CN103125516A - 对南方根结线虫具有杀虫增效作用的蛋白组合物Cry6A/Cry55A及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于杀虫微生物技术领域。公开了一组对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)具有杀虫增效作用的杀线虫晶体蛋白组合物。该组合物是将来自苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀线虫晶体蛋白Cry6A和Cry55A按照不同比例进行组合，该蛋白组合物在Cry6A和Cry55A的质量比1∶5-5∶1的范围内均对南方根结线虫具有显著的杀虫增效作用。当Cry6A和Cry55A的质量比为1∶1时，对南方根结线虫表现出最高的杀虫增效效果。本发明公开的蛋白组合物在农业生产中植物根结线虫的生物防治方面具有很大的应用潜力。

Description

对南方根结线虫具有杀虫增效作用的蛋白组合物Cry6A/Cry55A及应用

技术领域

本发明涉及一组来自于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白组合物，它们对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)具有明显的杀虫增效作用，可用于防治对农业生产危害巨大的南方根结线虫。

背景技术

植物病原线虫是一类重要的病原生物，其中许多种是国际公认的毁灭性有害生物。据估计，植物病原线虫造成全球主要农作物的年损失率约为12.3％，每年直接经济损失超过1000亿美元，在整个农业害虫造成的损失里几乎占到了一半(Chitwood，2003)。其中危害最大了又为植物根结线虫和包囊线虫，而根结线虫中危害最大的有南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)和爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)(Li et al.，2008)。

植物根结线虫主要生活在土壤中或寄生于植物体内，危害隐蔽，防治比较困难。目前应用于植物根结线虫防治的方法主要有化学防治、物理防治，生物防治等。化学防治所使用的化学农药多属于高度农药，对植物本身以及非靶标生物也有危害，而且不利于土壤活化、天敌繁衍和环境保护(陈品三，2001)。物理和栽培方法主要是指通过轮种、休闲、旱季耕翻、覆盖和利用抗病和耐病品种等措施来避免线虫的危害。但是由于现代农业中，土地资源有限，耕种指数高，以及受地域气候条件的限制，这种方法的作用也非常有限。生物防治指利用线虫天敌、微生物和高等植物产生的杀虫蛋白或拮抗性代谢物、以及基因工程手段培育抗性作物等来防治植物线虫。通过生物防治的手段来防止植物病原线虫体现出了巨大的优势和应用前景，将对保护环境，有效实现农产品的优质安全生产，扩大我国农副产品外销市场，推进绿色农业的发展，促进农村农村经济繁荣等起到重要的作用。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种在土壤等自然环境中广泛存在的革兰氏阳性细菌，其在芽胞形成过程中可产生具有杀虫活性的蛋白类伴胞晶体(Cry蛋白)。苏云金芽胞杆菌是目前世界上应用最广泛的生物杀虫剂，占整个生物农药产业90％以上的市场。其杀虫基因也广泛应用于转基因植物，在抗虫植物的培育中发挥了重要作用。部分苏云金芽胞杆菌菌株对植物病原线虫具有较高的毒杀活性。苏云金芽胞杆菌对植物病原线虫的作用最早报道于上世纪70年代。1972年Prasad等首先发现Bt β-外毒素对根结线虫的卵和幼虫有较高的毒杀活性。20世纪80年代中期Bone等发现Bt以色列亚种(subsp.israelensis及库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)的晶体蛋白对动物寄生线虫蛇形毛圆线虫(Trichostronglus colubr和rmis)的幼虫和卵有很高的毒力，其中以色列亚种的毒素蛋白还可杀死奥斯特线虫(Ostertagia ostertagi)、捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)等动物寄生线虫虫卵，从而首次证实了Bt伴胞晶体蛋白对线虫具有杀虫活性(Bone et al.，1985；1986；1987)。随着研究的不断深入，Bt防治植物病原线虫的效果不断得到肯定。美国Mycogen公司筛选到多株对植物病原线虫有活性的Bt，并申请了多项专利。1988年，Mycogen公司从Bt中克隆到杀线虫基因cry5和cry6，并将克隆到的基因转入了植物，发现对植物病原线虫均有很强的抑制作用，但该公司对cry5和cry6的核酸序列未作公开报道(Bone et al.，1988)。

本申请人的课题组从上世纪90年代开始，从全国各地采集到的1500多株Bt中初步筛选到9株对植物病原线虫有较高毒力的菌株，它们对北方根结线虫(M. hapla)、苎麻短体线虫(P.scribneri)和甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)有很高毒力的菌株，其中YBT-1532菌株及其杀虫蛋白已获得中国发明专利(ZL 00116062.1；余子全等，2007a)。之后，申请人从YBT-1532菌株中克隆到了一个抗线虫基因cry1Ea6(登录号Acc.NO.AF202531)。生物测定表明其表达产物对北方根结线虫LC50为18.44μg/ml。2002年，申请人从YBT-1518菌株中克隆到对线虫有毒的蛋白基因cry6Aa2(登录号Acc.NO.AF499736)，该基因在Bt无晶体突变株BMB171中获得高效表达，生物测定表明表达的晶体蛋白对北方根结线虫(M. hapla)具有高毒力，其LC50为9.47μg/ml(余子全等，2007b)。之后，申请人又先后克隆到了新型杀线虫晶体蛋白基因cry51Aa和cry5Ba2，生物测定表明它们表达的蛋白Cry51Aa1和Cry5Ba2对北方根结线虫(M.hapla)具有显著的毒杀作用，其LC₅₀分别为23.2μg/ml和18.1μg/ml(Guo et al.，2008)。

到目前为止，世界上发现的Bt中对线虫有毒性的基因主要有cry1，cry5，cry6，cry12，cry13，cry14，cry21等几大类。根据它们的序列同源性可分别属于两个亚家族(Subfamily)，cry1、cry12、cry13、cry14、xry21与cry5亲缘关系较近，蛋白质结构上与其它的杀虫晶体蛋白相似，归为cry5亚家族。cry6与其它cry类基因亲缘关系较远，蛋白质结构上与其它的杀虫晶体蛋白差异较大，单独作为cry6亚家族(图1-2)，推测二者的杀虫活性位点可能不同(Wei et al.，2003)。

使用两种或多种不同类型的杀虫蛋白进行复配，找到具有杀虫增效效果的蛋白组合，一方面可以显著提高了实际防治效果，降低使用量；另一方面还可以延缓靶标线虫抗药性的产生。Avital等(1996)测定了晶体蛋白Cry1C和几丁质酶(Chitinase)对棉贪夜蛾(Spodopteralittoralis)杀虫活性，实验结果展示二者对棉贪夜蛾存在协同增效作用。Margaret等(2001)研究了Cyt1Ab1和Cyt2Ba1针对登革热蚊子(Aedes aegypti)和热带家蚊(Culex quinquefasciatus)的活性，该研究为解决目标生物抗性问题和改善杀虫活性提供新的策略。蔡启良等(2003)实验结果，表明杀虫蛋白Vip83与Cry1Ac10和Vip83与Cry1Ca之间对棉铃虫均存在拮抗作用，对甜菜夜蛾(Spodotera exigua)协同增效作用不明显；但蛋白Vip83与Cry1Ac10对小菜蛾(Plutelaxylostella)协同作用不明显，而Vip83与Cry1Ca对小菜蛾存在协同增效作用。Vadim等(2003)测定了蛋白P20和Cyt1Aa与Cry4Aa和Cry11Aa不同组合针对四龄登革热蚊子毒性，实验数据显示蛋白P20和Cyt1Aa对Cry4Aa或Cry11Aa都存在协同增效作用。Xue等(2005)测定了杀虫蛋白Cry1Aa和Cry1c甜菜夜蛾毒效，实验结果显示二者在1∶1比例时与单独时的毒力比较有很大提高。Pérez等(2005，2007)深入研究了Cyt1Aa和Cry11Aa增效的机理，Cyt1Aa作为Cry11Aa在目标生物体内的另一受体发挥协同增效作用。

现有研究已经证明苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry6A，Cry5B和Cry55Aa对北方根结线虫(M.hapla)具有毒杀活性。但是，目前还没有关于这些杀虫晶体蛋白对南方根结线虫(M.incognita)活性的报道，尤其是该3种杀线虫蛋白之间的复配对南方根结线虫(M.incognita)的防治方面的研究还未见任何的报道。目前世界上报道的杀线虫Cry蛋白还很少，发现新的杀线虫蛋白和探索多种杀线虫蛋白的增效组合方式在防治植物寄生线虫领域将具有重大的意义，是农业生产中进行可持续防治植物寄生线虫的重要手段。

发明内容

本发明的目的一方面是为了探索Cry6A，Cry5B和Cry55Aa在南方根结线虫(M.incognita)防治方面的潜力；另一方面是为了寻找有效的蛋白组合以提高现有杀线虫晶体蛋白的活性，延缓靶标线虫对杀线虫晶体蛋白抗性的产生，为在农业生产上对植物寄生线虫的可持续防治提供新的策略。为此，本发明提供了1种来自苏云金芽胞杆菌的蛋白组合物Cry6A/Cry55A，该蛋白组合物对南方根结线虫存在杀虫增效作用，联合使用时比单独使用时防治效果有显著的提高，可以实现高效防治南方根结线虫的目的。

本发明提供了该组合物中活性蛋白的有效组合比例：按质量比，蛋白Cry6A：蛋白Cry55A为1∶5-5∶1制备。在该范围内对南方根结线虫均表现出显著的杀虫增效效果，且其最佳效果的质量比为1∶1，杀虫增效倍数为5.0。

在本发明的实施例部分，申请人详细描述了该该组合物中活性蛋白的制备方法及其作为杀南方根结线虫具有虫增效作用的蛋白组合物的具体配制方法，以及生物测定方法和效果评估。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry5B的蛋白质的序列。

序列表SEQ ID NO：2是苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry6A的蛋白质的序列。

序列表SEQ ID NO：3是苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry55Aa的蛋白质的序列。

图1：是苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry5Ba，Cry6Aa和Cry55Aa纯化后的SDS-PAGE检测。图中：

M，蛋白质分子量标准；

泳道1：重组菌BMB0215中晶体蛋白Cry5Ba的纯化后的蛋白条带；

泳道2：重组菌BMB0250中晶体蛋白Cry6Aa的纯化后的蛋白条带；

泳道3：重组菌BMB0224中晶体蛋白Cry55Aa的纯化后的蛋白条带。

图2：是是苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry5B的氨基酸序列。

图3：是是苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry6A的氨基酸序列。

图4：是苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry55Aa的氨基酸序列。

具体实施方式

以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。

在实施例中，有关上述苏云金芽胞杆菌晶体Cry5Ba，Cry6Aa和Cry55Aa蛋白质的标准操作方法和所使用的药品均参考萨姆布鲁克和拉塞尔著，《分子克隆实验指南》，第二版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京，2001手册所描述的方法。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

实施例1：晶体蛋白Cry5B、Cry6A和Cry55A对南方根结线虫具有高活性

1.晶体蛋白Cry5B、Cry6A和Cry55A的纯化和定量分析

苏云金芽胞菌株BMB0250、BMB0215和BMB0224(上述三菌株见文献：Suxia Guo，MeiLiu，Donghai Peng，Sisi Ji，Pengxia Wang，Ziniu Yu，and Ming Sun.New Strategy for IsolatingNovel Nematicidal Crystal Protein Genes from Bacillus thuringiensis Strain YBT-1518.Appliedand Environmental Microbiology，2008，6997-700.)是发明人所在课题组前期研究中构建的能够分别表达晶体蛋白Cry6Aa(长米粒状晶体，54KDa)、Cry5Ba(菱形晶体，140KDa)和Cry55Aa(长米粒状晶体，45KDa)的重组菌(Guo et al.，2008)。为了进行后续的生物测定和复配活性研究，申请人以BMB0250(即Cry6Aa的重组菌(Guo et al.，2008))、BMB0215(即Cry5Ba的重组菌，(Guo et al.，2008))和BMB0224(即Cry5Ba的重组菌，(Guo et al.，2008))为出发菌株，参照Griffitts等报道的用酸溶的方法，对Cry5B、Cry6A和Cry55A进行了蛋白的纯化(Griffittset al，2001)。

晶体蛋白纯化的具体步骤为：

1)将苏云金芽胞杆菌BMB0250、BMB0215和BMB0224用ICPM液体(每升培养基含蛋白胨6g，葡萄糖5g，CaCO₃1g，MgSO₄0.5g，KH₂PO₄0.5g，pH 7.0)于28℃培养至芽胞脱落，然后离心收集胞晶混合物；

2)用1M NaCl和去离子水将上述晶胞混合物各洗涤3次，之后加入5mL去离子水悬浮；

3)在上述体系中加入8倍体积的酸溶缓冲液(配方为：8.7mM柠檬酸三钠，43.4mM柠檬酸，10mM二硫苏糖醇即DTT)悬浮，室温下作用2h；

4)离心后将上清移入新的离心管中，加入1/40体积的1M的柠檬酸钾(pH 6.0)，冰上作用15～30min；

5)离心，将部分沉淀溶于5mL～10mL的20mM Hepes(pH 8.0)，即得到纯化好了的晶体蛋白溶液；

6)对纯化好的蛋白溶液的浓度进行了测定SDS-PAGE检测和定量分析后分小管存于-80℃备用。

按照上述步骤，申请人最终得到了纯化的晶体蛋白Cry6Aa、Cry5Ba和Cry55Aa(如图1所示)。之后，参照Bradford报道的方法对纯化好的蛋白溶液的浓度进行了测定(Bradford，1976)，纯化的Cry5Ba，Cry6Aa和Cry55Aa蛋白浓度分别为1.05mg/ml，1.24mg/ml和1.30mg/ml。

2.杀线虫晶体蛋白对南方根结线虫的生物活性测定方法

采集被南方根结线虫(M.incognita)侵染的番茄根，用灭菌的蒸馏水轻洗番茄根，从根部取下根结线虫卵块放于冰上的培皿中，无菌操作台中用1％H₂O₂和0.025％KI消毒2次，每次15min。之后把消毒的卵块转移到另一灭菌的培养皿中，然后用灭菌的蒸馏水洗4-5次，每次5min。最后将分离处理的卵块加入适量的灭菌蒸馏水，于25℃培养箱孵化3～5天。孵化出的2龄根结线虫线虫可用作生物测定的目标生物。

具体的生物测定方法如下：在96孔板上进行毒力的生物测定反应，每孔吸入大约40头2龄南方根结线虫幼虫，加入不同稀释浓度的纯化晶体蛋白，间苯二酚1μg/mL，2.5μg/mL制霉菌素，每孔体积为200μl，用无菌去离子水补足总体积，并设5～7个浓度梯度，每个浓度设3个重复。同时，以20μg/ml牛血清白蛋白(BSA)进行相同的处理作为阴性对照。生物测定反应5d后统计线虫死亡头数，于倒置显微镜下计数，暂时不活动的根结线虫并不一定表示是死亡的根结线虫，检测方法采用1％KMnO₄或甲基蓝染色1-2h来判断南方根结线虫死活(Guo et la.，2008)。然后统计数据，利用统计分析软件SAS 8.0根据概率算法计算出待测蛋白的LC₅₀。

3.晶体蛋白Cry5B、Cry6A和Cry55A对南方根结线虫的生物活性测定

杀线虫晶体蛋白基因cry6Aa、cry5Ba和cry55Aa是华中农业大学农业微生物学国家重点实验室从苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1518中克隆得到的(Suxia Guo，Mei Liu，Donghai Peng，Sisi Ji，Pengxia Wang，Ziniu Yu，and Ming Sun.New Strategy for Isolating Novel NematicidalCrystal Protein Genes from Bacillus thuringiensis Strain YBT-1518.Applied and EnvironmentalMicrobiology，2008，6997-700.)，它们在Genebank上的登录号分别为AF499736，EU121521和EU121522。生物活性测定证实该3种蛋白对北方根结线虫(M.hapla)均具有高毒力(Yu et al.，2008；Guo et al.，2008)。但是到目前为止，晶体蛋白Cry5B、Cry6A和Cry55A对南方根结线虫的活性还未见报道。于是，申请人将纯化后的上述三种晶体蛋白，采用上述生物测定的方法，对南方根结线虫进行了生物活性测定。结果如表1。

表1Cry5Ba、Cry6Aa以及Cry55Aa对南方根结线虫的活性测定

生物测定结果表明，晶体蛋白Cry5Ba、Cry6Aa以及Cry55Aa对南方根结线虫都有高活性，它们对应的LC₅₀分别为138.33μg/ml、376.07μg/ml和108.63μg/ml(见表1)。从该表1中可以看出，单独使用时，晶体蛋白Cry55Aa对南方根结线虫的活性是3种蛋白中活性最高的。

实施例2：晶体蛋白Cry6A，Cry5B和Cry55Aa两两组合不同配比情况下对南方根结线虫的活性测定

1.杀线虫晶体蛋白组合物对南方根结线虫的杀虫增效效果计算方法

采用Tabashnik等(1992)提出的协同系数(SF)计算公式进行杀虫增效效果的评估，具体公式如下：

$\frac{1}{{\mathrm{LC}}_{50\left(m\right)}}=\frac{\mathrm{Ra}}{{\mathrm{LC}}_{50\left(a\right)}}+\frac{R_b}{{\mathrm{LC}}_{50\left(b\right)}}$

其中，Ra和Rb分别表示杀线虫蛋白a和b在混合物所占的比例，LC₅₀(a)和LC₅₀(b)分别是杀线虫蛋白a和b单独生物测定时的半致死浓度。LC₅₀(m)和LC₅₀(理论)是同一个概念，为蛋白组合物计算出来的LC₅₀理论值，是根据毒素a和毒素b按照Ra和Rb配比并按照上述公式理论所得值。

在评估组合物是否具有增效活性是，按照以下原则：当SF＞1时，理论毒素a和b之间存在协同作用；当SF＜1时，理论认为毒素a和b之间存在拮抗作用；而当SF＝1时，理论毒素a和b之间为剂量相加关系。

2.晶体蛋白Cry6A和Cry5B不同配比对南方根结线虫的活性

在蛋白Cry5B和Cry6A不同配比的生物测定中，申请人设置了1∶1、1∶3、3∶1、1∶5、5∶1等5种配比方式，同时设置了单独的Cry5B和Cry6A作为对照。所有蛋白和蛋白组合对2龄南方根结线虫生物测定结果见表2。

生物测定结果显示蛋白Cry5B和Cry6A对2龄南方根结线虫的半致死浓度(LC₅₀)分别是146.05μg/ml和383.42μg/ml，说明Cry5B对2龄南方根结线虫的毒性高于蛋白Cry6A。在不同配比试验中，当蛋白Cry5B和Cry6A质量比从1∶1提高到5∶1时，所有的实验组计算的协同系数均大于1，表明所有配比比例下蛋白组合物都表现出对南方根结线虫的杀虫增效活性。当蛋白Cry5B和Cry6A的质量比为1∶1时，其半致死浓度(LC₅₀)为108.54μg/ml，计算的协同系数达到所有配比的最大值，为1.95。说明当蛋白Cry5B和Cry6A的质量比为1∶1时，蛋白组合物对2龄南方根结线虫的活性最高。

表2Cry6A和Cry5B不同配比对南方根结线虫的活性作用

3.晶体蛋白Cry5Ba和Cry55Aa不同配比对南方根结线虫生物活性测定

在蛋白Cry5Ba和Cry55Aa不同配比的生物测定中，申请人设置了1∶5、1∶1、5∶1配比方式。同时设置了单独的Cry5Ba和Cry55Aa作为对照。所有蛋白和蛋白组合对2龄南方根结线虫生物测定结果见表3：

生物测定结果显示蛋白Cry5Ba和Cry55Aa对2龄南方根结线虫的LC₅₀值分别是148.61μg/ml和102.57μg/ml。蛋白Cry55Aa对2龄南方根结线虫的活性略高于蛋白Cry5Ba的活性。在蛋白Cry5Ba和Cry55Aa不同配比的生物测定中，蛋白Cry5Ba和Cry55Aa配比为1∶1、1∶5和5∶1时的协同系数分别为1.09、1.07和0.96。根据协同系数(SF)判断标准，说明晶体蛋白Cry5Ba和Cry55Aa复配对2龄南方根结线虫的活性作用只是剂量相加的关系，没有杀虫增效效果。

表3晶体蛋白Cry5Ba和Cry55Aa不同配比对南方根结线虫的协同作用

4.晶体蛋白Cry6A和Cry55A不同配比对南方根结线虫的活性

在蛋白Cry6A和Cry55A不同配比的生物测定中，申请人设置了1∶1、1∶2、1∶5、2∶1、5∶1配比方式。同时设置了单独的Cry55A和Cry6A作为对照。所有蛋白和蛋白组合对2龄南方根结线虫生物测定结果见表4：

生物测定结果显示蛋白Cry6A和Cry55A对2龄南方根结线虫的半致死浓度(LC₅₀)分别是370.36μg/ml和102.57μg/ml，说明蛋白Cry55A对2龄南方根结线虫的活性高于蛋白Cry6A。

表4晶体蛋白Cry6A和Cry55A不同配比对南方根结线虫的活性作用

在不同配比试验中，当蛋白Cry55A和Cry6A质量比从1∶1提高到5∶1时，所有的实验组计算的协同系数均大于1，表明所有配比比例下都表现出对南方根结线虫的杀虫增效活性。当蛋白Cry5B和Cry6A的质量比为1∶1时，其半致死浓度(LC₅₀)为160.65μg/ml，计算的协同系数达到所有配比的最大值，为5.0，说明当蛋白Cry55A和Cry6A的质量比为1∶1时，蛋白组合物对2龄南方根结线虫的活性最高。

综合上述结果，比较上述3种蛋白组合方式，申请人发现组合物Cry55A/Cry6A在所有配比中的杀虫增效效果更为明显，尤其是质量比为1∶1时增效倍数达到了5.0，表明蛋白组合物Cry55A/Cry6A在防治植物寄生线虫的应用中具有更好的潜力。

参考文献：

1.余子全，孙明，王乾兰，刘斌，邹雪，喻子牛(2007)苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫生物测定方法的建立和高毒力菌株的筛选.农业生物技术学报，15：867-871。

2.余子全，白培胜，郭素霞，喻子牛，孙明(2007)苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达.微生物学报，47：865-868。

3.Chitwood DJ(2003)Research on plant-parasitic nematode biology conducted by the United StatesDepartment of Agriculture-Agrcultural Research Service.Pest Manag Sci 59：748-753.

4.Li XQ，Tan A，Voegtline M，Bekele S，Chen CS，et al.(2008)Expression of Cry 5B protein from Bacillusthuringiensis in plant roots confers resistance to root-knot nematode.Biol Control 47：97-102.

5.Bone LW，Bottjer KP，Gill SS(1985)Trichostrongylus colubriformis：egg lethality due to Bacillusthuringiensis crystal toxin.Exp Parasitol60：314-322.

6.Bone LW，Bottjer KP，Gill SS(1986)Trichostrongylus colubriformis：isolation and characterization ofovicidal activity from Bacillus thuringiensis israelensis.Exp Parasitol62：247-253.

7.Bone LW，Bottjer KP，Gill SS(1987)Alteration of Trichostrongylus colubriformis egg permeability byBacillus thuringiensis israelensis toxin.J Parasitol73：295-299.

8.Bone LW，Bottjer KP，Gill SS(1988)Factors affecting the larvicidal activity of Bacillus thuringiensisisraelensis toxin for Trichostrongylus colubriformis(Nematoda).J Invertebr Pathol52：102-107.

9.Guo SX，Liu M，Peng DH，Ji SS，Wang PX，Yu ZN，Sun M(2008)New strategy for isolating novelnematicidal crystal protein genes from Bacillus thuringiensis strain YBT-1518.Appl Environ Microbiol 74：6997-7001.

10.Wei JZ，Hale K，Carta L，Platzer E，Wong C，Fang SC，and Aroian RV(2003)Bacillus thuringiensis Crystalproteins that target nematodes.Proc Natl Acad Sci 100：2760-2765.

11.Wirth MC，Delécluse A，Walton WE(2001)Cyt1Ab1 and Cyt2Ba1 from Bacillus thuringiensis subsp.medellin and B.thuringiensis subsp.israelensis Synergize Bacillus sphaericus against Aedes aegypti andresistant Culex quinquefasciatus(Diptera：Culicidae).Appl Environ Microbiol67：3280-3284.

12.Griffitts JS，Whitacre JL，Stevens DE，and Aroian RV(2001)Bt toxin resistance from loss of a putativecarbohydrate-modifying enzyme.Science，293：860-864.

13.Yu Z，Bai P，Ye W，Zhang F，Ruan L，Yu ZN，Sun M.(2008)A novel negative regulatory factor fornematicidal Cry protein gene expression in Bacillus thuringiensis.J Microbiol Biotechnol 18：1033-1039.Tabashnik BE(1992)Evaluation of synergism among Bacillus thuringiensis toxins.Appl Environ Microbiol 58：3343-3346.

Claims (3)

1.一组对南方根结线虫具有杀虫增效作用的杀线虫蛋白组合物，其特征在于该组合物为来自于苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白Cry6A和Cry55，所述组合物中的蛋白Cry6A和蛋白Cry55A按质量比为1∶5-5∶1配比制备，这些蛋白的分子量分别为：Cry6A为54Kda；Cry55为45Kda；

其中：

蛋白Cry6A的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示；

其氨基酸序列如下所示：

MIIDSKTTLPRHSLIHTIKLNSNKKYGPGDMTNGNQFIISKQEWATIGAYIQTGLGLPVNEQQLRTHVNLSQDISIPSDFSQLYDVYCSDKTSAEWWNKNLYPLIIKSANDIASYGFKVAGDPSIKKDGYFKKLQDELDNIVDNNSDDDAIAKAIKDFKARCGILIKEAKQYEEAAKNIVTSLDQFLHGDQKKLEGVINIQKRLKEVQTALNQAHGESSPAHKELLEKVKNLKTTLERTIKAEQDLEKKVEYSFLLGPLLGFVVYEILENTAVQHIKNQIDEIKKQLDSAQHDLDRDVKIIGMLNSINTDIDNLYSQGQEAIKVFQKLQGIWATIGAQIENLRTTSLQEVQDSDDADEIQIELEDASDAWLVVAQEARDFTLNAYSTNSRQNLPINVISDSCNCSTTNMTSNQYSNPTTNMTSNQYMISHEYTSLPNNFMLSRNSNLEYKCPENNFMIYWYNNSDWYNNSDWYN；

蛋白Cry55的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：3所示；

其氨基酸序列如下所示：

MNKKSITHEEFIRQLKEYNLDNNLNYHDPAVLKKINELLPADQQYDLISPTQDWYQFKTLYPISKNGVIISSNLDDSSNVLVPELSENPYDPIPQSGKSTIQTAVRSPEALYIILTTNNSLSFGGGTNTMIATRIALLSVTRPELYQAITKVNYVYKSGQTAPRNAPVAYIELSPNNSYVQTLLNDSHMKRTSSYELVGSSIARRGIETKWSKSHTSGVSDTDSWSLAVSAGIDIEWDVGIPLTASAKEKLSLSITGTYGQSTTVSSQDTITQEYTFAKPGKDYKYDDYAYAVYQLKSNYQFIAGDAFNNLINSLSFGNQFSVHGDASYQYSTDTIFSTQTPDPTPTNEKSLIQVNFNPRFS。

2.如权利要求1所述的杀线虫的蛋白组合物，其特征在于，所述组合物中的蛋白质Cry6A和蛋白质Cry55A按质量比为1∶1。

3.权利要求1的蛋白组合物在制备防治南方根结线虫的微生物农药中的应用。

Images