CN102227635A - Na/K-ATP酶表达作为癌症治疗的指示剂 - Google Patents

Na/K-ATP酶表达作为癌症治疗的指示剂 Download PDF

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Abstract

公开了用于调控Na/K-ATP酶的表达的方法和其用途，包括在癌症的诊断/预后和治疗中的应用。

Description

Na/K-ATP酶表达作为癌症治疗的指示剂
交叉参考相关申请
本申请要求2008年10月29日提交的美国临时申请NO.61/109,386(将其公开内容通过参考并入本文)的利益。
关于联邦资助的研究的声明
本发明是在由卫生和人类服务部美国公共卫生署国家一般医学科学研究提供的国立卫生研究院基金HL-36573和HL-67963下由政府资助进行的，因此政府在本发明中具有权利。
参考经由EFS-WEB提交的序列表
本申请将通过USPTO EFS-WEB服务器电子提交，如被授权并且示于MPEP$1730 II.B.2(a)(A)中的，并且该电子提交包括电子地提交的序列(SEQ ID)表。该序列表的完整内容出于所有目的通过参考并入本文。序列表在电子提交的.txt文件上名称如下：2009年10月23日生成的420_50446_SEQ_LIST_D2009-09.txt，大小为2,092字节。
本发明的技术领域和工业实用性
本发明部分基于如下发现：哇巴因(ouabain)诱导的Na/K-ATP酶表达的变化决定细胞生长调控。此外，哇巴因诱导的PI3-K/Akt/mTOR途径的激活是哇巴因诱导的Na/K-ATP酶上调的关键因素。此外，雷帕霉素(或与雷帕霉素相似的药物)对PI3-K/Akt/mTOR途径的抑制还可使哇巴因应答从生长刺激变成生长抑制。
发明背景
Na/K-ATP酶(P型ATP酶家族的成员)经发现为能量转换离子泵(energy transducing ion pump)。其将Na+和K+运输穿过细胞膜并且维持动物细胞的离子稳态(ion homeostasis)。
最近的研究显示，Na/K-ATP酶还可以是可授予配体结合进入蛋白激酶级联的激活的重要受体。具体地，Na/K-ATP酶与Src相互作用，这产生至少两个重要的细胞调控。首先，其使Src保持在无活性状态。因此Na/K-ATP酶可充当天然的负Src调节剂。其次，该相互作用形成强心甾类固醇(Na/K-ATP酶的一组详尽表征的配体)的功能性受体复合物。强心甾类固醇(Cardiotonic steroids，CTS)包括强心内戊酯类(例如，哇巴因)和蟾蜍二烯羟酸内酯(bufadienolides)(例如，MBG-海蟾蜍毒素(marinobufagenin))。虽然CTS是已知的心脏药物，但它们中的一些现已被鉴定为内源性类固醇激素。CTS与受体复合物的结合激活了Na/K-ATP酶-结合的Src。随后被激活的Src反式激活其他酪氨酸激酶，然后它们一起募集并且进一步磷酸化多个膜蛋白和可溶性蛋白，这导致蛋白质激酶级联的激活和第二信使的产生。最终，该信号传导事件链将以细胞特异性方式改变细胞功能和细胞生长。例如，本发明者和其他研究人员已证明哇巴因诱导的ERK和PI3-K/Akt/mTOR途径的激活是导致转化的细胞系、原代培养物以及体内细胞生长刺激的原因。
CTS抑制许多癌细胞的细胞生长长期以来也得到公认。特别重要的是表明CTS治疗在患乳腺癌的妇女中的有益效果的研究。相一致地，最近的体外和体内研究已鉴定了几种展示抗癌活性的新型CTS化合物。例如夹竹桃苷在美国作为人癌症的抗癌药物正在进行临床试验。虽然哇巴因抑制Na/K-ATP酶的泵功能，但重要地要指出，哇巴因的生长抑制作用可在既不引起细胞内Na+和K+的显著改变也不影响细胞活力的剂量上发生。相反，与其对细胞生长刺激的作用一样，哇巴因通过激活蛋白激酶和产生第二信使而诱导细胞生长抑制。例如，最近的报导显示这些无毒性浓度的哇巴因刺激Src，从而导致EGFR/ERK途径的激活和细胞周期抑制剂p21cip(周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂)表达的诱导以及细胞生长停滞。因此，理解决定细胞响应CTS刺激的不同命运的分子机制变得重要起来，以便可开发抑制或刺激细胞生长的方法。
目前，Na/K-ATP酶是CTS的唯一已知的受体。以前的研究已显示CTS诱导Na/K-ATP酶的内吞作用和通过受体介导的信号转导调节其细胞表达。因为Na/K-ATP酶具有抽泵和信号转导功能，所以本发明者在本文中认为，细胞Na/K-ATP酶量的变化可对细胞生长具有显著的影响。
本发明者在本文中现已显示细胞Na/K-ATP酶在哇巴因诱导的细胞生长调控中的作用，并且发现了调节Na/K-ATP酶的细胞量的方法。考虑上述问题，很显然在本领域需要靶向新发现的Na/K-ATP酶/Src受体复合物以允许CTS例如哇巴因、地高辛(digoxin)和洋地黄毒苷(digitoxin)抑制或刺激细胞生长的方法。
这样的方法也可有助于开发日益更有效的、副作用更少的治疗剂、诊断剂或预防试剂。
根据本发明，正好提供了这样的方法。
发明概述
在第一广泛的方面，在本文中提供了确定癌症患者是否可从强心甾类固醇(CTS)治疗中获得治疗益处的方法，包括：确定患者的癌细胞是否已失去增加Na/K-ATP酶的细胞合成的能力，其中Na/K-ATP酶合成的丧失标示着患者可能从CTS治疗中受益。
在某些实施方案中，所述方法可用于意欲接受洋地黄治疗的癌症患者的诊断和/或预后。
在某些实施方案中，所述方法包括确定癌细胞中哇巴因诱导的Na/K-ATP酶表达的变化是否与哇巴因诱导的细胞生长调控直接相关。
在某些实施方案中，所述方法包括检测癌细胞中PI3-激酶的激活，其中PI3-激酶的激活影响癌细胞中哇巴因诱导的Na/K-ATP酶的上调。
在某些实施方案中，所述方法包括测量细胞中Na/K-ATP酶表达的变化。
在某些实施方案中，所述方法包括使用Western印迹或3H-哇巴因结合测定法进行测量。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了用于确定细胞是否对强心甾类固醇(CTS)治疗易感的方法，包括：确定细胞是否保持补充(replete)细胞中减少的Na/K-ATP酶的能力。
在某些实施方案中，所述方法包括确定细胞是否缺乏补偿哇巴因诱导的Na/K ATP酶损失的机制。在某些实施方案中，所述细胞是癌细胞。
在某些实施方案中，在本文中提供了调节Na/K-ATP酶的细胞合成的方法，包括施用有效量的Na/K-ATP酶抑制剂例如强心甾类固醇CTS以调节Na/K-ATP酶的表观生物学活性。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了用于治疗患者的方法，包括单独地或与mTOR抑制剂和/或磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinisitide 3-kinase，PI3-K)抑制剂的靶中的至少一个组合地给患者施用有效量的Na/K-ATP酶抑制剂。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了配制于药学上可接受的赋形剂中并且适合用于人患者的药物制剂，其中包含Na/K-ATP酶抑制剂与mTOR抑制剂和/或磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)抑制剂的靶中的至少一个。在某些实施方案中，所述Na/K-ATP酶抑制剂是强心甾类固醇(CTS)。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了用于治疗癌症患者的试剂盒，其单独地或与减少Na/K-ATP酶表达的组合物组合地包括Na/K-ATP酶抑制剂。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了鉴定不太可能响应强心甾类固醇(CTS)疗法的癌症患者的方法，所述方法包括：
从癌症患者获得生物样品，其中所述生物样品包含癌细胞；和
测定Na/K-ATP酶的水平或活性，其中与正常健康受试者中发现的Na/K-ATP酶水平或活性相比较具有NF Na/K-ATP酶水平或活性的变化的患者表示该患者不太可能对CTS疗法起反应。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了诊断癌症或为患有其中由哇巴因触发的分子信号转导途径的表达发生改变的癌症的患者提供预后的方法，所述方法包括：
将癌症样品与特异性结合作为由哇巴因触发的分子信号转导途径一部分的蛋白质的抗体接触，其中所述分子信号转导途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径；以及
确定样品中所述蛋白质的表达是否被改变，从而诊断癌症或提供癌症的预后。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了鉴定抑制其中由哇巴因触发的分子信号转导途径发生变化的癌症的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
将表达由哇巴因触发的分子信号转导途径的多肽成员的细胞与化合物接触，其中所述分子信号转导途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径；以及
测定所述化合物对所述多肽的作用；从而鉴定抑制癌症的化合物。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了鉴定抑制难治性癌症的化合物的方法，所述方法包括：
将表达由哇巴因触发的分子信号转导途径的多肽成员的细胞与所述化合物接触，其中所述分子信号转导途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径；以及
测定所述化合物对多肽的作用；从而鉴定抑制所述难治性癌症的化合物。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了治疗或抑制受试者的癌症的方法，所述癌症具有改变的由哇巴因触发的分子信号转导途径，所述方法包括：
给受试者施用治疗有效量的一种或多种调节由由哇巴因触发的分子信号转导途径的多肽成员的抑制剂，其中所述分子信号转导途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了治疗或抑制受试者的难治性癌症的方法，包括：
给受试者施用治疗有效量的一种或多种由哇巴因触发的分子信号转导途径的调节剂，其中所述分子信号转导途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径。
在某些实施方案中，难治性癌症具有改变的由哇巴因触发的分子信号转导途径的表达，并且所述难治性癌症通过如下步骤进行诊断：
将癌症样品与特异性结合作为由哇巴因触发的分子信号转导途径的一部分的蛋白质的抗体接触；和
确定所述蛋白质的表达在该样品中是否被改变，从而诊断癌症或提供癌症的预后。
在某些实施方案中，将一种或多种调节剂与另一种癌症疗法同时施用。
在某些实施方案中，所述方法包括在不同的时间点上多次测定表达水平的模式，从而允许监控受试者中癌症的进展。
在某些实施方案中，所述方法包括估计给定的癌症治疗模式在受试者中的成功概率。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了用于调节细胞生长的方法，包括在细胞中引起由哇巴因或其他强心药(CTS)诱导的Na/K-ATP酶表达的变化。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了用于调节细胞生长的方法，包括：
通过将细胞与具有足以引起哇巴因诱导的Na/K-ATP酶上调的量的CTS接触，以诱导细胞中PI3-K/Akt/mTOR途径的激活来调节细胞中Na/K-ATP酶的表达。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了用于估计CTS疗法在接受此种CTS疗法的患者中的功效的方法，包括监控Na/K-ATP酶在这样的患者中的表达。
在某些实施方案中，患者患有癌症。在某些实施方案中，所述方法包括在癌症的治疗中将有效量的雷帕霉素和CTS疗法一起施用。在某些实施方案中，所述癌症包括乳腺癌并且所述CTS疗法包括施用约1至约50nM哇巴因、地高辛或洋地黄毒苷。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了在有需要的细胞中补充功能性Na/K-ATP酶的质膜库的方法，包括在细胞中实现哇巴因诱导的Na/K-ATP酶(α1)的哇巴因敏感型α1同种型的上调。
在某些实施方案中，所述方法包括施用至少一种足以在癌细胞中减少质膜Na/K-ATP酶并且引起哇巴因诱导的生长抑制的CTS。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了使细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感的方法，包括：
施用足以在细胞中阻止哇巴因诱导的细胞生长的有效量的雷帕霉素。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了通过PI3-K/Akt/mTOR-依赖性翻译机制在有此需要的细胞中增加Na/K-ATP酶的表达的方法，其包括以低浓度施用哇巴因或其他CTS。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了在有需要的细胞中阻止哇巴因诱导的Na/K-ATP酶的上调的方法，包括抑制细胞中的PI3-K/Akt/mTOR途径。
在某些实施方案中，所述方法包括施用有效量的一种或多种PI3-K抑制剂或mTOR抑制剂。
在某些实施方案中，所述方法包括施用雷帕霉素或其类似物。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了恢复细胞生长的方法，包括施用足以抑制p21cip调控蛋白表达的有效量的哇巴因。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了在药学上可接受的赋形剂中配制的适合用于在人中治疗癌症的药物制剂，其包含与PI3-K/AKt/mTOR途径的抑制剂组合的哇巴因或其他CTS。
在另一个广泛的方面，在本文中提供了治疗癌症患者的试剂盒，其中包含与PI3-K/AKt/mTOR途径的抑制剂组合的哇巴因或其他CTS，各试剂以预先测量的剂量配制给患者施用。
当根据附图阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本申请中的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然易见。
附图概述
本专利或申请文件可包含一个或多个彩色制作的附图和/或一张或多张照片。具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开案的复印件在请求和支付必需的费用后由专利局提供。
图1A-1C：哇巴因对不同细胞的细胞生长的作用。
图1A：将LLC-PK1细胞、BT20细胞和DU145细胞在96孔板上传代培养(10,000个细胞/孔)并且进行血清饥饿。在用不同浓度的哇巴因处理24小时后，加入MTT试剂。在温育90分钟后通过加入100μl/孔由ATCC提供的去垢剂溶解细胞，然后测量OD570。
图1B：将上述3个细胞系在12孔板上传代培养(50,000个细胞/孔)并且进行血清饥饿。在哇巴因处理后，用胰蛋白酶处理3个孔的对照和哇巴因处理的细胞，在指定的时间点计数。
图1C：使LLC-PK1、BT20和DU145细胞血清饥饿过夜，然后用哇巴因处理24小时。收集细胞裂解物，使用Western印迹探测p21cip。*p＜0.05，**p＜0.01。
图2A-2C：长期哇巴因处理差异地在LLC-PK1、BT20和DU145细胞中调节Na/K-ATP酶的表达和膜丰度：
图2A：利用Western印迹法测量的长期哇巴因治疗调节的Na/K-ATP酶α1表达。
图2B：用10nM哇巴因处理LLC-PK1和BT20细胞24小时，然后使用Western印迹法就Na/K-ATP酶β1测定细胞裂解物。
图2C：用哇巴因预处理LLC-PK1、BT20和DU145细胞72小时。洗涤细胞，如本文中所述进行3H-哇巴因。*p＜0.05，**p＜0.01
图3A和3B：由siRNA导致的Na/K-ATP酶的减少使细胞对洋地黄诱导的细胞生长抑制敏感：
图3A：用不同浓度的哇巴因处理对照细胞(P11)和Na/K-ATP酶敲低细胞(A4-11和PY17)16小时，利用MTT测定法测量细胞生长。
图3B：用不同洋地黄化合物处理Na/K-ATP酶敲低细胞(PY17)，然后利用MTT测定法测量细胞生长。
图4A-4C：由siRNA导致的Na/K-ATP酶的减少通过p21cip的诱导调控细胞生长和细胞周期：
图4A：通过将细胞在12孔板中传代培养(50,000个细胞/孔)来测量P11、PY17和AAC-19细胞的细胞生长曲线，并且用胰蛋白酶处理每一种细胞类型3个孔，然后在指定的时间点上计数，将数据针对接种的细胞数目标准化。
图4B：将P11、PY17和AAC-19细胞在RIPA缓冲液中裂解，使用抗p21cip抗体通过Western印迹法对其进行分析。代表性Western印迹显示了p21cip在3个细胞系中的表达。
图4C：如本文中所述测量细胞周期。简而言之，将P11、PY 17和AAC-19在10-cm培养皿中培养24小时。用胰蛋白酶处理细胞，将其悬浮于柠檬酸盐缓冲液中，然后进行PI染色。然后利用流式细胞术测量细胞周期。
图5：哇巴因不影响Na/K-ATP酶α1 mRNA水平。用10nM哇巴因处理LLC-PK1、BT20和DU145细胞24小时。如实验方法部分中所述提取总RNA，将其用于RT-PCR以探测Na/K-ATP酶α1。
图6A-6C：哇巴因通过内吞作用加速Na/K-ATP酶降解：
图6A：用10nM哇巴因处理LLC-PK1细胞、BT20细胞和DU145细胞6小时，然后用冷甲醇固定。将Na/K-ATP酶α1进行免疫染色，使用Leica共聚焦显微镜使其可视。红色箭头指示内吞的包含Na/K-ATP酶α1的囊泡。
图6B：将LLC-PK1细胞血清饥饿24小时，然后用10μg/ml环己酰亚胺(CHX)处理2小时，接着加入10nM哇巴因。将无任何处理的细胞或只用CHO处理的细胞用作对照。在不同的时间点收集细胞，将其在RIPA缓冲液中裂解。加载等量的蛋白质以通过Western印迹法分析Na/K-ATP酶。显示来自4个实验的代表性Western印迹和定量数据。将每一个时间点上的Na/K-ATP酶α1量针对相同时间点上的对照进行标准化。
图6C：如图框B中一样处理BT20细胞，测定所述细胞的Na/K-ATP酶α1。*p＜0.05。
图7A-7D：哇巴因通过激活PI3激酶上调Na/K-ATP酶的表达和细胞生长：
图7A：用10nM雷帕霉素或50μM LY294002预处理LLC-PK1细胞30分钟。然后将哇巴因10nM加入培养基，进行另外24小时。使用Western印迹法分析细胞裂解物的Na/K-ATP酶α1。
图7：将LLC-PK1和BT20细胞与哇巴因一起温育15分钟，然后分析细胞裂解物的磷酸化的Akt(pAkt)。
图7C：将DU145细胞进行血清饥饿，然后用哇巴因或10nM IGF处理15分钟。通过Western印迹法探测pAkt。
图7D：用10nM雷帕霉素或50μM LY294002预处理LLC-PK1细胞30分钟，然后将其与哇巴因一起再温育24小时。然后使用MTT测定法测量细胞生长。
图8A-8D：Na/K-ATP酶的信号转导功能是哇巴因处理后其补充所必需的：
图8A：在500nM和1μM哇巴因处理72小时后，SYF细胞和SYF-Src细胞的Na/K-ATP酶表达水平。
图8B：在5和10nM哇巴因处理72小时后对照细胞(P11)和小窝蛋白-1敲低细胞(C2-9)的Na/K-ATP酶α1表达水平的测量。
图8C：用不同浓度的哇巴因处理C2-9细胞15分钟。分析细胞裂物的pAkt。
图8D：进行MTT测定法以比较P11与C2-9细胞之间响应哇巴因处理的细胞生长。
优选实施方案的详述
本发明部分地基于以下发现：哇巴因诱导的Na/K-ATP酶表达的变化决定其生长调节。
本发明还部分地基于以下发现：哇巴因诱导的PI3-K/Akt/mTOR/mTOR途径的激活是哇巴因诱导的Na/K-ATP酶上调的关键因素，以及雷帕霉素对PI3-K/Akt/mTOR/mTOR途径的抑制可将哇巴因应答从生长刺激变成生长抑制。
本发明还部分地基于以下发现：哇巴因和其他强心甾类固醇还可与雷帕霉素和雷帕霉素样药物一起用于治疗癌。
本发明还部分地基于以下发现：Na/K-ATP酶的表达可用于评估某些癌症或个体患者的洋地黄治疗的功效，并且可用于靶向Na/K-ATP酶开发新型抗癌治疗剂。
本发明还可部分地基于以下发现：通过除了雷帕霉素以外的方法抑制Na/K-ATP酶也可使细胞对哇巴因和其他强心甾类固醇诱导的细胞生长抑制敏感。
本发明还部分地基于以下发现：哇巴因对细胞生长的刺激或抑制作用取决于细胞是否可激活PI3-K/Akt/mTOR途径和补充细胞Na/K-ATP酶以抗哇巴因诱导的该酶的内吞作用和随后降解。
本发明还部分地基于以下发现：雷帕霉素对PI3-K/Akt/mTOR途径的抑制可以使哇巴因诱导的Na/K-ATP酶耗尽和细胞生长抑制致敏。
本发明还部分地基于本发明者的以下发现：通过除了哇巴因外的方法减少细胞Na/K-ATP酶还可刺激细胞周期抑制剂p21cip的表达，从而导致细胞生长抑制。
本发明还部分地基于本发明者的以下发现：这些发现表明哇巴因通过改变Na/K-ATP酶的表达来调控细胞生长。
下列部分更详细地描述了本发明的不同方面和实施方案。
哇巴因以细胞特异性方式调节细胞生长和Na/K-ATP酶表达。
哇巴因可以以细胞特异性方式刺激或抑制细胞生长。为了理解这些相反调控的分子机制，本发明者首先比较哇巴因对两个人上皮衍生癌细胞系(BT20和DU145)和一个猪肾上皮细胞系(LLC-PK1)的细胞生长的影响。如图1A中所显示的，MTT测定法显示1至50nM的哇巴因刺激LLC-PK1细胞的细胞生长。这些发现与观察到的哇巴因对其他肾上皮细胞的作用一致。相反地，本发明者未能检测到哇巴因对乳腺癌BT20或前列腺癌DU145细胞的任何刺激作用。然而，10-50nM哇巴因引起细胞生长的显著抑制(图1A)。
为了进一步确认这些观察，本发明者测定10和50nM哇巴因对细胞生长的作用作为时间的函数。如图1B中所描述的，哇巴因以时间依赖性的方式增加LLC-PK1细胞的数目，从而确认了哇巴因对此类细胞的生长刺激作用。
相反地，相同的处理显著减少了BT20细胞的数目。事实上，10和50nM哇巴因似乎分别足以完全阻止DU145和BT20细胞的生长。因为哇巴因在人乳腺癌MDA-MB-435细胞中通过刺激细胞周期抑制剂p21cip的表达来抑制细胞生长，所以本发明者在BT20和LLC-PK1细胞中测量哇巴因对p21cip表达的作用。
如图1C中所描述的，虽然10nM哇巴因在BT20和DU145细胞中刺激细胞周期抑制剂p21cip的表达，但其在LLC-PK1细胞中不能刺激所述抑制剂的表达。
由于Na/K-ATP酶是哇巴因的唯一已知的受体，因此本发明者接着测试哇巴因是否影响Na/K-ATP酶的表达。Western印迹分析显示全部3个细胞系均表达Na/K-ATP酶的哇巴因敏感性α1同种型(α1)。在相同的实验条件下，α2和α3同种型的表达检测不到(数据未显示)。有趣地，哇巴因对α1表达的作用也是细胞特异性的。虽然哇巴因在24小时或72小时的接触后在LLC-PK1细胞中引起α1表达的诱导，但其在BT20和DU145细胞中都减少α1的细胞量(图2A)。
虽然在LLC-PK1和DU145细胞中哇巴因对α1表达的作用在24小时的接触后都达到平稳状态，但在BT-20细胞中在哇巴因接触后72小时注意到α1表达的进一步降低。因为哇巴因抑制MDA-MB-435细胞的生长，所以本发明者还在将这些细胞与5nM哇巴因接触24小时后测量了哇巴因对α1表达的影响。检测到α1表达的显著降低(对照的82±2％，N＝3，P＜0.05)。因此，哇巴因诱导的α1表达的变化明确地与其对细胞生长的作用相关。
β1亚基不仅在功能性Na/K-ATP酶的形成中而且还在紧密连接的形成和肿瘤细胞生长的抑制中起着重要作用。因此，本发明者评估哇巴因是否影响LLC-PK1和癌细胞系中的β1表达。用10nM哇巴因处理细胞24小时，利用Western印迹法测量细胞中β1的量。如图2B中所描述的，哇巴因在LLC-PK1细胞中但不在BT-20中引起β1表达的适度增加。
为了评估α1表达的这些变化的功能性结果，本发明者测量了质膜中功能性Na/K-ATP酶的数目。将细胞与不同浓度的哇巴因接触72小时，然后使其经历3H-哇巴因结合。重要地要指出，该测定法测量在72小时处理的过程中未被哇巴因占据的Na/K-ATP酶的数目。如图2C中所描述的，高至10nM的哇巴因几乎不改变LLC-PK1细胞中结合位置的数目。这些数据显示哇巴因诱导的α1的上调正好足以补充功能性Na/K-ATP酶的质膜库。相反地，哇巴因在BT20和DU145细胞中都引起表面活性Na/K-ATP酶的显著减少(图2C)。结合起来，本发明者在本文中现已显示质膜Na/K-ATP酶的减少可能是哇巴因诱导的癌细胞的生长抑制的关键因素。
Na/K-ATP酶的减少减缓细胞生长并且使细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感。
由于LLC-PK1细胞和两个癌细胞系来源于不同物种，因此为了确定细胞Na/K-ATP酶的减少是否是哇巴因诱导的细胞生长抑制的关键因素，本发明者在本文中测量了Na/K-ATP酶的分等级敲低对LLC-PK1细胞的细胞生长的作用。与对照载体转染的LLC-PK1(P-11)细胞相比较，敲低A4-11和PY17细胞分别表达约40％和10％的Na/K-ATP酶。
如图3A中所显示的，P-11细胞在响应哇巴因刺激中表现如亲本LLC-PK1细胞一样。浓度为1至10nM的哇巴因刺激细胞生长。相反地，A4-11和PY17细胞表现如BT20和DU145细胞一样。未检测到生长刺激。相反，通过siRNA介导的机制产生Na/K-ATP酶表达的减少足以使此类细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感(图3A)。例如，10nM哇巴因在PY-17细胞中引起细胞生长的30％以上的减少。此外，哇巴因的生长抑制作用明确地与Na/K-ATP酶的细胞量相关。
为了测试哇巴因的该生长抑制作用是否适用于其他强心甾类固醇，本发明者在本文中测量了地高辛、洋地黄毒苷和海蟾蜍毒素MGB对PY-17细胞的细胞生长的作用。如图3B中所描述的，此类化合物引起与哇巴因产生的生长抑制相似的生长抑制。
为了进一步检查Na/K-ATP酶减少在细胞生长调控中的作用，本发明者比较了稳定细胞系P-11、PY-17和AAC-19、大鼠α1拯救的PY-17细胞的细胞生长曲线。如图4A中所显示的，Na/K-ATP酶敲低PY-17细胞生长比对照P-11细胞慢得多，然而大鼠Na/K-ATP酶α1的重新引入恢复了AAC-19细胞的细胞生长。
因为哇巴因在人癌细胞中刺激p21cip的表达和抑制细胞生长(图1)，因此本发明者在本文中确定细胞Na/K-ATP酶的敲低是否影响该细胞周期抑制剂的表达。p21cip的表达在对照P-11细胞中相当低(图4B)。Na/K-ATP酶的敲低在PY-17细胞中引起该细胞周期抑制剂的显著诱导。此外，通过敲入大鼠α1拯救PY-17细胞足以在AAC-19细胞中减少p21cip的表达。相一致地，本发明者还在PY-17细胞中检测到比在P-11和AAC-19细胞中更多的G0/G1细胞(图4C)。
哇巴因对α1 mRNA没有作用。
为了探测哇巴因诱导的α1的细胞特异性调控的分子机制，本发明者在用10nM哇巴因处理细胞后使用半定量RT-PCR测量α1 mRNA。如图5中所描述的，哇巴因在LLC-PK1、BT20和DU145细胞中对α1 mRNA的水平没有作用。因此，哇巴因诱导的α1蛋白的变化可能是通过翻译/翻译后机制。
哇巴因刺激Na/K-ATP酶的内吞作用和降解。
哇巴因在LLC-PK1细胞中刺激Na/K-ATP酶的内吞作用。如果哇巴因也在BT20和DU145细胞中刺激内吞作用，那么这可在这些细胞中导致增加的Na/K-ATP酶的降解和α1蛋白的减少。为了测试该作用，将细胞与10nM哇巴因接触，然后就α1进行免疫染色。大部分α1如在LLC-PK1细胞中一样在BT20和DU145细胞中存在于质膜中(图6A)。在24小时的哇巴因接触后，在BT20和DU145细胞中积累了许多α1阳性囊泡。
为了确定哇巴因诱导的内吞作用是否也导致增加的Na/K-ATP酶的降解，用环己酰亚胺(蛋白质合成抑制剂)预处理LLC-PK1细胞和BT-20细胞1小时，然后将其与10nM哇巴因接触6、16和24小时。如图6B和图6C中所描述的，哇巴因处理在BT-20和LLC-PK1细胞中都产生更多的α1亚基降解。
哇巴因在LLC-PK1细胞中但不在BT-20和DU145细胞中激活Akt。
本发明者和其他研究人员已证明哇巴因刺激PI3-K/Akt/mTOR途径。mTOR的激活可增加许多mRNA的翻译。因为哇巴因在LLC-PK1细胞中不增加α1 mRNA，所以本发明者确定哇巴因诱导的α1的上调是否对PI3-K(磷脂酰肌醇-3-激酶)和mTOR的抑制剂敏感。如图7A中所显示的，利用PI3-K抑制剂LY294002或mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶)抑制剂雷帕霉素预处理细胞完全消除了哇巴因诱导的α1亚基的上调。LY294002和雷帕霉素减少α1的基础表达。此外，在雷帕霉素存在的情况下，哇巴因治疗实际上导致α1表达的进一步减少。然而不希望受理论束缚，本发明者现认为雷帕霉素可阻止哇巴因诱导的α1表达但不阻止哇巴因诱导的α1内吞作用和降解。
为了测试Akt/mTOR途径的激活是否是α1表达的哇巴因诱导细胞特异性调控的关键因素，本发明者接着在3个不同的细胞系中测量哇巴因对Akt的作用。如图7B和图7C中所显示的，虽然哇巴因在LLC-PK1细胞中刺激Akt磷酸化，但其在BT20和DU145细胞中都不能刺激Akt磷酸化。为了确保Akt途径在癌细胞中是完整的，本发明者将DU145细胞与IGF接触并且测量Akt的激活。如图7C中所显示的，IGF在DU145细胞中引起Akt的显著刺激。相一致地，当在PY-17细胞中重复相同的实验时，哇巴因未显示对Akt磷酸化的作用(数据未显示)。
雷帕霉素使LLC-PK1细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感。
上述数据表明，PI3-K/Akt/mTOR的激活是哇巴因诱导的α1上调的关键因素。因为α1的补充是哇巴因诱导的细胞生长刺激所必需的，因此本发明者确定雷帕霉素对mTOR的抑制是否可在LLC-PK1细胞中将哇巴因诱导的细胞生长转变成生长抑制。如图7D所显示的，雷帕霉素的加入足以在LLC-PK1细胞中阻止哇巴因诱导的细胞生长。此外，其还使细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感。例如，10nM哇巴因足以在用该抑制剂预处理的LLC-PK1细胞中引起细胞生长的显著抑制。
Src和小窝蛋白1的参与。
Na/K-ATP酶通过与Src形成受体复合物而从质膜微囊(caveolae)发出信号。为了进一步理解哇巴因诱导的α1上调的分子机制，本发明者首先阐明Src的作用。将SYF细胞(其中Src家族激酶Src、Yes和Fin被敲除)接触哇巴因，进行24小时。因为这些细胞来自小鼠，所以在实验中使用0.5和1.0μM哇巴因。如图8A中所描述的，Src的敲除完全阻止哇巴因诱导的α1表达。相一致地，当利用c-Src拯救SYF细胞时，哇巴因能够引起3倍的α1表达的诱导。
为了测试小窝蛋白1和质膜微囊的参与，本发明者建立了由于小窝蛋白1特异性siRNA的表达而与亲本LLC-PK1细胞相比较而言表达约20％小窝蛋白1的小窝蛋白1敲低LLC-PK1细胞系(C2-9细胞)。如图8B中所显示的，小窝蛋白1的敲低完全消除了哇巴因诱导的α1表达的增加。相一致地，哇巴因不能刺激这些细胞中的Akt(图8C)。此外，小窝蛋白1的敲低不仅消除了哇巴因诱导的细胞生长刺激，而且还使细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感(图8D)。
哇巴因刺激Na/K-ATP酶的内吞作用和降解。
哇巴因在LLC-PK1细胞中刺激Na/K-ATP酶内吞作用。如果哇巴因在BT20和DU145细胞中也刺激内吞作用，那么这可导致增加的Na/K-ATP酶的降解和这些细胞中α1蛋白的减少。将细胞与10nM哇巴因接触，然后就α1进行免疫染色。大多数α1如在LLC-PK1细胞中一样在BT20和DU145细胞中存在于质膜中(图9A)。在6小时的哇巴因接触后，BT20和DU145细胞中积累了许多α1阳性囊泡。为了确定哇巴因诱导的内吞作用是否也导致增加的Na/K-ATP酶的降解，用环己酰亚胺(一种蛋白质合成抑制剂)预处理LLC-PK1细胞和BT-20细胞进行1小时，然后将其与10nM哇巴因接触6、16和24小时。如图9B和图9C中所显示的，哇巴因处理在BT-20和LLC-PK1细胞中均产生更多的α1亚基降解。
哇巴因在LLC-PK1中但不在BT-20和DU145细胞中激活Akt。
哇巴因刺激PI3-K/Akt/mTOR途径。mTOR的激活可增加许多mRNA的翻译。因为哇巴因不增加LLC-PK1细胞中的α1 mRNA，所以本发明者测试哇巴因诱导的α1的上调是否对PI3-K和mTOR的抑制剂敏感。如图10A中所显示的，利用PI3-K抑制剂LY294002或mTOR抑制剂雷帕霉素预处理细胞完全消除了哇巴因诱导的α1亚基的上调。有趣地，LY294002和雷帕霉素都减少α1的基础表达。此外，在雷帕霉素存在的情况下，哇巴因处理实际导致α1表达的进一步降低。然而不希望受理论束缚，本发明者在本文中现认为雷帕霉素可阻止哇巴因诱导的α1表达，但不阻止哇巴因诱导的α1内吞作用和降解。为了测试Akt/mTOR途径的激活是否参与哇巴因诱导的a1表达的细胞特异性调控，本发明者在本文中测量了哇巴因在3个不同的细胞系中对Akt的作用。虽然哇巴因在LLC-PK1细胞中刺激Akt磷酸化，但其不能在BT20和DU145细胞中刺激Akt磷酸化。为了确保Akt途径在癌细胞中是完整的，本发明者此处将DU145细胞与IGF接触，并且测量Akt的激活。IGF在DU145细胞中引起显著的Akt激活。相一致地，当在PY-17细胞中重复相同的实验时，哇巴因未显示对Akt磷酸化的影响(数据未显示)。
雷帕霉素使LLC-PK1细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感。
上述数据表明PI3-K/Akt/mTOR的激活是哇巴因增加a1的表达所必需的。因为a1的补充是哇巴因诱导的细胞生长刺激所必需的，因此本发明者在本文中确定了雷帕霉素对mTOR的抑制将在LLC-PK1细胞中使哇巴因诱导的细胞生长转变成生长抑制。如图10D中所显示的，雷帕霉素的加入足以在LLC-PK1细胞中阻止哇巴因诱导的细胞增殖。此外，其还使细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感。例如，10nM哇巴因足以在用抑制剂预处理的LLCPK1细胞中引起细胞增殖的显著抑制。
讨论
哇巴因对细胞生长的刺激或抑制作用取决于细胞是否可激活Akt/mTOR途径和补充细胞Na/K-ATP酶以抗哇巴因诱导的所述酶的内吞作用和随后的降解。
雷帕霉素对Akt/mTOR途径的抑制使得哇巴因诱导的Na/K-ATP酶的耗尽和细胞生长抑制敏化。
通过除了哇巴因外的方法减少细胞Na/K-ATP酶也可刺激细胞周期抑制剂p21cip的表达，从而导致细胞生长抑制。因此，这些发现表明哇巴因通过改变Na/K-ATP酶的表达来调控细胞生长。
哇巴因对Na/K-ATP酶的翻译上调取决于PI3-K/Akt/mTOR途径：Na/K-ATP酶是将ATP转化成跨膜离子梯度的重要离子泵。其还与Src相互作用以形成受体复合物。虽然Na/K-ATP酶提供强心甾类固醇的结合位置，但Na/K-ATP酶结合的Src却用作信号转导蛋白，将配体结合转化成蛋白激酶级联的刺激和第二信使的产生。虽然哇巴因以细胞特异性的方式对细胞生长展示刺激和抑制两种作用，但在两种类型的细胞中都已记录了近端信号转导事件(例如，Src和ERK)的激活。此外，哇巴因在可用哇巴因刺激或抑制的细胞中诱导Na/K-ATP酶的内吞作用和随后的降解。
本发明者在本文中认为哇巴因激活的下游事件必须在其响应哇巴因的生长走向相反方向的细胞中明显分向不同方向。据此，本发明者现已观察到哇巴因刺激PI3-K/Akt/mTOR途径，从而在LLC-PK1细胞中导致Na/K-ATP酶的翻译上调和细胞生长刺激。相反地，哇巴因不能激活人癌细胞例如BT20、MDA-MB-435s和DU145细胞以及在Na/K-ATP酶敲低细胞中的PI3-K/Akt/mTOR途径和补充Na/K-ATP酶(图7)。因此，PI3-K/Akt/mTOR途径的激活可能是哇巴因诱导的细胞生长刺激的关键因素。这与由其他研究人员在几个细胞系和原代培养物中报导的哇巴因诱导的PI3-K/Akt/mTOR途径的激活一致。此外，该激活似乎还是哇巴因刺激这些细胞的生长所必需的。
质膜微囊使信号转导事件区室化。具体地，通过耗尽小窝蛋白1或胆固醇使质膜微囊破裂可显著改变胰岛素/IGF诱导的PI3-K/Akt/mTOR途径的激活。相一致地，Cavl敲除引起体内胰岛素抗性。此外，小窝蛋白1和/或Na/K-ATP酶的表达在许多癌细胞系中显著降低。具体地，小窝蛋白1的表达在BT20细胞中几乎不存在，而Na/K-ATP酶的表达在DU145细胞中显著减少。因为小窝蛋白1和Na/K-ATP酶对于质膜微囊的形成都很重要，所以本发明者在本文中现认为小窝蛋白1或Na/K-ATP酶的减少在这些细胞中可促成哇巴因结合与PI3-K/Akt/mTOR途径的激活解偶联。相一致地，如图8中所显示的，本发明者在本文中发现小窝蛋白1或Na/K-ATP酶的敲低在LLC-PK1细胞中确实消除了哇巴因诱导的细胞生长应答。此外，其还阻止哇巴因诱导的Akt的激活。
细胞内Na+的巨大增加足以刺激Na/K-ATP酶的转录机制和上调其表达。当将细胞与产生50％以上Na/K-ATP酶抑制的低细胞外K+或哇巴因浓度接触时该现象发生。很明显，这不可能是1至10nM哇巴因籍以增加LLC-PK1细胞中Na/K-ATP酶表达的分子机制。首先，1-10nM的哇巴因不影响LLC-PK1细胞中的细胞Na+浓度。其次，哇巴因诱导的上调与低K+的不同，因为未检测到α1 mRNA的变化。在另一方面，PI3-K/Akt/mTOR途径的激活可刺激许多mRNA的翻译调控。
不希望受理论束缚，但本发明者在本文中现认为低浓度的哇巴因通过PI3-K/Akt/mTOR-依赖性翻译机制增加Na/K-ATP酶的表达。本发明者在本文中显示利用LY294002或雷帕霉素抑制PI3-K/Akt/mTOR途径足以阻止哇巴因诱导的Na/K-ATP酶的上调。
作为离子泵，Na/K-ATP酶维持正常的跨细胞膜的Na+和K+梯度。通过敲除Na/K-ATP酶或通过完全抑制该酶导致的这些梯度的显著变化对于哺乳动物细胞是致死的。因此，细胞Na/K-ATP酶的适度减少可能可引起细胞生长抑制。
本发明者现已发现，通过siRNA敲低Na/K-ATP酶足以刺激p21cip的表达，从而导致LLC-PK1细胞的生长抑制。相一致地，通过表达大鼠α1拯救这些细胞足以抑制p21cip的表达并且恢复细胞生长。有趣地，在许多类型的细胞中，已知哇巴因和其他强心甾类固醇与Na/K-ATP酶的结合诱导酶的内吞作用和降解。在功能上，哇巴因诱导(甚至被低浓度的哇巴因诱导的)的内吞作用可导致在一段时间内Na/K-ATP酶的显著减少，如果其不通过α1表达的上调补偿的话。原则上，该下调可足以解释哇巴因诱导的细胞生长停滞。该概念受到低浓度的哇巴因在一段时间内能够诱导p21cip表达并且抑制乳腺癌细胞的生长的事实支持。很明显，利用雷帕霉素阻止哇巴因诱导的Na/K-ATP酶的补充消除了LLC-PK1细胞中哇巴因诱导的细胞生长刺激。其也使这些细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感。结合起来，很清楚细胞Na/K-ATP酶的量对于细胞生长控制是很重要的。
70年代后期和80年代早期的流行病学研究指出了在乳腺癌患者中使用洋地黄药物的潜在有益性。多年来，洋地黄药物例如地高辛和洋地黄毒苷以及该类化合物的新型衍生物的功效已在细胞培养物中和动物模型中得到证明。值得注意地，在美国和欧洲正在进行I期和II期临床试验以测试作为抗癌药物的此类新型化合物。因为此类化合物还具有良好记录的对各种细胞的体外和体内生长刺激作用，所以很重要的是鉴定负责该相反生长调控的异向途径。
为此，本发明者在本文中现显示哇巴因诱导的Na/K-ATP酶的表达的变化决定其生长调控。此外，本发明者将哇巴因诱导的PI3-K/Akt/mTOR途径的激活鉴定为哇巴因诱导的Na/K-ATP酶上调的关键因素。此外，本发明者显示雷帕霉素(一种广泛使用的药物)对PI3-K/Akt/mTOR途径的抑制可将哇巴因应答从生长刺激变成生长抑制。
Na/K-ATP酶的表达可用于评估某些癌症或个体患者的洋地黄疗法的功效。此外，这些结果表明了靶向Na/K-ATP酶对于开发新型抗癌治疗剂是有用的。此外，这些结果还表明雷帕霉素在癌症的洋地黄疗法中的治疗效用。
示例性实施方案
下列实施例仅用于举例说明目的，并且绝不应当解释为在本发明的任何方面是限定性的。
材料：细胞培养基、牛血清白蛋白和胰蛋白酶购自Invitrogen(Burlington，ON)；Optitran硝酸纤维素膜来自Schleicher &Schuell(Keene，NH)；增强化学发光(ECL)super signal试剂盒(Enhanced chemiluminescence(ECL)super signalkit)购自Pierce(Rockford，IL)。单克隆抗α1抗体(α6F)获自DevelopmentalStudies Hybridoma Bank(University of Iowa)。抗p21cip1抗体、抗Src单克隆抗体和所有第二辣根过氧化物酶缀合的抗体来自Santa Cruz(Santa Cruz，CA)。多克隆抗Akt和抗pAkt at Ser473抗体来自Cell Signaling(Danvers，MA)。MTT测定试剂盒购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)(Manassas，VA)。3H-哇巴因来自NEN Life Science Products(Boston，MA)。
细胞培养：猪肾上皮细胞(LLC-PK1细胞)、人乳腺癌细胞(BT-20细胞)和人前列腺癌细胞(DU145细胞)获自ATCC并且在5％ CO2潮湿培养箱中在10％胎牛血清(FBS)、100个单位/ml青霉素和100g/ml链霉素存在的情况下维持在达尔伯克氏改良尹格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)或RPMI 1640培养基(针对DU145细胞)中。Na/K-ATP酶敲低(A4-11和PY17)和小窝蛋白-1敲低(C2-9)细胞衍生自LLC-PK1细胞并且被培养在DMEM中。除非另外指出，否则在实验之前将细胞进行血清饥饿24小时。
Western印迹分析：用PBS洗涤细胞，将其溶解在经改良且冰冷的RIPA缓冲液中。然后以14,000rpm离心细胞裂解物，将上清液用于蛋白质测定并进行Western印迹分析。将膜在室温下用在TBS-T(Tris-HCl 10mM，NaCl 150mM，Tween 20，0.05％；pH 8.0)中的4％牛奶封闭1小时，然后用特异性探针进行探测。使用ECL试剂盒检测蛋白质信号，然后使用Bio-Rad GS-670成像光密度仪(imaging densitometer)进行定量。
用于测量细胞增殖的MTT测定：将细胞于100μl培养基中以10,000个细胞/孔在96孔板中进行传代培养。在12小时的血清饥饿后，将细胞与不同浓度的哇巴因接触24小时。向每一个孔中加入10μl MTT试剂(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑「)，进行90分钟。用去垢剂溶解甲δ晶体，在570nm处测量OD值。
细胞生长曲线和细胞周期测量：将细胞于1ml培养基中以50,000/孔在12孔板中传代培养，进行24小时。然后将细胞血清饥饿24小时，用不同浓度的哇巴因处理进行指定的时间。在每一个指定的时间点上，用胰蛋白酶处理3个孔的对照或处理的细胞，然后计数。为了进行细胞周期测量，用胰蛋白酶处理细胞，将其重悬浮于柠檬酸盐缓冲液(8.55％蔗糖、1.18％柠檬酸钠、5％ DMSO，pH 7.6)中，用碘化丙锭(PI)染色。然后利用流式细胞仪分析染色的细胞。
3H-哇巴因结合：为了测量哇巴因对Na/K-ATP酶的细胞表面表达的作用，将细胞培养在12孔板中，用哇巴因处理72小时。之后，用无血清培养基洗涤细胞，将其进行3H-哇巴因结合测定。简而言之，将细胞在不含K+的Kreb′s溶液(NaCl 137mM；KCl 0mM；CaCl2 2.8mM；NaH2PO4 0.6mM；MgSO4 1.2mM；葡萄糖；10mM；Tris 15mM；pH 7.4)中温育15分钟，然后在37℃与100nM 3H-哇巴因接触30分钟。在温育结束时，用冰冷的不含K+的Kreb′s溶液洗涤细胞3次，将其溶解在0.1M NaOH-0.2％ SDS中，就3H-哇巴因在闪烁计数器中对其进行计数。在5mM未标记的哇巴因存在的情况下测量非特异性结合，然后将其从总结合中扣除。将平行的板用于计数细胞数目。将3H-哇巴因结合数据计算为每细胞的结合位置数。
共聚焦成像和免疫细胞化学：将LLC-PK1、BT20和DU145细胞进行血清饥饿24小时，在盖玻片上用哇巴因(10nM)处理6小时。用冰冷的甲醇固定细胞15分钟，用来自Invitrogen的信号增强剂(Signal Enhancer)进行封闭。然后将单克隆抗Na/K-ATP酶α1抗体与细胞在4℃下一起温育过夜。在3次洗涤后，加入Alexa 488-缀合的第二抗小鼠抗体，在室温下温育2小时。洗涤盖玻片，封片，然后使用Leica共聚焦显微镜进行成像。
定量RT-PCR：将细胞接种在6-cm培养皿中，在汇合达到90％后进行血清饥饿24小时。然后用10nM哇巴因处理细胞24小时。使用TRIzol提取总RNA，将其进行定量RT-PCR分析。使用下列方案在AB7500实时PCR系统上进行测定：1个循环(在95℃下进行6分钟)，40个循环(在95℃下进行30秒，在52℃下进行30秒，在72℃下进行30秒，和在85℃下进行1分钟)，然后进行解离期以确保单个产物。反应物在25μl的总体积中，包括1.25pl的Sybr Green(Invitrogen)、0.125pl的DNA聚合酶(Denville)、2.5pl的dNTP(Invitrogen)、10ng的cDNA。以5μM的浓度使用引物，序列为：
人GAPDH，5′-GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT[SEQ ID NO：1]和
3′-TCCACTTTACCAGAGTTAAAAGCAG[SEQ ID NO：2]；
人Na/K-ATP酶a1，5′-TGTCCAGAATTGCAG[SEQ ID NO：3]和
3′-TGCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT[SEQ ID NO：4]；
猪GAPDH，5′-ATGCTGGTGCTGAGTTCGTGG[SEQ ID NO：5]和
3′-AGATGATGACCCTTTTGGCTCC[SEQ ID NO：6]；和
猪Na/K-ATP酶a1，5′-ATCTCTGCTTCGTTGGGCTCATCT[SEQ ID NO：7]和
3′-AATGGCTTTGGCTGTGATGGGATG[SEQ ID NO：8]。
利用比较阈值(CT)法(ΔΔCT)计算相对Na/K-ATP酶a1基因的表达。为了标准化cDNA的差异量，将GAPDH用作内部对照。
统计：数据表示为平均值+SEM，并且使用Student′s t检验进行比较。p＜0.05被视为有显著性。
示例性治疗方法：本发明的方法优于本领域内已知的联合治疗，因为其允许常规抗癌剂以更低的剂量产生更大的效应。在某些非限定实施例中，当与哇巴因组合使用时，抗癌剂或常规抗癌剂的组合的有效剂量(ED50)可以是单独抗癌剂的ED50的至多1/2。此外，在某些非限制性的实施方案中，当与CTS例如哇巴因、地高辛或洋地黄毒苷组合使用时此种抗癌剂或此种抗癌剂的组合的治疗指数(TI)可以是单独的常规抗癌剂方案的TI的至少2倍。
治疗方法：在其他实施方案中，本发明方法组合哇巴因与其他疗法例如化学疗法和/或放射疗法，包括电离辐射、γ射线或粒子束。
施用和治疗：本发明的方法还可包括起初给受试者施用抗肿瘤剂以使受试者中的赘生性细胞能够耐抗肿瘤剂，随后施用有效量的本发明的任意组合物，其有效地选择性诱导此类细胞的终末分化、细胞生长停滞和/或凋亡，或治疗癌症或提供化学预防。
剂量和给药日程表(Dosage Schedule)：可根据多种因素包括品种(type)、物种、年龄、体重、性别和待治疗的癌症类型；待治疗的癌症的严重度(即，分期)；施用途径；患者的肾和肝功能；以及使用的具体化合物或其盐来选择给药方案。本领域普通医生或兽医可容易地确定和开具例如治疗、预防、抑制(完全或部分地)或阻止疾病的进展所需的药物的有效量。
适当的剂量的非限定性实例可包括每天一次、每天二次或每天三次、连续地(每一天)或间歇地(例如，每周3至5天)口服施用约25至4000mg/m2的总日剂量。例如，可以以日总剂量施用组合物，或将其分成多个日剂量例如每天两次和每天3次来施用。
此外，施用可以是连续的，即每一天，或是间歇的。如本文中所使用的术语“间歇的”或“间歇地”意指以定期或不定期的间隔停止和开始。例如，间歇施用可以是每周施用1至6天，或其可意指周期性施用(例如，每天一次施用，进行2至8个连续的周，然后进入停药期，长达一周不施用)或其可意指隔日施用。
此外，可按照任意规定的日程表施用组合物，连续进行数周，然后进入停药期。例如，可按照任一个开具的方案施用组合物进行2至8周，然后停药1周，或每天两剂，每周进行3至5天。
对于本领域技术人员应当显而易见的是，本文中描述的不同剂量和给药方案仅阐述特定的实施方案，其不应当被解释为限定本发明的宽范围。剂量和给药方案的任意排列、变化和组合包括在本发明的范围内。
药物组合物：可将本发明的化合物和其衍生物、片段、类似物、同源物、药学上可接受的盐或水合物与药学上可接受的载体或赋形剂一起掺入适合用于口服施用的药物组合物。此类组合物通常包含治疗有效量的本文中描述的任意化合物和药学上可接受的载体。优选地，有效量是有效地选择性诱导适当的赘生性细胞的终末分化并且低于在患者中引起毒性的量的量。
通常用作载体或稀释剂的任何惰性赋形剂可用于本发明的制剂，例如，树胶、淀粉、糖、纤维素材料、丙烯酸酯或其混合物。组合物还可包含崩解剂(例如，交联羧甲纤维素钠)和润滑剂(例如，硬脂酸镁)，此外还可包含选自粘合剂、缓冲剂、蛋白酶抑制剂、表面活性剂、增溶剂、增塑剂、乳化剂、稳定剂、增粘剂、甜味剂、成膜剂或其任意组合的一种或多种添加剂。此外，本发明的组合物可以以控制释放或立即释放(immediate release)制剂的形式存在。
可口服施用药物组合物，因而其以适合于口服施用的形式配制，即配制为固体或液体制剂。适当的固体口服制剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、粒剂、小丸等。适当的液体口服剂型包括溶液、悬浮液、分散体、乳剂、油等。
如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”旨在包括可与药物施用相容的任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，例如无菌无热原水。适当的载体描述于最新版本的Remington′s Pharmaceutical Sciences，本领域内的标准参考书，其通过参考并入本文。此类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、finger′s solution、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水性媒介物例如不挥发油。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域内是公知的。除非任何常规介质或试剂与所述活性化合物不相容，否则涵盖其在所述组合物中的应用。还可将补充的活性化合物掺入组合物。
固体载体/稀释剂的非限定性实例包括但不限于树胶、淀粉(例如，玉米淀粉、预胶化淀粉)，糖(例如，乳糖、甘露醇、蔗糖、葡萄糖)、纤维素材料(例如，微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或其混合物。
液体制剂、药学上可接受的载体的非限定性实例可以是水溶液或非水溶液、悬浮液、乳剂或油。非水性溶液的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯例如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。油的实例是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、葵花子油和鱼肝油。溶液或悬浮液还可包括下列成分：无菌稀释剂例如注射用水，盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇类、甘油，丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂例如乙酸盐类、柠檬酸盐类或磷酸盐类，和用于调整张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠调节pH。
此外，组合物还可包含粘合剂(例如，阿拉伯胶、玉蜀黍淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如，玉蜀黍淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、淀粉羟乙酸钠、Primogel)、不同pH和离子强度的缓冲剂(例如，tris-HCI，乙酸盐，磷酸盐)、防止吸收至表面的添加剂例如白蛋白或明胶、去垢剂(例如，Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面激活剂(例如，月桂基硫酸钠)、渗透促进剂、增溶剂(例如，甘油、聚乙二醇)、助流剂(例如，二氧化硅胶体)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠、丁酸化羟基茴香醚)、稳定剂(例如，羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(例如，卡波姆、二氧化硅胶体、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如，蔗糖、阿司帕坦、柠檬酸)、调味剂(例如，薄荷油、水杨酸甲酯或桔子调味料(orange flavoring))、防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸类)、润滑剂(例如，硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、流动助剂(flow-aid)(例如，二氧化硅胶体)、增塑剂(例如，邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如，卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)、聚合物包衣(例如，泊洛沙姆或poloxamines)、包衣和成膜剂(例如，乙基纤维素、丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类)和/或佐剂。
在某些实施方案中，可用可保护化合物以防止从身体快速清除的载体例如控制释放制剂(包括植入剂和微型胶囊化递送系统)来配制活性化合物。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、多正酯类和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。还可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.商购获得材料。还可将脂质体悬浮液(包括利用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向感染的细胞的脂质体)用作药学上可接受的载体。此类材料可按照本领域技术人员已知的方法来进行制备。
特别有利地以剂量单位形式配制口服组合物以易于施用和剂量的均一。如本文中使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理上分开的单位；每一个单位包含经计算与需要的药物载体结合产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的说明书决定于并且直接取决于活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果以及配制这样的活性化合物用于个体治疗的领域内所固有的限制。
可将药物组合物连同施用说明书一起装入容器、包装或或分配器。例如，可在治疗的第一天静脉内施用化合物，在第二天和此后所有连续的天口服施用。为了阻止疾病进展或稳定肿瘤生长，可施用本发明的化合物。
包含活性化合物的药物组合物的制备在本领域内是公知的，例如通过混合、粒化或压片方法来进行。通常将活性治疗成分与药学上可接受的并且与所述活性成分相容的赋形剂混合。为了进行口服施用，将活性成分与常规用于该目的的添加剂例如媒介物、稳定剂或惰性稀释剂混合，然后通过常规方法转化成用于施用的适当形式，例如如上所述的片剂、包衣片、硬或软胶囊、水性、醇性或油性溶液等。
给患者施用的哇巴因的量小于可在患者中引起毒性的量。在某些实施方案中，给患者施用的化合物的量小于使患者血浆中的化合物的浓度等于或超过该化合物的毒性水平的量。优选，患者血浆中的所述化合物的浓度维持在约10nM。在另一个实施方案中，患者血浆中的所述化合物浓度维持在约25nM。在另一个实施方案中，患者血浆中的所述化合物浓度维持在约50nM。
在另一个实施方案中，患者血浆中所述化合物的浓度维持在约10至50nM之间的范围内。在本发明的实施中应当给患者施用的化合物的最佳量将取决于使用的具体化合物和待治疗的癌症的类型。
体外方法：本发明还提供了体外方法，所述方法通过将细胞与有效量的含有哇巴因或其药学上可接受的盐或水合物的组合物接触来选择性诱导赘生性细胞的终末分化、细胞生长停滞和/或细胞凋亡，从而抑制此类细胞的增殖。
虽然可体外实施本发明的方法，但预期选择性诱导赘生性细胞的终末分化、细胞生长停滞和/或凋亡等的方法的优选实施方案包括体内接触细胞，即通过给需要治疗的具有赘生性细胞或肿瘤细胞的受试者施用所述化合物来进行接触。
因此，本发明还提供了如下方法，所述方法通过给受试者施用含有有效量的哇巴因或其药学上可接受的盐或水合物以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物来选择性诱导受试者的赘生性细胞的终末分化、细胞生长停滞和/或凋亡，从而抑制此类细胞在受试者中增殖。
虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解可进行各种改变并且可用等同物替代其组成部分而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多变动以使特定的情况或材料适合本发明的教导而不背离其基本范围。因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的具体实施方案，而是本发明将包括落在权利要求书的范围内的所有实施方案。
Figure IDA0000063825110000011
Figure IDA0000063825110000021

Claims (41)

1.确定癌症患者是否可从强心甾类固醇(CTS)治疗中获得治疗益处的方法，包括确定患者的癌细胞是否已失去增加Na/K-ATP酶的细胞合成的能力，其中Na/K-ATP酶合成的丧失标示着所述患者可能从CTS治疗中获益。
2.权利要求1的方法，其用于对意欲接受洋地黄治疗的癌症患者进行诊断和/或预后。
3.权利要求1的方法，其包括确定癌细胞中哇巴因诱导的Na/K-ATP酶表达变化是否与哇巴因诱导的细胞生长调控直接相关。
4.权利要求1的方法，其包括检测癌细胞中影响癌细胞内哇巴因诱导的Na/K-ATP酶上调的PI 3激酶的激活。
5.权利要求1的方法，其包括测量细胞中Na/K-ATP酶表达的变化。
6.权利要求1的方法，其包括使用Western印迹法或3H-哇巴因结合测定法进行测量。
7.用于确定细胞是否对强心甾类固醇(CTS)治疗易感的方法，其包括：确定所述细胞是否保持补充细胞中减少的Na/K-ATP酶的能力。
8.权利要求7的方法，其包括确定细胞是否缺乏补偿哇巴因诱导的Na/K ATP酶损失的机制。
9.权利要求7的方法，其中所述细胞是癌细胞。
10.调节Na/K-ATP酶的细胞合成的方法，包括施用有效量的Na/K-ATP酶抑制剂例如强心甾类固醇CTS以调节Na/K-ATP酶的表观生物学活性。
11.一种治疗患者的方法，其包括单独地或与mTOR抑制剂和/或磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)抑制剂的靶中的至少一种组合地给所述患者施用有效量的Na/K-ATP酶抑制剂。
12.一种配制在药学上可接受的赋形剂中并且适合用于人患者的药物制剂，其中包含与mTOR抑制剂和/或磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)抑制剂的靶中的至少一种相组合的Na/K-ATP酶抑制剂。
13.权利要求的药物制剂，其中所述Na/K-ATP酶抑制剂是强心甾类固醇(CTS)。
14.用于治疗癌症患者的试剂盒，其单独地或与减少Na/K-ATP酶表达的组合物相组合地包含Na/K-ATP酶抑制剂。
15.用于鉴定不太可能对强心甾类固醇(CTS)疗法产生反应的癌症患者的方法，所述方法包括：
从癌症患者获得生物样品，其中所述生物样品包含癌细胞；和测定Na/K-ATP酶的水平或活性，
其中与正常健康受试者中发现的Na/K-ATP酶水平或活性相比较而言具有NF Na/K-ATP酶水平或活性的变化的患者表示该患者不太可能对CTS疗法产生反应。
16.诊断癌症或为患有具有由哇巴因触发的分子信号转导途径的表达改变的癌症的患者提供预后的方法，所述方法包括：
将癌症样品与特异性结合作为由哇巴因触发的分子信号转导途径一部分的蛋白质的抗体接触，其中所述分子信号转导途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径；以及
确定所述样品中所述蛋白质的表达是否被改变，从而诊断癌症或提供癌症的预后。
17.鉴定抑制具有改变的由哇巴因触发的分子信号转导途径的癌症的化合物的方法，所述方法包括步骤：
将表达由哇巴因触发的分子信号转导途径的多肽成员的细胞与化合物接触，其中所述分子信号转导途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径；以及
测定所述化合物对所述多肽的作用；从而鉴定抑制癌症的化合物。
18.鉴定抑制难治性癌症的化合物的方法，所述方法包括：
将表达由哇巴因触发的分子信号转导途径的多肽成员的细胞与化合物接触，其中所述分子信号途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径；以及
测定所述化合物对所述多肽的作用；从而鉴定抑制该难治性癌症的化合物。
19.治疗或抑制受试者的癌症的方法，其中所述癌症具有改变的由哇巴因触发的分子信号转导途径，所述方法包括：给所述受试者施用治疗有效量的一种或多种调节由由哇巴因触发的分子信号转导途径的多肽成员的抑制剂，其中所述分子信号转导途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径。
20.治疗或抑制受试者的难治性癌症的方法，包括：给所述受试者施用治疗有效量的一种或多种由哇巴因触发的分子信号转导途径的调节剂，其中所述分子信号转导途径是功能性的或激活的PI3-K/Akt/mTOR途径。
21.权利要求20的方法，其中所述难治性癌症具有改变的由哇巴因触发的分子信号转导途径的表达，并且所述难治性癌症通过如下步骤进行诊断：
将癌症样品与特异性结合作为由哇巴因触发的分子信号转导途径一部分的蛋白质的抗体接触；和
确定所述样品中所述蛋白质的表达是否被改变，从而诊断或提供癌症的预后。
22.权利要求20的方法，其中将所述一种或多种调节剂与另一种癌症疗法同时施用。
23.本文权利要求中任一项的方法，其中所述方法包括在不同的时间点上多次测定表达水平的模式，从而监控受试者中癌症的进展。
24.权利要求23的方法，其中所述方法还包括估计给定的癌症治疗模式在受试者中的成功概率。
25.用于调节细胞生长的方法，包括在细胞中引起哇巴因或其他强心药(CTS)诱导的Na/K-ATP酶表达的变化。
26.用于调节细胞生长的方法，包括：通过将细胞与具有足以引起哇巴因诱导的Na/K-ATP酶上调的量的CTS接触，以诱导所述细胞中PI3-K/Akt/mTOR途径的激活，由此调节细胞中Na/K-ATP酶的表达。
27.用于评估CTS疗法在接受此种CTS疗法的患者中的功效的方法，包括监控在这样的患者中Na/K-ATP酶的表达。
28.权利要求27的方法，其中所述患者患有癌症。
29.权利要求28的方法，其还包括在癌症的治疗中将有效量的雷帕霉素和CTS疗法一起施用。
30.权利要求28的方法，其中所述癌症包括乳腺癌并且CTS疗法包括施用约1至约50nM哇巴因、地高辛或洋地黄毒苷。
31.在有需要的细胞中补充功能性Na/K-ATP酶的质膜库的方法，包括影响所述细胞中哇巴因诱导的Na/K-ATP酶哇巴因敏感型α1同种型(α1)的上调。
32.权利要求31的方法，包括施用至少一种足以在癌细胞中减少质膜Na/K-ATP酶并且引起哇巴因诱导的生长抑制的CTS。
33.使细胞对哇巴因诱导的细胞生长抑制敏感的方法，包括施用足以在细胞中阻止哇巴因诱导的细胞生长的有效量的雷帕霉素。
34.通过PI3-K/Akt/mTOR-依赖性翻译机制在有需要的细胞中增加Na/K-ATP酶的表达的方法，其包括以低浓度施用哇巴因或其他CTS。
35.在有需要的细胞中阻止哇巴因诱导的Na/K-ATP酶上调的方法，包括抑制所述细胞中的PI3-K/Akt/mTOR途径。
36.权利要求35的方法，其包括施用有效量的一种或多种PI3-K抑制剂或mTOR抑制剂。
37.权利要求36的方法，其包括施用雷帕霉素或其类似物。
38.用于恢复细胞生长的方法，其包括施用足以抑制p21cip调节蛋白表达的有效量的哇巴因。
39.在药学上可接受的赋形剂中配制的并且适合用于在人中治疗癌症的药物制剂，其中包含与PI3-K/AKt/mTOR途径的抑制剂相组合的哇巴因或其他CTS。
40.用于治疗癌症患者的试剂盒，其中包括与PI3-K/AKt/mTOR途径的抑制剂相组合的哇巴因或其他CTS，各自以预先测量的剂量配制用以给患者施用。
41.用于将细胞中的哇巴因应答从生长刺激改变成生长抑制的方法，其包括施用足以抑制所述细胞中的PI3-K/Akt/mTOR途径的量的雷帕霉素或其类似物。
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