CN105153294A - 一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胰岛素生产方法领域，公开了一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法。本发明为解决重组表达的胰岛素前体及胰岛素类似物前体在纯化制备过中存在的常规层析填料因不能耐受高盐上样、有机试剂用量大、成本高、产品纯度不高的问题，本发明采用以下技术方案：将离心后的发酵液上清经调节pH和离心后，直接上样经Capto？S、Capto？MMC、Uni？PMM？S、Uni？MSP中的任何一种填料制备的层析柱进行吸附、分离纯化、洗脱，最终得到高纯度的重组胰岛素及胰岛素类似物前体；本发明与现有纯化方法相比操作简单，收率高，耗时短，对环境影响小，可大规模降低现有的胰岛素及胰岛素类似物的产品生产成本。

Description

一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法
技术领域
本发明涉及胰岛素生产方法领域，特别涉及一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法。
背景技术
糖尿病是仅次于心血管和肿瘤的第三大致死疾病，2014年世界糖尿病患者已达3.87亿，且每年呈加速上升数目。胰岛素是治疗糖尿病的特效药，特别是晚期患者治疗时，没有其它药物可以代替，随着糖尿病患者人群不断扩大及胰岛素给药方式的多样化增加，胰岛素用量正迅速增加。在胰岛素的发展过程中，动物胰岛素由于免疫原性及疯牛病和动物口蹄疫等传播性疾病的蔓延，临床已逐渐淘汰；以甘精胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰岛素及德谷胰岛素为代表的重组胰岛素类似物临床上已得到广泛应用，并占据了绝大部分胰岛素市场。
随着重组DNA技术的进展，利用微生物如大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等发酵平台，获得大量的表达胰岛素前体成为现实，特别是巴斯德毕赤酵母，它以甲醇作为唯一碳源并采用廉价的BSM培养基进行高密度发酵，高效分泌表达重组蛋白，发酵成本低。但是在毕赤酵母发酵过程中不仅会产生大量色素，而且发酵液中残留的无机盐含量非常高，电导率值可达到40-50mS/cm，所以表达的胰岛素前体在纯化前，必须对发酵上清液进行超滤换液或适当稀释来降低电导，以便胰岛素原可以结合层析填料而实现分离纯化。
众所周知，常规胰岛素前体纯化方式为采用0.5～1.0MNaCl、pH值为2～4的酸性缓冲液线性梯度洗脱，这种方式得到的人胰岛素类似物前体溶液pH为酸性，且存在的大量的Na+不仅能抑制酶的活性，而且还需要进行更换缓冲液及除去金属离子才能进行后续酶切反应，延长生产周期，增加生产成本。
专利CN1699412A中公开的使用常规的阳离子交换柱(SP-fastflow)纯化胰岛素类似物前体(MIP)，但常规离子交换层析需对样品大体积稀释以降低盐浓度或超滤脱盐处理后才能进行纯化分离，延长了生产周期，增加了生产设备的投入；该专利实施例4中公开了应用XAD-7疏水吸附填料(Sigma公司)分离纯化-旋蒸除有机试剂-凝胶过滤(SephadexG25)除去色素和部分多糖，然后利用阳离子交换柱SP-Fastflow(AmershamBiosciences公司)除去多脂类等杂质，收集的胰岛素前体(MIP)纯度90％以上，其所采用的工艺步骤长、有机试剂消耗大、疏水吸附层析交换容量低、脱盐步骤产率低，不适合大规模的生产。
专利CN101029077A公开了一种活性炭结合阳离子交换(填料为：SP550EC)、超滤脱盐的策略纯化基因重组胰岛素前体，在发酵液直接加入处理后的活性炭，经过搅拌后离心、上清再次经活性炭过滤、透过液经阳离子柱层析、超滤脱盐、冻干获得胰岛素前体。该工艺步骤也需要对上清液进行透析除盐，工艺步骤同样繁琐，不适合规模化工业生产。
专利CN102816819A通过将胰岛素类似物前体蛋白依次采用离子交换和反相层析方法纯化，但该方案依旧存在前述层析填料不能耐受高盐上样，需要对样品脱盐处理，因此提出的方案很难应用于规模化工业生产。
综上所述，重组表达的胰岛素及胰岛素类似物前体在纯化制备过程中存在的常规层析填料不能耐受高盐上样、常规疏水填料在层析中存在的无机盐、有机试剂用量大、成本高、污染严重的问题，所以纯化工艺在策略上不得不增加降低盐浓度的工艺步骤，如增加超滤换液脱盐、大体积稀释等工艺步骤，这样不仅增加设备投入，且很大程度的降低了胰岛素前体回收率，因此从毕赤酵母发酵的高盐上清液中提取纯化目的蛋白的方法是胰岛素纯化制备工艺的难点。
发明内容
本发明针对现有重组胰岛素前体及重组胰岛素类似物前体纯化制备工艺上的技术不足，提出一种操作简便、成本更低的制备工艺方法。
本发明的技术方案包括以下步骤：
(1)发酵液前处理：发酵液经酸调节pH，通过离心或过滤等获得含胰岛素前体或胰岛素类似物前体蛋白的上清液；所得发酵液电导率范围在10-55mS/cm之间；
(2)平衡：用酸性平衡缓冲液平衡层析柱的柱床；
(3)上样：将步骤(1)中的上清液上样至步骤(2)中的层析柱，然后用步骤(2)中的酸性平衡缓冲液冲洗未吸附的杂质；
(4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱步骤(3)中的层析柱，得重组胰岛素或胰岛素类似物前体的洗脱峰。
所述步骤(1)发酵液前处理中，调节pH的酸可以是冰乙酸、盐酸、硫酸、磷酸中的一种或几种，pH调节至2.0-6.0；所述上清液的电导率在10～55mS/cm之间；所述上清优选pH为3.0-4.0，优选电导率为20～40mS/cm条件下上样吸附。
所述步骤(2)中所采用的层析柱中层析填料为CaptoS、CaptoMMC、UniPMMS、UniMSP中的任何一种，装填的高度为8-25cm，优选8-15cm。其中CaptoMMC为复合弱阳离子交换配基，CaptoS为复合强阳离子交换配基，UniPMMS和UniMSP是高交联聚丙烯酸酯或聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物为基质的单分散聚合物填料。
上述填料中Capto系列是新一代以高度交联的琼脂糖凝胶为基质的新型填料；MMC为复合配基的阳离子交换基团，S为复合配基的强阳离子交换基团；其吸附过程具有耐盐特性，所以该配基可在高电导率下直接进样并且和蛋白结合在配基上。
UniPMMS、UniMSP是以聚苯乙烯/二乙烯苯或聚丙烯酸酯基质新一代聚合物填料，S、MSP表示其交换基团为强阳离子交换基团。Uni系列填料广泛应用于小分子有机物、蛋白、多肽、核酸、天然产物和化学合成药物的高效分析和分离纯化过程中。聚苯乙烯/二乙烯苯或聚丙烯酸酯基质使其具有一定的疏水性，其吸附过程具有耐盐特性，可在高电导率下直接进样并且和蛋白结合在配基上。
所述步骤(2)和步骤(3)中的酸性平衡缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液中的任一种；平衡酸性缓冲液浓度为5～200mM，优选10-100mM，更优选20-50mM；缓冲液的pH为2.0～6.0，优选范围是3.0-4.0。
所述步骤(4)中洗脱碱性缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种缓冲体系，洗脱碱性缓冲液的浓度范围为5mM～200mM，优选范围20-100mM；pH为8.0～10.0，优选pH8.0-9.5。
本发明对重组胰岛素前体、胰岛素类似物前体或其衍生物具有非常广泛的适用性，业内专业人员可依据本发明而改进或优化胰岛素或其类似物前体的制备方法，其纯化制备工艺对多种胰岛素类似物前体均适用。
本文所用的术语“重组”，指采用基因工程手段，应用重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质。
本文所用的术语“胰岛素”指人胰岛素、牛胰岛素、猪胰岛素等天然胰岛素。
本文所用的术语“胰岛素类似物”指对天然胰岛素进行氨基酸位点突变、缺失或添加，使其具有新的生理特性的一类胰岛素，如甘精胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素、DesB30胰岛素等。
本文所用的术语“前体”，指天然胰岛素及突变后的胰岛素，如人胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素等未形成胰岛素双链结构的前体蛋白。
与传统的提取纯化方法相比，本发明具有明显的技术效果：
(1)不需要对发酵液上清中过量的无机盐采用稀释、超滤换液等方法去除，该方法中的层析柱能直接在高盐条件下吸附、分离重组胰岛素前体或类似物前体，一步收率85％以上，纯度90％以上的前体，并能除去绝大部分色素，由原来的多步工艺直接一步分离纯化，降低了工艺时间和设备投资成本；
(2)与亲水性的疏水交换层析相比，不需使用大量的无机盐做流动相；与非水相疏水吸附相比，不使用大量的有机试剂，对环境污染小，成本更低；
(3)本发明中利用洗脱缓冲液洗脱的胰岛素前体加入胰蛋白酶后可直接高效进行酶切反应制备DesB30-胰岛素，工艺连续性更好，操作步骤简单，耗时短。
附图说明
图1为实施例1中55mS/cm高盐条件下利用CaptoS柱分离纯化胰岛素前体的制备图和相应胰岛素前体洗脱峰的HPLC分析图谱；
图2为实施例2中CaptoMMC55mS/cm高盐条件下柱分离纯化胰岛素前体图谱和相应胰岛素前体洗脱峰的HPLC分析图谱；
图3为实施例3中UniPMMS55mS/cm高盐条件下柱分离纯化胰岛素前体图谱和相应胰岛素前体洗脱峰的HPLC分析图谱；
图4为实施例4中UniMSP55mS/cm高盐条件下柱分离纯化胰岛素前体图谱和相应胰岛素前体洗脱峰的HPLC分析图谱；
实施例
本发明实施例公开了一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺，需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是轻而易举的，它们都被视为包括在本发明中。
实施例1：利用本申请中的填料CaptoS和对照填料SP-Sepharose6FF分离重组人DesB30胰岛素前体
(1)发酵液前处理：发酵液来源于毕赤酵母发酵液，经盐酸调整pH为2.0，离心处理15min，8000g，4-10℃，收取离心上清液，测定电导率值55mS/cm；HPLC检测上清纯度38％，含量3.5mg/ml；
为实验不同的电导率对纯化结果的影响，将上述电导率为55mS/cm的发酵，用水调节为40、20、10mS/cm的3份，分别进行实验。
(2)设备/填料/缓冲溶液
设备：AKTAPureM1层析设备(美国GE公司)，全波长紫外检测器，流速范围0.01-20ml/min。
层析柱：XK16/20柱，检测波长：280nm。
层析填料：填料1：本技术方案中的填料CaptoS，柱床高度：8cm；柱体积20ml(自行装填)；填料2：普通层析填料SP-Sepharose6FF：柱长：8cm；柱体积20ml；
进样体积：70～80ml，线性流速：300cm/h，体积流速：10ml/min。
平衡缓冲液：100mM甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.0；
洗脱缓冲液：200mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH10.0
(3)操作步骤
a.以平衡缓冲溶液平衡填料5个柱床体积，10ml/min，至UV基线走平或波动≤10mAU；
b.10ml/min，进样60～100ml；
c.以平衡缓冲溶液平衡填料5个柱床体积，10ml/min；
d.以洗脱缓冲溶液洗脱，收集峰，HPLC检测结果。
(4)实验结果
表1CaptoS、SP-Sepharose6FF纯化分离重组人DesB30胰岛素前体结果
通过实验比对发现CaptoS能够在高盐条件下吸附、分离纯化，所获样品的纯度和收率均满足产业化要求，而普通的填料SP-Sepharose6FF在高盐条件下无法结合目的蛋白，只有在降低盐浓度后才能很好的结合目的蛋白。
同时CaptoS随着盐浓度的降低，纯化效果越好，洗脱峰的纯度越高，产品的得率也越高。
实施例2：CaptoMMC纯化分离重组人DesB30胰岛素前体
(1)样品来源：同实施例1。
(2)该实施例中使用的设备/填料/缓冲溶液条件如下：
设备：AKTAPureM1层析设备(美国GE公司)，全波长紫外检测器，流速范围0.01-20ml/min。
层析柱：XK16/20柱，检测波长：280nm。
层析填料：CaptoMMC，柱床高度：10cm；柱体积20ml(自行装填)；
进样体积：70～80ml，线性流速：300cm/h，体积流速：10ml/min。
平衡缓冲液：100mM甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.0；
洗脱缓冲液：200mMTris-HCl缓冲液，pH8.5。
(3)操作步骤：同实施例1。
(4)实验结果
表2CaptoMMC纯化分离重组人DesB30胰岛素前体结果
实施例3：UniPMMS纯化分离重组人DesB30胰岛素前体
(1)样品来源：同实施例1。
(2)该实施例中使用的设备/填料/缓冲溶液条件如下：
设备：AKTAPureM1层析设备(美国GE公司)，全波长紫外检测器，流速范围0.01-20ml/min。
层析柱：XK16/20柱，检测波长：280nm。
层析填料：UniPMMS，柱床高度：10cm；柱体积20ml(自行装填)；
进样体积：70～80ml，线性流速：300cm/h，体积流速：10ml/min；
平衡缓冲液：80mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH4.0；
洗脱缓冲液：100mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8.5；
(3)操作步骤：同实施例1。
(4)实验结果如下：
表3UniPMMS分离纯化重组人DesB30胰岛素前体结果
实施例4：UniMSP纯化分离重组人DesB30胰岛素前体
(1)样品来源：同实施例1。
(2)该实施例中使用的设备/填料/缓冲溶液条件如下：
设备：AKTAPureM1层析设备(美国GE公司)，全波长紫外检测器，流速范围0.01-20ml/min。
层析柱：XK16/20柱，检测波长：280nm。
层析填料：UniMSP，柱床高度：14cm；柱体积20ml(自行装填)；
进样体积：70～80ml，线性流速：300cm/h，体积流速：10ml/min；
平衡缓冲液：80mM乙酸-乙酸钠缓冲液，pH4.0；
洗脱缓冲液：150mMTris-HCl缓冲液，pH9.5
(4)其他条件同实施例1，实验结果如下：
表4UniMSP纯化分离重组人DesB30胰岛素前体结果
实施例5：CaptoS纯化分离重组人门冬胰岛素前体
(1)发酵液前处理：来源于重组人门冬胰岛素毕赤酵母发酵液，经磷酸调整pH为4.0，离心处理15min，8000g，4-10℃，收取离心上清液，纯水调整电导率至35mS/cm；HPLC检测上清纯度67％，含量6.3mg/ml。
(2)设备/填料/缓冲溶液：
设备：AKTAPureM1层析设备(美国GE公司)，全波长紫外检测器，流速范围0.01-20ml/min。层析柱：XK16/20柱。检测波长：280nm。
层析填料：CaptoS，柱长：8cm；柱体积20ml(自行装填)。
进样体积：70～80ml，线性流速：300cm/h，体积流速：10ml/min。
平衡缓冲液:10mM邻苯二甲酸-盐酸缓冲液，pH4.0；
洗脱缓冲液洗：100mMTris-盐酸缓冲液，pH8.0。
(3)操作步骤同实施例1。
(4)收集门冬胰岛素前体洗脱峰，HPLC检测纯度92.02％，得率89.36％。
实施例6：UniMSP纯化分离重组赖脯胰岛素前体
(1)发酵液前处理：来源于重组赖脯胰岛素前体毕赤酵母发酵液，经柠檬酸调整pH为6.0，离心处理15min，8000g，4-10℃，收取离心上清液，纯水调整电导率值至20mS/cm；HPLC检测上清纯度54％，含量3.2mg/m。
(2)设备/填料/缓冲溶液：
设备：AKTAPureM1层析设备(美国GE公司)，全波长紫外检测器，流速范围0.01-20ml/min。
层析柱：XK16/20柱，检测波长：280nm。
层析填料：CaptoS，柱长：8cm；柱体积20ml(自行装填)。
平衡缓冲液：10mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH3.0；
进样体积：70～80ml，线性流速：300cm/h，体积流速：10ml/min。
洗脱缓冲液：20mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8.5
(3)操作步骤：同实施例1。
(4)结果：收集胰岛素前体HPLC纯度92.45％，胰岛素前体得率90.11％。
实施例7：UniPMMS纯化分离重组人甘精胰岛素前体
(1)发酵液前处理：来源于毕赤酵母发酵液，经磷酸调整pH为4.0，离心处理15min，8000g，4-10℃，收取离心上清液，纯水调整电导率值至30mS/cm；HPLC检测上清纯度44％，含量5.1mg/ml，进样80ml。
(2)设备/填料/缓冲溶液：
设备：AKTAPureM1层析设备(美国GE公司)，全波长紫外检测器，流速范围0.01-20ml/min。
层析填料：UniPMMS，柱体积20ml。
进样体积：70～80ml，线性流速：300cm/h，体积流速：10ml/min。
平衡缓冲溶液：5mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，pH4.0；
洗脱缓冲液：10mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，pH8.0；
(3)操作步骤同实施例1。
(4)收集胰岛素前体HPLC纯度93.87％，胰岛素前体得率90.63％。

Claims (10)

1.一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，包括以下步骤：
(1)发酵液前处理：发酵液以酸调节pH，离心获得含胰岛素前体或胰岛素类似物前体蛋白的上清液；所得发酵液电导率范围在10-55mS/cm之间；
(2)平衡：用酸性平衡缓冲液平衡层析柱的柱床；
(3)上样：将步骤(1)中的上清液上样至步骤(2)中的层析柱，然后用步骤(2)中的酸性平衡缓冲液冲洗未吸附的杂质；
(4)洗脱：用碱性缓冲液洗脱步骤(3)中的层析柱，得重组胰岛素或胰岛素类似物前体的洗脱峰。
2.根据权利要求1所述的一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，其特征在于，步骤(1)发酵液前处理中，调节pH的酸可以是冰乙酸、盐酸、硫酸、磷酸中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，其特征在于，步骤(1)中发酵液离心上清pH2.0-6.0，优选pH为3.0-4.0。
4.根据权利要求1所述的一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，其特征在于，步骤(1)中发酵液离心上清优选电导率为20～40mS/cm。
5.根据权利要求1所述的一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所采用的层析柱中层析填料为CaptoS、CaptoMMC、UniPMMS、UniMSP中的任何一种。
6.根据权利要求1或5所述的一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，其特征在于，步骤(2)中层析柱用层析填料装填的高度为8-25cm，优选8-15cm。
7.根据权利要求1所述的一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中的酸性平衡缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液中的任一种。
8.根据权利要求1所述的一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中的平衡酸性缓冲液浓度为5～200mM，优选10-100mM，更优选20-50mM；缓冲液的pH为2.0～6.0，优选范围是3.0-4.0。
9.根据权利要求1所述的一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，其特征在于，步骤(4)中碱性缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液中的一种缓冲体系。
10.根据权利要求1所述的一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，其特征在于，步骤(4)中洗脱碱性缓冲液的浓度范围为5mM～200mM，优选范围20-100mM；pH为8.0～10.0，优选pH8.0-9.5。
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