CN105158462A - 神经系统疾病的诊断 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及：一种用于诊断疾病的方法，所述方法包括步骤检测样品中的结合于人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基的自身抗体；包含人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基的分离的和/或重组多肽；膜相关的人Na(+)/K(+)ATP酶或其变体用于诊断疾病的用途；包含人神经元Na(+)/K(+)ATP酶或其变体的α3亚基的分离的和/或重组多肽，其用于疾病治疗；结合于所述多肽的自身抗体；以及用于分离这种自身抗体的方法；包含所述多肽的药物组合物、医疗或诊断设备、或试剂盒。

Description

神经系统疾病的诊断
技术领域
本发明涉及一种用于诊断疾病的方法，包括步骤：检测样品中的结合于人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基的自身抗体。
背景技术
研发用于神经系统紊乱的诊断系统在生物医学科学中是一项持续的挑战，这是因为遇到的许多症状决不是可以由种类巨大的成因进行解释的，包括基因遗传的疾病、药物滥用、营养不良、感染、损伤、精神病学疾病、免疫缺陷和癌症。而且，将指示需要执业医生采取快速措施的疾病发作的症状和那些由于年老而有规律地发生的症状进行区分可能是困难的。
早期诊断的重要性不能被过分强调。许多神经变性紊乱(最为突出的阿尔茨海默氏痴呆和帕金森病)不能被治愈，但药物是可利用的，可用于减缓它们的发展进程。诊断越早，开发可用药物的范围以使患者充分受益的时机越好。
尽管需要早期的诊断，但同等重要的是要确保随后被选择作为治疗方案基础的结果是足够可靠的，以免患者被误诊。
向神经系统家寻求医疗救助的患者经常具有可以与多血症疾病相关的非特定症状。例如，在文献报道的一个病例中，患者由于遗传决定的线粒体代谢作用紊乱而患有运动失调、吞咽困难和构音障碍疾病(Danielsson等，Sensoryataxicneuropathywithdysarthria/dysphagiaandophthalmoplegia(SANDO).Twocasereports.ActaMyol.Dec2011；30(3)：188-190)。
相反，患有一组相似症状的一组患者显示出具有由自身抗体造成的Tau蛋白病变(tauopathy)(Sabater等，Anovelnon-rapid-eyemovementandrapid-eye-movementparasomniawithsleepbreathingdisorderassociatedwithantibodiestoIgLON5：acaseseries，characterisationoftheantigen，andpost-mortemstudy.LancetNeurol.2014年4月2日)。
在神经系统家检查具有许多非特定症状的患者的情况下，他或她将努力收集关于病因的任何类型的信息，即使确定的诊断超出了可行性。例如，如果能够建立症状是由于神经变性紊乱而造成的，这将帮助排除各种起相反作用的治疗方案。因此，存在相当大的测定需求，用于诊断与非特定症状相关的神经系统状况，诸如贯穿本申请所描述的那些。
因此，作为本发明基础的一个问题是提供一种用于诊断新的神经系统疾病的方法，所述疾病由来自以下组的一种或多种症状表征，包括视觉损伤、运动失调、构音障碍、吞咽困难和痉挛性四肢轻瘫，优选地伴有肿瘤，更优选腺癌。
作为本发明基础的另一个问题是提供一种自身抗体，当在取自患者的液态样品中发现了所述自身抗体时，指示所述患者患有神经系统疾病，所述疾病被表征为视觉损伤、运动失调、构音障碍、吞咽困难和痉挛性四肢轻瘫，优选地伴有肿瘤，更优选腺癌。
作为本发明基础的所述问题通过所附的独立权利要求和从属权利要求的主题得以解决。
发明内容
本发明基于发明人惊人的发现：存在结合于人神经元膜相关的ATP酶的自身抗体，所述自身抗体与神经系统疾病相关联，所述疾病被表征为视觉损伤、运动失调、构音障碍、吞咽困难和痉挛性四肢轻瘫。
此外，本发明基于发明人惊人的发现：出现结合于人神经元膜相关的ATP酶的自身抗体表明腺癌的可能性增加。
不希望被束缚于该理论，发明人假定患者的免疫系统攻击神经元或者对于神经系统至关重要的其它细胞中的人神经元ATP酶，以达到所述细胞死亡并且突触传递被减弱的效果。
本发明涉及多肽，包括哺乳动物ATP酶，更优选人ATP酶，更优选哺乳动物或人神经元ATP酶或其变体，所述多肽贯穿本申请被称为“发明的多肽”。在一种优选的实施方式中，所述ATP酶是膜相关的Na(+)/K(+)ATP酶。在一种最优选的实施方式中，所述多肽包括被数据库代码P13637编码的人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基。贯穿本申请，被引用的任何数据库代码指UniProtKB/Swiss-Prot数据库，更具体地是于2014年5月2日可在线访问的版本。
然而，本发明的教导也可以利用这些多肽或核酸的变体来执行。
附图说明
通过下面的附图以及非限定性的序列和实施例进一步阐明了本发明，从中可以得到本发明的其它特征、实施方式、方面和优势。
图1描述了中枢神经组织、心脏和胃的免疫荧光染色结果。采用稀释320倍的患者血清温育冰冻切片。核通过采用TO-PRO-3碘化物温育而被复染。A：大鼠小脑，B：灵长类动物小脑，C：大鼠海马，D：猪小脑，E：灵长类动物心脏，F：灵长类动物胃。
图2描述了固相支撑的免疫沉淀反应和验证被识别抗原的结果。A：采用胶状考马斯染色的不同免疫沉淀反应的洗脱物的SDS-PAGE分析。泳道1：分子量标记，泳道2-4：采用不健康的对照血清沉淀的大鼠小脑，泳道5：采用患者血清沉淀的大鼠小脑，泳道6：采用患者血清沉淀的猪小脑。B：不同免疫沉淀反应的洗脱物的蛋白质印迹分析，通过单克隆抗Na+/K+-ATP酶α3抗体(Dianova)进行检测。泳道1：采用患者血清沉淀的大鼠小脑，泳道2-4：采用不健康的对照血清沉淀的大鼠小脑，泳道5：分子量标记。C：采用患者血清和抗Na+/K+ATP酶α3抗体对大鼠小脑和大鼠海马的免疫荧光染色。核通过采用TO-PRO-3碘化物温育而被复染。
图3示出涉及将褐家鼠神经元(Na+/K+)ATP酶识别为结合于被分离的自身抗体的抗原的质谱数据。
图4描述了被转染的HEK293细胞的免疫荧光分析结果。10倍稀释的患者CSF在表达Na+/K+ATP酶的重组亚基的HEK293细胞上被温育。A3：α3亚基。B1：β1亚基，G：γ亚基。采用丙酮或1％福尔马林固定细胞。B：在神经元组织上的免疫荧光反应的中和作用。采用Na+/K+α3亚基转染的HEK293细胞的提取物或者采用空载体作为对照预温育1000倍稀释的患者血清。
图5示出了小鼠脑和肿瘤组织的免疫组织化学染色结果。A：稀释500倍的抗Na+/K+ATP酶α3，在小鼠小脑上。B：小鼠小脑上的通用阴性对照物。C：稀释1000倍的抗Na+/K+ATP酶α3，在患者结肠癌上。D：患者结肠癌上的通用阴性对照物。
具体实施方式
在一种优选的实施方式中，术语“变体”如在本文中使用的，指全长序列的至少一个片段，更具体地指一个或多个氨基酸或核酸序列，其相对于全长序列在一个或两个末端处被截短一个或多个氨基酸。这种片段包括或者编码具有原始序列或其变体的至少6、7、8、10、12、15、20、25、50、75、100、150或200个连续氨基酸的肽。变体的总长可以是至少6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。
在另一种优选的实施方式中，术语“变体”不但涉及至少一个片段，而且涉及包括氨基酸序列的多肽或其片段，所述氨基酸序列与被提到的参考氨基酸序列或其片段具有至少40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％的同一性，其中，除了对生物活性(例如抗原结合于(自身)抗体的能力)或者多肽的折叠或构象必不可少的那些氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代，和/或一个或多个这种必需的氨基酸以保守的方式被取代，和/或氨基酸被增加，从而所述多肽的生物活性得到保留。技术现状包括各种可用于比对两个给定的核酸或氨基酸序列并且计算同一性程度的方法，例如参见ArthurLesk(2008)，Introductiontobioinformatics，OxfordUniversityPress，2008，3rdedition。在一种优选的实施方式中，使用了ClustalW软件(Larkin等，ClustalWandClustalXversion2.0.Bioinformatics，23，2947-2948)，采用了默认设置。
在一种优选的实施方式中，变体可以另外包括化学修饰。
而且，变体也可以通过与其它已知的多肽或其变体融合而产生，并且包括活性部分或活性结构域，优选地当与参考序列的活性部分比对时，具有至少70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％的序列同一性，其中，术语“活性部分”如在本文中使用的，指天然序列的变体，其可以被截短，但保持一些生物活性。
所述多肽的变体具有生物活性。在一种优选的实施方式中，这种生物活性是特异性地结合于IgG2类自身抗体的能力，所述自身抗体发现于患有紊乱的患者中，所述紊乱选自以下组：包括副肿瘤性紊乱、神经系统紊乱，更优选地神经性的副肿瘤性紊乱，最优选神经系统紊乱，其被表征为选自以下组的一种或多种症状、优选所有症状：包括混合型运动障碍、视觉性能的急性下降、构音障碍和吞咽困难以及癌症，更优选腺癌。
当本发明的多肽被用于实施本发明的教导时，可以以任何形式和任何纯度提供，从包括内源形式的这种多肽的组织或细胞，更优选过表达所述多肽的细胞，这些细胞的天然的或富集的裂解产物，到被纯化的和/或分离的多肽，所述多肽基本上是纯的。在一种优选的实施方式中，所述多肽是天然的多肽。在另一种优选的实施方式中，所述多肽是重组蛋白质。在一种优选的实施方式中，如果在各个样品中至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的多肽由所述多肽组成，则多肽是纯的，如由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后进行考马斯蓝染色和目视检查所判断的。
如果本发明的包括人神经元Na(+)/K(+)ATP酶或其变体的多肽以组织的形式提供，则优选所述组织来自哺乳动物脑，例如人、大鼠、灵长类动物、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或母牛脑。
如果所述多肽以非重组细胞的形式提供，则优选所述细胞是神经元，优选海马神经元或者来自哺乳动物神经毡的细胞，例如大鼠、人、灵长类动物、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或母牛。如果细胞裂解物被使用，则优选所述细胞裂解物包括与细胞表面相关联的膜。如果所述多肽以重组细胞的形式提供，则优选所述重组细胞是诸如酵母细胞的真核细胞，更优选来自多细胞真核生物的细胞，诸如植物、哺乳动物、蛙或昆虫，最优选来自哺乳动物，例如大鼠、人、灵长类动物、驴、小鼠、山羊、马、绵羊、猪或母牛。例如，所述细胞可以是采用在功能上编码本发明的多肽的核酸转染的HEK293细胞。本领域技术人员熟悉用于制备、转染和培养这种细胞的方法，例如在Phelan.M.C.(2001)，BasicTechniqueesinMammalianCellTissueCulture，JohnWiley中描述的那些方法。
用于执行本发明教导的多肽，包括任何变体，优选被设计成它包括被自身抗体识别和/或特异性结合于自身抗体的表位，所述自身抗体结合于哺乳动物(优选人)神经元ATP酶、更具体地是人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基、或其变体，更优选取自患有被发明人识别的新神经系统紊乱的患者。
本发明的多肽可以是固定的多肽。在一种优选的实施方式中，术语“固定的”如在本文中使用的，指结合于在含水溶液中不溶的固体载体的分子，更优选地通过共价键、静电相互作用、封装或者包埋，例如通过在凝胶中使球状多肽变性，或者通过疏水相互作用，已经被描述在文献中，例如Kim，D.，和Herr，A.E.(2013)，Proteinimmobilizsationtechniquesformicrofluidicassays.Biomicrofluidics7(4)，041501。在文献中描述了用于固定分子的各种方法，例如Kim，D.Herr，和A.E.(2013)，Proteinimmobilizsationtechniquesformicrofluidicassays，Biomicrofltidics7(4)，041501。此外，用于固定反应的各种试剂和试剂盒在市场上是可买到的，例如从PierceBiotechnology购买。
重要的是用于诊断的样品包括受试者的全部免疫球蛋白中的有代表性的一组。
贯穿本申请描述的试剂、设备、方法和用途可以被用于诊断选自以下组的疾病：包括副肿瘤性紊乱、神经系统紊乱，更优选副肿瘤性的神经系统综合征，最优选神经系统紊乱，被表征为选自以下组的一种或多种症状、优选所有症状，包括混合型运动障碍、视觉功能的急性衰退、构音障碍和吞咽困难以及癌症，更优选腺癌。
在一种优选的实施方式中，术语“诊断”，如在本文中使用的，是指旨在获得信息的任何类型的过程，所述信息有助于评估患者是否患病或者是否可能或者比平均的或者可比较的受试者更可能患病，后者优选具有相似的症状，将来从过去的某种疾病或紊乱中遭受痛苦，在诊断时或者在将来找出疾病如何正在进展或者将来有可能如何进展，或者评价患者关于某种治疗的反应，例如服用免疫抑制药物、减缓神经变性疾病进展的药物或者抗癌药物。换言之，术语“诊断”不仅包括诊断，也包括预言和/或监测疾病或紊乱的过程。
在许多情况下，纯粹的检测，换言之，确定可检测水平的抗体是否存在于样品中，对于诊断是足够的。如果所述自身抗体能够被检测的话，这将是有助于临床医生诊断的信息，并且指示患者患一种或多种疾病的可能性增加。
本领域技术人员将理解临床医生通常不会仅基于单个诊断参数来断定患者是否患病或者有可能患有疾病、状况或紊乱，而是需要考虑其它的方面，例如其它自身抗体的存在、标记物、血液参数、患者症状的临床评价，或者医学成像或诸如多道睡眠描记术(polysomnography)的其它非侵入性方法的结果，以获得确凿的诊断。参见BaenklerH.W.(2012).Generalaspectsofautoimmunediagnostics，Renz，H.，Autoimmunediagnostics，2012，deGruyter，第3页。诊断药剂或方法的价值也可归于排除一种疾病的可能性，从而允许间接诊断另外的疾病。
因此，术语“诊断”并不优选地意味着根据本发明的诊断方法或药剂将是明确的，并且足以基于单次测试来结束诊断，更不用说参数了，而是可以指对于被称为“鉴别诊断”的贡献，即基于一定范围的诊断参数考虑可能的状况范围的可能性的系统的诊断过程。因此，本发明的方法、多肽或用途，任选地用于确定患者是否患有神经系统紊乱，所述紊乱被表征为选自以下组的一种或多种症状、优选所有症状，包括混合型运动障碍、视觉功能急性衰退、构音障碍和吞咽困难，或者是否患有癌症，优选腺癌，可以包括从患者获得样品，优选人类患者，确定所述样品中是否存在结合于人神经元Na+/K+ATP酶的α3亚基的自身抗体，其中，通过将样品与本发明的多肽进行接触并且检测在所述多肽和所述自身抗体之间是否发生结合而进行所述确定，优选地利用标记的第二抗体，更优选地利用来自以下组的方法，包括放射性免疫分析、蛋白质印迹、线印迹、ELISA、间接和免疫荧光，其中，如果自身抗体存在于样品中的话，则所述自身抗体结合于所述多肽，并且如果确定所述自身抗体存在于样品中，则将患者诊断为患有或者更可能患有所述神经系统紊乱或癌症。
术语“诊断”也可以指用于区分与相似或相同症状相关联的两种或多种状况的方法或药剂，例如，区分由自身免疫缺陷导致的运动失调和与神经变性疾病相关联的其它形式的运动失调，或者用于从相关的紊乱范围中挑选出亚群或特定的疾病。在一种优选的实施方式中，所述紊乱的范围是副肿瘤性的神经系统综合征。
术语“诊断”也可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或药剂，例如免疫抑制药物。
本发明涉及一种复合物，其包括结合于本发明的多肽的(自身)抗体。这种复合物可以被使用或者被检测，作为用于诊断疾病的方法的部分。包括来自受试者的抗体的液态样品可用于实施所述方法。这种液态样品可以是包含来自受试者的一组有代表性的抗体的任何体液，优选地样品包含来自受试者的IgG免疫球蛋白类的抗体，更优选地来自包含IgG1、IgG2和IgG4亚类的组，最优选来自IgG4亚类。例如，样品可以是脑脊液(CSF)、血液或血清、淋巴、间质液，并且优选血清或CSF，更优选血清。
将包含抗体的液态样品与本发明的多肽进行接触的步骤可以通过在包含抗体的样品存在下在这样的条件下温育固定形式的多肽而实施，所述条件适合于形成包含所述多肽和结合于本发明的多肽的抗体(优选自身抗体)的复合物。这些条件可以包括将在PBS缓冲液中以1∶100稀释的样品中的多肽在25℃下温育30分钟。
在一种优选的实施方式中，所述检测包括使用选自以下组的方法，包括免疫扩散技术、免疫电泳技术、光散射免疫测定、光散射免疫测定、凝集技术、标记的免疫测定，诸如来自如下组的那些：包括放射性标记的免疫测定、酶免疫测定、化学发光免疫测定以及免疫荧光技术。现有技术中也描述了这些方法。例如Zane，H.D.(2001).Immunology-Theoretical&PracticalConceptsinLaboratoryMedicine，W.B.SaundersCompany中，尤其是第14章中。
在一种优选的实施方式中，微板、膜ELISA、点印迹或者线印迹被用于实施根据本发明的诊断方法。适当的试剂、设备和软件包可从市场上购买，例如从德国的EUROIMMUN，Lübeck购买。
在另一种优选的实施方式中，符合本发明教导的预后、诊断、方法或试剂盒考虑采用间接的免疫荧光。本领域技术人员熟悉这种技术以及适宜的样品的制备，这些被描述于技术现状(US4647543)。
在一种优选的实施方式中，术语“特异性结合”，如在本文中使用的，是指所述结合强于用解离常数为1×10-5M、更优选1×10-7M、更优选1×10-8M、更优选地1×10-9M、更优选地1×10-10M、更优选1×10-11M、更优选1×10-12M表征的结合反应，如利用Biacore设备在25℃下在pH7的PBS缓冲液中通过表面等离子体共振所确定的。所述抗体可以是被分离的或者是在包括另外的抗体、多肽、代谢物、细胞等的混合物中。
在本发明的范围内提供了一种包括本发明的(自身)抗体和/或本发明的多肽的医疗或诊断设备。优选地，这种医疗或诊断设备包括本发明的多肽，所述多肽处于允许它与含水溶液(更优选液态人类样品)以直接方式接触的形式。特别是，本发明包含的多肽可以被固定在载体的表面上，所述载体包括但不局限于玻璃板或玻片、生物芯片、微量滴定板、珠(例如磁珠)、色谱柱、膜或类似物。示例性的医疗设备包括线印迹、微板和生物芯片。除了本发明的多肽之外，所述医疗或诊断设备可以包括另外的多肽，例如阳性或阴性对照物。
本发明的教导提供了一种用于诊断与一种或多种症状相关联的疾病的试剂盒，所述症状选自以下组：包括混合型运动障碍、视觉功能急性衰退、构音障碍和吞咽困难。这种试剂盒可以包括详细说明如何使用试剂盒的说明书以及用于将本发明的多肽与来自受试者(优选人类受试者)的体液样品进行接触的装置，例如线印迹，其中本发明的多肽被固定到线印迹上。此外，所述试剂盒可以包括阳性对照物。
在一种优选的实施方式中，所述试剂盒包括用于检测抗体的装置。用于检测的许多方法和装置已经描述于Philips，Terry.M.Analyticaltechniquesinimmunochemistry，1992，MarcelDekker，Inc。
本发明的多肽可以以细胞的形式提供，所述细胞包含和/或表达编码所述多肽的核酸。包含用于编码本发明的多肽的核酸的所述细胞可以是重组细胞或者分离的细胞，其中，术语“分离的”是指细胞被富集，从而与所述细胞的野生型环境相比，存在更少的其它分化或种类的细胞，或者事实上不存在这种其它的细胞。
本领域技术人员将理解贯穿本申请讨论的任何优选实施方式可以被应用到本发明的任何方面。
实施例：
以下实施例说明与一种或多种症状相关联的神经系统紊乱疾病与抗人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的自身抗体的出现有关，所述症状选自以下组：包括混合型运动障碍、视觉功能急性衰退、构音障碍和吞咽困难。所述自身抗体能够在临床上被诊断为患有所述疾病的患者中检测到，但在健康的受试者中或者在患有其它神经系统疾病的患者中不能检测到这样的抗体。
如在本文中示出的，这些自身抗体特异性地结合于人神经元Na(+)/K(+)ATP酶，并且也结合于其变体，更具体地结合于哺乳动物的相应物，诸如来自鼠、小鼠和猪的那些相应物。这些相应物具有大约83％的序列同一性。
患者的表征
66岁的女性患者在2012年11月首先出现视力模糊和运动失调。脑的MRI扫描显示皮层下的白质损伤。脑脊液检查显示淋巴单核细胞增多(12个细胞/μL)，蛋白质水平升高(104g/L)和寡克隆带。静脉内皮质激素类治疗3天后症状改善。怀疑中枢神经系统的慢性炎性疾病。
在2013年2月，患者因具有渐进性的运动失调而被重新收治，她不能独立行走，眼睛运动是痉挛性的，且双眼视力下降至0.2。脑脊液检查显示伴随浆细胞的淋巴单核细胞增多(46个细胞/μL)，蛋白质水平升高(83.6g/L)，和寡克隆带。考虑到副肿瘤性综合征，患者接受多价免疫球蛋白(2g/kg，静脉注射5天)。PET-CT显示代谢亢进的结肠直肠肿瘤。该肿瘤被完全切除。组织病理学分析显示为低分化的溃疡性腺癌。淋巴结的组织病理学分析显示无转移。
患者进一步接受免疫球蛋白(0.4g/kg，静脉注射，每4周)，在这种情况下，小脑症状是稳定的，并且推荐了辅助性化疗。
在2013年8月，症状再次恶化。患者患有严重的构音障碍和吞咽困难、垂直凝视瘫痪、严重的肢体运动失调以及痉挛性四肢轻瘫。她不能离床。血浆置换法进行了6次，宣称的副肿瘤性综合征无改善。PET-CT显示淋巴结腹膜后转移。进行淋巴结的CT引导的针活组织检查，其再次在组织学上显示出为低分化的腺癌。由于标准FOLFIRI制度，开始了姑息性的化疗。患者在2013年11月死亡，未进行尸体解剖。
患者的最初血清学检查
在2013年2月进行了最初的检查。根据由EUROIMMUN提供的用于IFA检验的标准温育协议，进行了间接的免疫荧光测定(IFA)。简要地，具有哺乳动物脑组织的4μm冰冻切片的玻片用在PBS，0.2％Tween-20(样品缓冲液)中以1∶10到1∶10′000的比例被稀释的患者血清在25℃下被温育30分钟。在利用样品缓冲液彻底清洗玻片后，玻片用共轭到异硫氰酸荧光素(FITC，EUROIMMUN)的抗人-IgG在25℃下温育30分钟。在另一次清洗步骤之后，采用荧光显微镜检查玻片。大鼠和灵长类动物的小脑显示出粒状和分子层的强IgG染色，但是未观察到浦肯野细胞的染色(图1A和1B)。采用猪小脑在所有层上获得了类似的强烈染色，尽管在大鼠海马上识别到神经毡的染色(图1C和1D)。来自小鼠全脑的冰冻切片和灵长类动物脑垂体、下丘脑、脑和脊髓的温育显示出神经毡在脑的所有部分均染色，无任何个别的特征。另外，心脏肌膜、肠肌间的和粘膜下层的神经以及胃壁细胞被染色(图1E和1F)。
更进一步采用重组地表达已知神经自身抗原(Hu，Yo、Ri、CV2、PNMA1、PNMA2、DNER/Tr、MAG、MP0、GAD65、两栖生理素、恢复蛋白、GABAB受体、甘氨酸受体、DPPX、水通道蛋白-4、NMDA受体、AMPA受体、LGI1、CASPR2)的HEK293细胞的单特异性免疫荧光测定(IFA)产生了阴性结果。IgG亚类分布的分析证实了独有的IgG2反应性。
在2013年8月初分析了随访的血清，接着是两周之后的血清/CSF对。如在初始血清样品中一样，反应模式相同。
识别脑特异性Na(+)/K(+)ATP酶作为目标自身抗原
采用1∶100稀释的患者血清或者来自健康对照者的血清，与大鼠或猪小脑的冰冻切片一起，进行了固相支撑的免疫沉淀反应。当使用患者血清时，免疫沉淀物含有大量的IgG，尽管它们通常在温育来自健康对照者的血清之后较低(图2A)。邻近免疫球蛋白，免疫沉淀的患者血清显示出相应于在SDS-PAGE中采用胶状考马斯染色的大约100kDa和50kDa的分子质量的蛋白质带(图2A)。这些带在对照样品中是不存在的。100kDa蛋白质被鉴定为ATP酶，Na+/K+运输，α3多肽，分别来自褐家鼠(UNIPROTacc.#P06687)和野猪(UNIPROTacc.#D2WKD7)。50kDa蛋白质被鉴定为来自褐家鼠(UNIPROTacc.#P07340)的相应β-1亚基。图3中显示了一组有代表性的质谱数据。表1中示出获得的主要数据。
采用单克隆抗Na+/K+ATP酶α-3抗体的蛋白质印迹分析显示出在采用患者血清获得的免疫沉淀物的100kDa处的强反应，而采用三个对照血清获得的部分无反应(图2B)。当被用在IFA中时，单克隆抗-Na+/K+ATP酶α-3抗体产生荧光图案，与由患者血清产生的那些荧光图案一致(图2C)。
作为正确的抗原鉴定的证据，所有可利用的患者样品随后通过IFA进行分析，采用了单独或者与ATP1B1和/或ATP1G联合表达ATP1A3的HEK293，并且采用了模拟物转染的对照物(图4A)。所有的样品在表达ATP1A3的细胞上产生了典型的染色图案，与固定的类型无关(丙酮或1.825％(w/v)福尔马林)。当所有的亚基被共同表达且福尔马林固定被避免时，荧光强度是最高的。相反，ATP1B1或ATP1G单独表达或模拟物转染不会导致任何抗体结合。通过由含有ATP1A3的HEK293部分(fraction)对结合于脑组织的抗体的剂量依赖性的竞争性消失，进一步证明了患者自身抗体的靶标和ATP1A3一致(图4B)。当单独地使用含有ATP1B1或ATP1G的类似部分时，抗体结合不受影响。
为了分析ATP1A3底物的特异性，34个来自具有各种神经自身抗体(抗-NMDAR、抗-Hu、抗-Yo、抗-Ri、抗-AQP4、抗-LGI1、抗-CASPR2)的患者的血清和50个来自健康供血者的血清也通过IFA进行了分析。所有血清均未如标引患者的样品那样在重组底物或不同的脑组织上产生类似的免疫荧光图案。
表1：在免疫沉淀反应实验的质谱分析中获得的一组有代表性的主要数据，旨在识别结合于分离的自身抗体的抗原。
肿瘤组织中ATP1A3的检测
通过小鼠脑的染色，表明利用鼠单克隆抗体检测福尔马林固定的、石蜡包埋的和热回收的组织切片中的ATP1A3的有效性(图5A)。患者的结肠直肠腺癌组织温育产生了肿瘤组织特有的细胞簇染色，但周围的健康组织没有任何染色(图5C)。一致地，来自健康供体的结肠组织也未被染色。

Claims (15)

1.一种用于诊断疾病的方法，其包括步骤：检测样品中结合于人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基的自身抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样品是包含抗体的体液，优选地选自包括全血、血清、脑脊液和唾液的组。
3.一种分离的和/或重组多肽，包含人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基或其变体。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中，所述多肽是固定的。
5.人神经元Na(+)/K(+)ATP酶或其变体用于诊断疾病的用途，优选地包括检测结合于所述人神经元Na(+)/K(+)ATP酶或其变体的自身抗体的步骤。
6.根据权利要求3-4中任一项所述的多肽，其用于疾病的治疗。
7.一种自身抗体，优选分离的自身抗体，其结合于根据权利要求3-4中任一项所述的多肽，其中，所述自身抗体优选地与根据权利要求3-4中任一项所述的多肽复合。
8.一种用于分离结合于根据权利要求3-4中任一项所述的多肽的自身抗体的方法，其包括步骤
a)在适于形成复合物的条件下，将包含所述自身抗体的样品与根据权利要求3-4中任一项所述的多肽进行接触，其中，所述自身抗体结合于所述多肽，
b)分离在步骤a)中形成的所述复合物，
c)离解在步骤b)中分离的所述复合物，以及
d)从所述多肽中分离出所述自身抗体。
9.一种药物组合物，包含根据权利要求3所述的多肽。
10.一种医疗或诊断设备，其包含根据权利要求3-4中任一项所述的多肽。
11.一种用于疾病诊断的试剂盒，其包含根据权利要求3-4中任一项所述的多肽。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，还包括用于检测复合物的装置，所述复合物包含结合于根据权利要求3-4中任一项所述多肽的自身抗体和根据权利要求3-4中任一项所述的多肽。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法、多肽用途、自身抗体、药物组合物、设备或试剂盒，其中，所述疾病选自以下组：包括癌症和神经系统紊乱、并且优选为所述神经系统紊乱，所述癌症优选腺癌，所述神经系统紊乱优选由两种或多种症状表征，所述症状选自以下组：包括混合型运动障碍、视觉功能急性衰退、构音障碍和吞咽困难。
14.根据权利要求5、8、12或13中任一项所述的方法，其中，所述自身抗体是结合于人神经元Na(+)/K(+)ATP酶的α3亚基的自身抗体。
15.根据权利要求3-14中任一项所述的多肽、用途、自身抗体、药物组合物、设备或试剂盒，其中，所述多肽以以下形式被提供：包含编码所述多肽的核酸的细胞，或者包含所述多肽的组织。
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