CN105188674A - 脂质体制剂及制造 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有治疗性试剂的脂质体制剂和用于制备所述制剂的方法。所述脂质体制剂具有增强所述制剂的均匀性和稳定性的特殊性质。所述制造方法是一种新颖的方法，该方法制造出具有均匀尺寸的脂质体制剂，该脂质体制剂带有可以独立地控制的很多期望性能。而且，本发明还涉及根据所述制造方法制得的脂质体制剂。

Description

脂质体制剂及制造

技术领域

本发明涉及一种新颖的脂质体制剂以及用于所述脂质体制剂的制造方法。

背景技术

本领域已知的是，脂质体用作载体将治疗性试剂输送至被靶向的细胞以治疗各种医疗病症的载体。在一种应用中，脂质体可以被配制成包封能够被巨噬细胞选择性吞噬的药学试剂。一旦吞噬，所述脂质体就在细胞内释放出所述试剂，从而抑制巨噬细胞的炎症性功能以及其他影响。

现有技术描述了用于制备这样的脂质体的若干种方法(参见例如J.等,1994,J.DrugTarget,2:299-308；J.等,1993,Calcif.TissueInt.,53:139-145；LasicDD.,LiposomesTechnologyInc.,Elsevier,1993,63-105.(chapter3)；WinterhalterM,LasicDD,ChemPhysLipids,1993；54(1-3):35-43)。在一种这样的方法中，脂质体被形成为多堆叠的液态晶体双层，所述液态晶体双层被水化成经水化的液态片材，在振动的过程中该脂质片材脱离并且自行闭合以形成大的多层囊泡(MLV)，这称为脂质薄膜水化技术。一旦形成这些颗粒，这些颗粒的尺寸取决于在该工艺的随后步骤中所使用的方法，例如声能(声波处理)或机械能(挤出)。声波处理通常制得小的单层囊泡(SUV)并且需要浴式和/或探头末端式超声仪。作为选择，脂质挤出(其在高压下(高达500psi)迫使脂质悬浮液通过一系列的聚碳酸酯过滤器(通常为0.8μm、0.4μm、0.2μm和0.1μm膜))，制得具有与所用的过滤器的孔隙尺寸近似的直径的颗粒。这些方法限于小批量生产，主要用于研究目的。而且，高压挤出技术与高操作成本和时间相关联。因此，本领域仍然需要可用于商业规模制造的脂质体制造方法，该方法具有再现性并且解决了包括脂质体生产的质量控制、稳定性、规模化和无菌在内的问题。

另外，本领域已知的是，脂质体制剂在尺寸和形状上基本是不均匀的，而这一点是提供无菌产品并且避免异常大的脂质体的潜在毒副作用的药物组合物的关键特征。目前，难以制造具有均匀尺寸的脂质体制剂。通过一系列的过滤器包括例如100nm聚碳酸酯过滤器的多层囊泡的挤出工艺无法一致地生产出具有基本均匀的尺寸为100nm的脂质体群的制剂。实际上，根据脂质体的物理特性，例如可压缩性和/或稳定性，挤出囊泡的平均囊泡直径可能相当大程度上取决于所使用的过滤器的类型和尺寸。因此，需要能够生产出尺寸和形状基本均匀的脂质体的制造方法。

而且，脂质体制剂的很多物理特性影响对脂质体的细胞反应并且影响作为药物组合物的脂质体的有效性。脂质体制剂的物理特性在很多方面受到制造方法的影响。然而，现有技术没有解决如何在配制工艺中能够控制脂质体性能以控制制造效率和脂质体稳定性。因此，需要一种大规模的制造工艺，该制造工艺具有成本效率，而且还能够控制脂质体制剂的特性以生产出基本均匀并且适合于临床使用的脂质体。

发明内容

本发明描述了包封治疗性试剂的新颖脂质体。本发明还涉及具有高度尺寸均匀性的脂质体制剂，这样的尺寸均匀性导致副作用最小化并且增加了灭菌工艺的可信度。本发明还描述了有效的并且具有成本效率的制造方法，该方法用于在低压挤出条件下制备脂质体。通过这种方法配制的脂质体具有期望的特性和有效的治疗性能。

所述脂质体制剂的特征在于脂质体具有期望的组成和物理特性。所述脂质体包含包封治疗性试剂的脂质组分。根据本发明的一个方面，所述脂质组分包含优选为摩尔比是3:1:2(DSPC:DSPG:胆固醇)的二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇。

所述脂质体由脂质组分和治疗性试剂组成，具有以重量计为约1:5至1:8优选为1:6至1:7的所述治疗性试剂的质量和所述脂质组分的质量的比率(称为药物：脂质比)。所述药物：脂质比增强了稳定性和有效性，并且还影响药物的释放和脂质体完整性。这些和其他结构特性赋予本制剂预想不到的益处。

本发明的脂质体的尺寸范围为30nm至500nm，优选为70nm至120nm，100nm至300nm，100nm至180nm、和70nm至150nm，这取决于所使用的载体和治疗性试剂的类型。在一个优选的实施方式中，所述脂质体的尺寸可以为80±5nm。

所述脂质体组合物的其他物理特性也显著地有助于其稳定性和有效性。例如，所述脂质体的电导率可能会影响选择性吸收到吞噬性细胞中。在一个实施方式中，所述电导率为13.5ms/cm至17.5ms/cm。类似地，所述制剂的外部和内部渗透压(osmolality)影响稳定性和有效性。优选的是，外部渗透压与人类身体的渗透压相匹配，而内部渗透压低至足以增强所述制剂的稳定性。在一个实施方式中，所述内部渗透压为340osmol/kg至440osmol/kg。另一个有利的参数为所述脂质体和/或所述脂质体制剂的pH。例如，所述脂质体制剂的约6.9的内部pH对长期稳定性以及药物渗漏速率和药物包封能力具有有利的影响。

本发明的所述脂质体与现有技术的那些脂质体相比相对刚性，这是作为具有可压缩性较低的脂质体膜的特征。本发明的脂质体具有小于0.7ml/g的可压缩性。由于它们具有较大的刚性，因此本发明的所述脂质体具有改善的稳定性和货架寿命。

所述脂质体制剂还具有新颖且有用的特性。本发明的所述脂质体制剂由尺寸和形状分布基本均匀同时相对刚性的脂质体组成。所述制剂从一个脂质体到另一个脂质体尺寸变化很小。所述脂质体的根据多分散指数(PolyDiversityIndex，“PDI”)测得的均匀性小于0.075，优选为约0.02至0.05，说明是具有高度均匀性的组合物。因此，本发明的所述脂质体制剂有益地降低了与大脂质体相关联的不利事件的发生率，并且允许有效地进行除菌过滤。

本发明的另一个方面是用于制造脂质体制剂的方法。所述制造方法包括如下步骤：(1)将治疗性试剂和预选择的脂质混合以形成囊泡；(2)在单阶段通过单尺寸设计过滤器挤出所述囊泡；和(3)超滤。超滤后，产品可选地被标准化到期望的最终浓度。因为步骤2的所述挤出作为在低压下的单阶段挤出进行，所以本方法相对于使用多阶段的高压挤出节约了操作成本和时间并且增加了产率。这些制造步骤适合于大规模生产。

在所述制造方法的一个实施方式中，所述制剂通过如下步骤制备：(1)将治疗性试剂与包含摩尔比为约3:1:2的DSPC、DSPG和胆固醇的脂质混合以形成囊泡，使得所述治疗性试剂与脂质的质量比为约1:5至1:8；(2)在单阶段通过具有约100nm的孔隙尺寸的过滤器挤出所述囊泡；和(3)超滤。

本发明的又一个方面是根据上文所述的制造步骤制得的脂质体制剂。所述制剂包含多个脂质体，所述脂质体由一定量的脂质组分组成，所述脂质组分包封治疗性试剂。例如，所述脂质组分包含摩尔比为约3:1:2的DSPC、DSPG和胆固醇，并且所述治疗性试剂与脂质组分的质量比可以为约1:5至1:8。所述制剂通过如下步骤制造：(1)将治疗性试剂和预选择的脂质混合以形成囊泡；(2)在单阶段通过单尺寸设计过滤器挤出所述囊泡；和(3)超滤。超滤后，产品可以可选地被标准化到期望的最终浓度。优选的是，根据本方法制得的所述制剂具有小于0.075的PDI，优选具有0.02至0.05的PDI。本方法生产出具有新颖且有用的特征的脂质体制剂，所述特征包括例如所述脂质组分的3:1:2的比率、药物：脂质比、PDI、刚性、pH、渗透压和电导率。

附图说明

图1是本发明的所述脂质体制剂的制造方法的流程图。

图2表示总结了根据本发明的一个方面的用于IV输注5mg/ml的剂量强度的1升脂质体阿伦膦酸盐(alendronate)的制造方法及其过程控制参数的流程图。

图3是根据本发明的一个方面的脂质体阿伦膦酸盐的TEM图像。

图4是比较各种脂质体制剂的比可压缩性的图。

图5A是本发明的所述脂质体制剂的尺寸分布的图。

图5B是现有技术的脂质体制剂的尺寸分布的图。

具体实施方式

本发明涉及用于各种疾病的治疗的一种新颖的脂质体、制剂及其制造方法。所述制剂包含多个包封治疗性试剂或“被包封的试剂”的脂质体。每个脂质体的物理特性促进了所述脂质体制剂的稳定性和有效性。所述制剂的特征在于尺寸和形状基本均匀的脂质体。而且，本发明还描述了的用于所述脂质体制剂的有效且具有成本效率同时满足大规模生产的需要的制造方法。本发明还进一步涉及通过所述制造方法制得的具有新颖且有用的性能的制剂。

A.脂质体的组分

本发明涉及新颖且有用的脂质体形式。不同的脂质体组分可以被用来形成本发明的所述脂质体。优选的是，所述脂质组分是非毒性生物可相容性脂质，例如，如由磷脂酰-胆碱、磷脂酰甘油和/或胆碱制得的脂质。在本发明的一个实施方式中，所述脂质组分包含二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)和胆固醇，优选的是它们的摩尔比为约3:1:2(DSPC:DSPG:chol(胆固醇))。

所述脂质组分包封治疗性试剂，其中两种组分具有预选择的质量。本文使用的“药物脂质比”(或药物：脂质比)是指以质量计所述药物与所述脂质组分的相对量，其包括所述脂质体和/或所述制剂。在本发明的一个实施方式中，所述脂质体具有以重量计为约1:5至1:8，优选为1:6至1:7的药物：脂质比。

B.脂质体的物理性能

所述脂质体的各种物理参数和特性可能影响所述制剂的均匀性、稳定性和有效性。所述物理特性包括(1)渗透压(所述脂质体的内部和外部)、(2)电导率(所述脂质体的内部和外部)、(3)药物脂质比、(4)pH(所述脂质体的内部和外部)和(5)所述组合物中所使用的药物和脂质的类型。

渗透压是所述脂质体制剂的溶质的浓度的度量。本文使用的术语“渗透压”是指每千克溶剂的由溶质摩尔数限定的以溶质的渗摩(osmol)表示的溶质浓度的量度(osmol/kg)。内部渗透压是溶质在所述脂质体内的浓度，而外部渗透压是溶质在所述脂质体外部的浓度。在本发明的一个实施方式中，所述脂质体具有低的内部脂质体渗透压。内部渗透压可以通过改变被包封在所述脂质体内的药物的量来进行调节。现有技术描述了含有尽可能多的药物的脂质体，导致脂质体具有高的渗透压(高包封比率)。然而，本发明公开了具有比现有技术的那些脂质体低的渗透压(或者低的包封比率)的脂质体。如本文所公开的较低的渗透压即约340osmol/kg至440osmol/kg的渗透压改善了所述脂质体的稳定性和所述脂质体在所述制剂中的均匀性。实现低的内部渗透压的一个方式是降低被包封在所述脂质体制剂中的治疗性试剂的量。另一种方式是降低内部渗透压，这不需要改变药物：脂质比，而是利用非带电性的试剂例如某些本领域已知的多糖或者糖。

外部渗透压优选与身体的渗透压是等渗的，特别是对于可注射制剂，以与身体的渗透压等渗。因此，外部渗透压优选为相对恒定。本发明的所述内部渗透压和外部渗透压导致产品具有高的稳定性、低的药物渗漏速率和所述脂质体的适当的药物包封能力。

本文使用的术语“电导率”是指所述脂质体基于溶液的离子含量而导电的能力。电导率与脂质体的离子含量有关并且影响所述脂质体制剂的稳定性、药物渗漏速率和药物包封能力。所述脂质体的电导率为约13.5ms/cm至17.5ms/cm。在本发明的一个实施方式中，被包封的药物试剂带有电荷。注意带电荷的药物在所述脂质体的电导率和渗透压之间具有一对一的相关性。因此，改变准备被包封的带电荷的试剂的量会成比例地影响这两种性能。在一个替代性的实施方式中，可以使用中性的(非带电性的)药物试剂。在使用例如中性试剂如多糖来调节电导率的情况中，渗透压独立于药物的浓度，因此可以独立于所述试剂的浓度进行控制。

本发明的所述脂质体的另一个方面是所述组合物的相对刚性，即，所述脂质体在不同环境和身体内部条件中的稳定性及其破裂分开的易感性。脂质体刚性是脂质体膜的强度及其耐受剪切力和压力的能力的量度，其可以改善所述脂质体的货架寿命。脂质体的刚性与其可压缩性成反比关系。具有低的可压缩性的脂质体具有相对较高的刚性。确定脂质体的刚性的一个例示性方法是通过超声测速术和密度测量术来进行。测定脂质体刚性的方法在本领域中是已知的，并且在例如Cavalcanti,LeideP.等，“Compressibilitystudyofquaternaryphospholipidblendmonolayers(季磷脂共混物单层的可压缩性研究)”,ColloidsandSurfacesB:Biointerfaces85(2011)153-160；和Hianik,Tibor等，“SpecificvolumeandcompressibilityofbilayerlipidmembraneswithincorporatedNa,K-ATPase(引入有Na,K–ATP酶双层脂质膜的比容和可压缩性)”,GeneralPhysiologyandBiophysics30(2011)145-153中有详细的描述，它们的全部内容在此通过参引的方式引入本文。

所述脂质体同时具有脂质体外部的溶剂的pH(外部pH)和脂质体的内部被包封部分的溶剂的pH(内部pH)。所述pH影响所述脂质体制剂的稳定性、药物从所述脂质体中渗漏的速率和所述脂质体的药物包封能力。所述制剂的一个实施方式具有约6.8至7.0的内部pH。所述内部6.8至7.0pH对于所述制剂的稳定性是有利的。用于所述治疗性试剂的溶剂的pH可以在使用已知缓冲液溶解所述治疗性试剂时通过连续滴定所述溶液以保持在6.8至7.0pH范围或者保持在特定的pH例如约pH6.9等方法来保持。所述脂质体的所述内部pH可以不同于所述脂质体的所述外部pH。可以通过改变组成所述脂质体的内部和外部表环境的溶液的pH来实现不同的pH。

C.制剂

本发明的所述脂质体制剂包含多个脂质体，所述脂质体具有上文所述的特性并且在尺寸和形状上基本是均匀的，从一个脂质体到另一个脂质体尺寸变化很小。所述制剂的均匀性采用其多分散指数(PDI)来量度。PDI是在0至1的非线性标度(scale)内测量的，其中0值是完美地均匀的制剂，而具有1的PDI的组合物具有高度多样性(非均匀性)。本发明的制剂具有小于约0.075的PDI，优选具有0.02至0.05的PDI，PDI值可以根据在Zetasizernanoseriesusermanual(Zetasizer纳米系列用户手册),2003,MalvernInstruments,第5.5-5.6页和KazubaM.,NanoSeriesandHPPSTrainingManualChapter1(纳米系列和HPPS培训手册第1章)，2003,MalvernInstruments,第9页中的讨论进行计算，它们的内容在此通过参引的方式引入本文。实际上，本制剂的PDI接近于尺寸设计标准的PDI，其中PDI小于约0.02。先前本领域中已知的制剂具有与本发明相比显著不同的均匀性，PDI通常为约0.3。由于PDI是一种非线性标度，因此本发明的PDI显著不同于现有技术中的制剂的PDI。实际上，本发明的低的PDI有利地避免了与大的脂质体相关联的毒性作用，并且生产出更加适合于过滤除菌的制剂。

本发明的制剂含有刚性和均匀性增加的脂质体，从而改善了其稳定性和货架寿命。而且，考虑了本发明的所述制剂是有效的(Banai,Shmuel等，“Targetedanti-inflammatorysystemictherapyforrestenosis:TheBiorestLiposomealAlendronatewithStentsTudy(BLAST)–adoubleblind,randomizedclinicaltrial”(“用于再狭窄的靶向抗炎系统治疗：带有StentsTudy(BLAST)的Biorest脂质体阿伦膦酸盐–双盲随机临床试验”),AmHeartJ.(2013)165(2):234-40)。

本制剂的脂质体对尺寸进行专门设计以为巨噬细胞和单核细胞所摄取。所述脂质体的尺寸可以为30nm至500nm范围。然而，根据所使用的试剂和/或载体的类型，所述范围包括但不限于70nm至120nm、100nm至500nm,100nm至300nm,100nm至180nm、和80nm至120nm。但是，这些范围只是一些例子，其他适合于通过吞噬作用摄取的具体尺寸将在本领域中被被认识到而没有偏离本发明的精神或者额范围。在一个优选的实施方式中，所述制剂中的所述脂质体的尺寸为约80±5nm。

可以利用本发明所述的脂质体包封各种治疗性试剂。一旦所述脂质体被吞噬，所述治疗性试剂是能够降低或者抑制患者中吞噬性细胞的活性和/或消除吞噬性细胞的量。所述治疗性试剂可以是任何化学实体，包括大分子或者小分子，多种化合物(不管是有机或者无机的化合物)的混合物、生物学大分子例如蛋白质、碳水化合物、肽、抗体以及核酸。治疗性试剂可以是来源于已知生物体的天然产品或者合成的化合物。

一种可以用于本发明的治疗性试剂类型是双磷酸盐。双磷酸盐(更正式地说是二磷酸盐)是具有两个C-P键特征的化合物。如果两个键位于同一个碳原子上(P-C-P)，则它们被称作孪位双磷酸盐。双磷酸盐是参与键形成和吸收的调节的内源性无机焦磷酸盐的类似物。双磷酸盐有时可以形成聚合链。处于其游离形式的双磷酸盐具有高的亲水性并且带有负电荷，几乎完全不能跨过细胞膜。

本文使用的术语双磷酸盐是指孪位和非孪位双磷酸盐。一种优选的双磷酸盐试剂具有下式(I)：

其中R₁为H、OH或者卤原子；并且R₂为卤素；可选地被杂芳基或杂环基C₁-C₁₀烷基氨基或者C₃-C₈环烷基氨基取代的线性或者支化的C₁-C₁₀烷基或者C₂-C₁₀链烯基，其中所述氨基可以是伯胺、仲胺或者叔胺基团；—NHY，其中Y为氢，C₃-C₈环烷基、芳基或者杂芳基；或者R₂为—SZ，其中Z为氯取代的苯基或者吡啶基。

双磷酸盐试剂的一个示例为阿伦膦酸盐，其具有下式(II)：

很多双磷酸盐具有类似于阿伦膦酸盐的活性并且可用作本发明的治疗性试剂。这些双磷酸盐可以基于它们模拟阿伦膦酸盐的生物学活性的能力进行选择。这包括例如在处于细胞内部之后抑制吞噬性细胞例如巨噬细胞和成纤维细胞中的体外活性；抑制IL-1和/或IL-6和/或TNF-α从巨噬细胞分泌；和体内活性，例如受检制剂使血液单核细胞在动物模型或者人类中耗竭或失去能力或者治疗心肌梗塞和减少梗塞的范围(zone)的能力。

可以应用于本发明的双磷酸盐包括但不限于氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、3-(N,N-二甲基氨基)-1-羟基丙烷-1,1-二磷酸，例如二甲基-APD；1-羟基-亚乙基-1,1-双磷酸，例如羟乙膦酸钠；1-羟基-3(甲基戊基氨基)-亚丙基-双磷酸，(伊班膦酸)，例如伊班膦酸盐；6-氨基-1-羟基己烷-1,1-二磷酸，例如氨基-己基-BP；3-(N-甲基-N-戊基氨基)-1-羟基丙烷-1,1-二磷酸，例如甲基-戊基-APD；1-羟基-2-(咪唑-1-基)乙烷-1,1-二磷酸,例如唑来膦酸；1-羟基-2-(3-吡啶基)乙烷-1,1-二磷酸(利塞膦酸)，例如利塞膦酸盐；3-[N-(2-苯基硫代乙基)-N-甲基氨基]-1-羟基丙烷-1,1-双磷酸；1-羟基-3-(吡咯烷-1-基)丙烷-1,1-双磷酸，1-(N-苯基氨基硫代羰基)甲烷-1,1-二磷酸,例如FR78844(Fujisawa)；5-苯甲酰基-3,4-二氢-2H-吡唑-3,3-二磷酸四乙酯，例如U81581(Upjohn)；和1-羟基-2-咪唑,2-a]吡啶-3-基)乙烷-1,1-二磷酸，例如YM529。

在某些实施方式中，例如，可以使用包封在1:5.7(对于阿伦膦酸钠而言，等于约1:3的摩尔比)的药物：脂质质量比的DSPC、DSPG和胆固醇中的阿伦膦酸酸钠。其中，另一种治疗性试剂氯膦酸二钠被包封在相同的脂质组分中的情况下，可以使用约1:5.4质量比(等于1:3摩尔比)。在本发明中，可以包封通过消除、延缓增殖和/或调低吞噬性细胞的活性来抑制或者耗竭吞噬性细胞的其他治疗性试剂。具体的治疗性试剂包括具有细胞毒性或者细胞抑制性的任何试剂，包括但不限于例如镓、金、二氧化硅、5-氟尿嘧啶、顺铂，烷化试剂、光神霉素和紫杉醇。在上述治疗性试剂中的任何试剂中，脂质体的药物：脂质比以重量计为约1:5至1:8，优选为1:6至1:7。

在一个实施方式中，所述制剂含有可以通过吞噬作用进入细胞并且选择性地靶向巨噬细胞和单核细胞而不影响其他非吞噬性细胞的被包封的治疗性试剂。因为除了被疾病或者病症单独引起的炎症之外，巨噬细胞和单核细胞还在它们的正常状态中被募集至细胞破坏区域并且促进炎症，所以单核细胞/巨噬细胞抑制和/或耗竭可以减弱潜在的受破坏的区域。处在吞噬性细胞内部之后，所述试剂释放并抑制单核细胞和/或巨噬细胞、使单核细胞和/或巨噬细胞失活、失去能力、杀灭和/或耗竭单核细胞和/或巨噬细胞，以治疗涉及吞噬免疫反应例如如缺血性再灌注损伤或炎症性损伤(例如如心肌梗塞)的各种病症、减少梗塞的最终范围和改善心脏修复和急性心肌梗塞后的结果。所述制剂的脂质体具有特殊的特性包括尺寸、电荷、pH、电导率和允许通过吞噬作用进行的原发摄入的渗透压。

在被单核细胞/巨噬细胞摄取之后，所述试剂对单核细胞/巨噬细胞具有持续的抑制活性。这种持续的活性足以调节单核细胞/巨噬细胞的炎症性作用。因此，不需要所述试剂的延迟释放以保持抑制作用。因此，例如通过使用被包封的试剂采用抑制单核细胞/巨噬细胞来治疗某些疾病的方法优选的是系统性疗法，其中所述制剂靶向循环的单核细胞和巨噬细胞。取决于被包封的所述治疗性试剂的类型，所述吞噬性细胞可能具有不同的反应。例如，阿伦膦酸盐包封脂质体导致凋亡，而氯膦酸盐包封脂质体导致坏死。非吞噬性细胞相对来说不能够摄取所述制剂，这是因为所述脂质体制剂的特定的物理化学性能。

而且，本发明的所述脂质体不仅保持所述治疗性试剂足够的时间使得所述试剂没有释放到体液中，而且还有效地将所述试剂卸载到所述靶标细胞中。本发明的所述脂质体将有效量的所述试剂输送至被靶向的细胞。术语“有效量”是指所述制剂的有效地实现所期望的治疗结果，例如治疗子宫内膜异位、再狭窄、缺血性再灌注损伤(IRI)、心肌梗塞或其他相关病症的量。例如，被激活的巨噬细胞和单核细胞的数量和/或活性的下降减少了梗塞的范围和/或在损伤涉及心肌损坏时改善了重新塑造。有效量还可能取决于因素的数量，所述因素包括但不限于：受治疗的个体的重量和性别；施用所述制剂的方式(即，其是系统性施用还是直接施用于部位)；治疗方案(即，所述制剂是每天一次、一天数次施用，还是以单剂量施用)；炎症的临床指示；影响被治疗的潜在病症的发展速度的临床因素、吸烟、血胆脂醇过多、促炎状态、肾病；和所述组合物的剂量形式。所述脂质体制剂的成功输送和施用取决于其稳定性和有效性。被包封在每一个脂质体中的治疗性试剂分子的数量(有效负载)、囊泡尺寸和游离的没有被包封的物质的水平是确定产品的治疗指数的重要参数。

D.剂量和施用

所述脂质体制剂可以通过有效地将所述脂质体运输至适当的或者所期望的作用部位的任何途径进行施用。优选的施用方式包括静脉内(IV)和动脉内(IA)施用(尤其适合于在线施用)。其他适合的施用方式包括肌肉内(IM)、皮下(SC)和腹膜内(IP)。这些施用可以是弹丸式注射或者输注。另一种施用方式可以通过血管周围输送进行。所述制剂可以直接施用或者在稀释后施用。也可以根据本发明使用上述施用途径中的任意施用途径的组合。可以使用任何施用途径，前提是颗粒与吞噬性细胞(例如循环单核细胞或者腹膜巨噬细胞)接触。

根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或者多种生理学可接受的载体进行配制，所述生理学可接受的载体包含本领域已知的赋形剂和助剂，它们有利于将活性组分加工成可以作为药物使用的制剂。

可以单独调节剂量和间隔时间以提供所述制剂的足以诱导或者抑制生物学效果(使有效浓度最小化，“MEC”)的血浆水平。MEC对于每一种制剂可以会有变化，但是可以根据体外数据加以确定。实现MEC所需要的剂量将取决于个体特征和施用途径。可以使用检测分析来确定血浆浓度。

取决于准备治疗的病症的严重程度和反应性，给药可以是单次施用或者多次施用，治疗过程持续若干小时至若干周或者直至实现治疗。施用频率可以根据病症和严重程度而变化。在一个实施方式中，所述制剂可以周期性地施用。剂量可以根据所期望的治疗的需要被配制成任何的量或者体积。例如，可以将1μg或者10μg的剂量施用于经历脉管手术例如支架植入的患者以防止支架内晚期丢失的发生率和严重程度。作为另一个实施例，剂量可以为至少100μg。在这个方面，所述制剂可以作为单剂量施用、多剂量施用和/或连续施用，例如通过在一段时间内连续输注。例如，剂量可以根据Banai,AmHeartJ.(2013),supra.中的描述施用。

E.脂质体制造方法

本发明的另一个方面涉及用于产品商业制造的制造脂质体和脂质体制剂的方法。这种制造方法允许按照上述内容控制物理特性以及控制某些工艺参数，包括水与溶剂的比率、溶剂组成和溶剂比率、囊泡制备温度、囊泡制备剪切力、挤出温度、挤出压力以及挤出膜尺寸和膜类型。

所述脂质体制剂的制备包括如下步骤：(1)将治疗性试剂和预选择的脂质混合以形成囊泡；(2)在单阶段通过单尺寸设计过滤器挤出所述囊泡；和(3)超滤。使用短语单阶段过滤器挤出是指挤出步骤使用单孔隙尺寸过滤步骤。其可以包括多轮通过该单尺寸设计过滤器但是避免如现有技术已知的那样需要多轮地和/或依次地通过不同尺寸设计过滤器，例如依次地通过1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.4μm和0.2μm的膜。超滤后，产品可以可选地被标准化到期望的最终浓度。因为步骤(2)的所述挤出作为在低压下的单阶段挤出进行，所以本方法相对于使用多阶段的高压挤出而言节约了操作成本和时间并且增加了产率。图1展示了制造方法的步骤。

第一步骤包括将治疗性试剂和预选择的脂质组分于溶液中混合以形成囊泡。在很多情况中，所述治疗性试剂和脂质组分将被溶解成治疗性试剂溶液和脂质组分溶液，然后将两者混合。在这个实施方式中，所述治疗性试剂溶液将具有某些物理特性，包括pH、渗透压和电导率。所述治疗性试剂溶液包含所述脂质体制剂的内部环境。因此，所述治疗性试剂溶液的pH、电导率、渗透压影响所述脂质体制剂的内部pH、电导率、渗透压。所述内部脂质体渗透压优选为340osmol/kg至440osmol/kg，而外部脂质体渗透压为270osmol/kg至340osmol/kg。所述溶液的pH拟将所述治疗性试剂溶液保持在意欲达到的pH范围。因此，如果使用酸性的治疗性试剂，例如双磷酸盐，则可以使用碱性pH溶液来将所述溶液的pH保持在6.8至7.0之间。例如，可以由溶解在氢氧化钠溶液中的阿伦膦酸钠制备治疗性试剂溶液，所得的阿伦膦酸盐溶液的pH为约6.8，并且电导率为约18.0ms/cm。所述溶液可以可选地在该过程中加热。在一个替代的实施方式中，可以使用氯膦酸钠或者阿伦膦酸盐一水合物。可以将所述溶液加热至利于双磷酸盐在碱性溶剂中溶解的55℃至75℃的温度，例如如70℃。取决于所溶解的其他赋形剂和治疗性试剂的量，所述溶液可以具有在340osmol/kg至400osmol/kg范围内的渗透压–其将成为内部渗透压。还取决于治疗性试剂和赋形剂的量，所述溶液可以具有14.0ms/cm至21.0ms/cm的电导率–其将成为内部电导率。内部pH、渗透压、电导率是所述脂质体制剂的稳定性和有效性的因素。在一个实施方式中，所述治疗性试剂溶液浓度在所述制造方法的步骤(1)的过程中可以在20g/L至120g/L的范围内。所述治疗性试剂溶液的制备可以与上文讨论的制造方法分开进行或者在上文讨论的制造方法之前进行。

所述脂质组分可以为在一定体积的一种或者多种脂质溶剂中含有所期望的初始量的所述脂质组分的溶液的形式。可以使用任何适当的脂质组分和脂质溶剂。例如，所述脂质组分在脂质体形成之前可以包含分别为3:1:2摩尔比的DSPC、DSPG和胆固醇。根据脂质的这种组合形成得到的脂质体还可以具有3:1:2的摩尔比的DSPC、DSPG和胆固醇。而且，所述脂质溶剂可以例如包含体积比分别为77/77/6的叔丁醇、乙醇和水。可用于配制本发明的所述脂质体的其他脂质溶剂包括氯仿或者甲醇。所述脂质组分被溶解在所述脂质溶剂中。所述脂质溶剂可以被加热至有利于所述脂质组分溶解的在55℃至75℃范围的温度，例如为70℃，以生成所述脂质溶液。溶解的脂质溶液的浓度可以为50g/L至350g/L。所述脂质溶液的制备可以与本文所讨论的制造方法分开进行或者在本文所讨论的制造方法之前进行。

将所述治疗性试剂溶液与所述脂质溶液混合形成多层囊泡(MLV)。药物：脂质比可以通过改变脂质溶液或者治疗性试剂溶液的量来控制。温和地加热这两种溶液可以可选地被用来帮助将所述溶液混合在一起。这个过程导致所述治疗性试剂有效地包封在多层囊泡中。在一个实施例中，可以以5.3份脂质和1份治疗性试剂将所述脂质溶液添加至治疗性试剂溶液中。脂质和药物的这个比率(重量比)增加了所述脂质体制剂的稳定性而对输送没有显著的伤害。实际上，这个过程允许药物：脂质比在以重量计为1:4至1:8的范围内变化，优选在1:5至1:6的范围内变化。而且，可以在挤出步骤之前调节溶剂的浓度而无需损害所述脂质体的完整性。

制造所述制剂的方法中的下一个步骤包括在单阶段通过单尺寸设计过滤器挤出所述囊泡。挤出囊泡降低了上文所述的多层囊泡的尺寸。所述方法使用单挤出步骤和低压力，这生产出尺寸和形状高度均匀的脂质体。挤出工序可以涉及使用微射流均质机或者其他常规均质机。均质机依靠剪切能来使大的脂质体碎化成较小的脂质体。适合于本文是用的均质机包括由各个制造商生产的微射流均质机，例如Boston,MA的微射流均质机。颗粒尺寸分布可以通过常规的激光束颗粒尺寸辨别法来监测。脂质体通过聚碳酸酯膜或者非对称性陶瓷膜挤出是将脂质体尺寸降低至相对而言充分被限定的尺寸分布的有效方法。挤出温度优选为大于所述脂质体的瞬时相温度(transientphasetemperature)以使尺寸能够降低。例如，在DSPG、DSPG和胆固醇的情况中，约55℃可能是期望的。可以使用其他脂质并且它们已知的瞬时相温度是挤出步骤期望的温度的量度。可以需要多轮来实现所期望的囊泡尺寸和均质性。可以实时分析样品以在这个步骤的过程中评价囊泡尺寸和细菌计数。

可以在单阶段低压力工艺技术中进行所述挤出步骤。在挤出工序中，MLV在一个阶段中通过在施加低压力的同时直接挤出通过一个膜来加工—而不是通过其中利用挤出机在高压力下将较大的脂质体依次通过较小的膜的多阶段挤出来形成小的单层脂质体(如在现有技术中所采用的)。在一个实施方式中，单阶段挤出工序在施加60psi至90psi的低压力的同时直接采用0.1μm孔隙尺寸的聚碳酸酯膜或者陶瓷膜进行以获得尺寸为100nm的脂质体。另外，该工序使用60psi至90psi的较低压力，这显著不同于高压力挤出的较高压力(高达500psi)。

通过消除多个膜并且在低压力下挤出，本发明的所述方法具有众多优点。第一，所述单阶段挤出工序具有以比多阶段挤出工序较少的时间进行挤出的优点。而且，消除了对高压力挤出的需要有利地节省了与高压力挤出设备相关联的高成本。低压力挤出机的成本显著较少。适合用于本发明的挤出机的一个示例是LIPEX^TM挤出机，可以从NorthernLipids,Inc.获得。另外，用于低压力挤出机的材料例如压缩空气通常花费比用于高压力挤出机的材料例如氮气的花费要低。而且，将多阶段挤出减少至单阶段挤出对应于废物的类似降低和较高的产率。

本方法的最后步骤包括将经挤出的囊泡超滤成经缓冲的溶液。虽然挤出工序产生尺寸和形状均匀的脂质体，但是超滤涉及对所述制剂施加压力使其通过膜以将经包封的脂质体与未被包封的治疗性试剂、溶剂和脂质分离。这个步骤优选在低于所述制剂中使用的脂质的瞬时相温度进行，例如在很多情况中在低于45℃进行。在超过工序的过程中可以使用不同类型的过滤膜。超滤步骤的一个实施方式使用中空纤维过滤膜，其中所述制剂被迫使通过纤维的开放的中空芯材，并且微分子(即，溶剂、未被包封的双磷酸盐、脂质)被过滤通过纤维的外膜，而相对较大的脂质体保留在所述纤维中。超滤得到具有大于或者等于96％被包封的治疗性试剂的制剂。

超滤步骤可以进一步包括透析步骤，其中所述制剂利用一定体积的缓冲溶液进行透析。缓冲溶液的一个实施例是磷酸盐盐水缓冲液(PBS)，但是可以使用在生理学渗透压保持阳离子和阴离子平衡的任何缓冲液。其他缓冲添加剂在本领域中是已知的，并且可以包括例如蔗糖、甘氨酸、琥珀酸钠和/或白蛋白。所述缓冲溶液优选反映最终制剂的外部环境，使得这种溶液的pH和电导率可以得到仔细地监测。优选的是，所述缓冲溶液是等渗的并且对细胞是非毒性的。可以对所述缓冲溶液进行过滤以进一步减少污染物并且可以在所述制造方法之前制备所述缓冲溶液。透析终点以达到所述制剂的期望的pH和电导率为标记。

在超滤步骤结束时，可以可操作地对所述制剂进行过滤以除菌，即以保持生物负载控制(bio-burdencontrol)。在该工序的一个实施方式中，除菌过滤器被连接至装有所述脂质体制剂的压力容器。所述除菌过滤器被进一步连接至无菌接收罐。对所述脂质体制剂施加压力迫使所述制剂通过所述除菌过滤器。而且，可以在该步骤的过程中获得另一份样品用于细菌含量。除菌过滤器孔隙尺寸可以在0.2μm至0.45μm的范围内。因为所述制剂的所述脂质体基本是均匀的并且没有大的脂质体，所以可以相对不复杂地进行除菌过滤。

在制造之后，所述制剂可以被标准化。最终标准化产生具有标准浓度的脂质体制剂批次。标准化分析所述产品的产率、尺寸、脂质组成、药物和游离药物含量和浓度。浓度分析可以采用本领域已知的方法例如HPLC、借助于分光光度计的磷酸盐分析法进行。在确认经超滤的产品的浓度之后，可以使用一定体积的缓冲溶液将所述制剂稀释至标准浓度。最终的标准化还涉及所述脂质体产品的无菌过滤。例如，超滤后的包封双磷酸盐的制剂可以使用适量的缓冲溶液稀释以达到最终的浓度。类似地，经超滤的产品可以在不同批次使用不同量的缓冲溶液稀释液分成准备以不同的终浓度使用的多个批次。可以获得样品以确定所得到的所述治疗性试剂的浓度。

这种制造方法具有的优点是所述脂质体的物理和化学特征可以控制、监测和再现。例如，可以通过其中溶解有所述治疗性试剂的所述溶液的组成来控制所述脂质体的内部pH。还可以通过改变所述治疗溶剂的量或者根据其是带有电荷的试剂还是不带有电荷的试剂来对内部渗透压进行类似控制。通过选择组成所述脂质体的脂质组分或者添加至溶解活性剂的脂质的量来控制药物：脂质比。增加脂质组分的量降低了药物：脂质比，并且反之亦然。低的药物：脂质比还降低了所述脂质体制剂的内部渗透压。所述组合物的外部pH和外部渗透压部分地受到含有最终的产品的缓冲溶液的组成的影响。可以利用包封在所述脂质体中的治疗性试剂和其他赋形剂的性质来控制电导率。通过本发明的方法，其他的因素，包括但不限于粘度、赋形剂质量、无菌性、与盐水、输注套件和注射器(用于可注射制剂)的相容性、和与加工设备的相容性都是可以独立控制的。

根据上文描述，在所述制造方法的一个优选的实施方式中，所述制剂通过如下步骤制备：(1)将含有治疗性试剂的溶液与包含摩尔比为约3:1:2的DSPC、DSPG和胆固醇的脂质的溶液混合以形成囊泡，使得所述治疗性试剂与脂质的质量比为约1:5至1:8；(2)在单阶段通过具有约100nm的孔隙尺寸的过滤器挤出所述囊泡；和(3)超滤。

本发明的另一个方面是根据以上制造步骤制得的脂质体制剂，其中所述制剂包含摩尔比为约3:1:2的DSPC、DSPG和胆固醇，并且所述治疗性试剂与脂质的质量比为约1:5至1:8，并且所述脂质体制剂通过如下步骤制造：(1)将含有治疗性试剂的溶液和含有脂质组分的溶液混合以形成囊泡；(2)在单阶段通过单尺寸设计过滤器挤出所述囊泡；和(3)超滤。超滤后，产品可以被标准化到期望的最终浓度。根据本方法制得的所述制剂具有小于0.075的PDI，优选具有0.02至0.05的PDI。本方法生产出具有如上所述的新颖且有用的特征的脂质体制剂，所述特征包括例如所述脂质组分的3:1:2的比率、1:5至1:8之间的药物：脂质比。而且，单独的脂质体特征包括pH、渗透压、电导率和刚性如上所述可以独立地进行控制。

以下实施例旨在展示和例举实施本发明的不同方面而绝非有意限制本发明。仅通过举例方式并参照附图对本发明进行描述。现在具体参照详细的附图，强调所显示的细节仅出于举例目的和仅出于阐述性讨论本发明的优先的实施方式目的，并且在提供据信最有用并且容易理解本发明的原理和观念方面的内容的过程中呈现。所述描述应当和使本领域技术人员明了本发明的若干种形式如何可以在实践中实施的附图一起考虑。

实施例1–脂质体制剂批次制备

根据上文描述的方法，制备实施例批次。清楚的是，批次尺寸如针对商业制备所期望的那样可以变化。在该实施例中，制备了包封在含有胆固醇、DSPC和DSPG并且被分散在磷酸盐缓冲盐水溶液中的脂质体中的1升批次的脂质体阿伦膦酸盐。脂质体阿伦膦酸盐可以以如下两种浓度提供以方便临床使用：5mg/ml和0.5mg/ml，作为无菌的带白色的脂质体分散液。可以进一步配制这些浓度以获得具有任何特定体积的所期望的量的治疗性试剂。脂质组分由胆固醇、DSPC和DSPG组成。分散液还含有磷酸盐缓冲盐水以控制pH、输注适用性和保持等渗性。在最终产品中至少有96％的药物被包封在所述脂质体中。为了施用，施用盐水稀释瓶子(根据需要作为其一部分)的内容物，然后作为输注液施用。

包括在制造方法中使用的组分的量和质量的批次配方以及它们在每1升批次基础上的量提供在下表1中。

表1–用于静脉内(IV)输注的脂质体阿伦膦酸盐，用于1升的批次配方

以表1的1升批次制备的用于IV输注脂质体阿伦膦酸盐的含量和量化组成总结在下表2中。注意，在该批次中，DSPC:DSPG:胆固醇的摩尔比为3:1:2。还有，药物：脂质比经计算为约1:57±1.5(重量：重量)。

表2–用于IV输注的脂质体阿伦膦酸盐的组合物

实际上采用本文描述的新颖的制造方法制得的用于IV输注的脂质体阿伦膦酸盐制剂提供在下表3中。

表3–用于5mg/ml剂量形式的规范

图2表示总结了用于IV输注5mg/ml的剂量强度的1升脂质体阿伦膦酸盐的制造方法及其过程控制参数的流程图。用于0.5mg/ml剂量强度的制造方法与用于5mg/ml剂量强度的制造方法相同。只有在形成用于施用的不同最终制剂浓度中的最后标准化步骤不同。本领域技术人员理解可以根据本方法制造其他剂量而无需过度实验。

治疗性试剂溶液(阿伦膦酸盐溶液)和脂质溶液制备如下：

阿伦膦酸盐溶液。称取NaOH(6.8g至8.0g)并在70±3℃的温度在600±150RPM将其溶解在850ml注射用水(WFI)中。通过视觉观察确认完全溶解。在70±3℃的温度以600±150RPM搅拌的情况下将阿伦膦酸钠(68g至80.75g)溶解在NaOH溶液中。通过视觉观察完全溶解(即澄清溶液)，检验电导率和pH测量结果(pH＝6.8±0.3。电导率＝18.0±1ms/cm)。

脂质溶液。称取包含30gDSPC(37.9毫摩尔)、10gDSPG(12.5毫摩尔)和10g胆固醇(25.8毫摩尔)(DSPC/DSPG/胆固醇；3/1/2摩尔/摩尔/摩尔)的脂质并在70±3℃将其溶解在位于加热的磁力搅拌器上的250ml烧杯的160ml的叔丁醇/EtOH/H₂O(77/77/6，体积/体积/体积)中，形成浓度为312mg/ml的脂质溶液。温度处在其界限内后形成澄清的黄色溶液。

MLV制剂。将所述脂质溶液添加至所述阿伦膦酸盐溶液(1份药物；5.3份脂质)，同时在600+150RPM混合并将温度保持为70±3℃。至少5分钟之后，添加100mlWFI(10％总体积)以在挤出之前降低溶剂浓度。将该制剂再混合10分钟。

挤出。使用装配有一个0.14μm陶瓷膜或者两个聚碳酸酯膜(例如0.2预过滤器和0.1μm膜)的1.2L加热不锈钢挤出机在压力为90±15psi且温度为68±5℃的情况下对所述制剂进行挤出以降低囊泡的尺寸并且改善囊泡的均匀性。该工序需要12至18轮以得到80nm至100nm的囊泡。实时对挤出轮次进行采样以检验在超滤之前囊泡的尺寸。脂质体制剂的尺寸使用MalvernNanoZS分析仪(容许极限：95±20nm)来分析。还分析了挤出样品的好氧性细菌计数(生物负载控制)。容许极限为<100CFU/ml。

超滤和透析。首先，在进行超滤之前允许将制剂冷却至<45℃。在带有500K中空纤维膜的AmershamQuixStand系统上进行超滤。使用不超过25psi的入口压力浓缩所述制剂。在达到最小体积之后，使用10倍初始体积(约7L)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液对所述制剂进行透析。所述PBS溶液通过将145mMNaCl、13mMNa₂HPO₄和7mMNaH₂PO₄溶解在10LWFI中来制备。所述PBS具有约6.9的pH和约16.9ms/cm的电导率。所述PBS通过0.2μm过滤器进行过滤。透析终点通过测量被透析的所述制剂的pH和电导率来标记。将所述制剂从超滤系统排出，不超过120％初始体积(约1.2升)。获取样品用于常规分析和好氧性细菌计数(生物负载控制)。容许极限为<1,000CFU/ml。

在透析结束时，将所述制剂过滤通过0.2μm过滤器以保持生物负载控制。将装有所述制剂的压力容器连接至无菌0.2μm过滤器(SartoriusSartobranP)。该过滤器预装配有无菌接收罐。通过对压力容器施加5至30ps的压力进行过滤。获取样品用于常规分析和好氧性细菌计数(生物负载控制)。容许极限为<100CFU/ml。

最终的标准化。通过HPLC分析所述制剂的脂质体中的尺寸、脂质/治疗性试剂组成以及药物和游离治疗性试剂含量。该实施例中预期产率为含有约6mg/ml的包封阿伦膦酸盐和35mg/ml的脂质的1升制剂。根据阿伦膦酸盐浓度的结果，计算所需要的稀释以得到约1升的5mg/ml或者0.5mg/ml最终制剂浓度。为了制得5mg/ml的制剂，使用如上文所述的约100mlPBS稀释约900ml超滤后的脂质体阿伦膦酸盐。另外，为了制得0.5mg/ml的制剂，对于0.5mg/ml浓度，使用约900mlPBS稀释约100ml超滤后的脂质体阿伦膦酸盐。获取样品以确定所得的阿伦膦酸盐浓度。

制备标准制剂浓度之后，将装有所述制剂的瓶子连接至位于100级房间(class100room)或无菌生物学罩(sterilebiologicalhood)中的两个相继的无菌0.2μm过滤器(SartoriusSartobranP)。该过滤器预装配至预先除菌的一次性接收袋或接收瓶中。使用蠕动泵或压缩氮气进行过滤。压力应当不超过10psi。当过滤结束时，检测过滤器的完整性。

上述实施例中制备的用于IV输注的脂质体阿伦膦酸盐具有众多期望的性能，例如(i)至少阿伦膦酸盐和脂质在5℃(在2℃至8℃范围)具有三年稳定性；(ii)平均囊泡直径为80±5，没有颗粒物质；(iii)阿伦膦酸钠的浓度不超过5mg/ml(在0.1mg/ml至5.0mg/ml范围)；(iv)阿伦膦酸盐包封大于或者等于96％；(v)二硬脂酰磷脂酰胆碱/二硬脂酰磷脂酰甘油/胆固醇(DSPC/DSPG/CHOL)的3/1/2摩尔/摩尔/摩尔的脂质组成；(vi)270osmol/kg至340osmol/kg的生理学渗透压；(vii)与水相似的粘度，即在20℃为约1.0mPa的动力学粘度；(viii)pH6.8(在6.8至7.0范围)；(ix)赋形剂的符合美国或者欧洲药典的世界范围内可接受的质量；(x)符合在USP24-NF19中公开的用于无菌性和热原的USP指南；(xi)与盐水、输注套件和注射器的可相容性(可用性)；和(xii)与过滤器、不锈钢和玻璃管件的可相容性。

图3是以上实施例中制造的脂质体阿伦膦酸盐的TEM图像。观测到脂质体群的良好均质性和均匀性，并且所示的脂质体的尺寸在40nm至120nm之间。

实施例2–脂质体刚性试验

分析四份大的单层脂质体样品(直径为约100nm)的刚性。溶解在根据本发明制得的PBS中的空脂质体被标记为LPO。含有根据本发明制得的0.5mg/ml的阿伦膦酸盐的脂质体制剂被标记为LSA。溶解在HEPES中的被标记为KS和HU的两份其他脂质体样品根据在Epstein-Barash,Hila等，“Physicochemicalparametersaffectingliposomalbisphosphonatesbioactivityforrestenosistherapy:Internalization,cellinhibition,activationofcytokinesandcomplement,andmechanismofcelldeath(影响用于再狭窄治疗的脂质体双磷酸盐生物活性的物理化学参数：内化作用、细胞抑制作用、细胞因子和补体的激活以及细胞死亡的机制)”,J.ControlledRelease146(2010)182-195中描述的方法制得。

分析每份样品的脂质体的比容可压缩性。使用超声测速术，根据如下关系式评价脂质体的弹性性能：

${\mathrm{\&beta;}}_S=\frac{1}{\mathrm{\&rho;}\&CenterDot;u^2},---\left(1\right)$

其中，β_S，ρ和u分别是悬浮液的绝热可压缩性、密度和音速(HianikT.,HaburcakM.,LohnerK.,PrennerE.,PaltaufF.,HermetterA.(1998):Compressibilityanddensityoflipidbilayerscomposedofpolyunsaturatedphospholipidsandcholesterol(由多不饱和磷脂和胆固醇组成的脂质双层的可压缩性和密度),Coll.Surf.A139,189-197；HianikT.,RybárP.,KrivánekR.PetríkováM.,MilenaRoudnaM.Hans-JürgenApell,HJ.(2011):SpecificvolumeandcompressibilityofbilayerlipidmembraneswithincorporatedNa,K-ATPase(引入有Na,K–ATP酶双层脂质膜的比容和可压缩性).Gen.Physiol.Biophys.30,145–153.)。因此，通过测量音速和密度的变化，还可以确定可压缩性的变化。

使用由两个几乎相同的声腔谐振器(acousticcavityresonator)组成的在约7.2MHz的频率操作的固定路径差速仪(fixed-pathdifferentialvelocimeter)测量超音速((SarvazyanA.P.(1991):Ultrasonicvelocimetryofbiologicalcompounds(生物化合物的超声测速仪),Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem.20,321-342；SarvazyanA.P.,ChalikianT.V.(1991):Theoreticalanalysisofanultrasonicinterferometerforprecisemeasurementsathighpressures(用于高压下精确测量的超声干涉仪的理论分析),Ultrasonics29,119-124))。使用计算机控制的网路分析仪(USAT,USA)来测量单元的谐振频率。样品体积为0.7ml。谐振器单元装配有磁力搅拌器以确保在测量过程中均质地分散样品。一个谐振器装有以磷脂计浓度为10mg/ml的脂质体溶液，而另一个谐振器填充由相同的缓冲溶液(PBS或者HEPES)但是没有囊泡作为参照物。当开始一系列测量时，首先通过测量带有相同参照液体的两个单元来比较两个谐振器的谐振频率。由于音频信号的能量密度全都比较小(超声波的压力幅值小于103Pa)，因此避免了声波对囊泡的结构性能的任何影响。一般来说，超声测速仪允许根据如下定义的等式测定声速(u)而不是其浓度依赖性增量(SarvazyanA.P.(1982):Developmentofmethodsofprecisemeasurementsinsmallvolumesofliquids(小体积液体中的精确测量方法的发展),Ultrasonics20,151-154)：

$\&lsqb;u\&rsqb;=\frac{u-u_0}{u_{0}c},---\left(2\right)$

其中，c是以mg/ml表示的溶质浓度，并且下标“0”表示溶剂(缓冲液)。根据两个谐振器的谐振频率f和f₀的变化可以直接确定[u]值(f是样品的谐振频率，而f₀是参照物-缓冲液的谐振频率)：

$\&lsqb;u\&rsqb;=\frac{u-u_0}{u_{0}c}=\frac{f-f_0}{f_{0}c}(1+\mathrm{\&gamma;})---\left(3\right)$

使用根据振动管原理(KratkyO.,LeopoldH.,StabingerH.(1973):Thedeterminationofthepartialspecificvolumeofproteinsbythemechanicaloscillatortechnique(通过机械式振荡器技术确定蛋白质的微分比容)),In:MethodsinEnzymology(Ed.E.Grell),vol.27,pp.98-110,AcademicPress,London)操作的高精度密度测量系统(带有两个DMA602M样品室的DMA60,AntonPaarKG,Graz,Austria)来确定囊泡溶液的密度(ρ)。微分表观比容(Apparentspecificpartialvolumes，)使用如下等式根据密度数据来计算：

其中，下标“0”同样表示参照溶剂并且[ρ]＝(ρ-ρ₀)/(ρ₀c)表示密度的浓度增量。单元的温度使用LaudaRK8CS超级恒温器(ultra-thermostat，Lauda,Germany)控制在±0.02℃内。

除了声音-速度浓度增量之外，确定比容也允许根据如下等式估测囊泡的下降的表观比可压缩性

其中，β₀是可压缩性的系数，并且ρ₀是缓冲液密度(Sarvazyan1991)。的值表示脂质体相对于缓冲液的体积可压缩性。较高的值意味着脂质体的可压缩性较高(即刚性较小)。

为了测定脂质体的比容可压缩性，测量了超声速度[u]和密度ρ的浓度增量。然后通过等式(4,5)确定比容可压缩性和表观比可压缩性

图4证明本发明的脂质体与其他脂质体制剂和空脂质体相比基本是刚性的。如图4所示，LSA脂质体的比可压缩性(与刚性成反比)显著低于采用现有技术常规配方制得的那些空脂质体的比可压缩性。LSA脂质体的可压缩性为约0.70，而空脂质体的可压缩性为约0.90。KS和HU脂质体的比可压缩性显著不同，为0.75。这个实施例证明机械性能对制剂和药物在脂质体内部的存在是敏感的。

实施例3–脂质体稳定性分析

根据实施例1制得的脂质体制剂的稳定性例举在表4和5中。表4证明了本发明的脂质体在4℃保存至少直达36个月时是稳定的，并且所述制剂满足所有的要求规范。

表4–在4℃的稳定性

表5证明了本发明的脂质体在25℃保存直达7个月时是稳定的，并且所述制剂满足所有的要求规范。

表5–在25℃的稳定性

实施例4–脂质体均匀性分析

通过使用MalvernNanozs颗粒尺寸测量系统分析脂质体制剂的均匀性。这个程序通过动态光散射法(DynamicLightScattering，DLS)确定了脂质体制剂的囊泡尺寸的均匀性并表征了悬浮在液体介质中的颗粒的尺寸分布。这个技术对于10nm至100nm范围内的颗粒尺寸分布是敏感的，并且可以用于一系列的颗粒，包括脂质体乳液、纳米颗粒和合成聚合物。该技术可以被用来提供均质脂质体制剂的平均直径以及制剂异质性的指示。在根据操作说明书标准化MalvernNano-zs颗粒尺寸测量系统之后，首先按照1/3将0.5mg/ml的脂质体样品稀释在PBS中。使用Ultraspec2100proUV/VIS分光光度计确认稀释溶液的UVλ_最大600nm。再将脂质体样品稀释直到获得最优的光密度(O.D.)值.10±0.02。再次确认第二稀释溶液的UVλ_最大600nm具有0.10±0.02O.D的值。然后，将1.0ml至1.5ml的稀释样品放置于培养管中，并且通过MalvernNano-zs颗粒尺寸系统分析囊泡尺寸。分析在环境温度(23℃±2℃)、173°的固定角、633nm的激光波长进行。累积数据以获得150至500Kcps(千计数/秒(kilocountspersecond))。

表6展示了根据本发明制得的制剂的测量结果。平均脂质体尺寸为80.41nm，PDI为0.04。

表6

测量编号	尺寸(nm)	PDI
			1	80.28	0.042
2	80.49	0.024
			3	80.29	0.052
4	80.82	0.022
			5	80.69	0.041
6	79.68	0.042
			7	80.57	0.043
8	80.56	0.030
			9	80.33	0.028

根据上文所述程序分析了在上文实施例2中描述的现有技术脂质体HU脂质体的均匀性。HU脂质体的Z-平均尺寸为176.5nm。

图5A和5B分别展示了根据本发明制得的脂质体和HU脂质体的尺寸分布。图5A显示了本发明的脂质体制剂具有约88nm的平均直径，并且直径尺寸紧密地分布在69nm至107nm的范围。相反，图5B显示HU脂质体制剂具有约201nm的平均直径，脂质体的直径从低至80nm至高达500nm。图5A中的制剂的PDI为0.025。图5B的HU制剂的PDI为0.118。

本文引用的所有公开的期刊、书籍、参考手册和摘要再次通过参引的方式全部引入本文以更加充分地描述本发明所述技术领域的状态。

由于可以对上文所述的主题进行各种改变而没有脱离本发明的范围和精神，因此打算包含在上述说明中或者限定在所附的权利要求书中的所有主题都应被解释为是本发明的描述性的和例举性的。根据上文教导，本发明的很多改变和变化都是可能的。

Claims (36)

1.一种具有脂质组分并且包封治疗性试剂的脂质体，所述脂质体具有约1:5至1:8的所述治疗性试剂与脂质的质量比，其中所述脂质组分包含摩尔比为约3:1:2的DSPC、DSPG和胆固醇，并且所述脂质体具有小于0.70ml/g的可压缩性。

2.根据权利要求1所述的脂质体，其中，所述脂质体带有负电荷。

3.根据权利要求1所述的脂质体，其中，所述脂质体具有340osmol/kg至440osmol/kg的脂质体内渗透压。

4.根据权利要求1所述的脂质体，其中，所述脂质体具有13.5ms/cm至17.5ms/cm的脂质体内电导率。

5.根据权利要求1所述的脂质体，其中，所述治疗性试剂是双磷酸盐。

6.根据权利要求5所述的脂质体，所述脂质体在该脂质体内具有0.5mg/ml至5mg/ml的双磷酸盐浓度。

7.根据权利要求1所述的脂质体，其中，所述脂质体具有约6.9的脂质体内pH。

8.一种包含多个脂质体的制剂，所述脂质体具有脂质组分和治疗性试剂，其中，所述脂质组分包含摩尔比为约3:1:2的DSPC、DSPG和胆固醇，并且所述制剂具有小于0.07的PDI。

9.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述脂质体带有负电荷。

10.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述脂质体具有340osmol/kg至440osmol/kg的脂质体内渗透压。

11.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述脂质体具有13.5ms/cm至17.5ms/cm的脂质体内电导率。

12.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述脂质体具有约80±5nm的平均尺寸。

13.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述治疗性试剂是双磷酸盐。

14.根据权利要求13所述的制剂，所述制剂在所述脂质体内具有0.5mg/ml至5mg/ml的双磷酸盐浓度。

15.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述制剂中的至少96％的所述治疗性试剂被包封。

16.根据权利要求8所述的制剂，所述制剂具有约1:5至1:8的所述治疗性试剂和所述脂质组分的质量比。

17.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述制剂具有约6.9的脂质体内pH。

18.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述脂质体具有不超过0.70ml/g的可压缩性。

19.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述PDI为0.02至0.05。

20.一种制造具有多个脂质体的治疗性制剂的方法，所述方法包括如下步骤：

(a)将含有治疗性试剂的溶液与含有脂质的溶液混合以形成囊泡，使得所述治疗性试剂与脂质的质量比为约1:5至1:8，所述脂质包含摩尔比为约3:1:2的DSPC、DSPG和胆固醇；

(b)在单阶段中通过具有约100nm的孔隙尺寸的过滤器挤出所述囊泡；以及

(c)对所述囊泡进行超滤。

21.根据权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括如下步骤：(d)使用磷酸盐缓冲盐水溶液稀释所述制剂以形成所述治疗性制剂的治疗性试剂的最终浓度。

22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述治疗性制剂具有约6.9的pH。

23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述脂质溶剂包含乙醇、叔丁醇和水。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，乙醇、叔丁醇和水的体积比为77/77/6。

25.根据权利要求20所述的方法，其中，步骤(b)的所述挤出在55℃至75℃之间进行。

26.根据权利要求20所述的方法，其中，步骤(b)的所述挤出在60psi至90psi之间的压力下进行。

27.根据权利要求20所述的方法，其中，步骤(b)的所述挤出在超滤之前重复10至18次。

28.一种包含多个脂质体的制剂，所述脂质体由一定量的脂质组分和治疗性试剂组成，所述脂质组分包含摩尔比为约3:1:2的DSPC、DSPG和胆固醇，并且所述治疗性试剂和脂质的质量比为约1:5至1:8，所述制剂通过如下步骤制造：

(a)将含有治疗性试剂的溶液与含有脂质的溶液混合以形成囊泡，使得所述治疗性试剂与脂质的质量比为约1:5至1:8，所述脂质包含摩尔比为约3:1:2的DSPC、DSPG和胆固醇；

(b)在单阶段中通过具有约100nm的孔隙尺寸的过滤器挤出所述囊泡；以及

(c)对所述囊泡进行超滤。

29.根据权利要求28所述的制剂，所述制剂进一步采用如下步骤来形成：(d)使用磷酸盐缓冲盐水溶液稀释所述制剂以形成所述制剂的最终浓度。

30.根据权利要求28所述的制剂，其中，所述制剂具有约6.9的pH。

31.根据权利要求28所述的制剂，其中，所述脂质溶剂包含乙醇、叔丁醇和水。

32.根据权利要求31所述的制剂，其中，乙醇、叔丁醇和水的体积比为77/77/6。

33.根据权利要求28所述的制剂，其中，步骤(b)的所述挤出在55℃至75℃之间进行。

34.根据权利要求28所述的制剂，其中，步骤(b)的所述挤出在60psi至90psi之间的压力下进行。

35.根据权利要求28所述的制剂，其中，步骤(b)的所述挤出在超滤之前重复10至18次。

36.根据权利要求28所述的制剂，其中，所述制剂具有小于0.07的PDI。