CN105181955B - 一种具有催化性能碳点的制备及基于此碳点试剂盒的应用 - Google Patents

一种具有催化性能碳点的制备及基于此碳点试剂盒的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有催化性能碳点的制备及基于此碳点试剂盒的应用。本发明的碳点制备主要是以聚乙烯亚胺、半胱氨酸、乙二醇、蒸馏水、固体磷酸油浴加热为淡黄色凝胶状，用水溶解后自然冷却至室温；将所得棕黄色凝胶状产物处理后即得产品。本发明基于此碳点试剂盒的应用，主要是利用碳点催化并分解双氧水的特性，把碳点与金纳米颗粒这两种纳米材料有机的结合起来，利用碳点具有生物酶性质，再加上抗体与抗原的特异性结合，形成了“三明治”的夹层结构，实现检测乳腺癌抗原以及冰毒的超高灵敏度的可视化检测方法。本发明现象明显，操作简便，灵敏度超高，能有效准确的测定出血清中乳腺癌抗原的浓度以及人血清中、唾液、尿液中冰毒的含量。

Description

一种具有催化性能碳点的制备及基于此碳点试剂盒的应用
技术领域
本发明属于化学应用技术领域，具体涉及一种具有催化性能碳点的制备及基于此碳点试剂盒的应用。
背景技术
碳点作为新型功能纳米材料，拥有良好的特性，如荧光性能强，生物相容性好，低细胞毒性，粒径均很小，合成方法简单易行，操作安全等。鉴于碳点优良的荧光性能、易功能化和工业化、无毒等性质，将来会给发光材料、光电器件、绿色环保生物医学等领域带来新的发展空间，如用于生物成像、生化分析检测、光电器件、光催化、金属离子检测及双光子成像等。另外，有些碳点表现出良好的光催化性能，结合显色反应，为建立超高灵敏度的可视化检验提供了发展平台。
近年来，肿瘤的发展呈上升趋势，肿瘤的早期诊断是亟待解决的最重要的医学问题之一。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，已成为威胁妇女健康的主要病因。由于癌症早期症状不明显，很难被及早发现，并且严重危害妇女健康，因而癌症的早期诊断是亟待解决的最重要的医学问题之一。另外，毒品滥用已成为日益严峻的全球问题,毒品犯罪给全社会来严重的危害。冰毒化学名称为甲基苯丙胺，是一类属于中枢神经兴奋剂的物质。因其特殊的生理作用,成为最为流行的合成毒品在全球蔓延,也是在我国发展速度最快的毒品。大量的事实表明,冰毒滥用将给个人和社会带来严重的危害，急需建立一种针对冰毒的超高灵敏度快速分析方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种具有催化性能碳点的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)以聚乙烯亚胺、半胱氨酸、乙二醇、蒸馏水、固体磷酸于180℃油浴加热至溶液为淡黄色凝胶状，然后用水溶解，直至成棕黄色凝胶状，自然冷却至室温；
(2)将上一步所得棕黄色凝胶状产物处理后得到纯净的碳点溶液；得到的碳点溶液为棕黄色，发绿色荧光；
(3)在步骤(2)碳点的催化作用下，5分钟内H2O2能氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺使之变成蓝色，即该碳点具有催化作用。
具体的，步骤(2)所述的处理是，首先用乙醇溶解棕黄色凝胶状产物，过滤，再进行旋蒸得到固体碳点；然后再以蒸馏水溶解固体碳点，用截留分子量为1000的透析袋，透析24h，得到纯净的碳点溶液。
具体的，步骤(2)所述碳点溶液的激发波长为360nm，发射450nm的绿色荧光。
本发明的目的之二在于提供基于上述碳点的试剂盒的应用，它包括如下顺序的步骤：
(1)将乳腺癌抗体或者冰毒抗体接到96孔聚苯乙烯微孔板上，4℃下反应10小时，三次PBS缓冲溶液冲洗后，加入终止缓冲溶液即浓度为1mg/mLBSA的PBS缓冲溶液反应1小时；
(2)三次PBS缓冲溶液冲洗后，再在不同微孔板中加入各种浓度的样品稀释液，反应1小时；所述样品稀释液是将乳腺癌抗原用pH＝7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液稀释成浓度为1×10-9至1×10-14U/mL的乳腺癌抗原溶液或者是将冰毒溶液用水稀释成浓度为1×10-11至1×10-16mg/mL的冰毒溶液；
(3)三次PBS缓冲溶液冲洗后，再对应加入碳点标记的乳腺癌抗体或者碳点标记的冰毒抗体，反应1小时；
(4)再用PBS缓冲溶液冲洗三次，然后加入柠檬酸三钠溶液以及双氧水溶液，反应40分钟后，加入氯金酸溶液；30分钟后，观察不同微孔板中溶液颜色的变化，与对比实验中生成的显色底物金纳米颗粒溶液即柠檬酸三钠溶液、双氧水溶液和氯金酸溶液所制备的金纳米颗粒溶液的颜色进行对比；并用酶标仪读取不同浓度的样品稀释液在波长550nm处的吸光度值，与对比实验中生成的显色底物金纳米颗粒溶液的吸光度值进行对比，即能得到检测结果，实现乳腺癌抗原以及冰毒的快速检测。
具体的，步骤(3)所述碳点标记的乳腺癌抗体是，使用活化剂EDC和NHS对碳点进行活化之后，将乳腺癌抗体加入到活化后的碳点溶液中，反应1小时，透析处理24小时所得；所述碳点标记的冰毒抗体是，使用活化剂EDC和NHS对碳点进行活化之后，将冰毒抗体加入到活化后的碳点溶液中，反应1小时，透析处理24小时所得。
具体的，步骤(4)所述加入柠檬酸三钠溶液、双氧水溶液以及氯金酸溶液中，柠檬酸三钠溶液浓度为4mmol/L，双氧水溶液浓度为320μmol/L，氯金酸溶液浓度为2mmol/L，三种溶液的体积比为1：1：1；步骤(4)中所述对比实验中生成的显色底物金纳米颗粒溶液是：以浓度为4mmol/L的柠檬酸三钠溶液、浓度为320μmol/L的双氧水溶液和浓度为2mmol/L的氯金酸溶液所制备的金纳米颗粒溶液，三种溶液的体积比为1：1：1。
具体的，上述碳点的试剂盒的应用，可应用于人体血清中的乳腺癌抗原含量检测或者人体血清、唾液、尿液中的冰毒含量检测。
具体的，对乳腺癌抗原含量的检测限值为1×10-16U/mL；对冰毒含量的检测限值为1×10-18mg/mL。
本发明方法制备的具有催化性能的碳点能代替常用的生物蛋白酶，从而建立一种超高灵敏度的可视化检测方法，它能快速准确地检测乳腺癌抗原以及冰毒。与生物蛋白酶相比，碳点具有制备简单、稳定性好、运输储存方便、成本低等特点。更重要的是，碳点不存在生物蛋白酶容易失去生物活性的问题，可长期保存。在此基础上，引入金纳米颗粒不同状态下表现出不同颜色，建立可视化检测，此外，金纳米粒子的高消光系数为这种检测方法提供了具有极高灵敏度的定量检测方法。
本发明利用碳点催化并分解双氧水的特性，把碳点与金纳米颗粒这两种纳米材料有机的结合起来，利用碳点具有生物酶性质，再加上抗体与抗原的特异性结合，形成了“三明治”的夹层结构，成功制备出检测乳腺癌抗原以及冰毒的超高灵敏度的可视化检测方法，且现象明显，操作简便，灵敏度超高，能有效准确的测定出血清中乳腺癌抗原的浓度以及人血清中、唾液、尿液中冰毒的含量。
通过本发明的方法处理，能得到不同颜色的金纳米颗粒溶液，这种纳米颗粒的颜色变化可根据双氧水的浓度进行调控，通过颜色以及吸光度值的变化达到了对乳腺癌抗原以及冰毒的超痕量检测，并且具有非常高的灵敏度，与现有技术相比，本发明方法简单，成本低，灵敏度高，能够实现快速准确的检测，并且对于其它生物大分子以及疾病的检测都具有十分重要的参考价值，具有很广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的碳点溶液的荧光谱图。
图2是本发明实施例1制备的碳点溶液的TEM图。
图3是本发明实施例2乳腺癌抗原标准溶液的检测时的显色底物以及对比实验显色底物的颜色变化对照图片。图3中，上一排的溶液为对比实验显色底物，下一排为不同的浓度乳腺癌抗原，从右至左依次为1×10-9、1×10-10、1×10-11、1×10-12、1×10-13、1×10-14U/mL。
图4是本发明实施例3的5个不同人血清中乳腺癌抗原含量检测时显色底物以及对比实验显色底物的颜色变化对照图片。图4中，上一排的溶液为对比实验显色底物，下一排左边第一个为不含乳腺癌抗原的男性血清，1～5号样品的乳腺癌抗原含量分别为：4.9，4.68，3.55，0.80，2.58U/mL。
图5是本发明实施例4的冰毒标准溶液的显色底物以及对比实验显色底物的颜色变化对照图片，图5中，上一排的溶液为对比实验显色底物，下一排冰毒的浓度从左至右分别为5.8×10-10、7.6×10-10，6.9×10-10、8.4×10-9、6.5×10-11mg/mL。
图6是本发明实施例4的冰毒标准溶液的显色底物在550nm处吸光度值变化的标准曲线图。
图7是本发明实施例5的用于6个不同人尿液中冰毒含量检测时显色底物以及对比实验显色底物的颜色变化对照图片，图7中，上一排的溶液为对比实验显色底物，下一排冰毒浓度从左至右分别为4.7×10-9、8.9×10-9，6.2×10-9、7.45×10-9、6.5×10-9mg/mL，其中6号样品为阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的描述，但不用于限定本发明。
实施例1：
取0.5g聚乙烯亚胺、0.1g半胱氨酸、10mL乙二醇、2mL蒸馏水于50mL的烧杯中，加入4g的固体磷酸，油浴(180℃)加热，至溶液为淡黄色凝胶状，加入2mL二次水；重复此步骤5次，直至成棕黄色凝胶，自然冷却至室温。然后以20mL二次水溶解凝胶，用10mol/L的NaOH溶液调节溶液pH≈7。再加50mL无水乙醇，静置12h，溶液分层。吸取上清液，去掉下层不溶物，得碳点的乙醇溶液。将碳点的乙醇溶液进行旋蒸处理，旋至几乎无液体状态，得固体碳点。以二次水溶解固体碳点，用截留分子量为1000的透析袋透析处理，得纯净的碳点溶液。用紫外-可见分光光度计及荧光分光光度计测得碳点光谱图，如图1所示，从图1中可看到，最佳激发波长为360nm，最佳发射波长为450nm，并对碳点进行TEM表征，如图2所示，可以看到碳点的大小在2.5nm左右。
实施例2：
乳腺癌抗原的显色反应。乳腺癌抗原标准溶液即样品稀释液是将纯净的乳腺癌抗原标准品用pH＝7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的PBS缓冲溶液稀释成不同浓度的溶液；碳点标记的乳腺癌抗体是使用活化剂EDC和NHS对碳点进行活化之后，将乳腺癌抗体加入到活化后的碳点溶液中，反应1小时，透析处理24小时所得。首先在96孔聚苯乙烯微孔板中加入乳腺癌抗体，4℃反应过夜后，用PBS缓冲溶液冲洗三次，加入BSA溶液反应1小时后，用PBS缓冲溶液冲洗三次再加入不同浓度的乳腺癌抗原标准溶液(1×10-12至1×10-14U/mL)反应1小时，再次PBS缓冲溶液冲洗三次之后，加入已经连接上碳点的乳腺癌抗体反应1小时，同样用PBS缓冲溶液冲洗三次，加入100μL浓度为4mM的柠檬酸三钠溶液和100μL浓度为320μmol/L的双氧水溶液反应40分钟，再加入100μL浓度为2mmol/L的氯金酸溶液。30分钟后，其颜色变化对照图3。当乳腺癌抗原的浓度为0时，微孔板中金纳米颗粒的颜色为红色，此时在微孔板中并没有形成三明治的夹心结构，即没有连接上有催化作用的碳点对双氧水进行分解，生成了红色溶液，而在不同浓度的乳腺癌抗原的条件下，由于乳腺癌抗体与抗原的特异性结合作用，在微孔板中形成了夹心结构，在生成金纳米颗粒时，碳点对双氧水溶液起到了分解的作用，因此形成了蓝色溶液。当乳腺癌抗原的浓度为1×10-16U/mL时，此时乳腺癌抗原的浓度已经很小，所连接上的碳点的量已经很少，无法分解双氧水，达到了对乳腺癌抗原的检测限，其检测限为1×10-16U/mL。
实施例3：
取5个乳腺癌患者血清样品，首先在5个96孔聚苯乙烯微孔板孔中分别加入乳腺癌抗体，4℃反应过夜后，用PBS缓冲溶液冲洗三次，加入BSA溶液反应1小时后，用PBS缓冲溶液冲洗三次再加入稀释1010倍的人血清样品。反应1小时，再次PBS缓冲溶液冲洗三次之后，加入已经连接上碳点的乳腺癌抗体反应1小时，同样用PBS缓冲溶液冲洗三次，加入100μL浓度为4mM的柠檬酸三钠溶液和100μL浓度为320μmol/L的双氧水溶液反应40分钟，再加入100μL浓度为2mmol/L的氯金酸溶液。30分钟后，其颜色变化如图4所示，当乳腺癌抗原的浓度为0时，微孔板中金纳米颗粒的颜色为红色，而在加入不同人血清之后的微孔板中，溶液颜色变化不同，即不同人血清中的乳腺癌抗原含量不同。通过实验检测得到的5个不同人血清中乳腺癌抗原的含量为结果分别为：4.9，4.68，3.55，0.80，2.58U/mL。
实施例4：
冰毒标准溶液即样品稀释液，是将冰毒溶液用水稀释成浓度为1×10-11至1×10- 16mg/mL的冰毒溶液；标记碳点的冰毒抗体是使用活化剂EDC和NHS对碳点进行活化之后，将冰毒抗体加入到活化后的碳点溶液中，反应1小时，透析处理24小时所得。首先做用于检测冰毒样品的标准曲线：在96孔聚苯乙烯微孔板中加入冰毒抗体，4℃反应过夜后，用PBS缓冲溶液冲洗三次，加入BSA溶液反应1小时后，用PBS缓冲溶液冲洗三次再加入含有冰毒标准溶液。反应1小时，再次PBS缓冲溶液冲洗三次之后，加入已经连接上碳点的冰毒抗体反应1小时，同样用PBS缓冲溶液冲洗三次，加入100μL浓度为4mM的柠檬酸三钠溶液和100μL浓度为320μmol/L的双氧水溶液反应40分钟，再加入100μL浓度为2mmol/L的氯金酸溶液。30分钟后，其颜色变化如图5所示，当冰毒的浓度为0时，微孔板中金纳米颗粒的颜色为红色，而在加入不同浓度冰毒之后的微孔板中，溶液颜色变化不同，根据其吸光度大小做出标准曲线，标准曲线如图6所示。
实施例5：
尿液中冰毒含量的检测。具体操作过程如上所述，仅将含有不同冰毒浓度的尿液样品代替冰毒标准溶液，如图7所示，其中6号样品为不含冰毒的阴性对照。当冰毒的浓度为0时，微孔板中6号样品金纳米颗粒的颜色为红色，此时在微孔板中并没有形成三明治的夹心结构，即没有连接上有催化作用的碳点对双氧水进行分解，生成了红色溶液，而在不同含量冰毒的条件下，由于冰毒与抗原的特异性结合作用，在微孔板中形成了夹心结构，在生成金纳米颗粒时，碳点对双氧水溶液起到了分解的作用，因此形成了不同于红色的一系列不同颜色的溶液。

Claims (3)

1.一种具有催化性能碳点的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以聚乙烯亚胺、半胱氨酸、乙二醇、蒸馏水、固体磷酸于180℃油浴加热至溶液为淡黄色凝胶状，然后用水溶解，直至成棕黄色凝胶状，自然冷却至室温；
(2)将上一步所得棕黄色凝胶状产物处理后得到纯净的碳点溶液；得到的碳点溶液为棕黄色，发绿色荧光；
(3)在步骤(2)碳点的催化作用下，5分钟内H2O2能氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺使之变成蓝色，即该碳点具有催化作用。
2.根据权利要求1所述具有催化性能碳点的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述的处理是，首先用乙醇溶解棕黄色凝胶状产物，过滤，再进行旋蒸得到固体碳点；然后再以蒸馏水溶解固体碳点，用截留分子量为1000的透析袋，透析24h，得到纯净的碳点溶液。
3.根据权利要求1所述具有催化性能碳点的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述碳点溶液的激发波长为360nm，发射450nm的绿色荧光。
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