CN105219788B - 苏云金芽胞杆菌ybt1520中的杀线虫蛋白nel的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物技术领域。具体涉及苏云金芽胞杆菌YBT1520中的杀线虫蛋白NEL的应用本发明的杀虫蛋白NEL是从苏云金芽胞杆菌YBT1520菌株基因组DNA中克隆得到，该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。从苏云金芽胞杆菌YBT1520基因芯片信息搜寻，发现杀虫蛋白NEL能够毒杀根结线虫，本发明具体公开了该杀虫蛋白基因NEL的克隆、异源表达及对根结线虫的生物测定方法该蛋白可用于微生物农药的制备和开发以及转基因植物的应用。

Description

苏云金芽胞杆菌YBT1520中的杀线虫蛋白NEL的应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域。具体涉及一种苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)YBT1520的杀线虫蛋白基因的克隆、异源表达及对根结线虫的生物测定，本发明的蛋白可用于微生物农药的制备和开发以及转基因植物的应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一类广泛存在于土壤中的革兰氏阳性细菌，它的一个显著特点就是能够在芽胞期产生对昆虫具有特异毒杀作用的晶体蛋白(Insecticidal crystal Proteins，ICPs)。近年来，苏云金芽胞杆菌毒杀线虫的能力被人们广泛关注。目前，Cry5,Cry6,Cry13,Cry14,Cry21和Cry55类晶体蛋白被报道对线虫具有活性，芽胞杆菌中的几丁质酶，金属蛋白酶也被报道有线虫毒杀活性。

植物寄生线虫病是一种世界范围内普遍发生的由植物寄生线虫所引起的植物病害。据估计，植物寄生线虫造成全球主要农作物的年损失率约为12.3％，每年直接经济损失超过1000亿美元，在整个农业害虫造成的损失里几乎占到了一半，是排在全球气候变化和生态环境恶化之后的第三大农业影响因素(段玉玺,吴刚.植物线虫病害防治.北京:中国农业科技出版社.2002.)。根结线虫是植物寄生线虫中的一种，是植物根系定居性内寄生生物，是我国经济作物的重要病原线虫，其寄主植物超过3000种，分属于114科，其中以茄科、葫芦科、十字花科等植物受害尤为严重(汪来发等.根结线虫生物防治研究进展.南京林业大学学报(自然科学版),2002,26(1):64-68.)。目前用于防治根基线虫的方法有：植物检疫、农业防治、化学防治、生物防治。植物检疫是一种可以根治线虫的好方法，但其成本高，不适宜大规模推广；农业防治技术在理论上来说非常有效，但是在实际生产中存在严重的弊端；化学杀虫剂对环境污染严重，使用过程中对人畜不安全，许多杀虫剂已被禁用(刘维志,植物病原线虫学,北京:中国农业出版社,2000)。而与以上方法相比，生物防治由于具有稳定、经济、长效和相对安全的特点，同时还能除害增产、减轻污染、保护生态环境，逐渐受到广泛关注。上世纪80年代Bone等人通过研究首次证实了苏云金芽胞杆菌晶体蛋白对线虫有杀虫活性(Bone L W,Bottjer K P，Gill S S.Trichostrongylus colubriformis:Egglethality due to Bacillus thuringiensis crystal toxin.Exp.Parasitol.,1985,60:314-322.)。之后，美国Mycogen公司的大量研究工作也进一步证实了苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对线虫的作用(Bradfish G A(1992).Process for controlling lepidopteranpests.EP19920920639.)。

苏云金芽胞杆菌YBT1520是由申请人所在的农业微生物学国家重点实验室保存的野生型菌株。NEL是在YBT-1520的基因芯片结果中发现的，存在于YBT-1520某质粒上，具有NPP1和RicinB结构域的新型杀虫蛋白。近年来，在植物病原菌中发现一类能引起植物细胞死亡的蛋白家族，这类蛋白都含有一个保守结构域NPP1(necrosis-inducingPhytophthora protein)，它们被统称为NLPs(Nep1-like proteins)。很多NLPs的一个共同的功能特征是触发很多双子叶植物产生防御反应、坏疽、萎蔫和细胞坏死，但是单子叶植物对其不敏感(Mark Gijzen,Thorsten Nürnberger.NEL-like proteins from plantpathogens:Recruitment and diversification of the NPP1domain acrosstaxa.Phytochemistry,2006,67:1800-1807.)。Ricin是一种分子量为65kd的由三条寡糖链糖构成的蛋白，主要结构是由两条肽链(A/B链)组成的异二聚体(戎隆富，王新建等.蓖麻毒素研究进展，安徽预防医学杂志，1999，5(2).)。Ricin具非常强的毒力和细胞毒性作用。Ricin B链上的半乳糖结合位点与细胞表面含末端半乳糖残基的受体结合；使整个毒素分子以内吞方式进入细胞；形成囊泡；毒素通过囊泡进入细胞质；随后蛋白链间二硫键被裂解；游离出A链。A链是一种蛋白酶；作用于真核细胞核糖体60S大亚单位的28S rRNA；水解A4324位点的腺嘌呤N-糖苷键；使其脱去腺嘌呤；丧失抗RNA酶的抗性而被降解；不能与延长因子(EF-2)结合，从而抑制蛋白质合成；最终导致细胞死亡。

发明内容

本发明的目的在于从野生型苏云金芽胞杆菌YBT1520中克隆并表达了一个新型的杀线虫晶体蛋白基因nel，生物测定实验表明该蛋白对线虫具有高毒力，预示着该基因在防治根结线虫杀虫制剂及转基因抗虫作物等研究领域有着良好的应用前景。

具体地本发明涉及一种苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT1520的杀线虫蛋白基因的克隆、异源表达及对根结线虫的生物测定，本发明的蛋白可用于微生物农药的制备和开发以及转基因植物的应用。

实现本发明的技术方案如下所述：

申请人从野生型苏云金芽胞杆菌YBT1520的基因组信息中分析并克隆到一个新的杀虫晶体蛋白基因nel(详细信息请参见《具体实施方式》)。经过进一步测序发现本发明的nel其编码区由1554个碱基组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。经序列分析发现，nel编码的蛋白NEL由518个氨基酸组成，其蛋白质的序列如SEQ ID NO:2所示，预测分子大小为52kDa。通过构建大肠杆菌重组菌纯化NEL蛋白及生物测定实验证明NEL蛋白对根结线虫具有毒杀作用。

申请人将获得的包含有杀虫晶体蛋白基因nel重组的大肠杆菌命名为Escherichia coli BL(pET28a-nel)，于2014年7月7日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2014326。

本发明提供的上述基因序列是一种新的杀线虫蛋白基因，该基因在防治根结线虫杀虫制剂及转基因抗虫作物等研究领域具有广泛的应用价值。

更详细的实施方案参见实施例中的描述。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质的序列。

序列表SEQ ID NO:2是本发明分离克隆的苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白的蛋白质的序列。

图1：是本发明实施例中杀虫蛋白基因nel的技术流程。

图2：是本发明实施例中克隆载体pET28a-nel的构建图及其物理图谱。

图3：是本发明实施例中克隆载体pET28a-nel的DNA凝胶电泳图。

图4：是本发明实施例中杀线虫蛋白NEL在重组菌中表达纯化的SDS-PAGE电泳分析结果，图中：箭头1所指是纯化后的NEL蛋白，箭头2所指是纯化前的NEL。

图5：是本发明实施例中杀线虫蛋白NEL针对根结线虫的生物测定结果图。

具体实施方式

以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，没有限制作用。有关实施例中所提到的DNA的标准操作方法和所使用的试剂均可参见《分子克隆实验指南》中所描述的方法(参见萨姆布鲁克和拉塞尔，2001，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本发明中所涉及的其他各项实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日前的各种常用工具书、科技文献或相关说明书、手册等加以实施。

实施例1苏云金芽胞杆菌YBT1520中杀虫晶体蛋白基因nel的克隆

本发明以野生型苏云金芽胞杆菌YBT1520(该野生型苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)1520的专利号为ZL95106749.4)作为杀线虫蛋白基因nel的来源菌株。

(1)苏云金芽胞杆菌YBT1520总DNA的抽提

采用常用的碱裂解法小量提取。其步骤如下：

将野生型苏云金芽胞杆菌YBT1520于28℃摇床中进行过夜活化，按1/100(v/v)的接种量转接至7mL新鲜的LB液体培养基中，于28℃以12000r/min震荡培养至对数生长中期；将培养好的YBT1520菌液分装至1.5mL离心管内，收集菌体(12000r/min，1min)，并用STE溶液(10mM Tris·HCl[pH8.0]，1mM EDTA[pH8.0]，100mM NaCl)洗涤1次；将上述菌体悬于100μL溶液Ⅰ(50mM蔗糖，25mM Tris·HCl[pH8.0]，10mM EDTA[pH8.0])，加入20μL溶菌酶(50mg/mL)混匀，冰上静置2～3h或过夜；加200μL 2％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，轻缓混匀后于55℃干浴锅处理30min；加100μL 5M NaCl溶液，轻缓混匀后至于冰上，静置10min；以12000r/min离心5min，吸取上清液至一个新的离心管中，分别加入RNase和蛋白酶K至终浓度10μg/mL和10μg/mL，混合均匀后至于37℃水浴锅温浴30min；用苯酚/氯仿/异戊醇溶液(体积比为24:25:1，v/v/v)抽提2次；吸取上清，并加入2倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，于室温静置30min或-20℃静置2h后，以12000r/min 4℃离心5min，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀1次；常温干燥沉淀，用20～30μL TE溶液(10mM Tris·HCl[pH8.0]，1mM EDTA[pH8.0])溶解沉淀，即为制备的总DNA样品。

(2)苏云金芽胞杆菌YBT1520中杀虫蛋白基因nel的克隆

根据苏云金芽胞杆菌YBT1520基因组信息及生物信息学预测结果设计一对特异性引物，该引物对的DNA序列如下所示：

GCGGAATTCATGAAATTAATATCAAAAATAGT/ATAAAGCTTATAAGCACCGCCATCTTCC，以苏云金芽胞杆菌YBT1520总DNA为模板进行PCR扩增以获得目标基因，PCR反应的体系和程序如下：

20μL反应体系包括：2μL 10×PCR反应缓冲液，1.6μL dNTP，各0.5μL特异性引物，0.2μL模板，0.2μL Ex-taq酶，加去离子水补充至20μL。

PCR反应程序和参数为：94℃，5min，1个循环；94℃，30s，52℃，30s，72℃，3.5min，30个循环；72℃，10min，1个循环；24℃，5min，1个循环。

将上述扩增得到的目标片段通过PCR回收试剂盒(购自Omega公司产品)纯化回收后，酶切回收后连接到载体pET28a上，即得到含有杀虫蛋白基因nel的重组载体pET28a-nel(见图2)。将上述连接产物转化大肠杆菌BL21，对得到的重组子进行抽质粒及酶切验证，将验证正确的重组子送样测序(测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成)。测序结果显示上述扩增得到的目标片段含有如序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列，申请人将该基因命名为nel(在本发明中，被命名的基因以斜体小写字母表示)。通过生物学软件分析发现，该基因可编码一段如序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列和对应的氨基酸序列，预测其分子量为52kDa，申请人将其命名为NEL(本发明中，被命名的蛋白以正体大写字母表示)。

实施例2杀线虫蛋白基因nel在重组菌株E.coil BL(pET28a-nel)中的表达纯化及生物活性测定

(1)杀线虫蛋白NEL的表达及纯化

37℃过夜活化E.coil BL(pET28a-nel)菌株，按1/100的接种量转接至新鲜的LB培养液中，于37℃以220r/min振荡培养到对数生长中期,按1/1000的量加入0.1M IPTG，于16℃以200r/min振荡诱导5小时,在12000r/min，1min，4℃离心收集菌体，加6-10ml Bindingbuffer洗涤菌体2次，适当体积Binding Buffer重悬，准备高压破碎(以下操作均在冰上进行)；高压破碎4-5次后，用1.5ml的EP管取样1ml离心，4℃,12000r/min，30min离心收集上清；将收集的上清用0.45um的微孔滤膜过滤；将膜放入柱底，加适当体积水，用枪从膜上部吸取气泡，待气泡不再产生，再吸走膜底部的气泡，以免气泡影响流速，然后加入适当His-Tag填料，待乙醇流出，用5倍体积的去离子水洗涤凝胶树脂，再用8倍体积床体积的Bindingbuffer平衡树脂，平衡结束后即可上样；将含蛋白的上清加入Ni柱中，冰上孵育30min,放出流穿峰，Washing Buffer洗柱4-5次，每次5倍体积，洗去杂带；Elution Buffer洗脱蛋白，收集洗脱峰，每管1ml；Binding Buffer洗柱2-3次，ddH2O洗2-3次，最后将柱子存放在2-3倍体积的20％乙醇中，4℃。由于纯化后的蛋白含高浓度咪唑，所以需将咪唑稀释成低浓度，以免影响后面NEL作用于根结线虫的生测结果。将纯化收集的洗脱峰加入30KD大小的超滤管中，用适当体积的磷酸盐缓冲液洗涤，4℃,4500r/min,20min离心，多次洗涤离心直至超滤管中剩余上清1.5ml左右，加入1ml PBS洗脱超滤管壁上的蛋白，收集蛋白溶液，每管100ul分装。值得注意的是，由于NEL极易降解，故所有操作必须在冰上进行，且纯化和浓缩尽量在一天内完成。

(2)杀线虫蛋白NEL对南方根结线虫生物活性的测定

以南方根结线虫的二龄幼虫作为靶标生物检测杀虫蛋白NEL对线虫的生物活性。取被南方根结线虫感染过的番茄根，将番茄根用自来水轻轻冲洗干净，从根部将南方根结线虫卵块剥离出来，用0.5％NaClO对卵块消毒2次，并用去离子水洗涤3次，然后置于25℃培养箱中孵化3-5天，孵化出的南方根结线虫即可作为生物测定的靶标。生物测定实验是在96孔板中进行，每孔中加入40-50头线虫，生测体系为100μL(具体方法参见：余子全等，苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫生物测定方法的建立和高毒力菌株的筛选，农业生物技术学报，2007(15)：867-871)。整个实验设5个浓度梯度，每个浓度设3个重复，用去离子水作为阴性对照。5天后统计死亡率，将死亡率校正后换算成几率值，结果显示本发明的杀线虫晶体蛋白NEL蛋白对根结线虫的LC50为0.498μg/μl。具体结果见表1。

表1 NEL蛋白以南方根结线虫为靶标的生物测定

以上试验结果说明本发明的蛋白NEL对南方根结线虫具有高毒力，该蛋白为防治根结线虫提供了一种新的资源。

Claims (3)

1.一种杀南方根结线虫晶体蛋白在制备防治南方根结线虫杀虫剂中的应用，编码该蛋白的基因是分离自苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)YBT1520的杀南方根结线虫蛋白基因NEL，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.保藏编号为CCTCC NO：M2014326的大肠杆菌在防治南方根结线虫中的应用。

3.保藏编号为CCTCC NO：M2014326的大肠杆菌在制备防治南方根结线虫的杀虫剂中的应用。