CN105200031B - 一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法 - Google Patents
一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105200031B CN105200031B CN201510701468.8A CN201510701468A CN105200031B CN 105200031 B CN105200031 B CN 105200031B CN 201510701468 A CN201510701468 A CN 201510701468A CN 105200031 B CN105200031 B CN 105200031B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sphere
- chitosan
- immobilization
- earthworm fibrinolysin
- magnetic micro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
本发明公开了一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法，其酶活性为25‑35U/mg。其制备方法是先将绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于pH3～9的缓冲液中得到蛋白酶缓冲液，再将其加入到经过活化的磁性壳聚糖微球中，水浴振荡偶联2～14h后得到偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球；再将其加入蚯蚓纤溶酶粗酶溶液在30‑60℃恒温水浴摇床中振荡固化反应0.5‑3h；反应结束后，反复洗涤至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球。本发明以绿豆胰蛋白酶抑制剂为配基，与磁性微球偶联，运用用于蚯蚓纤溶酶的分离纯化，提高了蚯蚓纤溶酶的分离纯化选择性，而且磁性微球易于与蚯蚓纤溶酶分离。
Description
技术领域
本发明属于磁性微球技术领域，具体是涉及用于固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法。
背景技术
磁性高分子微球是近年发展起来的一种新型磁性材料，是通过适当方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的复合微球。磁性复合微球不仅具有普通高分子微球的众多特性还具有磁响应性，所以不仅能够通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功能基(如-OH、-COOH、-CHO、-NH2，等)，还能在外加磁场作用下具有导向功能。磁性微球在固定化酶、细胞分离、蛋白质分离和纯化、免疫测定、靶向药物和DNA分离与核酸杂交等领域有着广泛的应用前景。目前常用于制备磁性微球的方法有包埋法、悬浮聚合法，这些方法制备得到的磁性微球粒径分布较宽，形状不规则。
绿豆胰蛋白酶抑制剂属于Bowman-Birk型丝氨酸蛋白酶抑制剂，含有7对二硫键，72个氨基酸残基，分子量为7.98kD，具有2个同源的结构域。抑制活性由活性中心及附近的氨基酸残基决定，绿豆胰蛋白酶抑制剂含有两个活性中心，分别为Lys20-Ser21和Arg47-Ser48，这两个活性片段可被消化酶消化分离，并都具有胰蛋白酶抑制活性，其中Arg活性片段有27个氨基酸残基组成，而Lys活性片段有两个肽链组成，由26个氨基酸残基组成的长链和9个氨基酸残基组成的短链，它们分别由分子内二硫键形成环状，绿豆胰蛋白酶抑制剂对热、酸、碱的稳定性很高。绿豆中含有的胰蛋白酶抑制剂的比活力是大豆胰蛋白酶抑制剂的2.76倍。
蚯蚓纤溶酶又称蚓激酶，是从蚯蚓体内提取出来的既具有直接溶解纤维蛋白的纤溶酶活性，又具有类尿激酶的纤溶酶原激活活性的一类蛋白质，既能溶解陈旧血栓又能抑制新血栓形成，实验表明该酶具有抗凝、溶纤、改善血液流变学性质，是预防和治疗血栓疾病的有效药物，该酶属于丝氨酸蛋白酶，可被丝氨酸蛋白酶抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂抑制，近几年的临床应用表明，它在治疗脑血栓、半身不遂、心肌梗塞等血栓类疾病方面具有见效快、疗效良好、口服有效、且较安全等优点。大量研究表明蚯蚓纤溶酶无论静脉注射或口服给药，均具有溶栓作用，是一种目前较为理想的血栓病治疗药物，具有广阔的开发前景。通常纤溶酶的提取是通过蚯蚓匀浆、盐析、凝胶层析、离子交换层析及高效液相色谱(HPLC)等一系列步骤进行分离纯化得到，该方法提取得到的纤溶酶纯度高，但由于纯化工序复杂成本高，耗时长经济效益低，只能用于实验室研究，很难用于工业生产，如何得到稳定的高活性的蚯蚓纤溶酶，可以为蚯蚓资源的利用开辟一条道路。
目前还没有关于绿豆胰蛋白酶抑制剂偶联壳聚糖磁性微球用于固定化蚯蚓纤溶酶的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法。其以绿豆胰蛋白酶抑制剂为配基，与磁性微球偶联，运用用于蚯蚓纤溶酶的分离纯化，提高了蚯蚓纤溶酶的分离纯化选择性，而且磁性微球易于与蚯蚓纤溶酶分离。
本发明的技术方案如下：
一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球，其酶活性为25-35U/mg，在pH 6.5～8.0之间的稳定性能保持在75％以上，储藏时间在30天内固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的酶活性为80％以上。
本发明的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其包括如下步骤：
(1)磁性壳聚糖微球的偶联：将绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于pH 3～9的缓冲液中得到蛋白酶缓冲液，再将其加入到经过活化的磁性壳聚糖微球中，水浴振荡偶联2～14h，振荡温度40～60℃，后得到偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球；
(2)蚯蚓纤溶酶的固定化：再将偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球加入蚯蚓纤溶酶粗酶溶液在30-60℃恒温水浴摇床中振荡固化反应0.5-3h；反应结束后，用去离子水和pH为6-8的磷酸缓冲液反复洗涤固定化蚯蚓纤溶酶的磁性壳聚糖微球粗品，至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球。
作为技术方案的优选，所述步骤(1)中的缓冲液为柠檬酸-磷酸二氢钠。所述蛋白酶缓冲液与活化的磁性壳聚糖微球的液固比为5～30∶1，水浴振荡偶联4～6h。这个工艺条件得到的偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球性能特别好。
作为技术方案的优选，所述步骤(2)中，每克偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球则加入1～5ml酶活为1-2万U/mL的蚯蚓纤溶酶粗酶溶液。
本发明中活化的磁性壳聚糖微球的制备是将磁性壳聚糖微球，加入NaOH溶液和NaBH4溶液，在30～80℃水浴振荡30～40min，再加入二甲基亚砜为活化剂，再加入体积分数为10％～60％的环氧氯丙烷，振荡活化2～10h后，抽滤，用蒸馏水洗涤即可得到活化的磁性壳聚糖微球。
作为技术方案的进一步优选，所述磁性壳聚糖微球与NaOH溶液的重量比为1∶5～10，磁性壳聚糖微球与NaBH4溶液的重量比为1∶4～12；每克磁性壳聚糖微球加体积分数为40％～60％的二甲基亚砜1.5～9mL，环氧氯丙烷为1～12mL。
作为技术方案的进一步优选，NaOH溶液的浓度为1.2～2.0mol/L，NaBH4溶液的浓度为5～10g/L，环氧氯丙烷的体积分数为30％～50％，在30～50℃下振荡活化2～6h时磁性壳聚糖微球的活化效果最好。
本发明中磁性壳聚糖微球的制备方法：
(1)将液体石蜡和Span-80按照重量比为20～40∶1混合，在30～50℃搅拌1～2h制备成油相；
(2)称取一定量的壳聚糖，用3～5％的醋酸溶液溶解，待壳聚糖完全溶解后得到壳聚糖溶液，加入Fe3O4粉末，超声分散10～20min，制得到水相；
(3)将水相与油相按照体积比为1∶5～6，将水相缓慢加入油相中，搅拌0.5～1h使溶液形成乳液体系；
(4)再向乳液体系中滴加质量分数为25％的戊二醛，继续搅拌1～2h，用NaOH溶液调pH至9～10，继续反应1～2h后停止反应，磁铁分离，用石油醚，乙醇和去离子水洗涤至中性，真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球。
作为技术方案的优选，本发明中所用的四氧化三铁为纳米级别，配制的壳聚糖溶液浓度为5～10mg/mL，搅拌转速为600～700rpm/min，这样制备得到的磁性壳聚糖微球的粒径最小，为215nm。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1.本发明的制备方法简单、操作易行，处理过程温和，对设备要求不高。
2.本发明以绿豆胰蛋白酶抑制剂为配基，与磁性壳聚糖微球偶联，运用用于蚯蚓纤溶酶的分离纯化，提高了蚯蚓纤溶酶的分离纯化选择性，而且磁性壳聚糖微球易于与蚯蚓纤溶酶分离。
3.本发明的蚯蚓纤溶酶固定在磁性微球上，因微球具有磁性，在外加磁场的作用下，纤溶酶可与反应物很快地分离。且固定化纤溶酶的pH稳定性较好，能够在pH 6.5～8.0的范围内，稳定性能保持在75％以上，热稳定性较游离酶高，在60℃下加热，相对活性仍能保持70％以上，且较长时间的存储，酶活性保持80％以上。
附图说明
图1是本发明的磁性壳聚糖微球的7000倍的电镜图；
图2是本发明的磁性壳聚糖微球的10万倍的电镜图；
图3是本发明的磁性壳聚糖微球的红外光谱分析图，图中3415cm-1是N-H和O-H的伸缩振动峰，2923cm-1和2855cm-1是脂肪族中C-H的特征吸收峰，1617cm-1是酰胺的特征吸收峰，1431cm-1是-CH3的特征振动峰，1119cm-1是C-O的伸缩振动吸收峰，620cm-1出现了Fe3O4的特征吸收峰。
图4是游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶的pH稳定性图；
图5是游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶的储藏稳定性图；
图6是游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶的热稳定性图。
具体实施例
下面通过具体实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例仅仅是用于本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的的构思前提下对本发明的制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
在实施例中，磁性壳聚糖微球的(a)粒径分布，(b)活化度，测定通过下面记载的方法进行测定。
(a)粒径分布
将磁性壳聚糖微球分散于乙醇中，加入几滴分散剂吐温-20，超声分散10min，使用纳米激光粒度分析仪进行丽都测定。
(b)活化度
采用硫代硫酸钠滴定法测定，称取0.1g洗涤抽干后的微球，加入1.5mL的1.3moL/L的硫代硫酸钠溶液，于40℃水浴恒温振荡器中振荡反应30min，反应完毕后，滴加1滴酚酞指示剂，用标准盐酸滴定至溶液无色后停止滴定，记录下滴定前后标准盐酸的体积变化。环氧基修饰密度用下列式子计算：
实施例1
量取100mL的液体石蜡和2mL的span-80加入250mL的三口烧瓶中，45℃水浴保温搅拌1h制成油相；称取0.2g的壳聚糖，用20mL3％的醋酸溶液溶解，待壳聚糖完全溶解后，加入0.6g的Fe3O4，超声分散10min；制备成浓度为5mg/ml的壳聚糖溶液，然后加入油相中，300rpm搅拌半个小时使溶液形成乳液体系后，缓慢滴加3mL质量为25％的戊二醛，继续搅拌1h，用1.0mol/L的NaOH溶液调pH至10左右，继续反应1h后停止反应，磁铁分离，用石油醚，乙醇和去离子水洗涤，真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球。
该磁性壳聚糖微球的粒径大小在表1中示出。
实施例2
量取100mL的液体石蜡和3mL的span-80加入250mL的三口烧瓶中，30℃水浴保温搅拌2h制成油相；称取0.8g的壳聚糖，用20mL5％的醋酸溶液溶解，待壳聚糖完全溶解后，加入0.6g的Fe3O4，超声分散20min；制备成浓度为6.5mg/ml的壳聚糖溶液，然后加入油相中，400rpm搅拌半个小时使溶液形成乳液体系后，缓慢滴加5mL质量为25％的戊二醛，继续搅拌2h，用1.0mol/L的NaOH溶液调pH至9左右，继续反应2h后停止反应，磁铁分离，用石油醚，乙醇和去离子水洗涤，真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球。
该磁性壳聚糖微球的粒径大小在表1中示出。
实施例3
量取100mL的液体石蜡和2.5mL的span-80加入250mL的三口烧瓶中，40℃水浴保温搅拌2h制成油相；称取1g的壳聚糖，用20mL3％的醋酸溶液溶解，待壳聚糖完全溶解后，加入0.6g的Fe3O4，超声分散15min；制备成浓度为8.1mg/ml的壳聚糖溶液，然后加入油相中，500rpm搅拌半个小时使溶液形成乳液体系后，缓慢滴加10mL质量为25％的戊二醛，继续搅拌1.5h，用1.0mol/L的NaOH溶液调pH至9.5左右，继续反应1.5h后停止反应，磁铁分离，用石油醚，乙醇和去离子水洗涤，真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球。
该磁性壳聚糖微球的粒径大小在表1中示出。
实施例4
量取100mL的液体石蜡和2mL的span-80加入250mL的三口烧瓶中，45℃水浴保温搅拌1.5h制成油相；称取1.2g的壳聚糖，用20mL3％的醋酸溶液溶解，待壳聚糖完全溶解后，加入0.6g的Fe3O4，超声分散10min；制备成浓度为10mg/ml的壳聚糖溶液，然后加入油相中，600rpm搅拌半个小时使溶液形成乳液体系后，缓慢滴加3mL质量为25％的戊二醛，继续搅拌1h，用1.0mol/L的NaOH溶液调pH至10左右，继续反应1h后停止反应，磁铁分离，用石油醚，乙醇和去离子水洗涤，真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球。
该磁性壳聚糖微球的粒径大小在表1中示出。
实施例5
量取100mL的液体石蜡和2mL的span-80加入250mL的三口烧瓶中，45℃水浴保温；称取0.2g的壳聚糖，用20mL3％的醋酸溶液溶解，待壳聚糖完全溶解后，加入0.6g的Fe3O4，超声分散10min；将壳聚糖溶液加入油相中，700rpm搅拌半个小时使溶液形成乳液体系后，缓慢滴加3mL质量为25％的戊二醛，继续搅拌1h，用1.0mol/L的NaOH溶液调pH至10左右，继续反应1h后停止反应，磁铁分离，用石油醚，乙醇和去离子水洗涤，真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球。
该磁性壳聚糖微球的粒径大小在表1中示出。
磁性壳聚糖微球粒径分布在图1、图2中示出，从图1可知，壳聚糖与Fe3O4纳米粒子形成的复合微粒粒径介于100-300nm之间，该粒径利于微球在反应体系中分散和磁分离，且小粒径的微球具有更大的比表面积，可以共价结合更多的酶，同时也可以降低底物和产物扩散限制的影响。其红外光谱分析图参见图3。
表1磁性壳聚糖微球的粒径
实施例6
称取0.25g实施例5制备得到的磁性壳聚糖微球于锥形瓶中，加入25mL 1.5mol/L的NaOH溶液和150mL 10g/L的NaBH4，在恒温水浴振荡器中振荡30min，反应温度为30℃，再以体积分数50％的二甲基亚砜为活化溶剂，加入体积分数40％的环氧氯丙烷，继续振荡反应5h后，抽滤，用蒸馏水冲洗至滤液中无环氧根和氢氧根，即可得到活化的磁性壳聚糖微球。
环氧根的检测：取2mL的滤液，滴入1滴酚酞，加入相同体积的1.3moL/L的Na2S2O3，振荡使其反应，若溶液不变红，则环氧基已洗干净。氢氧根的检测：取2mL的滤液，加入1滴酚酞，若溶液不变红，则氢氧根已洗干净。
该磁性壳聚糖微球的活化度结果在表2中示出。
实施例7
称取0.25g实施例5制备得到的磁性壳聚糖微球锥形瓶中，加入25mL2.0mol/L的NaOH溶液和100mL20g/L的NaBH4，在恒温水浴振荡器中振荡60min，反应温度为35℃，再以体积分数45％的二甲基亚砜为活化溶剂，加入体积分数30％的环氧氯丙烷，继续振荡反应3h后，抽滤，用蒸馏水冲洗至滤液中无环氧根和氢氧根，即可得到活化的磁性壳聚糖微球。
环氧根的检测：取2mL的滤液，滴入1滴酚酞，加入相同体积的1.3moL/L的Na2S2O3，振荡使其反应，若溶液不变红，则环氧基已洗干净。氢氧根的检测：取2mL的滤液，加入1滴酚酞，若溶液不变红，则氢氧根已洗干净。
该磁性壳聚糖微球的活化度结果在表2中示出。
实施例8
称取0.25g实施例5制备得到的磁性壳聚糖微球锥形瓶中，加入20mL2.2mol/L的NaOH溶液和100mL10g/L的NaBH4，在恒温水浴振荡器中振荡45min，反应温度为50℃，再以体积分数40％的二甲基亚砜为活化溶剂，加入体积分数35％的环氧氯丙烷，继续振荡反应3.5h后，抽滤，用蒸馏水冲洗至滤液中无环氧根和氢氧根，即可得到活化的磁性壳聚糖微球。
环氧根的检测：取2mL的滤液，滴入1滴酚酞，加入相同体积的1.3moL/L的Na2S2O3，振荡使其反应，若溶液不变红，则环氧基已洗干净。氢氧根的检测：取2mL的滤液，加入1滴酚酞，若溶液不变红，则氢氧根已洗干净。
该磁性壳聚糖微球的活化度结果在表2中示出。
实施例9
称取0.25g实施例5制备得到的磁性壳聚糖微球锥形瓶中，加入31mL1.8mol/L的NaOH溶液和50mL25g/L的NaBH4，在恒温水浴振荡器中振荡30min，反应温度为60℃，再以体积分数35％的二甲基亚砜为活化溶剂，加入体积分数45％的环氧氯丙烷，继续振荡反应4.5h后，抽滤，用蒸馏水冲洗至滤液中无环氧根和氢氧根，即可得到活化的磁性壳聚糖微球。
环氧根的检测：取2mL的滤液，滴入1滴酚酞，加入相同体积的1.3moL/L的Na2S2O3，振荡使其反应，若溶液不变红，则环氧基已洗干净。氢氧根的检测：取2mL的滤液，加入1滴酚酞，若溶液不变红，则氢氧根已洗干净。
该磁性壳聚糖微球的活化度结果在表2中示出。
实施例10
称取0.25g实施例5制备得到的磁性壳聚糖微球锥形瓶中，加入25mL 2.5mol/L的NaOH溶液和125mL 20g/L的NaBH4，在恒温水浴振荡器中振荡45min，反应温度为70℃，再以体积分数30％的二甲基亚砜为活化溶剂，加入体积分数60％的环氧氯丙烷，继续振荡反应4h后，抽滤，用蒸馏水冲洗至滤液中无环氧根和氢氧根，即可得到活化的磁性壳聚糖微球。
环氧根的检测：取2mL的滤液，滴入1滴酚酞，加入相同体积的1.3moL/L的Na2S2O3，振荡使其反应，若溶液不变红，则环氧基已洗干净。氢氧根的检测：取2mL的滤液，加入1滴酚酞，若溶液不变红，则氢氧根已洗干净。
该磁性壳聚糖微球的活化度结果在表2中示出。
表2磁性壳聚糖微球的活化度测定结果
实施例11
(1)磁性壳聚糖微球的偶联：取30mg的绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于2mL pH＝6.0的柠檬酸盐缓冲溶液(柠檬酸-磷酸二氢钠)中得到蛋白酶缓冲液，将其添加至0.2g按实施例10活化的磁性壳聚糖微球中，45℃恒温水浴振荡偶联6h，取出，磁铁分离，洗涤，得到偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球。
收集残液，测定残液的体积，根据BAPNA法测定残液中胰蛋白酶抑制剂的量，并计算得到偶联率。该磁性微球的偶联率结果在表3中示出。
(2)蚯蚓纤溶酶的固定化：将蚯蚓纤溶酶提取物用pH＝8.0的磷酸缓冲液溶解并定容至50mL，蚯蚓纤溶酶粗酶液的浓度为1万U/mL，取1.25mL添加至0.25g偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球中，40℃恒温水浴振荡1.5h，取出，用去离子水和磷酸缓冲液反复洗涤固定化蚯蚓纤溶酶的磁性壳聚糖微球粗品，至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球。
收集洗涤液，用纤维蛋白平板法测定原液及洗涤液中蚯蚓纤溶酶的活性，利用固定化前后酶活差算出固定化酶活力。
固定化酶的酶活在表4中示出。
实施例12
(1)磁性壳聚糖微球的偶联：取40mg的绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于6mL pH＝6.5的柠檬酸盐缓冲溶液(柠檬酸-磷酸二氢钠)中得到蛋白酶缓冲液，将其添加至0.25g按实施例10活化的磁性壳聚糖微球中，40℃恒温水浴振荡偶联5h，取出，磁铁分离，洗涤，得到偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球。
收集残液，测定残液的体积，根据BAPNA法测定残液中胰蛋白酶抑制剂的量，并计算得到偶联率。该磁性微球的偶联率结果在表3中示出。
(2)蚯蚓纤溶酶的固定化：将蚯蚓纤溶酶提取物用pH＝7.0的磷酸缓冲液溶解并定容至25ml，蚯蚓纤溶酶粗酶液浓度为2万U/mL，取2.25mL添加至0.75g偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球中，35℃恒温水浴振荡2.0h，取出，用去离子水和pH为6-8的磷酸缓冲液反复洗涤固定化蚯蚓纤溶酶的磁性壳聚糖微球粗品，至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球。
收集洗涤液，用纤维蛋白平板法测定原液及洗涤液中蚯蚓纤溶酶的活性，利用固定化前后酶活差算出固定化酶活力。
固定化酶的酶活在表4中示出。
实施例13
(1)磁性壳聚糖微球的偶联：取35mg的绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于4mL pH＝7的柠檬酸盐缓冲溶液(柠檬酸-磷酸二氢钠)中得到蛋白酶缓冲液，将其添加至0.35g按实施例10活化的磁性壳聚糖微球中，50℃恒温水浴振荡偶联5.5h，取出，磁铁分离，洗涤，得到偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球。
收集残液，测定残液的体积，根据BAPNA法测定残液中胰蛋白酶抑制剂的量，并计算得到偶联率。
该磁性微球的偶联率结果在表3中示出。
(2)蚯蚓纤溶酶的固定化：将蚯蚓纤溶酶提取物用pH＝7.5的磷酸缓冲液溶解并定容至50mL，蚯蚓纤溶酶粗酶液的浓度为1万U/mL，取2mL添加至0.5g偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球中，30℃恒温水浴振荡2.5h，取出，用去离子水和pH为6-8的磷酸缓冲液反复洗涤固定化蚯蚓纤溶酶的磁性壳聚糖微球粗品，至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球。
收集洗涤液，用纤维蛋白平板法测定原液及洗涤液中蚯蚓纤溶酶的活性，利用固定化前后酶活差算出固定化酶活力。
固定化酶的酶活在表4中示出。
实施例14
(1)磁性壳聚糖微球的偶联：取30mg的绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于5mL pH＝7.5的柠檬酸盐缓冲溶液(柠檬酸-磷酸二氢钠)中得到蛋白酶缓冲液，将其添加至0.4g按实施例10活化的磁性壳聚糖微球中，60℃恒温水浴振荡偶联4.5h，取出，磁铁分离，洗涤，得到偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球。
收集残液，测定残液的体积，根据BAPNA法测定残液中胰蛋白酶抑制剂的量，并计算得到偶联率。
该磁性微球的偶联率结果在表3中示出。
(2)蚯蚓纤溶酶的固定化：将蚯蚓纤溶酶提取物用pH＝6.5的磷酸缓冲液溶解并定容至50ml，蚯蚓纤溶酶粗酶液的浓度为1万U/mL，取1.5mL添加至0.5g偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球中，40℃恒温水浴振荡1.5h，取出，用去离子水和pH为6-8的磷酸缓冲液反复洗涤固定化蚯蚓纤溶酶的磁性壳聚糖微球粗品，至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球。
收集洗涤液，用纤维蛋白平板法测定原液及洗涤液中蚯蚓纤溶酶的活性，利用固定化前后酶活差算出固定化酶活力。
固定化酶的酶活在表4中示出。
实施例15
(1)磁性壳聚糖微球的偶联：取40mg的绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于4mL pH＝8.0的柠檬酸盐缓冲溶液(柠檬酸-磷酸二氢钠)中得到蛋白酶缓冲液，将其添加至0.2g按实施例10活化的磁性壳聚糖微球中，55℃恒温水浴振荡偶联5h，取出，磁铁分离，洗涤，收集残液，测定残液的体积，根据BAPNA法测定残液中胰蛋白酶抑制剂的量，并计算得到偶联率。
该磁性微球的偶联率结果在表3中示出。
(2)蚯蚓纤溶酶的固定化：将蚯蚓纤溶酶提取物用pH＝6.0的磷酸缓冲液溶解并定容至50ml，蚯蚓纤溶酶粗酶液的浓度为1万U/mL，取2.5mL添加至1g偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球中，45℃恒温水浴振荡3.0h，取出，用去离子水和pH为6-8的磷酸缓冲液反复洗涤固定化蚯蚓纤溶酶的磁性壳聚糖微球粗品，至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球。
收集洗涤液，用纤维蛋白平板法测定原液及洗涤液中蚯蚓纤溶酶的活性，利用固定化前后酶活差算出固定化酶活力。
固定化酶的酶活在表4中示出。
表3偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球偶联率
表4固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球酶活测定结果
实施例16
(1)测定固定化蚯蚓纤溶酶pH稳定性
将相同酶浓度的本发明的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球和蚯蚓纤溶酶游离液，分别在pH为5.5、6.5、7.5、8.5、9.5下37℃水浴处理30min，测定酶活，未经处理的酶活为100％。得到游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶的pH稳定性图，如图4所示。由图可知固定化蚯蚓纤溶酶的耐酸碱性较游离酶的好，其稳定范围也较pH宽，游离酶在pH为7.5处具有最高活性，固定化酶在pH为7.0处具有最高活性，这是将酶固定在载体后其构象发生了变化，使得pH稳定性发生变化。
(2)测定固定化蚯蚓纤溶酶储藏稳定性
将相同酶浓度的本发明的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球和蚯蚓纤溶酶游离液置于4℃冰箱中保存，每隔5d取样测酶活，直至30d。测定酶活，未经处理的酶活为100％。得到游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶的储藏稳定性图，如图5所示。
由图5可知，随着储藏时间的变化，游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶的活性都逐渐地下降，在储藏的前5天，游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶的活性均没有明显变化，储藏10天时，游离酶的相对酶活为80％，而固定化蚯蚓纤溶酶的酶活仍有95％，之后游离酶的活性急剧下降，到30天时，仅保留32％，而固定化蚯蚓纤溶酶的活性仍有80％，结果表明，蚯蚓纤溶酶经固定化后稳定性得到很大的提高。
(3)测定固定化蚯蚓纤溶酶热稳定性
将相同酶浓度的本发明的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球和蚯蚓纤溶酶游离液在30、40、50、55、60℃下水浴30min，测定酶活，未经热处理的酶活为100％。，计算残余酶活比q，
式中：c0-不同温度下0min时酶活，U；
ct-tmin时酶活，U。
得到游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶的热稳定性图，如图6所示。由图6可知，游离酶和固定化蚯蚓纤溶酶相对酶活随温度变化趋势相似，随着温度升高，相对酶活下降，但是在相同温度条件下，固定化蚯蚓纤溶酶的相对活性比游离蚯蚓纤溶酶的相对活性高，说明经磁性壳聚糖微球固定化后的蚯蚓纤溶酶比游离态的蚯蚓纤溶酶热稳定性好。
Claims (8)
1.一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
（1）磁性壳聚糖微球的偶联：将绿豆胰蛋白酶抑制剂溶于pH 3~9的缓冲液中得到蛋白酶缓冲液，再将其加入到经过活化的磁性壳聚糖微球中，水浴振荡偶联2~14 h， 振荡温度为30-60 ℃，得到偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球；
（2）蚯蚓纤溶酶的固定化：再将偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球加入蚯蚓纤溶酶粗酶溶液在30-60℃恒温水浴摇床中振荡固化反应0.5-3.0 h；反应结束后，用去离子水和pH为6-8的磷酸缓冲液反复洗涤固定化蚯蚓纤溶酶的磁性壳聚糖微球粗品，至洗涤液中检测不出蛋白为止，磁铁分离收集即可得到固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球,其酶活性为25-35 U/mg，在pH 6.5~8.0之间的稳定性能保持在75%以上，储藏时间在30天内固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的酶活性为80%以上。
2.根据权利要求1所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中蛋白酶缓冲液与活化的磁性壳聚糖微球的液固比为5~30:1，水浴振荡偶联4~6h。
3.根据权利要求1所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的缓冲液为柠檬酸钠-磷酸氢二钠缓冲液。
4.根据权利要求1所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，每克偶联绿豆胰蛋白酶抑制剂的磁性壳聚糖微球则加入1~5 mL酶活为1~2万U/mL的蚯蚓纤溶酶粗酶溶液。
5.根据权利要求1所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述活化的磁性壳聚糖微球的制备是将磁性壳聚糖微球，加入NaOH溶液和NaBH4溶液，在30~80℃水浴振荡30~40 min，再加入二甲基亚砜为活化剂，再加入体积分数为10%~60%的环氧氯丙烷，振荡活化2~10 h后，抽滤，用蒸馏水洗涤即可得到活化的磁性壳聚糖微球。
6.根据权利要求5所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述磁性壳聚糖微球与NaOH溶液的重量比为1:5~10，磁性壳聚糖微球与NaBH4溶液的重量比为1:4~12；每克磁性壳聚糖微球加体积分数为40%~60%的二甲基亚砜1.5~9 mL，环氧氯丙烷为1~12 mL。
7.根据权利要求5所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述NaOH溶液的浓度为1.2~2.0 mol/L，NaBH4溶液的浓度为5~10 g/L，环氧氯丙烷的体积分数为30%~50%，在30~50 ℃下振荡活化2~6 h。
8.根据权利要求5或7任一所述的固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法，其特征在于：所述磁性壳聚糖微球的制备方法：
（1）将液体石蜡和Span-80按照重量比为30~50:1混合，在30~50 ℃搅拌1~2 h制备成油相；
（2）称取一定量的壳聚糖，用3~5%的醋酸溶液溶解，待壳聚糖完全溶解后得到浓度为5~10 mg/mL的壳聚糖溶液，加入Fe3O4粉末，超声分散10~20 min，制得到水相；
（3）将水相与油相按照体积比为15~6，将水相缓慢加入油相中，搅拌0.5 ~1.0 h使溶液形成乳液体系；
（4）再向乳液体系中滴加质量分数为25%的戊二醛，继续搅拌1~2 h，用NaOH溶液调pH至9~10，继续反应1~2 h后停止反应，磁铁分离，用石油醚，乙醇和去离子水洗涤至中性，真空干燥，即可得到磁性壳聚糖微球。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510701468.8A CN105200031B (zh) | 2015-10-27 | 2015-10-27 | 一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510701468.8A CN105200031B (zh) | 2015-10-27 | 2015-10-27 | 一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105200031A CN105200031A (zh) | 2015-12-30 |
| CN105200031B true CN105200031B (zh) | 2018-04-06 |
Family
ID=54947993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510701468.8A Active CN105200031B (zh) | 2015-10-27 | 2015-10-27 | 一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105200031B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1673367A (zh) * | 2005-03-23 | 2005-09-28 | 河北大学 | 一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法 |
| CN103289981A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-09-11 | 广州润虹医药科技有限公司 | 一种蚯蚓纤溶酶冻干粉的制备方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006023530A2 (en) * | 2004-08-16 | 2006-03-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for enhancing structural and functional nervous system reorganization and recovery |
-
2015
- 2015-10-27 CN CN201510701468.8A patent/CN105200031B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1673367A (zh) * | 2005-03-23 | 2005-09-28 | 河北大学 | 一种分离蚯蚓纤溶酶单一组分的方法 |
| CN103289981A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-09-11 | 广州润虹医药科技有限公司 | 一种蚯蚓纤溶酶冻干粉的制备方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Enzyme encapsulation in magnetic chitosan-Fe3O4 microparticles;Tales Alexandre Costa-Silva 等;《J Microencapsul》;20140901;第1-6页，尤其是第2页左栏Enzyme immobilisation onto magnetic chitosan部分 * |
| Preparation of Magnetic Chitosan Nanoparticles As Support for Cellulase Immobilization;Limin Zang 等;《Ind. Eng. Chem. Res.》;20141231;第3448-3454页 * |
| 京尼平交联壳聚糖微球的制备及理化性质;熊华 等;《南昌大学学报（工科版）》;20131231;第35卷(第4期);第307-312页，尤其是第308页1.2.1壳聚糖微球的制备方法 * |
| 壳聚糖固定化蚯蚓纤溶酶及其性质;武金霞 等;《河北大学学报（自然科学版）》;20080331;第28卷(第2期);第193-197页，尤其是材料与方法部分 * |
| 磁性蚯蚓纤溶酶脂质体的制备;静天玉 等;《河北大学学报（自然科学版）》;19991231;第19卷(第4期);第360-363页，尤其是对比文件1摘要、讨论部分 * |
| 蚯蚓纤溶酶的分离纯化及抗栓活性研究;何执中 等;《中国生化药物杂志》;20011231;第22卷(第6期);第284-286页，尤其是摘要、第286页右栏 讨论部分 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105200031A (zh) | 2015-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103167866B (zh) | 用于寡核苷酸递送的新型低分子量阳离子脂质 | |
| Wang et al. | Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B-12 | |
| CN102964539B (zh) | 多孔磁性聚苯乙烯微球的制备方法 | |
| US20160008482A1 (en) | Gla domains as targeting agents | |
| Oke et al. | Advances in the application of deep eutectic solvents based aqueous biphasic systems: An up-to-date review | |
| Tarragó et al. | Identification by 19F NMR of traditional Chinese medicinal plants possessing prolyl oligopeptidase inhibitory activity | |
| CN105200029B (zh) | 一种用于蚯蚓纤溶酶固定化的磁性微球及其制备方法 | |
| Borkotoky et al. | Interactions of angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) and SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain (RBD): a structural perspective | |
| Zhang et al. | Synthesis of PEGylated polyglutamic acid peptide dendrimer and its application in dissolving thrombus | |
| CN105200030B (zh) | 一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球的制备方法 | |
| CN105200031B (zh) | 一种固定化蚯蚓纤溶酶的磁性微球及其制备方法 | |
| CN105734025B (zh) | 利用十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵提高苹果中多酚氧化酶活性的方法 | |
| CN105646541B (zh) | 一种原研制品质头孢他啶及其药物制剂 | |
| CN104095811A (zh) | 尼莫地平纳米混悬剂及其制备方法 | |
| Li et al. | Metal–Organic Materials (MOMs) Enhance Proteolytic Selectivity, Efficiency, and Reusability of Trypsin: A Time-Resolved Study on Proteolysis | |
| Yao et al. | Production, purification, and functional properties of microbial fibrinolytic enzymes produced by microorganism obtained from soy-based fermented foods: developments and challenges | |
| CN100506983C (zh) | 一种从矛头蝮蛇毒中提取单一成份巴曲酶的方法 | |
| Zhu et al. | In situ extraction of intracellular l-asparaginase using thermoseparating aqueous two-phase systems | |
| CN103740687B (zh) | 一种制备尿激酶粗品的方法 | |
| CN105087531B (zh) | 一种制备尿激酶的方法 | |
| CN102242102A (zh) | 一种来源于矛头蝮蛇毒x因子激活物的制备方法 | |
| Gribkova et al. | Thrombin inhibitors based on single-stranded DNA aptamers | |
| CN101693748B (zh) | 一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用 | |
| CN100582227C (zh) | 降纤酶的亲和分离材料和降纤酶的亲和纯化方法 | |
| CN104419695B (zh) | 糜蛋白酶原的仿生亲和材料的制备及糜蛋白酶纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |