CN105188725B - 靶向真菌细胞壁多糖的抗体 - Google Patents

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Abstract

公开了一种包含一个或多个多糖部分的化合物，所述多糖部分各自独立地由式β(1→4)‑[GlcNH‑R]n‑2,5‑脱水甘露糖表示，其中n是3～500的正整数，并且R是H或酰基。所述化合物可以通过下述过程制造：(a)使壳聚糖与足以将所述壳聚糖部分地N‑酰化的酰化剂反应，产生改性甲壳素/壳聚糖混合聚合物；和(b)使所述改性甲壳素/壳聚糖混合聚合物与脱氨基剂反应以在未酰化的壳聚糖部分处切割所述混合聚合物。所述化合物可用于进行针对真菌感染的免疫。还公开了对所述化合物具有特异性的抗体、此类抗体在针对真菌感染进行保护中的应用。

Description

靶向真菌细胞壁多糖的抗体
背景技术
近年来侵袭性真菌疾病发病率的显著上升，以及出现药物抗性和之前罕见的真菌物种，突出了对于广谱有效的新型治疗和预防性抗真菌治疗策略的需要(3-5)。侵袭性真菌感染的发病率增加可部分归因于免疫受损的患者群体的增多，原因是与获得性免疫缺陷有关的疾病的患者、重症护理病房中的患者、进行手术或免疫抑制性治疗的患者和接受器官或细胞移植治疗的患者的数量不断增长。重要的是，使个体易患侵袭性真菌疾病的风险因素不排除增强有效的免疫响应和有利地响应免疫治疗的可能性(6,7)，承诺开发有效的基于疫苗或免疫治疗的途径来满足该未被满足的医学需要。
影响人类的两种最普遍的病原性真菌-曲霉菌和念珠菌属-占所有健康护理获得性感染的约8-10％，造成的死亡率为30-40％(5,8)。念珠菌物种是美国医院感染败血症的第四大原因，由所有病原性真菌导致的侵袭性真菌疾病的发病率上升带来了全世界的显著护理负担。由于医院获得性真菌感染的停留和治疗长度增加造成的过度护理成本仅在美国即为每年10亿美元。此外，临床分离物的综合抗真菌易感性测试明显得出，即使安全有效的抗真菌药物取得进展，但是对所有类别的当前可获得的抗真菌剂具有抗性菌株的出现(5)。隐球菌性脑膜炎是被隐球菌属真菌感染，也称为隐球菌病，在晚期HIV/AIDS人群中是非常严重的机会性感染。隐球菌病不具有传染性，意味着其不会人-人传播。隐球菌性脑膜炎特别是在隐球菌从肺扩散到脑后发生。作为世界上的全球问题，每年发生约1000000例隐球菌性脑膜炎新病例，导致625,000例死亡。许多病例是机会性感染，其出现在具有HIV/AIDS的人中。虽然在发达国家可广泛获得的抗逆转录病毒治疗(ART)有助于在这些地区减少隐球菌感染，但在获得护理受限的发展中国家这仍然是主要问题。例如在整个撒哈拉以南非洲的大多数地区，隐球菌属现在是成人脑膜炎的最常见原因。隐球菌性脑膜炎是HIV/AIDS患者中前列原因之一，在撒哈拉以南非洲，其可能每年导致与肺结核一样多的人死亡(24)。
抗击真菌疾病的这些重大挑战在于迫切需要高度有效的泛真菌疫苗作为抗真菌武器库的有价值组分。迄今为止，已经开发出两种真菌细胞壁糖组分，β-甘露聚糖和β-葡聚糖，作为用于抗真菌接种的靶标。由线性β-(1→3)-葡聚糖或β-(1→2)-甘露三糖组成的结合疫苗已经显示赋予针对真菌疾病的保护性，在主动和被动性免疫中均具有功效(9-11)。在真菌疾病的动物模型中，β-葡聚糖疫苗证明针对白色念珠菌(C.albicans)、烟曲霉(A.fumigatus)和新型隐球菌(C.neoformans)有效，证实可以针对多种不同的真菌病原体进行成功接种(9,12)。然而，产生有效的疫苗响应需要仔细考虑靶抗原的精细结构，有确凿证据表明真菌病原体使用的一种免疫逃避机制是表达诱导非保护性或抑制性抗体响应的免疫显性表位。这些诱饵表位消除了针对保护性表位的响应的有效性。例如，由线性β-(1→3)-葡聚糖表位组成的疫苗产生保护性响应，而由具有β-(1→6)-葡聚糖枝化物的β-(1→3)-葡聚糖组成的疫苗产生针对两种结构的抗体，但不赋予针对真菌疾病的保护性(13,14)。
另外，疫苗的基础有用性依赖于靶抗原的通用性。例如，β-(1→2)甘露三糖表位不在所有念珠菌属物种中出现，并且使用该表位的疫苗抗原依赖于保护性肽表位以扩展其应用(10)。考虑到一些细胞壁糖表位的有限分布，并且从真菌病原体逃避针对细胞壁组分产生的免疫响应所使用的机制出发，需要广泛有效的真菌疫苗。本发明设计为靶向高度保守的真菌细胞壁糖表位以提供泛真菌疫苗(pan-fungal vaccine)。
尚未检查甲壳素作为抗真菌疫苗的靶标，主要的原因在于其高度不溶的性质。用于将甲壳素降解成可溶性片段的本领域可用的方法在化学计量上不受控，因此难以调节解聚合的程度。
发明内容
本发明提供一种包含一个或多个多糖部分的化合物，所述多糖部分各自独立地由式β(1→4)-[GlcNH-R]n-2,5-脱水甘露糖表示，其中n是3～500的正整数，并且R是H或酰基。
本发明还提供一种用于制造由式β(1→4)-[GlcNH-R]n-2,5-脱水甘露糖表示的化合物的方法，其中n是3～500的正整数，所述方法包括：
(a)使壳聚糖与足以将所述壳聚糖部分地N-酰化的量的酰化剂反应，产生改性甲壳素/壳聚糖混合聚合物；
(b)使改性甲壳素/壳聚糖混合聚合物与脱氨基剂反应以在未乙酰化的壳聚糖部分处切割所述混合聚合物，产生式β(1→4)-[GlcNH-R]n-2,5-脱水甘露糖的化合物。
本发明提供一种使哺乳动物受试对象对真菌性感染或病原体免疫的方法，所述方法包括对所述受试对象施用致免疫量的所述化合物或包含该化合物的组合物。本发明提供一种在哺乳动物受试对象中刺激针对真菌病原体的免疫响应的方法，所述方法包括对所述受试对象施用致免疫量的所述化合物或包含该化合物的组合物。本发明还提供对上述化合物具有特异性的抗体。并且还提供保护哺乳动物受试对象免于真菌感染或病原体的方法，所述方法包括对所述受试对象施用有效保护所述受试对象免受真菌感染的量的抗体。
附图说明
图1:用于制备改性甲壳素片段的反应方案。
用于从壳聚糖一锅制备改性甲壳素片段的反应方案。
图2:改性甲壳素与破伤风类毒素缀合的分析。
考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶显示改性甲壳素片段与破伤风类毒素(TT)蛋白的缀合。
图3:改性甲壳素-TT缀合物的给药和免疫方案。
表格显示用于对Balb/C小鼠施用改性甲壳素-TT缀合物疫苗的给药和免疫方案。
图4:Balb/C小鼠中改性甲壳素-TT缀合物疫苗的免疫原性。
线图显示Balb/C小鼠中改性甲壳素-TT疫苗缀合物的免疫原性。筛选中的抗原是与人血清白蛋白(HSA)交联的改性甲壳素。
图5A:在用改性甲壳素-TT疫苗缀合物免疫的Balb/C小鼠中免疫响应的特异性。
线图比较了与改性甲壳素-HSA筛选抗原结合的疫苗血清的抑制作用。
图5B：在用改性甲壳素-TT疫苗缀合物免疫的Balb/C小鼠中的免疫响应的特异性。
柱状图显示疫苗血清缺乏针对多种含有糖缀合物的GlcNAc的交叉反应性。
图5C:在用改性甲壳素-TT疫苗缀合物免疫的Balb/C小鼠中的免疫响应的特异性。
柱状图显示疫苗血清针对甲壳素/壳聚糖多糖的反应性。左侧图显示，针对改性甲壳素具有反应性的抗体可以由于吸附在特定甲壳素或壳聚糖上而减少。此外，来自甲壳素或壳聚糖的可溶性提取物抑制疫苗血清与改性甲壳素-HSA的结合。右侧图显示，不相干抗体(抗-HA)与其表位的结合不受相同处理影响。
图6:改性甲壳素-TT缀合物疫苗诱导的抗体与全白色念珠菌真菌的结合。
柱状图显示来自空白对照(mock)(PBS)和改性甲壳素-TT免疫的Balb/C小鼠的血清抗体与全白色念珠菌结合。反应性与改性甲壳素片段特异性竞争(competed awaywith)。
图6B：改性甲壳素-TT缀合物疫苗诱导的抗体与全白色念珠菌真菌的结合。
柱状图显示抗原亲和性纯化的甲壳素反应性抗体与全白色念珠菌真菌结合。
图7A：在各种条件下生长的白色念珠菌酵母细胞的形态。
酵母细胞在30C在YPD培养基o/n生长。
图7B：在各种条件下生长的白色念珠菌酵母细胞的形态。
在YPD培养基和血清中于37C生长150分钟的中间体丝状细胞。
图7C:在各种条件下生长的白色念珠菌酵母细胞的形态。
在YPD培养基和血清中于37C生长300分钟的丝状物。
图8A：通过流式细胞术使改性甲壳素和海带多糖疫苗诱导的抗体与全白色念珠菌结合。
用于抗体与酵母细胞结合的检验对照。
图8B：通过流式细胞术使改性甲壳素和海带多糖疫苗诱导的抗体与全白色念珠菌结合。
破伤风类毒素抗体对照与酵母细胞的结合。
图8C：通过流式细胞术使改性甲壳素和海带多糖疫苗诱导的抗体与全白色念珠菌结合
海带多糖抗体(上部)和改性甲壳素抗体(下部)与于30C在YPD培养基o/n生长的酵母细胞的结合
图8D：通过流式细胞术使改性甲壳素和海带多糖疫苗诱导的抗体与全白色念珠菌结合。
海带多糖与于37C在YPD培养基和血清中生长150分钟的酵母细胞的结合。
图8E：通过流式细胞术使改性甲壳素和海带多糖疫苗诱导的抗体与全白色念珠菌结合。
改性甲壳素抗体与于37C在YPD培养基和血清中生长300分钟的酵母细胞(菌丝)的结合。
图9A：改性甲壳素-TT疫苗介导的保护免受白色念珠菌的致死性挑战(challenge)。
将小鼠(Balb/C)用改性甲壳素-TT疫苗免疫，随后用致死剂量的活白色念珠菌挑战。真菌挑战后监视存活36天。
图9B：改性甲壳素-TT疫苗介导的保护免受白色念珠菌的致死性挑战。
将小鼠(CD1)用改性甲壳素-TT和海带多糖-TT缀合物疫苗免疫，随后用致死剂量的活白色念珠菌挑战。真菌挑战后监视存活28天。
图10A：正常人血清与甲壳素、改性甲壳素和海带多糖的通过ELISA进行的免疫反应性。
在改性甲壳素-HSA涂布板上的正常人血清(IgGγ)的反应性。所有血清都显著地与改性甲壳素反应，表明：通过暴露至真菌或其他含甲壳素的外源抗原，在人体中存在天然获得的甲壳素-特异性抗体。
图10B:正常人血清(NHS)与甲壳素、改性甲壳素和海带多糖的通过ELISA进行的免疫反应性。
通过用各种抑制剂进行竞争性抑制得出高滴度NHS与改性甲壳素-HSA涂布板的结合的抗体特异性。针对改性甲壳素的NHS特异性最高，然后是小甲壳素寡糖抑制剂(DP5和DP3)。
图10C：正常人血清与甲壳素、改性甲壳素和海带多糖的通过ELISA进行的免疫反应性。
通过用DP增加的甲壳素寡糖进行竞争性抑制得出高滴度NHS与壳六糖-HSA涂布板的结合的抗体特异性。随着甲壳素寡糖的尺寸从DP2增加至DP6，抑制增加，表明这些人抗体识别最小尺寸为六糖的甲壳素的构象表位。
图10D：正常人血清与甲壳素、改性甲壳素和海带多糖的通过ELISA进行的免疫反应性。
在海带多糖-HSA涂布板上的正常人血清(IgGγ)的反应性。NHS识别海带多糖(β葡聚糖)抗原，不过与改性甲壳素的程度不相同。
图11：通过流式细胞术使改性甲壳素和海带多糖疫苗诱导的抗体与全新型隐球菌A型(H99)结合。
用于抗体与酵母细胞结合的检验对照。
具体实施方式
本发明提供包含一个或多个多糖部分的化合物，所述多糖部分各自独立地由式β(1→4)-[GlcNH-R]n-2,5-脱水甘露糖表示，其中n是3～500的正整数，并且R是H或酰基。在本发明的一个更具体实施方式中，n是3～100、或6～50的正整数。在一个实施方式中，所述酰基R是乙酰基。在另一实施方式中，所述化合物中至少30％的酰基是乙酰基。
技术领域是预防、治疗和检测真菌感染。具体而言，靶向真菌细胞壁的糖组分的疫苗或免疫治疗药可以为弥散性或局部侵入性真菌感染提供治疗。疾病指征是多种的，包括但不限于由念珠菌属、曲霉属和隐球菌属物种的人类病原体形式引起的疾病。另外，针对这些病原性真菌的保守性糖组分产生抗体响应的能力可以得到开发用于检测患者生物样品(例如血浆、血清或其他体液以及组织切片等)中的这些真菌剂的诊断性试剂。最后，由于针对甲壳素的Th2型炎性响应涉及过敏性哮喘和其他过敏性状况(2)，导致向Th1型免疫响应改变的基于甲壳素的疫苗可以改善变应原诱导的炎症的症状。
另一令人感兴趣的基础性细胞壁糖是表面α-1,3-葡聚糖。真菌病原体的成功感染依赖于对宿主免疫机制的瓦解，该免疫机制检测诸如β-葡聚糖等保守性细胞壁组分。较不常见的多糖，α-(1,3)-葡聚糖，是大多数真菌呼吸性病原体的细胞壁成分，并且与致病性相关或者与毒力直接相关。但是，α-(1,3)-葡聚糖增强真菌毒力的确切机制是未知的。α-(1,3)-葡聚糖存在于荚膜组织胞浆菌酵母细胞壁的最外层，并通过掩盖免疫刺激性β-葡聚糖免于被宿主吞噬细胞检测而促成发病机理。吞噬细胞中促炎性TNFα的产生受酵母细胞上α-(1,3)-葡聚糖层的存在抑制，或者受宿主β-葡聚糖受体dectin-1的RNA干扰类耗减抑制。Rappleye等已经功能上定义了影响组织胞浆菌病中的起始宿主-病原体相互作用的关键分子组分，并且揭露了荚膜组织胞浆菌(H.capsμlatum)阻挠宿主免疫系统的重要机制。此外，他们提出该逃避程度有助于导致二态真菌病原体和机会致病性真菌之间的致病潜力的差异(25)。另一研究表明细胞壁α-1,3-葡聚糖对真菌感染的相关性。由于许多真菌物种能够潜在地利用相同或类似的潜入感染策略，靶向真菌α-1,3-葡聚糖，例如通过赋予针对作物植物的α-1,3-葡聚糖酶活性，或者施加真菌α-1,3-葡聚糖合酶的抑制剂而靶向真菌α-1,3-葡聚糖，可以提供用于预防各种重要作物中的真菌疾病的多种策略。虽然详细的机制仍有待解决，事实是在真菌侵入之前，除去表面α-1,3-葡聚糖可快速地激活宿主植物针对真菌病原体的防御响应，引起对病原体感染的抑制(26)。酵母细胞壁对于维持细胞完整性，特别是面对诸如在哺乳动物宿主中生长等挑战时的细胞完整性而言是关键的。病原性真菌新型隐球菌另外经由细胞壁中的α(1-3)葡聚糖将其多糖荚膜锚定至细胞表面。其α葡聚糖合酶基因被扰乱的隐球菌细胞对胁迫(包括温度)敏感，并显示难以分裂。这些细胞缺乏表面荚膜，不过它们持续将荚膜材料脱落至环境中。电子显微镜显示，缺乏通常定位在细胞壁的外部的α葡聚糖，细胞壁的外部区域高度无序，并且内部区域肥大。对细胞壁组分进行的分析表明，α葡聚糖的完全丧失伴随有甲壳素/壳聚糖的补偿性增加、以及β葡聚糖在细胞壁级分之间的再分配。突变体不能在感染小鼠模型中生长，但引起在线虫死亡。这些研究整合α葡聚糖在隐球菌细胞壁中的形态学和生物化学研究(27)。
因此包含甲壳素/壳聚糖和一种或多种葡聚糖抗原(例如含有α-1,3键和/或β-1,3键的均聚物的葡聚糖抗原)的疫苗会靶向高度保守的真菌细胞壁表位，并提供泛真菌疫苗。
本发明提供一种抗真菌缀合物疫苗，其靶向作为横跨多个门的病原性真菌的共有结构元件的保守性糖细胞壁组分。这些疫苗的组分可以包括一个或多个由源自甲壳素的寡糖或多糖组成的表位，该表位可以单独，或者与β-甘露聚糖或葡聚糖表位组合。糖组分可以缀合至合适的免疫原性蛋白载体，例如破伤风类毒素、白喉类毒素或存在于真菌细胞表面上的特定蛋白毒力因子。在本发明的实施方式中，载体蛋白与一个或多个多糖部分在每个所述多糖部分的脱水甘露糖基处直接共价连接。在一个实施方式中，载体蛋白与一个或多个多糖部分经由一个或多个免疫原性支架(scaffold)部分共价连接。可以使用任何常规的支架部分，例如其包括多糖、肽聚糖、多肽和聚甘油。支架可以是线性或树枝状(dendrimeric)的。设想的多组分疫苗可以包括但不限于甲壳素、β-甘露聚糖和/或葡聚糖表位(线性α-1,3-和/或β-1,3-葡聚糖)的简单混合物或者各自与选择的载体蛋白或免疫原性支架缀合的衍生物。
在一个实施方式中，β-甘露聚糖可以是β-1,2-甘露糖四糖。在β-1,2-甘露糖四糖/支架复合物的最简单实施方式中，寡糖可以与改性甲壳素多糖反应而产生多价分子。β-1,2-甘露糖四糖可以化学合成(23)。寡糖的缩合可以通过本领域可获得的用于使寡糖的还原端与改性甲壳素游离氨基之间反应的许多方法中任一种来实现，或者经由配备有方酸酯基的间隔臂实现。另外，本发明设想将支架寡糖/多肽与合适的载体蛋白缀合的另一步骤。这种缀合可以通过本领域从业者可获得的许多手段实现。例如，支架复合物可以通过还原性氨化直接缀合，或者通过使用合适的交联剂(cross-linker)而间接缀合，所述交联剂含有长度适于减少糖构建体和载体蛋白之间的空间阻力的间隔子。在本发明的又一实施方式中，树枝状多糖支架可以通过如下制备：首先使支架组分与多官能交联试剂(cross-linking reagent)(例如三-琥珀酰亚胺基-氨基三乙酸酯(TSAT))反应。该反应会产生树枝状聚合物样形式的可利用支架的多价阵列，以用于β-1,2甘露糖寡糖组分的随后缩合。
作为选择，不同的糖组分可以直接或间接化学交联。例如，可以通过将糖一起连接在常用支架基质(例如树枝状基质)上而对进行结合，或者通过共缀合至蛋白载体上而连接糖。又一实施方式是通过在糖组分之间形成化学交联并且随后将支架多糖基质缀合至免疫原性蛋白或肽载体而将支架与组分直接连接。这些化学交联可以通过本领域从业者可获得的任意数量的手段实现，所述手段包括但不限于还原性氨化或者利用异双官能或同双官能化学交联剂。
本发明提供包含上述化合物的组合物，其中对于所述组合物中至少80％的所述化合物分子，n的值为6～50。在替代性实施方式中，本发明提供包含上述化合物分子的组合物，其中n的平均值为10～50。
测试了产生用于抗真菌疫苗中的甲壳素或壳聚糖衍生片段的方法。部分基于文献(15-18)中可获得的方法，在各种条件下测试许多策略。途径包括直接获得甲壳素寡糖的方法，例如甲壳素的部分酸水解。测试的变量包括时间、温度和反应规模。在所有测试的方法中，溶解度是主要问题，并且所需尺寸的寡糖产率在1％以下的令人失望的范围内，与已公布的产率一致，但是这对于有效的生产疫苗抗原是不期望的。基于已公布的方法还测试了各种条件，以实现对壳聚糖寡糖或多糖的有限亚硝酸脱氨基化，这将游离氨基脱氨基化，并在脱氨基化的残基处伴随有糖苷键切割(聚合物片段化)。对于亚硝酸脱氨基化而测试的变量包括改变亚硝酸的摩尔分数和以不同的壳聚糖尺寸和乙酰化程度开始。在所有这些情况下，亚硝酸处理溶解壳聚糖悬浮物，但是该反应难以控制，并且同样的是所需尺寸的寡糖的产率低。最后，在尝试生产部分脱-N-乙酰化甲壳素作为亚硝酸脱氨基化反应的起始材料时，用NaOH处理甲壳素以在亚硝酸脱氨基化之前实现有限的脱-N-乙酰化。该处理仅产生分子量非常低的甲壳素寡糖。
用本领域的现有方法不能以可接受的产率获得所需尺寸的甲壳素衍生片段，因此提出了用于获得所需产物的另一策略，即，将壳聚糖部分地再N-酰化(例如再N-乙酰化)以生产甲壳素/壳聚糖混合聚合物，其中含有游离氨基的葡萄糖胺残基的数量有限。由于随后的亚硝酸脱氨基化仅发生在含有游离氨基的葡萄糖胺残基处，因此N-酰化葡萄糖胺(例如N-乙酰化葡萄糖胺)残基会抗切割。由于酰化(例如乙酰化)反应在性质上不具有催化性，因此对该反应是否能够通过调节反应中存在的乙酰化剂的摩尔分数来控制进行了测试。通过调整酰化(例如乙酰化)试剂的量，发现可以在随后的亚硝酸脱氨基化反应中直接控制甲壳素衍生片段的大小。此外，由壳聚糖产生改性甲壳素片段的两个反应可以作为一锅反应进行，其由固相酰化(例如乙酰化)反应，和随后的酸化和亚硝酸脱氨基化组成，从而产生改性甲壳素片段。可以使用任何常规酰化剂，例如乙酸酐或乙酰氯(这两种都是乙酰化剂)或N-丙酸酐或丙酰氯(其是丙酰化剂)。
在疫苗制剂中使用甲壳素的主要障碍是其高度不溶性。用于将甲壳素降解成可溶性片段的本领域可获得的方法在化学计量上不受控，因此难以调节解聚合程度。目标在于有效地产生甲壳素衍生片段，所述片段的尺寸足以诱导针对真菌细胞壁中的天然甲壳素的疫苗响应，同时还满足所述片段是可溶的或者足够均匀的从而使它们适于配制为可注射疫苗的潜在竞争标准。以下非限制性实例证明一锅反应在满足这些标准方面是多么的成功。通过利用在化学计量受限反应中使壳聚糖部分地再-N乙酰化的第一步，可以随后以受控方式通过亚硝酸脱氨基化将改性聚合物片段化(实施例1和图1)。
本发明提供一种使哺乳动物受试对象对真菌性感染免疫的方法，所述方法包括对所述受试对象施用致免疫量的上述化合物或组合物。受试对象可以是人类或非人动物。
为了改善糖抗原的免疫原性并且促进T细胞依赖性记忆响应，将改性甲壳素片段缀合至破伤风类毒素。破伤风类毒素是含有多个T-辅助表位的免疫原性蛋白的非限制性实例，这可以使其适合于用作糖缀合物疫苗的蛋白载体。实施例2和图2显示用于将含有醛甲壳素片段与破伤风类毒素经由还原性氨化而缀合的方法的非限制性实例。实施例3和图3提供在测试动物中诱导疫苗响应的免疫策略的典型实例。
如此处所示，在用改性甲壳素疫苗免疫的Balb/C小鼠中的抗体响应的评价证明，疫苗针对免疫抗原(实施例4和图4)和针对全白色念珠菌真菌(实施例6和图6)产生稳健的特异性免疫响应。经空白对照(PBS)免疫的动物展示出基本的与全白色念珠菌(实施例6A和图6A)结合水平，这与之前的真菌暴露一致。用改性甲壳素疫苗进行免疫显著地提高了识别白色念珠菌的血清抗体的滴度，表明针对真菌的适应性响应的增强。白色念珠菌的结合基本上被改性甲壳素片段抑制，证明大部分的血清受体识别甲壳素，并且重要的是，抗体识别在天然真菌中的甲壳素。抗原抑制试验证明针对免疫抗原的疫苗响应有特异性(实施例和图5A)。此外，诱导的抗体与多种含有存在于哺乳动物中的糖缀合物的GlcNAc不显示可检测的交叉反应性(实施例5B和图5B)。这些阴性特异性对照包括O-连接的GlcNAc-丝氨酸(其是主要的胞内聚糖)；卵清蛋白和胎球蛋白(它们都含有许多不同的N-和O-连接的糖抗原)；透明质酸(HA)，其是胞外基质的主要组分；和粗血清(其含有多种糖蛋白)。当将疫苗血清预先吸附在甲壳素或壳聚糖颗粒的悬浮物上或者与可溶性甲壳素/壳聚糖温育时，与改性甲壳素抗原的结合受到显著抑制(实施例5C和图5C)，进一步证明疫苗响应的特异性。疫苗诱导的血清抗体的抗原亲和性纯化显示，甲壳素特异性级分(fraction)能够结合全白色念珠菌。这些数据提供针对真菌细胞壁的保守性关键组分(即，存在于所有已知病原性真菌中的甲壳素)的疫苗。
通过流式细胞术对改性甲壳素疫苗诱导的抗体与白色念珠菌酵母细胞结合进行的分析表明，改性甲壳素抗体阳性染色念珠菌细胞，有约25％的活群体以约1:10稀释度(实施例6C和图8C，下图)结合，进一步支持了实施例6中详解的结合数据。用海带多糖-TT缀合物产生的高滴度海带多糖(β-葡聚糖)抗体也阳性染色白色念珠菌(图8C，上图)。这些数据暗示，两种糖都暴露在真菌的表面。
还通过流式细胞术检查了改性甲壳素抗体以及β-葡聚糖抗体对培养基中生长的各个阶段念珠菌的结合。通过在含有血清的YPD培养基中培养获得酵母细胞(在30℃温育过夜后)和菌丝体(丝状)形式(在37℃分别温育150分钟和300分钟后)(图7A-C)。
流式细胞术染色结果表明，疫苗诱导的海带多糖抗体与念珠菌细胞的结合在酵母细胞上最高，并且随着细胞分化成更具毒力的真菌丝状体形式而降低(图8D)，而改性甲壳素诱导的抗体不受真菌分化阶段的影响，表明其在整个侵入过程中始终有抗原性表达(图8E)。这些结果对于开发有效的泛真菌疫苗制剂的重要之处在于，其强调了为了在整个真菌侵入过程中的最佳功效，需要在疫苗制剂中引入超过一种细胞壁糖组分。
通过流式细胞术对改性甲壳素疫苗诱导的抗体与新型隐球菌A型(H99)酵母细胞的结合进行的分析表明，经改性甲壳素抗体阳性地染色隐球菌细胞，约31％、47％和60％的活群体以1:10稀释分别结合25％、75％和85％改性甲壳素-TT缀合物抗体(实施例6和图11下图)，这进一步支持实施例6中详述的结合数据。用海带多糖-TT缀合物产生的高滴度海带多糖(β-葡聚糖)抗体也阳性地染色新型隐球菌(图11，上图)。对于白色念珠菌，这些数据暗示，两种糖都暴露在隐球菌真菌的表面。
在应对病原性真菌的致死性挑战而进行保护的初步实例中，Balb/C和CD1小鼠接受包含改性甲壳素-破伤风类毒素缀合物的单细胞壁组分疫苗，显示出应对100％致死剂量的活白色念珠菌有部分保护(实施例7和图9A和9B)。在重复致死性挑战试验中，相同的改性甲壳素-破伤风类毒素缀合物疫苗显示应对活白色念珠菌有相似的部分保护，不过其比海带多糖(β-葡聚糖)-破伤风类毒素缀合物或者壳六糖-破伤风类毒素缀合物(图9B)保护更大。这些结果进一步扩展，并且会在使用例如白色念珠菌、烟曲霉和新型隐球菌的类似的体内致死性挑战模型中检查本发明的其他实施方式，例如包含多种细胞壁组分的疫苗(实施例9和图8)的功效。
就此处所示的甲壳素、改性甲壳素和海带多糖抗体是否存在，对正常人血清(NHS)进行分析证明，这些抗体在健康个体中天然获得并存在(图10)。甲壳素抗体似乎以显著水平存在(图10A)，并且这些水平显著高于针对β-葡聚糖的抗体(图10D)，有趣的是注意到甲壳素抗体针对由至少一种DP6糖制成的构象表位(图10C)。这些结果对于设计基于甲壳素的疫苗而言是重要的，因为它们表明最佳缀合物疫苗应该含有具有至少6个GlcNAc残基的甲壳素片段。
如前述说明书中所述产生的疫苗可以配制在药学上可接受的载体中，例如磷酸盐缓冲盐水、正常盐水或其他合适的载体中。另外，疫苗可以优选地包括一种或多种佐剂以增强免疫原性和/或功效。佐剂可以直接添加至疫苗组合物，或者可以分开地施用，与施用疫苗同时施用或者在施用疫苗后施用。不旨在限制，合适的佐剂包括本领域已知的各种佐剂，其单独或组合使用。非限制性实例是诸如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或明矾等铝盐，但也可以是钙、镁、铁或锌的盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子或阴离子衍生的糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。佐剂可以选自例如各种水包油乳液、Toll样受体激动剂(特别是Toll样受体2激动剂、Toll样受体3激动剂、Toll样受体4激动剂、Toll样受体7激动剂、Toll样受体8激动剂和Toll样受体9激动剂)、皂苷或其组合。
产生富有成效的抗体响应的疫苗组合物可以以多种方式使用。例如，疫苗可以用于对有真菌感染风险的患者直接免疫。作为选择，本发明的化合物和组合物可用于分离或产生针对本发明化合物的抗体。可以使用本领域可获得的已知方法制备性质上为多克隆或单克隆的分离抗体。例如，本发明化合物可用于通过本领域从业者公知的方法筛选人类抗体噬菌体展示文库。作为另一实例，本文所述的组合物可用于在合适的宿主中引发抗体响应，并且所得的抗体可以利用本领域已经建立的已知方法通过杂交瘤技术永生化。在另一非限制性实例中，使用本领域已知的方法，本文所述化合物可用于利用人B细胞淋巴瘤技术直接产生人类抗体。由此产生的任何抗体可用于赋予预防性用途或治疗性用途的被动保护。这些分离抗体的用途的非限制性实例可以包括经由免疫疗法针对真菌疾病直接保护，与现有的抗真菌剂组合疗法，或者免疫缀合物制备，例如直接缀合至抗真菌剂。此外，这些抗体可用于开发检测患者样品中的真菌感染的诊断平台。
基于上述产生疫苗抗原(引发针对真菌细胞壁组分的特异性响应)的成就，可以将任何基于前述抗体的策略扩展至抗体片段或工程化抗体衍生物，其可以包括抗体的一个或多个互补决定区(CDR)，或者抗体的一个或多个抗体结合片段。术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、骆驼源化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFv)、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F(ab')片段等，以及以上任一种的表位结合片段。
将存在于真菌细胞壁中的一部分甲壳素用甲壳素脱乙酰酶改性，以产生壳聚糖，有证据证明甲壳素/壳聚糖聚合物的混合物对于正确的细胞壁完整性和功能而言是必需的(19,20)。关于改性甲壳素片段的NMR数据显示，一些残余的游离氨基增加了疫苗同时靶向在甲壳素性细胞壁中包含纯甲壳素以及壳聚糖的区域的可能性。
除了甲壳素之外，β-甘露聚糖和β-葡聚糖聚合物包含真菌细胞壁的基础性糖成分。诱导出靶向特异性β-甘露聚糖和β-葡聚糖等糖的抗体的疫苗已经显示赋予针对真菌疾病的保护，该保护显示基于疫苗的有效性和被动保护(9-11)。迄今为止，未将甲壳素作为抗真菌疫苗靶标进行研究。在体内，这三种糖组分共价交联而形成细胞壁网格(21,22)。由改性甲壳素单独的疫苗制剂或真菌细胞壁的两种以上保守性糖表位的组合组成的疫苗制剂产广泛的保护性疫苗响应。此类组合疫苗可设计为共施用混合物或者设计为更严格地模拟真菌细胞壁表面形貌的交联支架。预期这些疫苗高度有效地诱导泛真菌免疫响应。
通过参考以下实施例会更好地理解本发明，所述实施例说明本文所述的发明，但不构成限制。
实施例
实施例1:对壳聚糖进行的部分再N-乙酰化/脱氨基化，以产生改性甲壳素片段：
-使3g壳聚糖(16.8mmol的GlcNH2；Sigma cat.#419419)悬浮在于250mL圆底烧瓶中的150mL的H2O中，并放置在搅拌板上。
-将795μL的相对于氨基数量为0.5当量的乙酸酐添加至15mL EtOH中。
-经由添加漏斗在30分钟逐滴将乙酸酐溶液添加至搅拌中的壳聚糖悬浮液。反应物变得极具粘性，但仍可以搅拌反应混合物。
-使反应在室温再进行30分钟。
- 18mL的冰醋酸添加至反应混合物，产生～3的pH。
- 6mL的新制备的5％NaNO2水溶液添加至反应，在室温将混合物搅拌1小时。反应释放出大量的气体，并且在反应过程中粘性变小很多。
-将反应混合物用16.5mL的10N NaOH中和。
-在具有7,000分子量阈值的透析膜中将样品相对于4L的1M NaCl透析过夜。在室温进一步将样品相对于4L水透析，所述4L水更换4次。
-在4,000RPM将反应混合物离心15分钟以除去不溶性材料，然后过滤通过0.45um注射器过滤器。
-取出样品以用于HPLC和NMR分析。
实施例2:通过还原性氨化制备改性甲壳素-破伤风类毒素疫苗缀合物：
-将5mg破伤风类毒素(TT,3.3mL，来自3mg/mL的盐水溶液；Sreum StatenInstitute)添加至50mg改性甲壳素片段。
-在室温使席夫碱反应进行6小时。
-将10mg再纯化的氰基硼氢化钠在10μL体积H2O中添加至反应混合物。使反应在室温进行，并在1天和3天后通过SDS-PAGE进行监视。
-反应后，将甲壳素-TT混合物用PBS稀释至～2mL，并相对于4L的PBS透析。将透析样品过滤通过0.45μm注射器过滤器。通过BCA检验将最终透析物定量，并且通过SDS-PAGE和HPLC进行分析。
实施例3：用改性甲壳素-TT疫苗缀合物对Balb/C小鼠免疫：
接受40只雌性Balb/C小鼠，并在标准日夜周期下圈养，提供可随意取用的食物和水。使动物适应所述设施最少一个周，然后随机分成4个组，并如下进行免疫：
1.在第0天通过腹膜内注射递送在弗氏完全佐剂中的PBS乳液(200μL)。在第28和38天，以相同的递送方式使动物接受在弗氏不完全佐剂中的PBS注射。
2.在第0天通过腹膜内注射将改性甲壳素-TT缀合物(25μg的抗原)作为在弗氏完全佐剂中的乳液(200μL)注入10只小鼠。在第28和38天，以与初次免疫相同的递送方式使动物接受在弗氏不完全佐剂中的甲壳素-TT(25μg)的增强注射。
3.根据组2的策略，用改性甲壳素-TT(50μg)注射动物。
4.根据组2&3，用改性甲壳素-TT(100μg)注射动物。
*将在第4、38和50天小鼠放血，并制备血清，以评价甲壳素特异性抗体响应。
在起始注射(研究第4天)之前4天将动物放血，并制备血清，以在免疫前血清中确定抗体滴度。根据上述试验组，在研究第0天将小鼠免疫。将LMW甲壳素-TT抗原以0.25mg/mL、0.5mg/mL和1.0mg/mL的浓度悬浮在PBS中，以1:1的比例与弗氏完全佐剂混合，并涡旋20分钟以形成乳液。在第0天将200μL的含有PBS/弗氏对照或测试抗原(对于总共25μg、50μg或100μg蛋白缀合物，终浓度分别为0.125mg/mL,0.25mg/mL或0.5mg/mL)如上所述通过腹膜内注射施用至各小鼠。对于第28天和第38天的随后增强，类似地在弗氏不完全佐剂中制备抗原并以相同的方式施用。在第38天和第50天将经免疫动物放血，并制备血清，以评价抗体响应。
实施例4：在用改性甲壳素-TT疫苗缀合物免疫的Balb/C小鼠中抗体响应的检验。
-在PBS中制备两种不同的改性甲壳素人血清白蛋白(HSA)缀合物的2μg/mL溶液。
-将100μL的各溶液涂布在96孔检验板的一半孔中(每种抗原1/2板)，并在室温温育过夜。
-将孔用PBST洗涤3次，然后用在PBS中的1％BSA封闭1小时。
-用PBST洗涤孔3次。
-收集改性甲壳素疫苗小鼠血清，并在PBS中1:20稀释。
-处理组如下：
1.PBS/弗氏
2.改性甲壳素-TT/弗氏；25μg/小鼠
3.改性甲壳素-TT/弗氏；50μg/小鼠
4.改性甲壳素-TT/弗氏；100μg/小鼠
- 200μL的10倍稀释的各收集血清样品铺在经甲壳素-HSA涂布微孔板的第一列孔中。
-制备两倍稀释系列稀释物，总共12种不同的血清浓度，范围为1:200～1:409,600。
-使样品在室温温育2小时。
-将板用PBST洗涤3次，然后与100μL以1:2500稀释于1％BSA/PBST中的抗小鼠IgG(γ-链特异性)-HRP一起在室温温育1小时。
-将孔用PBST洗涤3次，然后与100μL的SureBlue Reserve TMB过氧化物酶底物一起在室温温育5分钟。
-用100μL 1N HCl停止反应。
-在微板阅读仪上读取450nm的吸光度。
实施例5：在用改性甲壳素-TT疫苗缀合物免疫的Balb/C小鼠中抗体响应的特异性的检验。
A.抗原抑制
-在PBS中制备改性甲壳素HSA缀合物(批次#2和#3)的2μg/mL溶液。
-将100μL的各溶液涂布在96孔检验板一半的孔中，并在室温温育过夜。
-将孔用PBST洗涤3次，并用在PBS中的1％BSA封闭1小时。
-将孔用PBST洗涤3次，并在4℃贮存直到使用。
-在PBS中制备GlcNAc、HA和改性甲壳素片段2mg/mL溶液，并将200μL的各溶液转移至一组滴度管(titer tube)中。
-制造在PBS中的两倍稀释系列稀释物，用于总共11种不同浓度的各抑制剂，范围2mg/mL～1.95μg/mL，以及不抑制的对照(最终抑制剂浓度1mg/mL～976ng/mL)。
-将来自改性甲壳素-TT/弗氏处理组(100μg/小鼠,第50天放血)的收集样品在1％BSA/PBST中稀释至20:000倍。
-将100μL的稀释血清样品转移至各个滴度管(最终40:000稀释度)，并与抑制剂一起在室温温育30分钟。
-将100μL的各血清样品/抑制剂转移至经改性甲壳素-HSA涂布的微孔板中，并在室温温育2小时。
-将板用PBST洗涤3次，然后与在1％BSA/PBST中以1:2500稀释的100μL抗小鼠IgG(γ-链特异性)-HRP一起在室温温育1小时。
-将孔用PBST洗涤3次，然后与100μL的SureBlue Reserve TMB过氧化物酶底物一起在室温温育5分钟。
-用100μL 1N HCl终止反应，并在微板阅读仪上读取450nm的吸光度。
B.抗体反应性特异性对照
-测试化合物(丝氨酸-O-GlcNAc、卵清蛋白、胎球蛋白、透明质酸(HA)、胎牛血清)除了FBS之外均在PBS中制备为2μg/mL溶液，FBS制备为在PBS中的10％溶液(v:v)。
-将100μL的各溶液涂布至96孔检验板的孔中。在4℃使测试抗原在板中温育过夜。
-将孔用PBST洗涤3次，并用1％BSA/PBS封闭1小时。
-将孔用PBST洗涤3次，并在4℃贮存直到使用。
-通过处理组收集改性甲壳素疫苗小鼠血清，并1:20稀释于PBS中。处理组中如下：
1.PBS/弗氏
2.改性甲壳素-TT/弗氏；25μg/小鼠
3.改性甲壳素-TT/弗氏；50μg/小鼠
4.改性甲壳素-TT/弗氏；100μg/小鼠
-将收集的血清样品进一步在1％BSA/PBST中稀释至最终1:20,000倍。
- 100μL的来自各组的稀释血清样品一式三份地转移至检验板的孔，并在室温温育1小时。
-将板用PBST洗涤3次，然后与在1％BSA/PBST中以1:2500稀释的100μL抗小鼠IgG(γ-链特异性)-HRP一起在室温温育1小时。
-将孔用PBST洗涤3次，然后与100μL的SureBlue Reserve TMB过氧化物酶底物一起在室温温育5分钟。
-用100μL 1N HCl停止反应。
-在微板阅读仪上读取450nm的吸光度。
-注意的是，对于组4的所有重复，ELISA响应均超出线性范围。将这些样品任意分配3.0的值，其接近微板阅读仪的检出限。这些值可能是低估值。
C.甲壳素/壳聚糖吸附和抑制
-在PBS中制备测试化合物(改性甲壳素-HSA或LMW HA-HSA)的2μg/mL溶液。
-将100μL的各溶液涂布在96孔检验板一半的孔中，并在4℃温育过夜。
-将孔用PBST洗涤3次，并用在PBS中的1％BSA封闭1小时。
-用PBST洗涤孔3次。
-同时，将收集的改性甲壳素疫苗小鼠血清在1％BSA/PBS中稀释至终浓度1:5000。
-将HA MAb#2在1％BSA/PBS中稀释至1:2000。
-将5mL的稀释血清样品或HA MAb与100mg的甲壳素或壳聚糖(都制成不溶性悬浮液)一起在4℃在旋转器上温育过夜。
-稀释的甲壳素疫苗#1血清或HA MAb的级分置于4℃以充当阳性对照，并与甲壳素/壳聚糖提取物混合，以用于抑制试验。
-平行地，将甲壳素和壳聚糖与5mL的1％BSA/PBS以相同的方式温育，以提取可溶性甲壳素/壳聚糖而用于抑制测试。
-将样品以4500离心5分钟，以使不溶性甲壳素和壳聚糖成球团析出。
-将上清液级分取出至新管，并在1％BSA/PBS中稀释4倍(对于改性甲壳素疫苗，最终1:20,000；对于HA MAb，最终1:8,000)。
-将未处理的改性甲壳素疫苗血清样品和未处理的HA MAb在1％BSA/PBS(100μLAb或血清+300μL BSA/PBS)中类似地稀释至相当的终浓度。
-对于抑制测试，将未处理血清或Ab溶液用甲壳素或壳聚糖提取物稀释4倍至相当的终浓度(对于改性甲壳素疫苗，最终1:20,000；对于HA MAb，最终1:8,000)。在添加至ELISA板之前，将溶液在室温预温育30分钟。
-一式三份地将100μL的各样品添加至涂布有改性甲壳素-HSA或LMWHA-HSA的ELISA条带。
-使样品在条带中在室温温育1小时。
-将条带用PBST洗涤3次，然后与100μL以1:2500稀释于在1％BSA/PBST中的抗小鼠IgG(γ-链特异性)-HRP一起在室温温育1小时。
-将孔用PBST洗涤3次，然后与100μL的SureBlue Reserve TMB过氧化物酶底物一起在室温温育5分钟。
-用100μL 1N HCl停止反应。
-HA ELISA样品显色非常迅速，因此反应在～1内终止。类似地，在改性甲壳素疫苗样品中的阳性对照显色迅速，因此反应在2分钟后停止。
-在微板阅读仪上读取450nm的吸光度。
实施例6:经改性甲壳素-TT疫苗免疫的Balb/C小鼠的血清抗体针对白色念珠菌全细胞的免疫反应性的检验
A.全血清与白色念珠菌细胞的结合
-从Saboraud右旋糖琼脂板挑选白色念珠菌的单集落，将其用于接种2mL的YPD生长培养基。使培养物在30℃生长过夜，在250RPM摇晃。
-将100μL的5x106细胞/mL悬浮液添加至胺表面改性的条带孔微量板的各孔中。使细胞在室温静置1小时。
-将100μL的在PBS中的2％戊二醛溶液添加至各孔。
-使细胞在室温交联过夜。
-吸掉固定剂，并用PBST洗涤孔3次。
-将孔在室温用在PBS中的1％BSA封闭1小时。
-同时，将收集的改性甲壳素疫苗小鼠血清在1％BSA/PBS中稀释至1:20,000浓度。
-一式三份地在滴度管中分配100μL的2mg/mL改性甲壳素或PBS。
-对于抑制测试，将100μL的血清添加至含有抑制剂(对于改性甲壳素疫苗血清样品，最终1:40,000；对于抑制剂为1mg/mL)的试管。在添加至ELISA板之前，将溶液在室温预温育30分钟。
-将100μL的各样品添加至经白色念珠菌涂布的条带孔板。使样品在室温温育1小时。
-将带用PBST洗涤3次，然后与100μL以1:2500稀释于1％BSA/PBST中的抗小鼠IgG(γ-链特异性)-HRP一起在室温温育1小时。
-将孔用PBST洗涤3次，然后与100μL的SureBlue Reserve TMB过氧化物酶底物一起在室温温育。
- 2分钟后用100μL 1N HCl停止反应。
-在微板阅读仪上读取450nm的吸光度。
B.亲和性纯化的改性甲壳素反应性抗体与白色念珠菌的结合
-将20mg的改性甲壳素和高碘酸盐氧化的HA溶解在pH 7.5的2mL的20mMNaPO4中。经氧化HA需要在室温过夜以溶解。
-将UltraLink酰肼凝胶(4mL的浆料，2mL的沉降树脂)用5体积的pH 7.5的20mMNaPO4洗涤。
-将溶解的糖添加至经洗涤树脂中，使其在室温反应24小时。
-将未结合材料排走，并用以下洗涤树脂：
1. 20柱体积的20mM NaPO4,pH 7.5。
2. 5柱体积的10X PBS。
3. 10柱体积的1X PBS。
-将收集的改性甲壳素疫苗小鼠血清(来自PBS对照组和100μg的改性甲壳素-TT免疫组)在1％BSA/PBS中稀释至起始浓度1:40。
-将100μL(200μL浆料)的改性甲壳素和经氧化HA UltraLink酰肼凝胶在微量旋转柱中用500μL的PBS洗涤。
-将200μL的各血清和亲和性树脂混合并在室温温育1小时。
-通过在8500RPM离心30秒除去未结合材料。
-将树脂用500μL PBST洗涤3次。
-将pH 2.8的200μL的0.2M甘氨酸添加至各树脂，使其相互作用～3分钟。
-洗脱的蛋白质通过离心直接收集至含有pH 8的50μL的1M Tris的管中。
-从Sabouraud右旋糖琼脂板挑选白色念珠菌的单集落，并用于接种2mL的YPD生长培养基，使培养物在30℃生长过夜，同时以250RPM摇晃。
-将100μL的1x107细胞/mL悬浮液添加至胺表面改性的条带孔微量板的各孔中。使细胞在室温沉降2小时。
-将100μL的在PBS中的2％戊二醛溶液添加至各孔。
-使细胞在室温交联1小时。
-仔细地吸掉固定剂，并用PBST洗涤孔3次。
-将孔在室温用在PBS中的1％BSA封闭1小时。
-将抗原亲和性纯化的抗体用在PBS中的1％BSA稀释1:1,000。
-在滴度管中制备2倍稀释系列稀释物。
-将100μL的抗体稀释液一式三份地添加至白色念珠菌涂布板。
-使样品在室温温育1小时。
-将板用PBST洗涤3次，然后与100μL以1:2500稀释于1％BSA/PBST中的抗小鼠IgG(γ-链特异性)-HRP一起在室温温育1小时。
-将孔用PBST洗涤3次，然后与100μL的SureBlue Reserve TMB过氧化物酶底物一起在室温温育5分钟。
-用100μL 1N HCl停止反应。
-在微板阅读仪上读取450nm的吸光度。
C.通过流式细胞术进行的疫苗诱导的抗体与白色念珠菌的结合
念珠菌细胞:使用灭菌环，将来自冷冻原液的白色念珠菌在SDA板上划线培养，并在30C温育。使用接种环挑选来自SDA板的单集落，将其接种至含有50ml YPD的250-ml烧瓶中，在150rpm摇晃下于30C温育至少18小时。对于使用念珠菌菌丝体阶段的试验，将细胞在37C在含有血清的YPD中温育150分钟和300分钟，然后O/N温育，以诱导和促进分化成念珠菌的菌丝体阶段。将O/N培养物转移至50ml管中，在1000g离心20分钟，并用2ml PBS溶液洗涤球团至少3次。将球团再悬浮于2ml PBS中，调整浓度至0.1OD600(4x106/ml)。
隐球菌细胞:使用灭菌环进行来自原液的真菌过夜划线生长，并且将菌株新型隐球菌A型冷冻原液划线，以在SDA板上分离，并在30℃温育。使用接种环挑选来自SDA板的单集落，将其接种至含有50ml YPD的250-ml烧瓶中，在以150rpm摇晃下于30C温育至少18小时。对于使用隐球菌菌丝体阶段的试验，将细胞在37C在含有血清的YPD中温育150分钟和300分钟，然后O/N温育，以诱导和促进分化成念珠菌的菌丝体阶段。将O/N培养物转移至50ml管中，在1000g离心20分钟，并用2mlPBS溶液洗涤球团至少3次。将球团再悬浮于2mlPBS中，调整浓度至1.0的OD600读数(4x107/ml)。
血清和抗体:来自各种疫苗组的小鼠血清以1:10、1:50和1:100稀释在PBS中，并以15μl体积/管来使用。将对照抗体稀释为：针对念珠菌的小鼠mAb，1:5、1:10和1:20稀释度；针对念珠菌的兔pAb，1:50,1:100和1:200稀释度，并以20μl体积/管来使用。FITC-标记的二抗以1:25稀释在PBS中，并以15μl/管而使用。碘化丙啶以在PBS中的1:2(5μl/管)而使用。
流式细胞术:将约100μl的真菌细胞转移至管中，加入合适的血清和抗体，并在冰上温育60分钟。然后将细胞用1ml PBS洗涤2次(通过在40C以1000g旋转10分钟，倾析出上清液)，然后在避光的冰上与二抗一起温育30分钟。
添加稀释的碘化丙啶(不洗涤)，将细胞在冰上另外温育10分钟，然后2PBS洗涤，最后在200μl的1％多聚甲醛中固定。然后在FACS Calibur仪器上获得数据。
实施例7:改性甲壳素-TT疫苗赋予针对白色念珠菌病原性真菌的致死性挑战的保护。
A.用改性甲壳素-TT疫苗免疫Balb/C小鼠，用壳六糖(Chitoheaose)-TT和海带多糖-TT缀合物免疫CD1小鼠。
-接收使40只雌性小鼠接受，并在标准日夜周期下圈养，提供可随意取用的食物和水。使动物适应所述设施最少一个周，然后随机分成2个组，并如下进行免疫：
-首先，将Balb/C小鼠分成2个组，n＝20小鼠/组：
1.PBS/弗氏；200μL/小鼠；腹膜内注射
2.工序甲壳素-TT/弗氏；200μL/小鼠；腹膜内；100μg/小鼠
-对于空白对照免疫的对照动物，在第0天通过腹膜内注射将在弗氏完全佐剂中的PBS乳液(200μL)递送至20只小鼠。在第28和38天，以与初次免疫相同的递送方式使动物接受在弗氏不完全佐剂中的PBS注射。
-对于疫苗接种组，在第0天通过腹膜内注射将改性甲壳素-TT缀合物(100μg的抗原，作为在完全弗氏佐剂中的乳液)递送至20只小鼠中(200μL)。在第28和38天，以与初次免疫相同的递送方式使动物接受在不完全弗氏佐剂中的甲壳素-TT(50μg)的增强注射。
-在第-4、38、50和62天将动物放血，制备血清以用于评价抗体响应。
-使用相同的策略来用改性甲壳素-TT、海带多糖-TT和壳六糖-TT缀合物免疫CD1小鼠。
B.用致死剂量的白色念珠菌挑战经甲壳素-TT疫苗免疫的Balb/C和CD1小鼠
将来自以上每个免疫组中的动物随机分成3组，每个免疫群10只，并如下用白色念珠菌接种。
试验组:n＝10只小鼠/组，随机分组
组1和2包含来自经PBS(空白对照)免疫的动物中的动物
1.盐水；200μL/小鼠；尾静脉注射
2. 5x106白色念珠菌；200μL，来自2.5x107CFU/mL；尾静脉注射
组3和4包含来自经改性甲壳素TT免疫的动物中的动物
3.盐水；200μL/小鼠；尾静脉注射
4. 5x106白色念珠菌；200μL，来自2.5x107CFU/mL；尾静脉注射
监视小鼠:
1.每日检查小鼠的死亡率和危难征兆(signs of distress)：
食物和水消耗减少、重量损失、自我孤立/躲藏、呼吸急促、张嘴呼吸、运动增加/减少、异常姿势/定位、脱水、抽搐、颤抖和震颤。
2.将显示危难征兆并伴随有任何下述情况的小鼠定义为濒死：运动受损(无法够到食物和水)、肌肉萎缩的证据或消瘦的征兆、昏睡(嗜睡、厌恶活动、缺乏身体或精神警觉性)、长期厌食、呼吸困难和神经紊乱。当它们看起来濒死和死亡似乎逼近时，将小鼠安死术。将死亡日期记录为下一天。
实施例8:检测和表征在人正常血清中的甲壳素和β-葡聚糖抗体
在PBS中制备不同人血清白蛋白(HSA)缀合物(改性甲壳素、壳六糖和海带多糖)的2μg/mL溶液。
-将100μL的各溶液涂布在96孔检验板一半的孔中(每种抗原1/2板)，并在室温温育过夜。
-将孔用PBST洗涤3次，并用PBS中的1％BSA封闭1小时。
-用PBST洗涤孔3次。
-正常人血清以1:20稀释于PBS中。
- 200μL的10倍稀释的各收集血清样品铺在经各种HSA涂布微孔板的第一列孔中。
-制备两倍稀释系列稀释物，总共12种不同的血清浓度，范围为1:200～1:409,600。
-使样品在室温温育2小时。
-将板用PBST洗涤3次，然后与100μL以1:2500稀释于1％BSA/PBST中的抗人IgG(γ-链特异性)-HRP一起在室温温育1小时。
-将孔用PBST洗涤3次，然后与100μL的SureBlue Reserve TMB过氧化物酶底物一起在室温温育5分钟。
-用100μL 1N HCl停止反应。
-在微板阅读仪上读取450nm的吸光度。
实施例9:制备β1,3葡聚糖/甲壳素缀合物破伤风类毒素疫苗。
以下是制备包含真菌细胞壁的两种以上保守性组分的组合真菌疫苗的数个所提出方法中的一个实例。在该实例中，海带多糖(β-1,3葡聚糖的线性、未支化的聚合物)还原并用高碘酸钠氧化，随后经由还原性氨化与壳聚糖直接缀合，最终将交联的糖缀合至破伤风类毒素。
-通过标准方法将海带多糖用硼氢化钠还原，随后用高碘酸钠氧化。
-将100mg的经氧化海带多糖溶解于PBS(在37℃数分钟以溶解)，并与低分子量壳聚糖以1:5的比例混合。壳聚糖保持为不溶性悬浮液。
-反应置于37℃摇晃温育器中进行24小时。
-添加20mg的NaCNBH3，使反应在37℃继续另外24小时。
-将反应悬浮液转移至一次性塑料柱，用H2O充分洗涤不溶性材料以除去任何残留的未反应海带多糖。
-将洗涤的不溶性材料再悬浮于5mL的10％乙酸水溶液中。
-添加1mL新制备的亚硝酸钠水溶液，使反应在室温进行60分钟。大多数不溶性材料在反应过程中进入溶液。
-将反应混合物在4500xG离心5分钟，以除去残留的不溶性材料。对可溶性级分进一步如下所述进行处理。
-将可溶性级分稀释于15mL、终浓度1M NaCl中，并针对4升H2O透析，对H2O进行4次更换。将经透析材料冻干以提供松软的白色粉末，总产量90mg。
-通过SEC HPLC分析多糖缀合物，通过1H NMR确认产物中甲壳素和β-葡聚糖的存在。
-将10mg破伤风类毒素(TT,3.3mL，来自3mg/mL的盐水溶液)添加至40mg的海带多糖-甲壳素缀合物。
-将2μL等分试样的样品添加至98μL的1X LDS样品缓冲盐+5μL的1MDTT以用于SDS-PAGE分析。
-将另一2μL的样品添加至98μL的1X PBS中，以用于HPLC分析。
-使溶液在摇晃温育器(300RPM)中在37℃反应24小时。
-将再纯化的氰基硼氢化钠40mg直接添加至反应。使反应在摇晃温育器(300RPM)中在37℃进行24小时。
-反应后，将缀合反应在具有10,000MWCO膜的Amicon超滤装置中浓缩至～2.5mL。将样品针对4L的PBS透析，透析液更换3次。通过BCA检验将最终透析物定量，并且通过SDS-PAGE和SEC HPLC进行分析。将样品调整至浓度为1mg/mL，将其通过0.22微米过滤器无菌过滤。
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Claims (17)

1.一种包含一个或多个多糖部分的化合物，所述多糖部分各自独立地由式β(1→4)-[GlcNH-R]n-2,5-脱水甘露糖表示，其中n是3～500的正整数，并且R是H或酰基，并且所述一个或多个多糖部分是甲壳素/壳聚糖混合聚合物；
并且所述化合物还包含与所述一个或多个多糖部分共价连接的载体蛋白，所述载体蛋白与所述一个或多个多糖部分在每个所述多糖部分的脱水甘露糖基处直接共价连接，或者与所述一个或多个多糖部分经由一个或多个免疫原性支架部分共价连接，
其中所述载体蛋白选自由破伤风类毒素、白喉类毒素以及真菌蛋白毒力因子组成的组，并且每个所述支架部分选自由多糖、肽聚糖、多肽和聚甘油组成的组。
2.如权利要求1所述的化合物，其中n是3～100的正整数。
3.如权利要求2所述的化合物，其中n是6～50的正整数。
4.如权利要求1所述的化合物，其中所述酰基R是乙酰基。
5.如权利要求1所述的化合物，其中所述化合物中至少30％的所述酰基是乙酰基。
6.如权利要求1所述的化合物，其中所述支架是线性的。
7.如权利要求1所述的化合物，其中所述支架是树枝状的。
8.如权利要求1或7所述的化合物，所述化合物还包含与所述载体蛋白或所述支架共价连接的一个或多个线性β-甘露聚糖或葡聚糖表位。
9.如权利要求8所述的化合物，其中所述β-甘露聚糖是β-1,2-甘露糖四糖。
10.如权利要求8所述的化合物，其中所述一个或多个葡聚糖表位中的一个是线性α-1,3-葡聚糖表位。
11.如权利要求8所述的化合物，其中所述一个或多个葡聚糖表位中的一个是线性β-1,3-葡聚糖表位。
12.一种包含权利要求1～11中任一项所述的化合物的组合物，其中对于所述组合物中至少80％的所述化合物的分子，n的值为6～50。
13.一种包含权利要求1～11中任一项所述的化合物的组合物，其中n的平均值为10～50。
14.权利要求1～13中任一项所述的化合物或组合物在制备使哺乳动物受试对象对真菌病原体免疫的药剂中的应用，所述药剂包含致免疫量的所述化合物或组合物。
15.如权利要求14所述的应用，其中，所述受试对象是人受试对象。
16.一种对权利要求1～5中任一项所述的化合物具有特异性的抗体。
17.对权利要求1～5中任一项、12或13所述化合物或组合物具有特异性的抗体在制备保护哺乳动物受试对象免受真菌感染的药剂中的应用，所述药剂包含有效地保护所述受试对象免受真菌感染的量的所述抗体。
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