CN105194672A - hsa-miR-381-3p在结核病治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了hsa-miR-381-3p在结核病治疗中的应用。本发明发现hsa-miR-381-3p抑制物可解除BCG感染对DC细胞中CD1c表达的抑制，促进DC对T细胞的活化，对T细胞增殖、IFN-γ分泌及其杀伤活性也具有显著的促进作用，hsa-miR-381-3p抑制物不仅具有治疗结核病的作用，也具有增强体内免疫力的作用，可应用于免疫增强剂的制备。hsa-miR-381-3p抑制物具有结核感染基因治疗的应用价值，可为结核感染的过继细胞免疫治疗开辟新径，可应用于治疗结核病药物的制备和免疫增强剂的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种可抑制靶向结合CD1c
3’非编码末端（3’UTR）的微小RNA（micorRNA）的抑制物，这种microRNA抑制物转染得到的树突状细胞及其在制备抗结核感染药物中的应用。
背景技术
结核至今仍是全球范围内感染率最高的传染病，病死率仅次于艾滋病。近年来，随着人口流动的增加、HIV与结核分枝杆菌伴发感染、以及多重耐药菌株的流行，使全球结核病死灰复燃，呈现卷土重来之势。据WHO统计，全球3.5％的新发病例和20.5％的以往治疗病例为耐多药结核（MDR-TB），其中9%为广泛耐药结核（XDR-TB）；我国是全球耐多药结核负担最重的国家，每年新发MDR-TB患者12万、XDR-TB患者近1万；前者治愈率不足50%，后者则基本无药可治。因此，寻找新治疗靶点、开创新治疗方法已成为当务之急！
结核杆菌属于胞内寄生菌，体液免疫难以对其发挥作用，抗结核感染的免疫机制是以T细胞为主的细胞免疫。T细胞识别的抗原包括I/II类MHC分子递呈的抗原肽和CD1分子递呈的脂类抗原，MTB是脂类抗原含量最高的微生物，故CD1在抗结核免疫中的作用尤其重要。CD1是I类MHC样非多态性第三类抗原递呈分子，根据基因同源性分为I、II、III类，其中I类CD1递呈的菌类抗原均来源于以结核杆菌为代表的分枝杆菌，提示其在宿主与病原性分枝杆菌的相互作用中占有重要地位。研究表明，I类CD1递呈抗原诱导T细胞免疫反应具有速度快、活化细胞数量大、可形成免疫记忆的特点，对抑制结核杆菌扩增与播散、减少病理损伤具有非常重要的意义。
I类CD1分子包括CD1a、CD1b和CD1c，其中CD1c因其广泛的胞内外分布特点和所递呈抗原的独特性，在抗结核免疫中独树一帜。CD1c是内吞系统中分布最广的CD1分子，表达于胞膜或穿梭于内涵体与溶酶体之间，执行全面巡查内吞系统中脂类抗原的功能。同时，CD1c递呈抗原不依赖内涵体的酸化，因此功能不受MTB抑制吞噬体成熟的免疫逃逸机制影响。CD1c在脾脏边缘区B细胞、活化B细胞、以及绝大部分树突状细胞（dendritic
cell, DC）亚群表面组成性高表达，被认为是介导抗原递呈细胞（antigen
presenting cell, APC）与T细胞相互作用的重要分子。CD1c特异性递呈的结核抗原为聚酮类脂质抗原mycoketide，仅在致病性分枝杆菌中生成，而在非致病性分枝杆菌中缺失，表明其与细菌毒力密切相关。该抗原具有宿主脂质分子所缺乏的结构特征，对其免疫识别不会引发交叉反应而导致宿主组织损伤。此外，mycoketide的分子结构与CD1c的抗原结合槽完美匹配，尽管其在MTB菌体中的表达量低至nM级，仍可诱导出特异的CD1c限制性T细胞，并产生记忆性免疫保护反应。
综上所述，CD1c在抗结核免疫反应中发挥重要作用。然而研究发现，CD1c在DC分化过程中受MTB显著抑制。MTB感染健康志愿者PBMC来源的APC，24 h后APC表面CD1c表达开始减少，且表达水平随感染复数的增加而降低，48 h后完全检测不到，导致对CD1c限制性T细胞株的抗原递呈能力完全被抑制。此外，MTB感染的单核细胞虽能分化为成熟DC，但其CD1c分子表达选择性缺失，将该DC与同种异体脐带血初始T细胞共孵育，T细胞增殖水平显著降低，无法表达IFN-γ，不能有效协助巨噬细胞对胞内MTB的杀伤，提示CD1c表达低下与结核病密切相关。同时，研究显示，对CD1c表达/功能的调节，将直接影响CD1c限制性T细胞的反应水平。在结核潜伏感染者外周血中，可检测到具有免疫保护效应的CD1c限制性T细胞，其活性可被CD1c阻断抗体显著抑制，增殖水平降低约90%，IFN-γ表达水平降低70%以上。用MTB脂类抗原免疫CD1c转基因小鼠，可诱导出抗原特异性CD1c限制的Th1型细胞免疫反应；采用MTB标准毒株H37Rv气溶胶或BCG静脉注射感染该小鼠，3-4周后出现CD1c特异性T细胞免疫反应，8周后肺部荷菌量低于野生型小鼠。上述研究表明，MTB通过下调CD1c表达抑制抗原递呈，调控CD1c表达，可调变宿主抗MTB感染免疫反应，有望成为结核病治疗的新靶点。
目前，文献所报道的MTB感染后CD1c下调多源于其mRNA水平降低的现象，恰与微小RNA（microRNA）调节基因表达的机制之一--通过降解mRNA
poly(A)尾从而降低靶标mRNA稳定性相吻合。microRNA是一类在基因表达调控中发挥极其重要作用的小分子RNA，于转录后水平调节mRNA稳定性与蛋白质翻译效率，在结核免疫中的效应受到越来越广泛的关注。有研究报道，H37Rv感染改变了巨噬细胞（macrophage,
Mφ）的microRNA表达谱，其中显著上调的miR-132和miR-26a靶向抑制IFN-γ信号级联途径中的转录共激活因子p300，从而降低Mφ对IFN-γ的反应性；抑制miR-132和miR-26a后，p300表达上调，提高了Mφ对IFN-γ的反应性，Mφ表面HLA-DR、CD86、FcγRI、CXCL10等表达增加，吞噬能力显著增强。此外，miR-29可降解IFN-γ的mRNA，MTB感染后，miR-29被抑制的转基因小鼠比野生型对照分泌更多的IFN-γ，产生较强的Th1免疫应答，肺病理损伤较轻，肺脾荷菌量也较少，表明通过靶向抑制miR-29，可上调IFN-γ表达水平，从而调控抗结核免疫应答。上述研究表明，microRNA在结核菌与宿主相互作用中发挥重要的调控作用，但其对CD1c表达调控的研究尚未见报道。
在DC中发现并抑制结核感染过程中下调CD1c表达的microRNA，并通过输注microRNA抑制物或过继输注经microRNA抑制物修饰的DC给免疫低下或免疫缺陷的患者，可将保护性免疫传递给受者。直接输注microRNA抑制物，可促进结核患者体内抗原递呈细胞表面CD1c表达水平上调，与过继输注树突状细胞类似，均可增强受者体内CD1c限制性T细胞对靶抗原的特异性识别及杀伤能力并改善患者的免疫状态。
发明内容
本发明的目的在于提供hsa-miR-381-3p在结核病治疗中的应用。
本发明的目的在于提供hsa-miR-381-3p在免疫增强剂制备中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
hsa-miR-381-3p作为结核病治疗靶点的应用。
对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质在制备免疫增强剂中的应用。
进一步的，上述对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质选自抑制hsa-miR-381-3p表达的物质、促进hsa-miR-381-3p降解的物质、抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质中的至少一种。
进一步的，上述抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质选自hsa-miR-381-3p
inhibitor、hsa-miR-381-3p antagomir中的至少一种。
对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质在制备治疗结核病药物中的应用。
进一步的，上述对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质选自抑制hsa-miR-381-3p表达的物质、促进hsa-miR-381-3p降解的物质、抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质中的至少一种。
进一步的，上述抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质选自hsa-miR-381-3p
inhibitor、hsa-miR-381-3p antagomir中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明预测并验证了靶向CD1c 3’UTR的microRNA，并鉴定其抑制物对BCG感染的DC中CD1c的表达以及对T细胞活化水平的影响。结果表明，microRNA抑制物可下调microRNA，并逆转BCG感染对DC中CD1c表达的抑制，促进DC对T细胞的活化，T细胞增殖、IFN-γ分泌及其杀伤活性均显著增高。
附图说明
图1为抑制基因CD1c表达的microRNA（a）及荧光素酶报告基因法验证microRNA对CD1c
3’UTR的靶向结合（b）；其中WT表示pMIR-report-CD1c
3’UTR-wt，Mutant表示pMIR-report-CD1c
3’UTR-mut；RLU表示荧光素酶的活性强度；
图2为hsa-miR-381-3p对原代DC中CD1c表达的调节作用；a为实时荧光定量PCR的检测结果，b为Western
blot的检测结果，c为流式细胞仪检测的结果，d是对c图中各组数据的柱形统计图；
图3为hsa-miR-381-3p对CD1c+细胞系中CD1c表达的调节作用；
图4为结核患者PBMC中hsa-miR-381-3p和CD1c的表达情况；a为CD1c
mRNA的相对表达水平；b为hsa-miR-381-3p的相对表达水平；N为健康志愿者的PBMC；TB为肺结核患者的PBMC；
图5为分化过程中的DC 中CD1c
mRNA与hsa-miR-381-3p的表达情况；
图6为感染了BCG的DC中CD1c与hsa-miR-381-3p的表达情况；a为流式细胞仪检测的结果，b是对a图中表面带CD1c蛋白的细胞数的柱形统计图；c是对a图中细胞表面CD1c蛋白所结合抗体的平均荧光强度的柱形统计图，体现CD1c蛋白的平均表达量；d为实时荧光定量PCR的检测结果；
图7为 hsa-miR-381-3p抑制剂对BCG感染的DC中CD1c表达的调节作用；
图8 为hsa-miR-381-3p抑制剂对感染了BCG的DC活化T细胞效应的调节作用；a为淋巴细胞的增殖水平；b为IFN-γ分泌水平的检测结果，SFC：spot-forming
cells斑点形成细胞；c和d为淋巴细胞表面标志物的检测结果；e为淋巴细胞中CD8+ T细胞对作为靶细胞的DC的杀伤活性检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件操作，例如Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》(第三版)
(Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
以下实施例中，所有计量资料结果用
±s表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较各组间各指标的差异，方差不齐时用Welch校正，采用LSD法进行各组间两两比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3法校正。检验水准α=0.05，双侧检验。采用SPSS17.0
for windows统计软件包进行数据分析。
下述DC是人体内的一种细胞亚群，可由人外周血中分离其前体单核细胞后经体外细胞因子诱导分化获得；PBL是人体外周血中的淋巴细胞，是PBMC分离单核细胞后所余细胞；这两种细胞分离和培养的实验设备要求低，技术成熟。
实施例
1
1
、抑制基因CD1c表达的
microRNA
本实施例通过利用TargetScan、miRanda、miRDB等microRNA数据库，预测并结合实验筛选了大量的可能抑制基因CD1c表达的microRNA，最终发现microRNA：hsa-miR-381-3p能够抑制基因CD1c的表达，其发挥抑制基因表达的机制可能是hsa-miR-381-3p能与CD1c
3’UTR结合（如图1a所示），从而抑制基因CD1c的表达。hsa-miR-381-3p的序列为5’- UACUUAAAGCGAGGUUGCCCUUUGUAUAUUCGGUUUAUUGACAUGGAAUAUACAAGGGCAAGCUCUCUGUGAGUA-3’（SEQ ID NO：1）。
2
、荧光素酶报告基因法验证
hsa-miR-381-3p
对
CD1c
3’
UTR
的靶向结合
方法：
1）合成能与CD1c
3’UTR靶向结合的hsa-miR-381-3p（下文中也称为hsa-miR-381-3p模拟物mimic），如图1a所述，。
2）化学合成hsa-miR-381-3p
inhibitor（中文翻译为hsa-miR-381-3p抑制物），简称为hsa-miR-381-3p-I，本实施例所用到的hsa-miR-381-3p
inhibitor由广州市锐博生物科技有限公司合成，可竞争性地与hsa-miR-381-3p结合，从而阻止hsa-miR-381-3p发挥正常的功能。在本发明的研究过程中还发现hsa-miR-381-3p
inhibitor可能还会引起hsa-miR-381-3p的降解或抑制hsa-miR-381-3p的表达。
3）将编码CD1c
3’UTR的碱基序列：5’- GATATACTTTATGTCACTTAAGCTTAAA CTTGTATTTTCTATGAT -3’ （SEQ ID NO：2）克隆至pMIR-report载体荧光素酶基因下游，构建野生型表达载体pMIR-report-CD1c
3’UTR-wt；同时将编码CD1c
3’UTR的突变序列5’-GATATACTTTATGTCACTTAAGCTTAAACACTCTATTTCTATGAT-3’ （SEQ ID NO：3）克隆至pMIR-report载体荧光素酶基因下游，构建表达载体pMIR-report-CD1c
3’UTR-mut，突变后的CD1c
3’UTR不能再与hsa-miR-381-3p结合。
4）将上述2种荧光素酶报告基因载体，分别与hsa-miR-381-3p、hsa-miR-381-3p-I共转染293T细胞；48 h后，检测荧光素酶活性，同时设立对照组miR-NC、miR-NC-I，分别作为hsa-miR-381-3p、hsa-miR-381-3p-I的对照，细胞中转染了miRNA，但该miRNA本身对细胞活性没有影响。
结果：
荧光素酶活性检测结果如图1b所示，从中可以看出当hsa-miR-381-3p和pMIR-report-CD1c
3’UTR-wt共转染293T细胞时，荧光素酶活性明显降低；而hsa-miR-381-3p-I和pMIR-report-CD1c
3’UTR-wt共转染293T细胞时，荧光素酶活性显著增强；而在突变型载体pMIR-report-CD1c
3’UTR-mut组中均无相应的现象；这说明有CD1c
3’UTR 存在时，microRNA：hsa-miR-381-3p抑制了荧光素酶的表达，而hsa-miR-381-3p-I能够解除hsa-miR-381-3p对荧光素酶表达的抑制作用。进一步说明：hsa-miR-381-3p与CD1c
3’UTR之间存在结合作用，并由此抑制荧光素酶的表达。
3
、
hsa-miR-381-3p
对原代
树突
状细胞
中
CD1c
表达的调节作用
方法：
3 .1采用淋巴细胞分离液分离健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral
blood mononuclear cell，PBMC）；采用密度梯度离心法分离纯化PBMC，具体操作如下：
1) 在15 ml刻度无菌离心管加入适量Ficoll淋巴细胞分离液；
2) 取肝素抗凝的外周静脉血与等量RPMI 1640液充分混匀稀释，用巴斯德滴管吸取2倍体积的抗凝血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意保持界面完整。18~20°C，1800~2000 rpm/min水平离心20~30 min；
3) 离心后管内液体分为四层，上层为血浆和稀释液，管底主要为红细胞和粒细胞层。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的灰白色云雾层；
4) 用吸管插到灰白色层，吸取单个核细胞，置于另一离心管内，加入5倍以上体积的RPMI
1640液，18~20°C，1500 rpm/min离心10 min，洗涤细胞两次去除大部分混杂的血小板后为PBMC；
5) 细胞计数及细胞活力检测：PBMC细胞悬液与1/10体积的0.4 %台酚蓝染液混合，于血球计数板上计数板上角上四个大方格总细胞数，总细胞数的四分之一数乘以104即为每毫升浓度；死细胞可着色台盼蓝，活的不着色，计数200个淋巴细胞，计算活细胞百分率［活细胞率%=（活细胞数/总细胞数）×100%］。
3.2用免疫磁珠从上述所得的PBMC分选出CD14+单核细胞，利用重组人GM-CSF 1000 U/mL、IL-4 500
U/mL诱导其向DC分化；具体操作如下：
1）用免疫磁珠（德国美天旎生物公司）从PBMC中分选CD14+ 单核细胞，并调整细胞数目为5×106/孔，每孔分别加入含重组人GM-CSF
1000 U/mL、IL-4 500 U/mL、2-ME的临床级无血清淋巴细胞培养基；
2）连续培养6天，每隔2天，补加GM-CSF
1000 U/mL、IL-4 500 U/mL，即得原代树突状细胞（DC）。
3.3采用脂质体法，分别将hsa-miR-381-3p、hsa-miR-381-3p-I转染DC，同时设立miR-NC、miR-NC-I组作为对照组；72 h后，分别收集RNA、蛋白与细胞样品。并分别用实时荧光定量PCR、Western
blot和流式细胞术等方法检测各组中CD1c的表达。
结果：
检测结果如图2所示，其中图2a为实时荧光定量PCR的检测结果，其中，hsa-miR-381-3p组中CD1c的表达水平显著下调，而hsa-miR-381-3p-I组中CD1c的表达水平显著上调；图2b为Western
blot的检测结果，GAPDH为内参，从中可以看出hsa-miR-381-3p组中CD1c蛋白表达水平显著下调，而hsa-miR-381-3p-I组中CD1c蛋白表达水平显著上调；图2c和d为免疫荧光结合流式细胞术检测的结果，同样可以看出hsa-miR-381-3p组中细胞表面带CD1c蛋白的细胞数明显降低，而hsa-miR-381-3p-I组中带CD1c蛋白的细胞数明显上升。
上述结果说明hsa-miR-381-3p可显著抑制DC细胞中CD1c的表达；与之相反，hsa-miR-381-3p-I对DC细胞中CD1c表达具有显著促进效应。
4
、
hsa-miR-381-3p
对
CD1c
+
细胞系中
CD1c
表达的调节作用
方法：
1）培养表达CD1c的Jurkat细胞；
2）采用脂质体法，分别将hsa-miR-381-3p、hsa-miR-381-3p-I转染Jurkat细胞，同时设立miR-NC、miR-NC-I组作为对照组；48 h后，实时荧光定量PCR检测CD1c的表达。
结果：
检测结果如图3所示，从中可以看出，与DC中的效应相同，hsa-miR-381-3p可显著抑制Jurkat细胞中CD1c的表达；
hsa-miR-381-3p-I对Jurkat细胞中CD1c表达具有显著促进效应。
5
、结核患者
PBMC
中
hsa-miR-381-3p
和
CD1c
的表达情况
方法：
1） 采用淋巴细胞分离液分离肺结核初治患者与健康志愿者PBMC；
2）流式细胞术检测细胞表面CD1c的表达，实时荧光定量PCR检测hsa-miR-381-3p与CD1c mRNA的表达。
结果：
结果检测如图4所示，从中可以看出结核患者PBMC中CD1c的表达水平显著低于健康志愿者（图4a），而hsa-miR-381-3p的表达水平显著高于健康志愿者（P<0.05）（图4b），与CD1c表达负相关。
6
、分化过程中的
DC
细胞
CD1c
与
hsa-miR-381-3p
的表达情况
方法：
1）采用淋巴细胞分离液分离健康志愿者PBMC；
2）计数PBMC，免疫磁珠分选出CD14+单核细胞，同上诱导其向DC分化；
3）分别在诱导分化 0 h、2 h、4 h、24 h和72 h时，采用实时荧光定量PCR检测CD1c
mRNA与hsa-miR-381-3p的表达情况。
结果：
检测结果如图5所示，从中可以看出，在第0～4 h内hsa-miR-381-3p的表达水平低，尤其是在4 h时，而此时CD1c
mRNA表达水平逐渐升高，在第4～72 h内，hsa-miR-381-3p的表达水平逐渐升高时，伴随着CD1c
mRNA表达水平的逐渐降低。
上述结果说明，在DC细胞的分化过程中，CD1c和hsa-miR-381-3p的表达水平呈负相关。
7
、感染了
BCG
的
DC
细胞中
CD1c
与
hsa-miR-381-3p
的表达情况
方法：
1） 同上分离健康志愿者单核细胞，诱导其向DC分化；
2）诱导DC分化的同时感染卡介苗（BCG），BCG的终浓度为20 μg/mL；
3） 72 h后，流式细胞术检测细胞表面CD1c的表达，实时荧光定量PCR检测CD1c
mRNA与hsa-miR-381-3p的表达。
结果：
检测结果如图6所示，图6a和b为流式细胞术仪检测的结果，可以看出BCG感染组中细胞表面带CD1c蛋白的细胞数明显降低（为1.47%），无BCG感染组为7.88%；图6d为实时荧光定量PCR的检测结果，BCG感染组中，hsa-miR-381-3p表达水平显著上调，而CD1c
mRNA表达水平显著下调。
上述结果说明，BCG感染会引起DC细胞中hsa-miR-381-3p表达上调，
CD1c mRNA表达下调。
8
、
hsa-miR-381-3p
抑制剂对
BCG
感染的
DC
中
CD1c
表达的调节作用
方法：
1） 同上分离健康志愿者单核细胞，诱导其向DC分化；
2）诱导DC分化的同时感染卡介苗（BCG），BCG的终浓度为20 μg/mL；
3） 同一时间，采用脂质体法转染hsa-miR-381-3p-I。
4）72 h后，实时荧光定量PCR检测CD1c
mRNA与hsa-miR-381-3p的表达情况。
结果：
检测结果如图7所示，从中可以看出，加入hsa-miR-381-3p-I后，hsa-miR-381-3p表达水平降低，同时CD1c
mRNA表达水平上升，说明下调hsa-miR-381-3p表达水平可减弱BCG感染对CD1c表达的抑制。
9
、
hsa-miR-381-3p
抑制剂对感染了
BCG
的
DC
活化
T
细胞效应的调节作用
方法：
1）分离健康志愿者CD14+单核细胞，诱导其向DC分化，同时感染BCG（或不感染BCG作为对照组），并转染hsa-miR-381-3p-I或miR-NC-I（作为对照组）；
2）分离健康志愿者外周血淋巴细胞（peripheral
blood lymphocyte, PBL），冻存3天后复苏。
3）3 d后将DC与外周血淋巴细胞混合培养；
4）分别用EdU掺入法检测上述各组细胞中淋巴细胞的增殖水平；用酶联免疫斑点法（The
Enzyme-Linked ImmunoSpot, ELISpot）检测淋巴细胞IFN-γ的分泌水；用免疫荧光染色结合流式细胞术检测淋巴细胞表面标志；用时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved
fluoroimmuno-assay, TRFIA）检测外周血淋巴细胞中CD8+ T细胞（具有杀伤活性的CD1c限制性T细胞均是CD8+T细胞）对DC的杀伤活性。
上述实验共设置了以下4组：
BCG-/miR-NC-I组：未经BCG感染的DC转染miR-NC-I阴性对照；
BCG-/miR-381-3p-I组：未经BCG感染的DC转染hsa-miR-381-3p-I；
BCG+/miR-NC-I组：经BCG感染的DC转染miR-NC-I阴性对照；
BCG+/miR-381-3p-I组：经BCG感染的DC转染hsa-miR-381-3p-I。
结果：
检测结果如图8所示，图8a为淋巴细胞增殖水平的检测结果，当存在BCG感染时，BCG能够抑制DC表面CD1c的表达，使DC对淋巴细胞的活化水平降低，表现为淋巴细胞增殖水平降低，然而，当加入hsa-miR-381-3p-I后，DC细胞表面CD1c表达水平上调，从而对淋巴细胞的活化水平将不受BCG的抑制；图8b为IFN-γ分泌水平的检测结果，不管有没有BCG存在，hsa-miR-381-3p-I均能提高淋巴细胞分泌IFN-γ的水平；图8c和d为淋巴细胞表面标志物的检测结果，从中可以看出转染hsa-miR-381-3p-I组的DC可诱导较高水平的CD4+CXCR5+保护性Th（该亚群Th细胞的保护效应由文献Slight,
S., J. Rangel-Moreno, R. Gopal, Y. Lin, J. B. Fallert, S. Mehra, M. Selman, E.
Becerril-Villanueva, J. Baquera-Heredia, and L. Pavon. 2013. CXCR5⁺ T helper cells mediate protective
immunity against tuberculosis. J. Clin. Invest. 123: 712-726.阐明。）和CD8+ CD107+ CTL（其中，CD107是CD8+ T细胞释放杀伤性颗粒酶过程中、将颗粒酶转运至细胞膜的载体蛋白，可指示杀伤性颗粒酶的释放，从而显示CD8+ T细胞的杀伤活性）；图8e为淋巴细胞中CD8+ T细胞对DC的杀伤活性的检测结果，从中可以看出转染hsa-miR-381-3p-I组的T细胞杀伤水平显著上调。
上述的实验结果显示：hsa-miR-381-3p抑制物（hsa-miR-381-3p
inhibitor）可抑制hsa-miR-381-3p的功能，其可解除BCG感染对DC中CD1c表达的抑制，促进DC对T细胞的活化，对T细胞增殖、IFN-γ分泌及其杀伤活性也具有显著的促进作用，可见hsa-miR-381-3p抑制物（hsa-miR-381-3p
inhibitor）不仅具有治疗结核病的作用，同时也能增强体内的免疫力，也可应用于免疫增强剂的制备。可见hsa-miR-381-3p抑制物（hsa-miR-381-3p
inhibitor）具有结核感染基因治疗的应用价值，可为结核感染的过继细胞免疫治疗开辟新径，可应用于治疗结核病药物的制备和免疫增强剂的制备。
综上所述，所有对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质均可用于结核病的治疗、免疫增强剂的制备。对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质可以是抑制hsa-miR-381-3p表达、促进hsa-miR-381-3p降解的物质、或抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质。抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质可以是hsa-miR-381-3p
inhibitor（hsa-miR-381-3p抑制物）、hsa-miR-381-3p
antagomir（hsa-miR-381-3p拮抗剂）。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 南方医科大学
<120>
hsa-miR-381-3p在结核病治疗中的应用
<130>
<160>
3
<170>
PatentIn version 3.5
<210>
1
<211>
75
<212>
RNA
<213> 人工序列
<400>
1
uacuuaaagc gagguugccc uuuguauauu cgguuuauug acauggaaua uacaagggca 60
agcucucugu gagua
75
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2
<211>
45
<212>
DNA
<213> 人工序列
<400>
2
gatatacttt atgtcactta agcttaaact tgtattttct atgat 45
<210>
3
<211>
45
<212>
DNA
<213> 人工序列
<400>
3
gatatacttt atgtcactta agcttaaaca ctctatttct atgat 45
Claims (7)
1.hsa-miR-381-3p作为结核病治疗靶点的应用。
2.对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质在制备免疫增强剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质选自抑制hsa-miR-381-3p表达的物质、促进hsa-miR-381-3p降解的物质、抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质选自hsa-miR-381-3p inhibitor、hsa-miR-381-3p antagomir中的至少一种。
5.对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质在制备治疗结核病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述对hsa-miR-381-3p具有抑制作用的物质选自抑制hsa-miR-381-3p表达的物质、促进hsa-miR-381-3p降解的物质、抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述抑制hsa-miR-381-3p发挥正常作用的物质选自hsa-miR-381-3p inhibitor、hsa-miR-381-3p antagomir中的至少一种。
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Non-Patent Citations (2)
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| ANDREAS GISEL ET AL.: "miRNAs for the Detection of MultiDrug Resistance: Overview and Perspectives", 《MOLECULES》 * |
| M. BHOMIA ET AL.: "Analysis of microRNAs induced by Venezuelan equine encephalitis virus infection in mouse brain", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
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