(SHODEX，日本)，7.8×300mm，孔径为300埃(5μm)；
3)流动相：乙腈与0.5M磷酸钠盐缓冲液以体积比10:90混合的混合溶液，pH值为6.8；
4)柱温：30℃；
5)流速：0.8ml/min；
6)检测波长：205nm；
7)进样量：20μl。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：对照溶液的制备：取含量已知的NGF原液(舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：Y110502，浓度：0.43mg/ml)，使用上述作为流动相的混合溶液进行稀释，配制成NGF的浓度为50μg/ml的溶液，作为对照溶液；；
2、样品溶液的制备：另取神经因子制剂一支，加入0.6ml作为流动相的混合溶液溶解配制成样品溶液；
3、测定结果：将对照溶液和样品溶液在上述色谱条件下进行检测，记录色谱图(图4)，根据色谱图获取保留时间、峰面积等参数。按外标法以峰面积根据上述公式(1)计算神经因子制剂中NGF的含量，对照溶液重复检测2次，样品溶液重复检测6次，结果如表7所示。此外，NGF与辅料的分离度考察结果如表8所示。
表7
表8
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 实施例3 | 12.485 | 596620 | 2.79 | 1.978 | 6849 |
从图4及表7、表8可以看出：该色谱柱的重复性良好，测定多份样品的含量时，结果准确可靠。
实施例4：使用醋酸钠盐来测定神经生长因子制剂中的NGF含量
一、色谱条件：
1)仪器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪；
2)凝胶色谱柱：TSK G3000SWxl SEC，7.8×300mm，孔径为300埃(5μm)；
3)流动相：乙腈与0.25M醋酸钠盐缓冲液以体积比15:85混合的混合溶液，pH值为6.8，
4)柱温：40℃；
5)流速：0.6ml/min；
6)检测波长：214nm；
7)进样量：20μl。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：对照溶液的制备：取含量已知的NGF原液(舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：Y110502，浓度：0.43mg/ml)，使用上述作为流动相的混合溶液进行稀释，配制成NGF的浓度为50μg/ml的溶液，作为对照溶液；
2、样品溶液的制备：另取神经因子制剂一支，加入0.6ml作为流动相的混合溶液溶解配制成样品溶液；
3、测定结果：将对照溶液和样品溶液在上述色谱条件下进行检测，记录色谱图(图5)，根据色谱图获取保留时间、峰面积等参数。按外标法以峰面积根据上述公式(1)计算神经因子制剂中NGF的含量，对照溶液重复检测2次，样品溶液重复检测6次，结果如表9所示。此外，NGF与辅料的分离度考察结果如表10所示。
表9
表10
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 实施例4 | 17.020 | 1138448 | 2.35 | 1.34 | 10244 |
从图5及表9、表10可以看出：将缓冲液改为醋酸钠盐缓冲液时，重复性也良好，测定多份样品的含量时，结果准确可靠。
实施例5使用添加有乙腈的流动相来测定神经生长因子制剂中的NGF含量
一、色谱条件：
1)仪器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪；
2)凝胶色谱柱：TSK G3000SWxl SEC，7.8×300mm，孔径为300埃(5μm)；
3)流动相：乙腈与0.25M磷酸钠盐缓冲液以体积比15:85混合的混合溶液，pH值为6.8，
4)柱温：30℃；
5)流速：0.5ml/min；
6)检测波长：214nm；
7)进样量：20μl。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：取含量已知的NGF原液(舒泰神(北京)生物制药股份有限公司，批号：Y110502，浓度：0.43mg/ml)，使用上述作为流动相的混合溶液进行稀释，配制成NGF的浓度为50μg/ml的溶液，作为对照溶液；
2、样品溶液的制备：另取神经因子制剂一支，加入0.6ml作为流动相的混合溶液溶解配制成样品溶液；
3、测定结果：将对照溶液和样品溶液在上述色谱条件下进行检测，记录色谱图(图6)，根据色谱图获取保留时间、峰面积等参数。按外标法以峰面积根据上述公式(1)计算神经因子制剂中NGF的含量，对照溶液重复检测2次，样品溶液重复检测6次，结果如表11所示。此外，NGF与辅料的分离度考察结果如表12所示。
表11
表12
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 实施例5 | 20.351 | 1496043 | 2.70 | 1.27 | 11015 |
从图6及表11、表12可以看出：调整流速为0.5ml/min时，重复性也良好，测定多份样品的含量时，结果准确可靠。
实施例6使用添加有乙腈的流动相来测定神经生长因子制剂中的NGF含量
一、色谱条件：
1)仪器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪；
2)凝胶色谱柱：TSK G3000SWxl SEC，7.8×300mm，孔径为300埃(5μm)；
3)流动相：乙腈与0.25M磷酸钠盐缓冲液以体积比15:85混合的混合溶液，pH值为6.8，
4)柱温：30℃；
5)流速：1.0ml/min；
6)检测波长：214nm；
7)进样量：20μl。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：与实施例5相同；
2、样品溶液的制备：与实施例5相同；
3、测定结果：将对照溶液和样品溶液在上述色谱条件下进行检测，记录色谱图(图7)，根据色谱图获取保留时间、峰面积等参数。按外标法以峰面积根据上述公式(1)计算神经因子制剂中NGF的含量，对照溶液重复检测2次，样品溶液重复检测6次，结果如表13所示。此外，NGF与辅料的分离度考察结果如表14所示。
表13
表14
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 实施例6 | 10.152 | 733776 | 2.32 | 1.23 | 8405 |
从图7及表13、表14可以看出：调整流速为1.0ml/min时，重复性也良好，测定多份样品的含量时，结果准确可靠。
实施例7：使用添加有乙腈的流动相来测定神经生长因子制剂中的NGF含量
一、色谱条件：
1)仪器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪；
2)凝胶色谱柱：TSK G3000SWxl SEC，7.8×300mm，孔径为300埃(5μm)；
3)流动相：乙腈与0.25M磷酸钠盐缓冲液以体积比15:85混合的混合溶液，pH值为6.8，
4)柱温：30℃；
5)流速：0.6ml/min；
6)检测波长：214nm；
7)进样量：20μl。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：与实施例5相同；
2、样品溶液的制备：与实施例5相同；
3、测定结果：将对照溶液和样品溶液在上述色谱条件下进行检测，记录色谱图(图8)，根据色谱图获取保留时间、峰面积等参数。按外标法以峰面积根据公式(1)计算神经因子制剂中NGF的含量，对照溶液重复检测2次，样品溶液重复检测6次，结果如表15所示。此外，NGF与辅料的分离度考察结果如表16所示。
表15
表16
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 实施例7 | 16.496 | 1190407 | 3.27 | 1.234 | 14140 |
从图8及表15、表16可以看出：该测定方法的重复性良好，测定多份样品的含量时，结果准确可靠，并且，与比较例1相比，响应值更高、分离度更好、对称性更好、理论塔板数更高，说明了通过在流动相中添加水溶性有机溶剂，能够提高NGF和辅料的分离度，有效测定神经生长因子制剂中的NGF含量。
试验例1：本发明的神经生长因子含量的测定方法的进样精密度实验
一、色谱条件：与实施例7相同。
二、实验步骤：用与实施例7相同的方法制备样品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，记录色谱图，获取保留时间、峰面积等参数，计算RSD值，结果如表17所示。
表17
表17的结果可以表明：进样精密度良好(判断基准：RSD值＜2％)。
试验例2：本发明的神经生长因子含量的测定方法的回收率试验
一、色谱条件：与实施例7相同。
二、实验步骤：
1、对照溶液的制备：与实施例7相同，配制3份，摇匀，待用；
2、样品溶液的制备：取含有人血白蛋白(以质量百分含量计为0.1％)和甘露醇(以质量百分含量计为5.0％)的水溶液，将该水溶液加入NGF原液中，配制成NGF浓度为40、50、60μg/ml的溶液各3份，摇匀，待用；
3、在上述色谱条件下，将对照溶液和样品溶液注入液相色谱仪进行检测，记录色谱图，采用外标法计算出NGF的含量，并根据加入量，计算神经生长因子制剂中NGF的回收率，以回收率95％～105％为合格，结果如表18所示。
表18
上述实验结果表明：本发明的神经生长因子含量的测定方法的回收率合格，可以准确测定NGF含量。
试验例3：流动相中加入乙腈前后对于色谱柱的使用寿命的影响
一、色谱条件：
1)仪器：SHIMADZU LC-20AD高效液相色谱仪；
2)凝胶色谱柱：TSK G3000SWxl SEC，7.8×300mm，孔径为300埃(5μm)；
3)流动相1：0.25M磷酸钠盐缓冲液，pH值为6.8；
流动相2：乙腈与0.25M磷酸钠盐缓冲液以体积比15:85混合的混合溶液，pH值为6.8；
4)柱温：30℃；
5)流速：0.8ml/min、0.6ml/min；
6)检测波长：214nm；
7)进样量：20μl。
二、实验步骤：
1、一根色谱柱在流动相1条件下对NGF含量测定，比较进样数在600针和1000针时NGF峰形的改变。结果见图9、10及表19。
2、一根色谱柱在流动相2条件下对NGF含量测定，比较进样数在600针和1000针时NGF峰形的改变。结果见图11、12及表20。
表19
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 进样600针 | 12.236 | 858399 | 2.47 | 0.00 | 8522 |
| 进样1000针 | 15.902 | 1366542 | 2.88 | 0.00 | 2152 |
表20
| 苏肽生样品 | 保留时间 | 峰面积 | 分离度 | 对称因子 | 理论塔板数 |
| 进样600针 | 16.460 | 1237404 | 2.95 | 1.24 | 12546 |
| 进样1000针 | 16.758 | 1123632 | 2.49 | 1.10 | 10345 |
从图9～12及表19、表20可以看出：采用两种流动相时，在进样针数相同的情况下，加入乙腈的流动相体系测得的峰形好，色谱柱的寿命长。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方案及实施例对本发明做了详尽的描述，但在本发明的基础上，所属技术领域的技术人员可以在不偏离本发明主旨的范围内对之进行修改和改进，这些修改或改进均属于本发明要求保护的范围。
Claims (11)
1.一种神经生长因子含量的测定方法，其为使用高效液相凝胶色谱对制剂中的神经生长因子含量进行测定的方法，色谱条件为：(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为10000～500000道尔顿，孔径为200～300埃的凝胶色谱柱；(2)流动相：浓度为0.1～0.5M的缓冲液，pH值为6.5～7.2；(3)柱温：20～40℃；(4)流速：0.5～1.0ml/min；(5)检测波长：205～220nm，其特征在于，所述流动相含有以体积百分数计为5～20％的水溶性有机溶剂。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流动相含有以体积百分数计为10％-15％的水溶性有机溶剂。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述水溶性有机溶剂为乙腈、甲醇或异丙醇。
4.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，所述流动相的pH值为6.8。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱的孔径为300埃。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱为TSK G3000 SW xlSEC或SHODEX Protein KW-804。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述柱温为30℃。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述流速为0.6～0.8ml/min。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述流速为0.6ml/min。
11.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述检测波长为214nm。
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