CN105219859B - Menin因子的应用 - Google Patents

Menin因子的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105219859B
CN105219859B CN201510672222.2A CN201510672222A CN105219859B CN 105219859 B CN105219859 B CN 105219859B CN 201510672222 A CN201510672222 A CN 201510672222A CN 105219859 B CN105219859 B CN 105219859B
Authority
CN
China
Prior art keywords
menin
factor
cell
expression
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510672222.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105219859A (zh
Inventor
程鹏
金钢
张怡杰
李刚
王云峰
陈颖
郝骏
刘彻
李森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Military Medical University SMMU
Original Assignee
Second Military Medical University SMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Military Medical University SMMU filed Critical Second Military Medical University SMMU
Priority to CN201510672222.2A priority Critical patent/CN105219859B/zh
Publication of CN105219859A publication Critical patent/CN105219859A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105219859B publication Critical patent/CN105219859B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了肿瘤抑制因子menin在诊断和治疗胰腺癌中的应用，对menin因子过表达抑制胰腺癌细胞生长的机理进行了阐述，menin因子一方面通过上调基因p18、p27、HOXA9、HDAC5以及CBX4的表达以及抑制下调基因CDK2、CDK4、ESM1、IGFBP7、GAS1的表达来抑制胰腺癌细胞的生长；另一方面Menin通过和Dnmt1竞争性结合来降低p18/p27启动子的DNA甲基化水平，来促进p18/p27基因的转录来抑制胰腺癌细胞的生长，为胰腺癌的治疗提出了一种新的途径。

Description

Menin因子的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肿瘤抑制因子Menin的应用。
背景技术
胰腺癌是目前已知的一种致命性的癌症，严重影响了人类健康。几乎所有的胰腺癌患者都会面临癌细胞转移，最后因癌细胞的增长无法控制而死亡。因此，了解胰腺癌的发病机制以及发展预后机制，对于诊断、预防和治疗这种疾病是非常重要的。
和其他的恶性肿瘤疾病类似，胰腺癌主要也是由基因的获得性突变的积累引起的，如癌基因、肿瘤抑制基因及基因组维持基因等的突变。胰腺癌中的单个抑癌因子基因K-ras、p16、TP53、MADH4以及BRCA2的突变率分别为85％、82％、76％、53％以及10％。在胰腺癌的发展过程中，除了基因水平的突变，生长因子、受体、细胞周期调节因子以及表观遗传因子中的异物，也会影响下游靶基因的激活或抑制，参与靶基因的生长及分化的控制。这些扰动对于侵入性的以及转移性的表型的发展赋予了极大的优势。
近些年，基于表观遗传调控可逆性的观点，改变表观调控模式成为了一个潜在的治疗途径。大家普遍认同，反常的DNA甲基化的出现是发生癌病变的关键因素。例如，在多种癌症中，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制因子，如p27和p16在沉默基因时，其启动子是高度甲基化的。与之前的研究一致，胰腺癌患者中的DNA甲基转移酶1(Dnmt1)是过表达的，且受肠高血糖素(Gli)的调控。
编码menin因子的MEN1基因的突变，会引起一种名称为多发性内分泌瘤1型的可遗传的肿瘤综合征，其特征在于，易引起多发性内分泌器官如甲状旁腺、胰岛以及其他非内分泌器官中癌变因子的发展。Menin因子参与细胞增殖、凋亡以及DNA损伤等多种细胞过程。已有报道表明，胰腺癌神经内分泌肿瘤(PanNETs)中的menin突变率高，同时，menin因子还调控胰岛以及胰腺多发性肿瘤的生长。另外，menin和也染色质重塑因子，如组蛋白甲基转移酶(HMT)以及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)相互作用，调控目标基因的转录。这些发现提供了一种Menin因子和胰腺癌相关的肿瘤存在联系的启示。然而，目前对于Menin因子是否会在占胰腺恶性肿瘤80％的胰腺导管腺肿瘤中不受管制，还无法确定，同时，其在胰腺癌中的作用也尚未进行过研究。
发明内容
本发明是为解决上述问题而进行的，对menin因子调节胰腺癌细胞的生长机制进行探讨，为未来进行胰腺癌的诊断和治疗提供一种参考。
本发明的目的之一在于提供一种menin因子在诊断胰腺癌中的应用，诊断产品包括用实时荧光定量PCR、免疫沉淀反应、微阵列、基因芯片诊断胰腺癌的产品。
荧光定量PCR的引物的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，免疫沉淀反应中与Menin蛋白特异性结合的抗体为抗DNA甲基转移酶1(Dnmt1)抗体。
本发明的另一个发明目的在于提供了一种menin因子在治疗胰腺癌中的应用，治疗产品包括使得menin因子过表达的成分。
发明作用与效果
本发明揭示了Menin因子在抑制胰腺癌细胞的生长中的作用，并通过Menin因子调节靶基因转录，为menin因子诊断或治疗胰腺癌提出了一种新的调控机制。
附图说明
图1是本发明的Menin因子在胰腺癌发展过程中的表达结果；
图2是本发明的Menin因子调控胰腺癌细胞生长的实验结果；
图3是本发明的Menin因子调控细胞周期调节因子表达的实验结果；
图4是本发明的Menin因子降低p18以及p27启动子甲基化水平的结果；
图5是本发明的Menin因子和Dnmt1相互作用的实验结果；
图6是本发明的Menin因子和Dnmt1相互作用对Hedgehog信号路径的实验结果。
具体实施方式
以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。应理解，这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中，未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件如Smabrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、材料与方法
1、患者和组织样本
样本采集自2010年7月至2012年6月期间接受胰腺癌手术的64名患者。这些患者中，年龄最小的为35岁，年龄最大的是81岁，平均年龄56岁，共39名男性患者，25名女性患者。临床分类基于胰腺癌的分类。
样本包括胰腺癌肿瘤组织以及癌旁正常组织(2.0mm)，组织样本的大小约为2.0×1.5×0.4cm。样本被分为四组，来进行不同的实验：第一组在Trizol试剂中裂解，用于RNA提取；第二组为新鲜冰冻组织用于DNA提取；第三组和浓度为10％的多聚甲醛混合，用于病理鉴定；第四组在2×SDS-PAGE缓冲液中进行western blot分析。
2、细胞培养及试剂
HEK293T细胞和胰腺癌细胞株(PANC-1、ASPC-1、MIAPaCa-2、Bxpc-3)从中国科学院(CAS，上海，中国)的典型培养物保藏的细胞库购买，细胞按照供应商的说明进行培养。甲基转移酶5-Aza-dC、Hedgehog抑制因子环巴胺以及Hedgehog促进剂SAG均购自于Sigma公司(圣路易斯，MO，美国)。
二、实验方法
1、RNA提取和实时荧光定量PCR分析
使用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)按照供应商的说明从组织或细胞的中提取总RNA。反转录使用Takara RNA PCR试剂盒(Takara，大连，中国)，按照制造商的说明进行，具体步骤如下：
(1)RNA的抽提
步骤1，收集细胞，加入1ml的TRIzol试剂裂解，然后加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIzol试剂的60％。
步骤2，RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
步骤3，RNA清洗移去上清液，每1mlTRIzol试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
步骤4，RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
步骤5，溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
(2)荧光定量PCR(Q-PCR)
步骤1，反转录合成cDNA：采用oligo dT引物和1μg总RNA进行cDNA的合成；
步骤2，配置实时定量PCR反应体系：SYBR Green 1染料10μL；上游引物1μL；下游引物1μL；dNTP 1μL；Taq聚合酶2μL；cDNA 5μL
步骤3，将配制好的PCR反应溶液置于Real time PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
为了定量目的基因的转录，在ABI7900仪(ABI，CA，USA)上使用SYBR Green预混物Ex Taq(Takara公司)进行实时PCR。根据PCR记录，绘制熔融曲线，采用3磷酸甘油醛脱氢酶(3-GAPDH)的归一化对目标mRNA的相对含量进行说明。PCR过程中，Menin以及在考察Menin因子和胰腺癌关系中所涉及的其他基因扩增引物的序列如表1所示：
表1 menin因子及相关基因扩增的引物序列表
2、Weston Blot分析
步骤如下：
步骤1，细胞在放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液中进行裂解，缓冲液含有50mmol/L、pH为7.4的Tris-盐酸，150mmol/L的NaCl，1％NP40和0.1％SDS，或者直接在2*SDS-PAGE缓冲液中裂解。
步骤2，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
步骤3，冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶的加样孔内。
步骤4，电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。转膜装置从下至上依次按阳极碳板、滤纸、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜精确对齐，每一步去除气泡，接通电源，恒流转移1.5hr。
步骤5，转膜完毕后，用5％脱脂牛奶的PBS封闭后，将膜用抗体标记，随后加入辣根过氧化物酶偶联二抗。使用了以下抗体：抗Menin(Santa Cruz公司，加利福尼亚州，美国)，抗Dnmt1(Abcam,MA公司)，抗Flag(Sigma公司)，抗myc(Sigma，MO)，抗Glil(Abcam，MA)，抗GAPDH(Abcam公司)。GAPDH蛋白质被用作上样对照。
步骤6，通过微孔化学发光底物试剂盒(Millipore公司，比尔里卡，MA)检测信号。
3、免疫共沉淀(IP)反应
具体步骤如下：
步骤1，HEK293T细胞用Dnmt1–flag或Menin-myc转染48小后，得到ASPC-1细胞，加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min,采用PIPA缓冲液收集ASPC-1细胞浆解物；
步骤2，细胞浆解物以3000rpm离心3min后，取上清液和已预先固定抗Menin抗体的Flag M2beards(Sigma公司)4℃缓慢摇晃孵育过夜；
步骤3，取10μL Menin蛋白琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3次；
步骤4，将预处理过的10μL Menin蛋白琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与Menin蛋白琼脂糖珠偶连；
步骤5，免疫沉淀反应后，在4℃以3,000rpm速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μL的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟；
步骤6，SDS-PAGE分离不同大小的蛋白，和抗Dnmt1抗体进行免疫印迹分析。
4、甲基特异性PCR(MSP)分析
简言之，DNA先经NaOH溶液变形及NaHSO3修饰，再由DNA纯化树脂(Promega)进行纯化，再次被NaOH溶液处理，而后和乙醇进行沉淀反应，溶解于双蒸水中，最后进行PCR反应。具体分析步骤按照参考文献[17]中记载的方法进行，引物序列采用现有技术文件“A.Sanchez-Aguilera,J.Delgado,F.I.Camacho,M.Sanchez-Beato,L.Sanchez,C.Montalban,M.F.Fresno,C.Martin,M.A.Piris,J.F.Garcia,Silencing of thep18INK4c gene by promoter hypermethylation in Reed-Sternberg cells in Hodgkinlymphomas,Blood,103(2004)2351-2357”以及现有技术文件“J.Worm,J.Bartkova,A.F.Kirkin,P.Straten,J.Zeuthen,J.Bartek,P.Guldberg,Aberrant p27Kip1promotermethylation in malignant melanoma,Oncogene,19(2000)5111-5115”中所记载的序列。
5、ChIP分析
使用染色质免疫沉淀(ChIP)检测试剂盒(Upstate，美国)进行分析。简言之，空白对照或menin过表达MIAPaCa-2细胞用用甲醛固定。DNA经几次超声处理后被剪成200-1000bp之间的片段。染色质使用抗Dnmt1抗体(Abcam公司)进行孵育和沉淀。
具体步骤如下：
步骤1，取出1平皿细胞(10cm平皿)，加入甲醛体积分数1％为磷酸盐缓冲液，37℃孵育10min。
步骤2，终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M，吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
步骤3，细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中。预冷后2000rpm5min收集细胞。
步骤4，超声破碎，加抗体的作为实验组，不加抗体的作为对照组；100μL加入4μL5mol/L NaCl(NaCl终浓度为0.2mol/L)，65℃处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
步骤5，在100uL的超声破碎产物中，加入900μL ChIP Dilution Buffer和20μl的50×PIC。再各加入60μl Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1h。
步骤6，取上清，各留取20μl做为input。一管中加入1μl抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。
步骤7，依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10min，4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
步骤8，洗涤溶液：
(1)低盐缓冲液冲洗一次；(2)高盐缓冲液冲洗一次；(3)LiCl缓冲液冲洗一次；(4)TE缓冲液冲洗两次。
步骤9，清洗完毕后，开始洗脱。
洗脱液的配方：100μl 10％SDS，100μl 1M NaHCO3，800μl ddH2O，共1ml。
步骤10，解交联：每管中加入20μl 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M)，混匀，65℃解交联过夜。
步骤11，DNA片段的回收，PCR分析。
6、免疫沉淀反应(DIP)分析
采用DNA提取试剂盒(来锋，上海)提取对照组和menin过表达MIAPaCa-2细胞中的DNA，和抗5-mc抗体进行沉淀反应。具体步骤如下：
步骤1，DNA提取，按照试剂盒的说明进行；
步骤2，取少量裂解液以备Western blot分析，将1μg抗5-mc抗体和10-50μLprotein A/G-beads加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；
步骤3，免疫沉淀反应后，在4℃以3,000g速度离心5min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μL的2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟；
步骤4，SDS-PAGE，Western blotting分析。
7、微阵列分析
步骤1，对照组和menin过表达MIAPaCa-2细胞中总RNA提取，同1中的RNA提取方法；
步骤2，采用RNeasy mini试剂盒(QIAGEN，德国)对RNA进行纯化，采用低进量快速扩增标记试剂盒(安捷伦科技，CA)对RNA进行扩增并进行Cy3标记；
步骤3，在分子杂交仪中，采用基因表达杂交试剂盒(安捷伦科技，CA)使对照组和MIAPaCa-2细胞组的RNA分别和芯片杂交17小时；
步骤4，采用基因表达冲洗缓冲液试剂盒(安捷伦科技，CA)对芯片进行杂交，由上海生物科技有限公司进行数据的采集和分析。
统计分析
采用SPSS13.0软件进行数据分析，统计学差异采用卡方检验进行估计。每组实验至少进行三次，实验数据采用平均值±标准偏差的形式表示。统计显著性表示为*(P＜0.05)，**(P＜0.01)，***(P＜0.001)。
结果分析
胰腺癌中Menin蛋白被钝化
尽管多项研究表明，Menin蛋白的钝化与胰腺神经内分泌肿瘤密切相关，但是Menin蛋白与胰腺癌的关系却并不明确。为了解决这一问题，我们收集了处于I至IV阶段的病人的标本，分析了其2年存活率的数据。如图1A所示，随着胰腺癌的发展，2年存活率下降。随后，我们运用了实时定量基因扩增荧光检测系统，检测胰腺癌组织和正常组织中的Menin转录水平。发现胰腺癌组织中的Menin表达要远低于正常细胞中的表达，并且在胰腺癌组织中，Menin的表达的反向调节显著，见图1B。此外，此种反向调节的作用，在六个代表性病例上，被蛋白质印迹分析所证实，见图1C。
Menin抑制胰腺癌细胞的生长
由于Menin表达的反向调节作用，假设在胰腺癌的发展过程中，Menin起到消极的调节作用。为了证实其在胰腺癌细胞中的作用，将其在五组胰腺癌细胞株(PANC-1,ASPC-1,MIAPaCa-2,Bxpc-3,MIAPaCa-2)中进行表达。如图2A所示，Menin因子在PANC-1和ASPC-1细胞中的表达水平较高，在MIAPaCa-2中的表达水平最低。
随后，我们构建了Menin shRNAs去抑制Menin在ASPC-1中的表达。如图2B所示，sh1/3产生了良好的抑制作用。Menin抑制细胞的增殖采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)进行测定，如图2C所示，Menin贫乏细胞的增殖率高于对照组细胞或不进行抑制的sh2过表达的ASPC-1细胞的增殖率。相反的，如图2D所示，Menin的过表达极大抑制了MIAPaCa-2细胞的生长。
为了证实Menin因子在有机体内的抑制作用，将对照组和Menin过表达细胞分别注射入裸鼠体内。如图2E所示，从Menin过表达细胞中提取的肿瘤较对照组中的明显小。这些数据表明，Menin因子过表达在体内和体外均有抑制胰腺癌细胞生长的作用。
Menin调控细胞周期调节因子的表达
为了确定Menin因子抑制胰腺癌细胞生长的下游目标，采用微阵列对对照组以及Menin过表达MIAPaCa-2细胞之间的基因表达模式进行比较。总共比较了721个基因，其中，316个基因表达上升，405个基因表达下调，如图3A所示，CDK抑制因子p27和p18显示出了极高的表达水平上升，而CDK2和CDK4则显示出了明显的表达水平下降，这和MIAPaCa-2细胞中的Menin过表达的抑制效应明显一致。除此之外，HOXA9以及表观遗传因子HDAC5、CBX4的表达也减少，其他基因如ESM1、IGFBP7、和Hedgehog/Gli的信号靶标GAS1的表达也由于Menin过表达而显著减少。另外，Menin过表达MIAPaCa-2细胞对上述基因解除调控也被Q-PCR的结果所证实，见图3B。
为了进一步证实这些结果，对Menin被抑制细胞中的可能成为Menin靶标的基因的表达进行测定，结果如图3C所示，由于Menin因子的消耗，Menin过表达细胞中的上调基因p18、p27、HOXA9、HDAC5以及CBX4的表达被抑制；而Menin被抑制的ASPC-1细胞中的下调基因CDK2、CDK4、ESM1、IGFBP7以及GAS1的表达被极大催生。这些发现证实，Menin可能通过调控重要的细胞周期调控因子的表达来抑制胰腺癌细胞的生长。
Menin下调p18以及p27启动子的甲基化水平
利用胰腺癌患者样本中的cDNA，对I–IV期胰腺癌组织以及与其临近的正常组织中的p18和p27的相对表达水平进行测定。如图4A所示，和Menin的表达模式类似，随着胰腺细胞癌变的发展，p18和p27的表达也呈下调趋势。
尽管之前已有Menin通过促进p18和p27组蛋白甲基化来调控胰岛细胞的生长报道，但这对于理解Menin是否能够影响DNA甲基化这一导致细胞周期因子发生畸变而不受约束的调控路径于事无补。申请人首先采用MSP对胰腺癌组织以及与其临近的正常组织中的p18和p27启动子的甲基化水平进行测定。和预计中的结果类似，胰腺癌组织中的p18和p27启动子的甲基化水平显著上调(图4B所示)，这和图4A中的两种基因的表达水平下降一致。接着，在MIAPaCa-2细胞中对依赖于Menin过表达的甲基化水平进行测定。如图4C所示，由于Menin过表达，p18和p27启动子的甲基化水平显著下降，导致了图3B中的p18和p27的转录激活。并且，Menin过表达的MIAPaCa-2细胞甲基化状态的改变也被图4D中的DIP分析结果证实。因此，Menin能够通过抑制p18以及p27基因启动子的DNA甲基化来促进p18以及p27的转录激活。
Menin和Dnmt1相互作用来减弱Dnmt1富集以及随后的p18以及p27基因启动子的DNA甲基化状态
Menin和染色质重塑因子如HMT和HDAC结合调控目标基因的转录。假设Menin和DNA甲基转移酶结合去调控p18以及p27基因启动子的DNA甲基化状态。尽管已有报道说明在胰腺癌前期以及胰腺导管癌中，Dnmt1表达水平增加，但Dnmt1在胰腺癌中的作用尚未阐明。
检测胰腺癌组织以及与其临近的正常组织中的Dnmt1的转录水平。如图5A所示，相对于正常组织，Dnmt1在胰腺癌组织中过表达。接着，通过有效损耗ASPC-1细胞中的Dnmt1来测定Dnmt1的作用(图5B)，如图5C所示，Dnmt1表达受抑制导致了ASPC-1的细胞生长受抑制，这个menin过表达的结果相类似。同时，如图5D所示，在Dnmt1受抑制的细胞中，p18以及p27的表达也显著下调。
以上结果表明，Dnmt1受抑制将减缓p18以及p27的转录受抑制的程度。为了进一步确认，发明人采用一种名称为5-Aza-dC的Dnmt1抑制因子强制抑制ASPC-1细胞启动子的甲基化，如图5E所示，发现p18和p27被5-Aza-dC强烈诱导，并和其剂量呈正相关。图5F为免疫共沉淀的结果，如图5F所示，Dnmt1和menin之间显示了一种明显的相互作用，这种作用也被ASPC-1细胞证实在细胞内也存在，结果如图5G所示。
图5H显示了ChIP的分析结果，目的是为了确定menin是否能够减弱Dnmt1在目标基因p18/p27启动子上的富集，以MIAPaCa-2细胞中的抗Dnmt1抗体进行检测。结果显示，Dnmt1在目标基因p18/p27启动子上的富集明显下降，而Dnmt1和对照组GAPDH启动子的结合活性并未出现明显变化。
以上数据证明了Menin通过和Dnmt1竞争性结合来降低p18/p27启动子的DNA甲基化水平。
Menin和Dnmt1相互作用在Hedgehog信号路径下游扮演的角色
如图6A所示，和图3中的微阵列的分析结果一致，由于menin过表达，Gli1和Gas1的表达被明显抑制。为了确定Dnmt1-menin复合是否受Hedgehog信号路径调控，发明人利用10μmol/L环巴胺去阻塞Hedgehog信号。如图6B所示，在用环巴胺作用MIAPaCa-2细胞48小时后，Gli1和Dnmt1表达下降，而Menin的表达水平却显著上调。该结果也被图6C所示的western blot的分析结果所证实。相反，当MIAPaCa-2细胞被Hedgehog激动剂SAG作用激活Hedgehog信号时，如图6D所示，Gli1和Dnmt1的表达被显著引导而Menin的表达被抑制。
Dnmt1能够和肺腺癌基因的menin因子的中心结合，发明人假定，当Hedgehog信号路径取决于Dnmt1表达上调时，menin或许不会被激活。为了证实这一假设，将激动剂SAG作用于Dnmt1shRNA2表达细胞48小时，如图6E所示，由于Dnmt1受抑制，menin表达受抑制的现象减弱，说明menin在Hedgehog信号路径下游的表达是否受抑制取决于Dnmt1是否被激活。
由于menin是Hedgehog信号的负相关因子，其过表达可以中和Hedgehog信号对胰腺癌细胞生长所起的作用。因此，当对照或menin过表达的MIAPaCa-2细胞分别被SAG处理24、48及72小时后，如图6F所示，尽管Hedgehog信号被SAG激活可强烈促进胰腺癌细胞的生长，但SAG的这种促进作用会被menin的过表达明显隐藏。换句话说，menin过表达能够绕过Hedgehog信号去抑制胰腺癌细胞的生长。在menin过表达的细胞中，SAG对p27和p18表达的抑制作用也被减小。但p27和p18在menin过表达的细胞中的表达水平比对照组高，不管细胞是否被SAG处理过。有意思的是，Dnmt1的表达水平不受menin过表达的影响，结果见图6G。
综上，menin过表达和Dnmt1竞争性相互作用去减弱p27和p18启动子的甲基化水平，随后导致p27和p18的转录激活进而抑制胰腺癌细胞生长。
实施例作用与效果
本实施例对menin因子过表达抑制胰腺癌细胞生长的机理进行了阐述，menin因子一方面通过上调基因p18、p27、HOXA9、HDAC5以及CBX4的表达以及抑制下调基因CDK2、CDK4、ESM1、IGFBP7、GAS1的表达来抑制胰腺癌细胞的生长；另一方面Menin通过和Dnmt1竞争性结合来降低p18/p27启动子的DNA甲基化水平，来促进p18/p27基因的转录来抑制胰腺癌细胞的生长，为胰腺癌的治疗提出了一种新的途径。

Claims (7)

1.一种Menin因子的应用，其特征在于：
所述Menin因子在制备诊断胰腺导管腺癌的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的Menin因子的应用，其特征在于：
其中，所述诊断胰腺导管腺癌的产品为用荧光定量PCR或免疫沉淀反应来诊断胰腺癌的产品。
3.根据权利要求2所述的Menin因子的应用，其特征在于：
其中，所述用荧光定量PCR诊断胰腺导管腺癌的产品中至少包含一对特异扩增Menin基因的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求2所述的Menin因子的应用，其特征在于：
其中，所述用免疫沉淀反应诊断胰腺导管腺癌的产品中至少包含与Menin蛋白特异性结合的抗体。
5.根据权利要求4所述的Menin因子的应用，其特征在于：
其中，所述抗体为抗DNA甲基转移酶1抗体。
6.一种Menin因子的应用，其特征在于：
所述Menin因子在制备治疗胰腺导管腺癌的药物或试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的Menin因子的应用，其特征在于：
其中，所述药物或试剂中包含促进所述Menin因子过表达的物质。
CN201510672222.2A 2015-10-16 2015-10-16 Menin因子的应用 Active CN105219859B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510672222.2A CN105219859B (zh) 2015-10-16 2015-10-16 Menin因子的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510672222.2A CN105219859B (zh) 2015-10-16 2015-10-16 Menin因子的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105219859A CN105219859A (zh) 2016-01-06
CN105219859B true CN105219859B (zh) 2019-10-25

Family

ID=54989125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510672222.2A Active CN105219859B (zh) 2015-10-16 2015-10-16 Menin因子的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105219859B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012094401A2 (en) * 2011-01-04 2012-07-12 The Johns Hopkins University Genes frequently altered in pancreatic neuroendocrine tumors
CN103251958A (zh) * 2013-01-22 2013-08-21 上海市内分泌代谢病研究所 Men1基因及其编码蛋白的应用
CN104694572A (zh) * 2015-03-31 2015-06-10 山东农业大学 一种可在真核细胞高效表达牛menin的表达载体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012094401A2 (en) * 2011-01-04 2012-07-12 The Johns Hopkins University Genes frequently altered in pancreatic neuroendocrine tumors
CN103251958A (zh) * 2013-01-22 2013-08-21 上海市内分泌代谢病研究所 Men1基因及其编码蛋白的应用
CN104694572A (zh) * 2015-03-31 2015-06-10 山东农业大学 一种可在真核细胞高效表达牛menin的表达载体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Interplay between Menin and K-Ras in Regulating Lung Adenocarcinoma;Yuan Wu et al;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20121116;第287卷(第47期);摘要、第40010左栏 *
胰腺内分泌肿瘤;王春友;《中国实用外科杂志》;20100930;第30卷(第9期);第736-739页 *
表观遗传学与肿瘤干细胞;许力凡等;《遗传》;20130930;第35卷(第9期);第1049-1057页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105219859A (zh) 2016-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. N6-methyladenosine ALKBH5 promotes non-small cell lung cancer progress by regulating TIMP3 stability
Marwitz et al. Downregulation of the TGFβ pseudoreceptor BAMBI in non–small cell lung cancer enhances TGFβ signaling and invasion
Wong et al. Identification of pyruvate kinase type M2 as potential oncoprotein in squamous cell carcinoma of tongue through microRNA profiling
Fu et al. cAMP-response element-binding protein mediates acid-induced NADPH oxidase NOX5-S expression in Barrett esophageal adenocarcinoma cells
CN107805663B (zh) Lnc03729基因作为生物标志物在肺腺癌预诊断试剂中的应用
CN109468382B (zh) lncRNA在肺腺癌诊疗中的应用
CN108531596B (zh) 一种lncRNA作为生物标志物在胃癌诊治中的应用
WO2012108843A1 (en) Treating cancer by inhibiting expression of olfm4, sp5, tobi, arjdia, fbni or hat1
CN107326071A (zh) Plpp4作为非小细胞肺癌诊断、治疗、预后靶点的应用
US20140045924A1 (en) Melanoma treatments
Zheng et al. NUDT21 knockdown inhibits proliferation and promotes apoptosis of pancreatic ductal adenocarcinoma through EIF2 signaling
CN107164554B (zh) Asprv1作为生物标志物在喉鳞癌诊疗中的应用
Wang et al. Knockdown of long non‐coding RNA small nucleolar RNA host gene 9 or hexokinase 2 both suppress endometrial cancer cell proliferation and glycolysis
Jia et al. SNHG1/miR-194-5p/MTFR1 axis promotes TGFβ1-induced EMT, migration and invasion of tongue squamous cell carcinoma cells
CN105219859B (zh) Menin因子的应用
WO2021114137A1 (zh) 长非编码rna letn作为肿瘤标志物及治疗靶点
JP2022522660A (ja) Ｔｕｔ４／７発現調節因子を含む癌予防又は治療用薬学的組成物
KR102008997B1 (ko) 마이크로rna를 포함하는 간질환 진단용 조성물
US8664191B2 (en) Use of two microRNA moleculars in lung cancer prognosis and medicine preparation
CN110042164B (zh) 肺癌诊疗用lncRNA标志物
Ding et al. MicroRNA-378 promotes the malignant progression of oral squamous cell carcinoma by mediating FOXN3.
CN113995768A (zh) 寡核苷酸在抑制新冠病毒所致的多组织器官细胞损伤中的应用
CN108130374B (zh) 肾癌的诊断产品以及治疗药物组合物
Shi et al. Long intergenic non‐coding RNA 00337 confers progression of esophageal cancer by mediating microrna‐145‐dependent fscn1
Chen et al. PRKD3 promotes malignant progression of OSCC by downregulating KLF16 expression.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant