CN105191836B - 一种基于扇贝心跳指标的快速选种方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种基于扇贝心跳指标的快速选种方法，本发明对扇贝进行体外、非侵入性无损伤的心跳检测，将获得的扇贝心跳频率和波形作为扇贝快速选种的依据。本发明方法结合了红外感应技术、滤波技术、波形放大技术，能够快速灵敏地捕捉和检测扇贝的心跳频率和波形。与传统方法相比，本方法具有非侵入性、无损伤性、可长期跟踪等特点，而且是首次将扇贝心跳作为快速选种的指标。采用本种方法能够究为虾夷扇贝抗逆品种的选育及抗性指标体系的建立提供了研究基础。

Description

一种基于扇贝心跳指标的快速选种方法

技术领域

本发明属于海洋贝类养殖评价技术领域，具体涉及一种基于扇贝心跳指标的快速选种方法。

背景技术

扇贝是我国重要的海洋经济养殖贝类，其营养丰富，经济价值高，深受国内外消费者的喜爱。我国扇贝养殖历史悠久，养殖成本低，在我国具有开展扇贝养殖的优越条件，发展扇贝养殖潜力巨大。我国的扇贝养殖品种主要包括栉孔扇贝(Chlamysfarreri)、虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)、海湾扇贝(Argopectenirradias)，华贵栉孔扇贝(Chlamysnobilis)等，自然分布在黄渤海、东海、南海等各大海区，其中以海湾扇贝为代表的贝类大规模养殖曾掀起我国海洋水产养殖的第三次浪潮。近年来我国扇贝养殖业逐渐出现种质衰退、养殖病害频发、夏季高温期大规模死亡的现象，造成沿海养殖巨大的经济损失，严重挫伤了扇贝养殖业的积极性。因此，培育高产抗逆特性的扇贝良种是推动扇贝养殖产业发展的有效方法。研究表明，养殖过程中，扇贝机的体抗性会受到海水温度、盐度、溶氧量、饵料等因素的影响，其中而且不同遗传背景的同种扇贝在生长过程中会显示出不同的生理抗性，机体对病害的抵抗力具有显著性差异。抗逆品种的选育是扇贝良种培育的重要方向，但迄今为止扇贝中尚未建立快速、准确、高效的快速选种的方法。

现阶段，扇贝选种的方法更多地关注于壳高、壳长、壳宽、体重、软组织重等生长性状以及扇贝各组织器官的酶活、组分含量等分子指标。这些研究虽然能够从个体水平、细胞水平甚至分子水平(抗氧化能力、机体能量代谢水平)等不同角度在不同程度上指示扇贝的选种指标。但是上述的方法实验周期长、通量低，较难实现实时实地快速测定，而且细胞、分子水平的检测需要活体采样，某种程度上会导致育种候选个体/群体损伤甚至死亡，无法很好的保证其活性作为后续育种和传代的亲本。因此，提供一种具有操作简便、测定迅速、活体检测、实时实地监测的扇贝选种方法就成为扇贝育种的研究热点之一。

发明内容

本发明的目的是建立一种基于扇贝心跳指标的快速选种的方法，利用扇贝心跳频率和波形作为活力指标对扇贝进行快速选种。在不伤害育种参考个体/群体机体活性的基础上，实现心跳活力指标的红外感应无损伤检测，以弥补现有技术的不足，解决现阶段海产经济贝类养殖过程中缺少快速、准确、高效、活体检测的快速选种的问题，从而使心跳作为性状/活力指标，就如同壳高、壳长、壳宽、体重等体尺性状，应用于扇贝的育种工作中。

本发明通过对扇贝的心跳频率和波形进行检测，同时结合相应扇贝个体温度胁迫下耐受时间的测定，建立一种海产经济养殖扇贝快速选种的新方法，为养殖扇贝快速选种提供可靠的技术手段。

本发明提供一种基于扇贝心跳指标的快速选种的方法，包括如下的步骤：

1)将待检测的扇贝个体首先培养5-7天使其适应检测环境；

2)将红外传感器(InfraredSensors)的红外感端粘附到扇贝壳外靠近心脏的位置；

3)检测之前10分钟，将扇贝放到同样温度的充气的水体环境中，待外套膜触须充分伸展之后进行检测；

4)实验数据的采集：

A、心率的检测：

截取扇贝心跳波形图中波形稳定的区域，图像中能够明区分扇贝两个心耳的波形和一个心室的波形；信号的强度在1.45-1.95V之间；

B、心跳波形峰高的检测：

计算10分钟检测时间内所有稳定波形的频率，计算10分钟检测时间内所有稳定波形的平均峰高；

5)数据分析

建立二维坐标系，横轴设定为心率a_i(beatsperminute-bpm)，纵轴设定为心跳波形峰高h_i(V)，并且将横纵坐标进行标准化；将(a_i，h_i)设定为二维坐标系中的点，所有点标准化之后，计算(a_i，h_i)与(a₀，h₀)之间的距离Y_i；根据不同个体的Y_i值选择育种个体；

所述的标准化，其公式如下：

Y_i的计算公式如下：

其中

a₀为同种同龄扇贝最适生长条件下的心率；

h₀为同种同龄扇贝最适生长条件下的峰高；

a_i标表示每个检测扇贝个体标准化之后的心率；

表示所有检测扇贝个体心率的平均值；

ε_a表示所有检测扇贝个体心率的标准差；

h_i标表示每个检测扇贝个体标准化之后心跳波形的峰高；

表示所有检测扇贝个体标准化之后心跳波形峰高的平均值；

ε_h表示所有检测扇贝个体心跳波形的标准差；

Y_i表示在所设定的二维坐标系中，每个检测扇贝个体心跳标准化之后的点(a_i标，h_i标)与同种同龄扇贝最适生长条件下的心率(a₀，h₀)之间的相对距离。

本发明还提供一种基于扇贝心跳指标的快速选种的标准，所述的标准如下：虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)最适生长条件下心率为16.05±1.52bpm，心跳波形峰高为1.62±0.21V；

本发明对扇贝进行体外、非侵入性无损伤的心跳检测，将获得的扇贝心跳频率和波形作为扇贝快速选种的依据。本发明方法结合了红外感应技术、滤波技术、波形放大技术，能够快速灵敏地捕捉和检测扇贝的心跳频率和波形。与传统方法相比，本方法具有非侵入性、无损伤性、可长期跟踪等特点，而且是首次将扇贝心跳作为快速选种的指标。采用本种方法能够究为栉孔扇贝抗逆品种的选育及抗性指标体系的建立提供了研究基础。

附图说明：

图1：本发明中涉及的检测扇贝心跳示意图

图2：本发明中涉及检测到的扇贝心跳波形图

图3：本发明中涉及到检测四种实验扇贝心跳频率随温度的变化图

图4：本发明中涉及到评价虾夷扇贝快速选种的二维坐标分析图

具体实施方式

心率一般是指动物在静息状态下，每分钟心跳的次数；心跳波形反映了心脏兴奋的产生、传导和恢复过程，申请人在长期的研究中发现扇贝的心跳频率和波形可以作为扇贝快速选种的指标。

1、扇贝心跳检测仪器的连接：

(1)红外传感器(InfraredSensors)(CNY-70)的接口端以RJ11连接方式接入Heartbeatmonitor(AMP-03)；

(2)心跳监测器(HeartbeatMonitor)(AMP-03)和数据采集分析系统(PowerLab8/35八通道研究型高速记录主机，含LabChartPro专业版)两端均以BNC连接方式相互连接；

(3)数据采集分析系统(PowerLab8/35八通道研究型高速记录主机，含

LabChartPro专业版)以USB连接方式接入电脑(安装LabCharbv7forWindows)。

2、扇贝心跳检测方法的标准化：

(1)将实验扇贝外壳的附着生物清除干净，放在实验条件下5-7天使其适应实验环境；

(2)将红外传感器(InfraredSensors)(CNY-70)的红外感端用Blu-Tag型胶(蓝丁胶)粘到扇贝壳外靠近心脏的位置(背部围心腔中)；

(3)检测之前10分钟，将扇贝放到充气的5L的实验水体环境中，待外套膜触须充分伸展之后，进行检测，单一实验条件下持续观测10分钟。

3、实验数据的采集：

(1)截取扇贝心跳波形图中波形稳定的区域，图像中能够明显区分扇贝一个心室的波形(短而高的波峰)和两个心耳的波形(长而平的波峰)。信号的强度在1.45-1.95V之间(具有种内和种间差异)。

(2)计算10分钟检测时间内所有稳定波形的频率，将每个个体按上述步骤重复三次或以上，作为此条件下此扇贝个体的心率，作为选种指标一；

(3)计算10分钟检测时间内所有稳定波形的平均峰高，将每个个体按上述步骤重复三次或以上，作为此条件下此扇贝个体的峰高，作为选种指标二；

(4)将检测个体转移到温度为该物种ABT的水体环境中，测定检测个体在ABT温度下的耐受时间。

4、依据心跳指标的快速选种评价：

(1)比较选种指标一-心率(a_i)，相同实验条件下，选种指标一越接近同种同龄扇贝最适生长条件下的心率(a₀)，选种指标越好；

(2)比较选种指标二-峰高(h_i)，选种指标二越接近同种同龄扇贝最适生长条件下的峰高(h₀)，选种指标越好；

(3)综合选种指标一(a₀)和选种指标二(h₀)；

(4)数据分析

建立二维坐标系，横轴设定为心率(bpm)，纵轴设定为心跳波形峰高(V)，并且将横纵坐标进行标准化；将(a_i，h_i)设定为二维坐标系中的点，所有点标准化之后，计算的(a_i，h_i)与(a₀，h₀)之间的距离Y_i。Y_i值越小，快速选种综合指标越大。

下面以心跳频率和波形为指标评价，对温度影响下的虾夷扇贝进行快速选种的方法为例详细叙述本发明的方法

实施例1

1、扇贝心跳检测仪器的连接：

(1)红外传感器(InfraredSensors)(CNY-70)的接口端以RJ11连接方式接入心跳监测器(HeartbeatMonitor)amplifer(AMP-03)；

(2)心跳监测器(HeartbeatMonitor)amplifer(AMP-03)和数据采集分析系统(PowerLab8/35八通道研究型高速记录主机，含LabChartPro专业版)两端均以BNC接口相互连接；

(3)数据采集分析系统(PowerLab8/35八通道研究型高速记录主机，含LabChartPro专业版)以以USB连接方式接入电脑(安装LabCharbv7forWindows)。

2、扇贝心跳检测方法的标准化：

(1)将实验扇贝外壳的附着生物清除干净，放在实验条件下暂养5-7天，使其适应实验环境；

(2)将红外传感器(InfraredSensors)(CNY-70)的红外感端用Blu-Tag型胶(蓝丁胶)粘到扇贝壳外靠近心脏的位置(背部围心腔中)；

(3)实验之前10分钟将扇贝放到充气的、具有升温设备的5L实验水体环境中，待外套膜触须充分伸展之后，进行检测。

初始水温设置为10℃，升温速度设置为0.2℃/分钟，每升温0.2℃，恒温10分钟检测心跳，之后继续升温，直到升温至37℃。持续观测各温度下扇贝的心跳频率和波形。实验扇贝保证不少于6个个体的重复样；

3、实验数据的采集：

(1)截取扇贝心跳波形图中波形稳定的区域，图像中能够明显区分扇贝一个心室的波形(短而高的波峰)和两个心耳的波形(长而平的波峰)；信号的强度在1.45-1.95V之间(具有种内和种间差异)。

(2)计算每个检测温度点10分钟恒温过程中稳定波形的频率作为此条件下此扇贝个体的心率和心率的标准差(SD)，作为快速选种指标一；

(3)用MicrosoftOffice做出每个检测扇贝个体心跳频率随温度变化的曲线图；

(4)计算每个检测温度点10分钟恒温过程中稳定波形的平均峰高和峰高的标准差(SD)作为此条件下此扇贝个体的波高，作为快速选种指标二；

4、依据心跳指标的快速选种评价：

虾夷扇贝为冷水贝，最佳生长温度范围：5-20℃，最佳生长温度范围内心率为16.05±1.52bpm，最佳生长温度范围内心跳波形峰高为1.62±0.21V，ABT(Arrheniusbreaktemperatures即阿列纽斯突破温度)为22℃；

(1)比较快速选种指标一-心率：相同实验条件下，快速选种指标一越接近同种同龄扇贝最佳生长温度范围内的心率，选种指标越好；

在20℃下检测6只不同遗传背景的虾夷扇贝，心跳频率分别为A：20.56±2.33bpm，B：25.37±3.33bpm，C：28.74±3.07bpm，D：22.33±2.67bpm，E：23.67±1.89bpm，F：25.38±2.88bpm。仅从心率指标看，虾夷扇贝A最接近同种同龄扇贝最佳生长温度范围内的心率(16.05bpm)，选种指标越好；

(2)比较快速选种指标二-峰高，快速选种指标二越接近同种同龄扇贝最佳生长温度范围内的峰高，选种指标越好；

在20℃下检测三只不同遗传背景的虾夷扇贝，心跳波峰分别为A：1.63±0.42V，B：1.65±0.72V，C：1.70±0.58V，D：1.83±0.62V，E：1.67±0.47V，F：1.48±0.67V。仅从心跳波峰指标看，A最接近同种同龄扇贝最佳生长温度范围内的峰高(1.62V)，选种指标越好；

(3)综合快速选种指标一和快速选种指标二；

数据分析

建立二维坐标系，横轴设定为心率(bpm)，纵轴设定为心跳波形峰高(V)，将(a_i，h_i)设定为二维坐标系中的点，同时进行标准化；

坐标轴和坐标点标准化之后，计算(a_i标，h_i标)与(a₀，h₀)之间的距离Y_i。Y_i值作为兼具了心率和波形的扇贝快速选种综合指标，Y_i值越小，选种综合指标越大。

在20℃下检测6只不同遗传背景的虾夷扇贝，(a_i，h_i)分别为，A：(20.56，1.63)，B：(25.37，1.65)，C：(28.74，1.70)D：(22.33，1.83)E：(23.67，1.67)F：(25.38，1.48)；(a₀，h₀)为M：(16.05，1.62)。通过公式 标准化之后(a_i标，h_i标)的坐标分别为，A：(‐0.6387，‐0.2327)，B：(0.5442，‐0.0411)，C：(1.37299，0.4380)D：(‐0.2034，1.6834)E：(0.1261，0.1505)F：(0.5467，‐1.6697)；M：(a₀，h₀)为(‐1.7478，‐0.3285)。(a_i，h_i)与(a₀，h₀)之间的距离通过公式分别为，Y_A＝1.1132，Y_B＝2.3099，Y_C＝3.2412，Y_D＝2.5363，Y_E＝1.9342，Y_F＝2.6577；综合选种指标Y_A<Y_E<Y_B<Y_D<Y_F<Y_C，6只虾夷扇贝的选种指标高低为A>E>B>D>F>C。

(4)将检测个体转移到温度为该物种ABT的水体环境中，测定检测个体在ABT温度下的耐受时间。

将6只不同遗传背景的虾夷扇贝放入22℃(虾夷扇贝ABT)的温度下检测，观察每只虾夷扇贝心率出现显著性差异(心律不齐或者心跳骤停)的时间T_i。ABT温度下检测到6只不同遗传背景的虾夷扇贝T_i分别为：T_A＝52min42s；T_B＝28min05s；T_C＝19min25s；T_D＝22min33s；T_E＝39min12s；T_F＝19min44s。

ABT温度下检测到6只不同遗传背景的虾夷扇贝的耐受时间T_A>T_E>T_B>T_D>T_F>T_C，与此三只虾夷扇贝的快速选种指标的大小关系一致，均为A>E>B>D>F>C。

表1依据心跳指标虾夷扇贝不同个体的选种指标Yi和ABT温度下的耐受时间Ti(表1)

虾夷扇贝个体	Yi	Ti
			A	1.1132	52min42s
B	2.3099	28min05s
			C	3.2412	19min25s
D	2.5363	22min33s
			E	1.9342	39min12s
F	2.6577	19min44s

应用本发明方法，在虾夷扇贝最佳生长温度15℃下，检测一龄虾夷扇贝个体(n＝320，取自大连市长海县獐子岛海区)的心率，做好标记后海上笼养，跟踪统计海上养殖过程中死亡率，验证本发明方法在育种工作中的应用。

心跳检测结果显示，320只一龄虾夷扇贝在15℃条件下的心率在6.23bpm-18.64bpm之间变化，呈现较为规则的正态分布；心跳波幅在1.34bpm-1.86bpm之间变化，亦呈现较为规则的正态分布。根据心率和波幅，应用上述统计方法，分别选取320只一龄虾夷扇贝排名前30％(组1，n＝96只)和后30％(组2，n＝96只)分别装笼海上暂养，定期统计各组死亡率(表2)，结果如下：

表2依据心跳指标一龄虾夷扇贝排名前30％(组1，n＝96只)和后30％(组2，n＝96只)的海上笼养死亡率统计

分组	数目	死亡率-1个月	死亡率-3个月	死亡率-6个月
					组1	96	8.48±0.81	13.58±0.72	18.43±1.83
组2	96	15.34±1.67	30.03±2.97	38.42±4.66

以上结果显示，组1和组2各96只一龄虾夷扇贝个体在测定心跳放到海上笼养之后，1个月、3个月、6个月死亡率的组间比较均具有显著性差异(T检验，P<0.05)，验证了心跳作为扇贝快速育种指标的可靠性。为了更好的验证本发明方法的准确性，2014年3月在烟台海益苗业有限公司育苗车间内实验。对不同批次，相同养殖方式的虾夷扇贝进行心跳指标的检测，同时统计生产后亲贝的死亡率和幼苗成活率。结果表明，扇贝心跳频率和波幅接近同种同龄扇贝最适生长条件下的心率指标，亲贝的死亡率和后代成活率均具有显著优势。结果表明本发明的检测标准可以有效的确定扇贝抗性的强弱，从而为扇贝的快速选种和科研提供翔实和有效的实验方法方法，为我国扇贝的高质健康养殖提供技术支撑。

Claims (2)

1.一种基于扇贝心跳指标的快速选种的方法，包括如下的步骤：

1)将待检测的扇贝个体首先培养5-7天使其适应检测环境；

2)将红外传感器的红外感端粘附到扇贝壳外靠近心脏的位置；

3)检测之前10分钟，将扇贝放到同样温度的充气的水体环境中，待外套膜触须充分伸展之后进行检测；

4)实验数据的采集：

A、心率的检测：

截取扇贝心跳波形图中波形稳定的区域，图像中能够明区分扇贝两个心耳的波形和一个心室的波形；信号的强度在1.45-1.95V之间；

B、心跳波形峰高的检测：

计算10分钟检测时间内所有稳定波形的频率，计算10分钟检测时间内所有稳定波形的平均峰高；

5)数据分析

建立二维坐标系，横轴设定为心率a_i(beatsperminute-bpm)，纵轴设定为心跳波形峰高h_i(V)，并且将横纵坐标进行标准化；将(a_i，h_i)设定为二维坐标系中的点，所有点标准化之后，计算(a_i，h_i)与(a₀，h₀)之间的距离Y_i；根据不同个体的Y_i值选择育种个体；

所述的标准化，其公式如下：

Y_i的计算公式如下：

其中

a₀为同种同龄扇贝最适生长条件下的心率；

h₀为同种同龄扇贝最适生长条件下的峰高；

a_i标表示每个检测扇贝个体标准化之后的心率；

表示所有检测扇贝个体心率的平均值；

ε_a表示所有检测扇贝个体心率的标准差；

h_i标表示每个检测扇贝个体标准化之后心跳波形的峰高；

表示所有检测扇贝个体标准化之后心跳波形峰高的平均值；

ε_h表示所有检测扇贝个体心跳波形的标准差；

Y_i表示在所设定的二维坐标系中，每个检测扇贝个体心跳标准化之后的点(a_i标，h_i标)与同种同龄扇贝最适生长条件下的心率(a₀，h₀)之间的相对距离。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法中的Y_i值越小，选种的综合指标越大。