CN105203577A

CN105203577A - 一种检测微生物的方法

Info

Publication number: CN105203577A
Application number: CN201510632753.9A
Authority: CN
Inventors: 代凤英; 杜美红; 杨寅; 张淼; 许迪莘
Original assignee: Beijing Physichemistry Analysis & Measurment Centre
Current assignee: Beijing Physichemistry Analysis & Measurment Centre
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2035-09-29
Also published as: CN105203577B

Abstract

本发明涉及食品安全检测领域，公开了一种检测微生物的方法，包括：1)将能够特异地与微生物结合的第一抗体偶联在非磁性微球上得到免疫微球，将能够与第一抗体结合的第二抗体偶联在磁球上得到免疫磁球；2)将免疫微球与液体形式的待测样品进行混合，使得免疫微球能够特异性地吸附微生物；3)将步骤2)得到的混合后的物料与免疫磁球混合，使得第一抗体能够与第二抗体结合；4)将步骤3)得到的混合后的物料进行磁分离，除去未结合在免疫磁球上的物质；5)重悬磁分离得到的沉淀物，并将得到的重悬液进行核磁共振而检测横向弛豫时间，从而判断微生物的含量。本发明能够快速有效地检测样品中微生物的含量，在痕量微生物检测领域极具应用前景。

Description

一种检测微生物的方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，具体地，涉及一种检测微生物(特别是有害微生物)的方法。

背景技术

食品安全是重大民生问题。食源性微生物致病菌有效的监测对于首都食品质量控制和监管尤为重要。针对食品中的病原微生物(如细菌、真菌和病毒等)以及其他有害生物(如寄生虫)，传统的检测方法为分离培养法。分离培养需要前增菌、增菌、生化鉴定或血清学鉴定，整个检测过程需要2-3天甚至5-6天的时间才能完成，而且检测过程中所需的培养基准备、平板培养、菌落计数、生化鉴定等使得检测任务劳动强度大，耗时，不能及时、快速评价食品中微生物的安全性，不利于监管部门对问题食品的快速反应。传统检测病原微生物方法步骤多，所需时间长，速度慢，难以适应食品快速流通检测的需要；现代微生物检测方法虽然检测速度快，但是在细菌浓度较低情况下容易造成漏检。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、检测时间短、灵敏度高的检测微生物的方法。

本发明的发明人进行了大量的研究，结果发现采用具有很高的单分散性、生物相容性、易于修饰功能基团的非磁性微球作为微生物(如沙门氏菌)前浓缩的载体，配合使用免疫磁分离技术与核磁共振技术即可实现微生物的高灵敏度检测。因此，为了实现上述目的，本发明提供了一种检测微生物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将能够特异地与微生物结合的第一抗体偶联在非磁性微球上，得到免疫微球，而将能够与所述第一抗体结合的第二抗体偶联在磁球上，得到免疫磁球；

(2)将免疫微球与液体形式的待测样品进行混合，混合的条件使得当待测样品中存在所述微生物时，免疫微球能够特异性地吸附微生物；

(3)将步骤(2)得到的混合后的物料与免疫磁球混合，混合的条件使得第一抗体能够与第二抗体结合；

(4)将步骤(3)得到的混合后的物料置于分选磁场中进行磁分离，除去未结合在免疫磁球上的物质；

(5)重悬磁分离得到的沉淀物，并将得到的重悬液进行核磁共振而检测横向弛豫时间，根据横向弛豫时间判断待测样品中的微生物的含量。

通过上述技术方案，本发明能够快速有效地检测样品中微生物(特别是细菌、真菌或病毒等)的含量，操作简单易行且特异性强、灵敏度高，在痕量微生物检测领域极具应用前景。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是按照本发明的一种实施方式测得的微生物的含量与△T₂值之间的关系图；

图2是根据本发明的方法检测微生物时形成的沙门氏菌-免疫微球-免疫磁球夹心复合结构的扫描电镜照片。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的单位“CFU/mL”意指以每毫升待测样品为基准的菌株的CFU数；使用的术语“免疫磁球”是指通过偶联反应将抗体结合到磁性微球(或磁球)的表面上，形成的免疫磁性微球；术语“横向弛豫时间”是指两个处在一定距离内，进动频率相同、进动取向不同的核互相作用，交换能量，改变进动方向所需的时间称为横向弛豫时间(或自旋-自旋弛豫时间，T₂)；本发明中使用的液体体积均为20℃下的数值；涉及的术语“室温”指室内温度，通常为5-40℃。

本发明提供的检测微生物的方法包括以下步骤：

(1)将能够特异地与微生物结合的第一抗体偶联在非磁性微球上，得到免疫微球，而将能够与所述第一抗体结合的第二抗体偶联在磁球(即磁性微球)上，得到免疫磁球；

本发明的检测方法优选为体外检测方法。

根据本发明，所述微生物可以为各种常见的微生物，特别是有害微生物(或致病菌)，如细菌、真菌或病毒。

所述第一抗体可以根据微生物的具体种类进行选择，只要能够特异性地结合所述微生物即可。优选情况下，所述微生物为沙门氏菌(Salmonella)，所述第一抗体为编号为01-91-99的KPL多克隆抗体。

所述第二抗体可以根据第一抗体的具体种类进行选择，只要能够特异地与第一抗体结合即可，例如，所述第二抗体可以为兔抗山羊IgG二抗。

根据本发明，第一抗体与非磁性微球偶联获得所述免疫微球的方法可以为常规方法，例如，可以参照免疫磁球的制备方法，参见文献(刘辉荣等，简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备，中国公共卫生，2008，11:1349-1351)中的方法进行，只是富集的手段为固液分离(离心)。

优选地，相对于每克的非磁性微球，所述第一抗体的用量为10-50mg(更优选为10mg、15mg、20mg、30mg、40mg、50mg、或者上述任意两个数值之间的范围)。

所述非磁性微球可以为各种常规的可以与抗体偶联的非磁性微球(不具有磁性)，优选地，所述非磁性微球为表面羧基化的二氧化硅微球(可通过常规的溶胶-凝胶Stober法制得)和/或聚苯乙烯微球。

优选情况下，所述非磁性微球的粒径为100-200nm(如100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm或者上述任意两个数值之间的范围)。

根据本发明，第二抗体与磁球偶联获得所述免疫磁球(或免疫磁珠)的方法可以为常规方法，例如，可以按照文献(刘辉荣等，简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备，中国公共卫生，2008，11:1349-1351)中的方法进行。

优选地，相对于每克的磁球，所述第二抗体的用量为20-100mg(更优选为20mg、25mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、或者上述任意两个数值之间的范围)。

所述磁球可以为各种常规用于免疫磁分离的磁球，例如，可以为表面修饰有羧基的超顺磁性Fe₃O₄微球(可以参见J.Am.Chem.Soc.2001,123,12798-12801中记载的方法制得)。

优选情况下，所述磁球的粒径为10-200nm(如10nm、20nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm或者上述任意两个数值之间的范围)。在本发明优选的实施方式中，所述磁球的粒径小于非磁性微球的粒径，从而更便于第一抗体和第二抗体的结合。

优选地，相对于每毫升的液体形式的待测样品，所述免疫微球的用量为100-900μg(更优选为780-850μg)，所述免疫磁球的用量为100-600μg(更优选为380-450μg)。

根据本发明，步骤(2)或步骤(3)中，对所述混合的条件没有特别的要求，只要能够使微生物被所述免疫微球特异性地结合或第一抗体与第二抗体特异性地结合即可。步骤(2)或步骤(3)中，所述混合的条件可以包括：温度为室温，时间为25-35min。步骤(2)和步骤(3)中的混合的条件可以相同或不同。混合可以在磷酸盐缓冲液中进行，所述磷酸盐缓冲液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氢二钠和0.038-0.056mol/L的磷酸二氢钠。

根据本发明，置于分选磁场中进行的磁分离可以借助免疫磁分离系统(例如磁力架或MatrixPathatrix免疫磁分离系统)进行，对所述磁分离的条件没有特别的限定，优选地，步骤(4)中，所述磁分离的条件包括：温度为室温，时间为25-35min。

根据本发明，步骤(5)中，本领域技术人员能够对重悬所用溶液的用量进行选择，例如，相对于每毫克的沉淀物，重悬所用溶液的用量为0.5-1.5mL。重悬所用的溶液可以为常规的用于悬浮免疫磁球的溶液，优选为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氢二钠和0.038-0.056mol/L的磷酸二氢钠。步骤(2)、步骤(3)和步骤(5)中优选使用的磷酸盐缓冲液可以相同或不同。

根据本发明，所述核磁共振的条件包括：扫描次数(scans)为4-8次，重复延迟时间(recycledelay)为1.5-2.5s，接收机放大倍数(gain)为50-60dB，重复测量时间(repetitiontime)为10s。

本发明中，核磁共振检测的△T₂值(待测样品与空白样品测得的T₂的差值)与结合有微生物的免疫磁球的含量(St)呈比例关系(△T₂＝a·lg(St)+b，a和b为常数)，因此，检测微生物含量已知的标准样品，获得△T₂与含量之间的关系后，即可根据待测样品的△T₂值判断待测样品中的微生物的含量。

根据本发明的方法，其中，待测样品可以为食品和/或药品。具体地，可以按照国家标准GB4789.1-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》中的方法取得待测样品。

本发明的方法具有较高的灵敏度，特别适用于微生物含量为1-10⁶CFU/mL的待测样品的检测。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，以下实施例中，将从KPL公司商购得到，商品号(Cat.#)为01-91-99的抗体作为特异性抗体；兔抗山羊IgG二抗购自Meridian。

制备实施例1

(1)将通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的表面修饰有羧基的超顺磁性Fe₃O₄微球(根据热分解方法合成(参见J.Am.Chem.Soc.2001,123,12798-12801，粒径为13nm)作为磁球使用，取2mg磁球，分散磷酸缓冲溶液中，分散液中磁球的浓度为2mg/mL。取0.05mg特异性抗体(溶于1mL的磷酸缓冲液中)与2mg磁球混合，37℃下在摇床(200r/min)中保持3h，然后通过磁分离进行清洗，去除未偶联到磁球表面的特异性抗体。接着用浓度为1％(w/v)的牛血清白蛋白溶液(溶于磷酸缓冲液)，在37℃下封闭30min，然后通过磁分离进行清洗，洗去多余的牛血清白蛋白溶液，即得到免疫磁球。

(2)根据溶胶-凝胶Stober法在碱性条件下制备二氧化硅微球(粒径为200nm)，通过等摩尔的硅烷偶联剂和丁二酸酐使二氧化硅微球表面羧基化，从而得到非磁性微球。使用非磁性微球制备免疫微球，免疫微球与免疫磁球的制备过程类似，免疫微球制备过程中是通过离心手段富集，免疫磁球是通过磁分离富集；且在本制备实施例中，免疫微球连接的是多克隆抗体01-91-99，免疫磁球连接的是兔抗山羊IgG二抗(用量为0.025mg)。

实施例1

取免疫微球800μg与不同浓度的含沙门氏菌(鼠伤寒沙门氏菌，Salmonellaenteritidis，购自ATCC，货号14028)的样品溶液(10⁰-10⁷CFU/mL)1mL混合，将反应混合溶液置于混匀仪上室温(25℃)孵育30min。取免疫磁球400μg，加入到反应完全的免疫微球与菌的混合溶液中，再次置于混匀仪上室温(25℃)孵育30min(沙门氏菌、免疫微球和免疫磁球形成沙门氏菌-免疫微球-免疫磁球夹心复合结构，如图2所示)。反应结束后，将反应溶液进行磁分离30min，将上清液小心取出置于新的离心管中，PBS重悬下沉。将重悬液加入到核磁管中用于NMR检测(条件：扫描次数为4次，重复延迟时间为2s，接收机放大倍数为56dB，重复测量时间为10s)而检测T₂值，同时做空白对照检测T₂₀值，从而计算△T₂值(T₂－T₂₀)，获得微生物的浓度与△T₂值之间的关系图(参见图1)。

从图1可以看出，△T₂值与沙门氏菌的浓度(St)呈明显的增长趋势，在10¹-10⁷CFU/mL的范围内，△T₂值与沙门氏菌的浓度(St)呈比例关系，△T₂＝6.22724×lg(St)+2.31399，R²＝0.99549，因此，可以根据T₂值检测沙门氏菌的浓度。

从实施例1可以看出，本发明的方法具有快速、灵敏、简单、时间短(<1h)等明显优势，且其检出限较低，适用于应对突发情况，在食品安全、环境卫生等领域有很好的发展前景。

实施例2

本实施例用来说明按照本发明的方法检测鸡蛋蛋壳表面的沙门氏菌的方法。

将鸡蛋置于30mL的PBS中静置5min，取1mL样品溶液依次加入到制备实施例1制得的免疫微球和免疫磁球中，其余步骤按照实施例1中描述的方法进行，测得的△T₂值为12.46ms，计算得到样品溶液中沙门氏菌的含量为43CFU/mL。

按照GB4789.4-2010中规定的方法(食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验)，对样品溶液进行平板计数法的菌体数目检测，最终得到样品溶液中沙门氏菌的含量为51CFU/mL。

本实施例说明本发明的方法具有较高的准确度。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种检测微生物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述微生物为沙门氏菌(Salmonella)，所述第一抗体为编号为01-91-99的KPL多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于每克的非磁性微球，所述第一抗体的用量为10-50mg。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，所述非磁性微球的粒径为100-200nm；优选地，所述非磁性微球为表面羧基化的二氧化硅微球和/或聚苯乙烯微球。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于每克的磁球，所述第二抗体的用量为20-100mg。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，所述磁球的粒径为10-200nm；优选地，所述磁球为表面修饰有羧基的超顺磁性Fe₃O₄微球。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于每毫升的液体形式的待测样品，所述免疫微球的用量为100-900μg，所述免疫磁球的用量为100-600μg。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)或步骤(3)中，混合的条件可以包括：温度为室温，时间为25-35min。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，所述磁分离的条件包括：温度为室温，时间为25-35min。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(5)中，重悬所用的溶液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氢二钠和0.038-0.056mol/L的磷酸二氢钠。