CN105147693A - 一种小分子化合物在制备抗肺癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子化合物在制备抗肺癌药物中的应用；本发明通过药理药效学实验证明，该小分子化合物对人非小细胞肺癌细胞株A549细胞具有显著的抑制增殖、诱导凋亡等作用；实验结果表明该小分子化合物可以显著降低线粒体膜电位，并且有明显的caspase3/7活性。说明该小分子化合物是通过caspase-3依赖型线粒体途径来诱导A549细胞的凋亡。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种新型小分子化合物在制备抗肺癌药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤已经成为严重威胁人类健康与生活质量的主要原因之一。肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内肺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势，尤其是在中国等发展中国家。在我国，随着工业化速度加快、环境污染加重、人口老龄化加剧，肺癌的患病率以及致死率日益加重。因此，寻找治疗肺癌的有效方法已经成为目前最为迫切的任务之一。
肺癌的治疗方法包括手术治疗、放射治疗、药物治疗等。目前肺癌的治疗已从最初的手术治疗的单一手段发展到今天的手术切除、放射治疗和内科治疗为一体的综合治疗模式。另外，80%的肺癌患者在发现时已属于晚期，大多患者仍以药物治疗为主。鉴于传统药物严重的毒副作用以及耐药性等问题，研究开发新的高效、肿瘤特异性以及毒副作用小的药物成为治疗肺癌的主攻方向之一。
近年来，随着分子生物学对生命和肿瘤研究的不断深入，针对特定生理过程和靶点的分子靶向药物以其独特的疗效和远大的前景在肺癌治疗中引起了广泛关注。化学合成的有机小分子是一种分子量小、容易进入细胞、可以与其中的蛋白质分子结合并影响蛋白活性的一种化合物。在抗肿瘤药物的筛选中，活性化合物可被视为一种药物先导化合物，为后续进行的结构修饰、药理学研究、药代动力学分析等奠定基础。除此之外，还可以进一步寻找活性化合物的作用靶点及作用机制，从而为药物研发提供新的靶点。
细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种形式之一，是细胞一种生理性、主动性的细胞“自杀行为”，是一个受到一系列相关基因严格调控的细胞死亡过程。凋亡不会引起后续的炎症等不良反应，因此已经成为研究抗癌药物的主要方式之一。不同的凋亡信号在细胞中引发不同的凋亡信号转导通路。根据凋亡信号的来源可以将细胞凋亡信号转导通路分成两条：外源性通路（死亡受体通路）和内源性通路（线粒体通路）。
线粒体是细胞凋亡调控的活动中心。当受到细胞凋亡信号刺激。线粒体释放细胞色素C至细胞浆中。细胞色素C与细胞内存在的一种凋亡细胞蛋白酶激活因子(Apoptosis
Protease Activating Factor-1，Apaf-1)结合，在dATP存在的条件下，通过半胱氨酸蛋白酶募集域的作用，Apaf-1和Caspase-9酶原结合。使Caspase-9酶原活化，然后激活下游的效应半胱氨酸蛋白酶如Caspase-3、6，7等成员，从而启动细胞凋亡。
Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)。该家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡机制网络中居中心地位，是一组在细胞凋亡过程中起着关键作用的酶。Caspase家族在诱导细胞凋亡的分子机制中起着关键作用，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。Caspass-3是迄今为止研究比较透彻的一个，它是主要的效应者分子。其中Caspase-3被认为是凋亡的关键蛋白酶，一旦被激活，即发生下游的级联反应，使凋亡不可避免，因而Caspase-3被称为“死亡蛋白酶”。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种小分子化合物在制备抗肺癌药物中的应用；本发明通过药理药效学实验证明，该小分子化合物对人非小细胞肺癌细胞株A549细胞具有显著的抑制增殖、诱导凋亡等作用。
本发明所述的小分子化合物 如下：
8-[(E)-2-[(4-bromophenyl)methylidene]hydrazin-1-yl]-3-methyl-7-(2-phenoxyethyl)-2,3,6,7-tetrahydro-1H-purine-2,6-dione（购自Life Chemicals Small Molecules Collection公司）；
化学结构式如下：
；
中文名称为：8-[(E)-2-[(4-溴苯基)亚甲基]联氨-1-基]-3-甲基-7-(2-苯氧乙基)-2,3,6,7-四氢-1H-嘌呤-2,6-二酮。
本发明所述小分子化合物在制备抗肺癌药物中的应用；其中肺癌细胞为非小细胞肺癌细胞株A549细胞。
MTT法检测该小分子化合物能有效抑制A549细胞的生长，抑制细胞存活率IC50浓度为4.945 ±0.402 μM。
Hoechst
33342染色结果显示，该小分子化合物可以使A549细胞的细胞核发生明显的核皱缩现象。
流式细胞术结果显示，该小分子化合物对A549细胞具有明显的诱导凋亡作用。
用JC-1染色检测线粒体膜电位的结果显示，该小分子化合物可以使A549细胞的线粒体膜电位显著降低，即通过线粒体途径诱导A549细胞的凋亡。
Caspase水平分析结果显示，该小分子化合物可以显著增强A549细胞内Caspase 3/7的活性，即该小分子化合物通过caspase 3/7依赖型途径诱导A549细胞的凋亡。
附图说明
图1为MTT法检测该小分子化合物对A549细胞的生长抑制作用结果；
图2为流式细胞技术检测DMSO对A549细胞凋亡的影响结果；
图3为流式细胞技术检测2.5 μM的该小分子化合物 对A549细胞凋亡的影响结果；
图4为流式细胞技术检测5 μM的该小分子化合物对A549细胞凋亡的影响结果；
图5为流式细胞技术检测10 μM的该小分子化合物对A549细胞凋亡的影响结果；
图6为线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测该小分子化合物诱导A549细胞线粒体膜电位的变化情况(**P<0.01)结果；
图7为Caspase-Glo® 3/7 Assay（Promega）检测该小分子化合物处理的A549细胞中Caspase 3/7活性的变化情况结果(**P<0.01)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。
实施例 1：通过MTT法检测该小分子化合物对A549细胞存活率的影响，实验步骤如下：
（1）取胰酶消化对数期细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞悬液浓度为5×104cell/ml，加入96孔细胞培养板中，每孔加入100 μl细胞悬液，然后放入37℃的细胞培养箱，培养箱的CO2浓度为5%，培养24h；
（2）该小分子化合物的原溶液浓度为10 mM，用DMSO进行浓度梯度稀释，浓度梯度为10 μM、5 μM、2.5 μM、1.25 μM，每个梯度每孔加入1μl，设三个复孔，补充100 μl RPMI-1640培养液；同时设置加入1 μl 0.5% DMSO为对照组，继续放入培养箱中培养72h；
（3）每孔加入MTT溶液20μl，37℃培养4h后，去上清，用100μl DMSO溶解剩余的甲瓒结晶，酶标仪检测490nm处的吸光值，计算该小分子化合物对A549细胞生长的抑制率及其IC50值；细胞抑制率 =（1-加药组平均OD 值/ 对照组平均OD 值）×100%。
结果见图1，该小分子化合物对A549细胞具有显著的抑制生长作用且呈明显的浓度依赖效应。
实施例2：Hoechst 33342染色观察小分子化合物处理过的A549细胞的核皱缩现象
本实验通过Hoechst 33342染色（碧云天）检测小分子化合物处理的A549细胞的核皱缩现象，实验步骤如下：
（1）取胰酶消化对数期细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞悬液浓度为1×105cell/ml，加入24孔细胞培养板中，每孔加入0.5ml细胞悬液，然后放入37℃的细胞培养箱，培养箱的CO2浓度为5%，培养24h；
（2）分别加入5μl 5μM、2.5 μM的该小分子化合物，补充0.5ml RPMI-1640培养液，同时设置加入5μl 0.5%DMSO为对照组，继续放入培养箱中培养24h；
（3）吸除培养基，多聚甲醛（工作浓度10μg/ml）固定10min，吸除多聚甲醛，PBS清洗两次，加入100μl 100μg/ml的Hoechst 33342染色液，用1 ml
PBS稀释至工作浓度10μg/ml，染色15 min，吸除染色液，用PBS清洗三次，每次3-5 min，置于荧光显微镜下观察细胞的核皱缩现象；
结果显示，DMSO处理的A549细胞的细胞核呈现正常的蓝色且细胞核完整为椭圆形；2.5 μM 该小分子化合物处理过的A549细胞的细胞核发出亮蓝色荧光且细胞核由于发生显著地皱缩现象而呈现为月牙形；5 μM 该小分子化合物处理过的A549细胞的细胞核发出亮蓝色荧光且细胞核呈现碎块状；由此我们可以初步判断细胞发生了凋亡。
实施例3：通过流式细胞技术检测该小分子化合物诱导A549细胞的凋亡情况
本实验通过Annexin
V-FITC流式检测试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司）检测小分子化合物诱导A549细胞凋亡的情况，实验步骤如下：
（1）取胰酶消化对数期细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞悬液浓度为5×105cell/ml，加入6孔细胞培养板中，每孔加入1ml细胞悬液，然后放入37℃的细胞培养箱，培养箱的CO2浓度为5%，培养24h；
（2）分别加入10μl 10μM、5 μM、2.5μM的该小分子化合物，补充1ml RPMI-1640培养液。同时设置加入10μl 0.5%DMSO为对照组。继续放入培养箱中培养24h；
（3）用胰酶消化细胞，收集细胞悬液，按照试剂盒说明书稀释结合缓冲液，用4℃预冷的PBS洗涤细胞两次，用500μl结合缓冲液重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC和10μl 20μg/ml的碘化丙啶溶液，混匀后于室温避光孵育15min，以DMSO组为阴性对照用流式细胞仪检测细胞凋亡。
结果见图2- 5，我们可以得出结论：该小分子化合物可以诱导A549细胞发生明显的凋亡现象且呈浓度依赖效应。
实施例4：通过线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)（碧云天）检测该小分子化合物诱导A549细胞的线粒体膜电位的变化情况，实验步骤如下：
（1）取胰酶消化对数期细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞悬液浓度为5×104cell/ml，加入96孔黑色透明底细胞培养板中，每孔加入100 μl细胞悬液，然后放入37℃的细胞培养箱，培养箱的CO2浓度为5%，培养24h；
（2）用10 μM、5 μM、2.5 μM 的小分子化合物处理A549细胞，每个梯度每孔加入1 μl，设三个复孔，补充100 μl RPMI-1640培养液。同时设置加入1 μl 0.5%DMSO为对照组。继续放入培养箱中培养24h；
（3）吸除旧培养基，PBS洗涤两次。加入100 μl细胞培养液与100 μl JC-1染色工作液（完全按照碧云天提供的说明书进行配制），充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟；
（4）在孵育期间，按照每1ml
JC-1染色缓冲液(5×)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1×)，并放置于冰浴；
（5）37℃孵育结束后， 吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次；
（6）加入200 μl细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红；
（7）通过酶标仪进行荧光检测，检测JC-1单体时激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。
结果见图6，该小分子化合物可以使A549细胞的线粒体膜电位显著降低，即通过线粒体途径诱导A549细胞的凋亡。
实施例5：通过Caspase-Glo® 3/7
Assay（Promega）检测该小分子化合物处理的A549细胞中Caspase 3/7活性的变化，实验步骤如下：
（1）取胰酶消化对数期细胞，用RPMI-1640培养液调整细胞悬液浓度为5×104cell/ml，加入96孔白底细胞培养板中，每孔加入100 μl细胞悬液，然后放入37℃的细胞培养箱，培养箱的CO2浓度为5%，培养24h；
（2）分别用1μl 10 μM、5 μM、2.5 μM的该小分子化合物处理A549细胞24h，设三个复孔，补充100 μl RPMI-1640培养液。同时设置加入1 μl 0.5%DMSO为对照组。继续放入培养箱中培养24h；
（3）吸除培养基，加入100 μl培养基与100 μl 分析试剂(完全按照说明书进行配制)，振荡，于室温避光培养1 h，用酶标仪检测Caspase 3/7的活性；
结果见图7，该小分子化合物可以显著增强A549细胞内Caspase 3/7的活性，即该小分子化合物通过caspase 3/7依赖型途径诱导A549细胞的凋亡。
Claims (1)
1.结构式为式I所示的小分子化合物在制备抗肺癌药物中的应用，
式Ⅰ：
8-[(E)-2-[(4-溴苯基)亚甲基]联氨-1-基]-3-甲基-7-(2-苯氧乙基)-2,3,6,7-四氢-1H-嘌呤-2,6-二酮。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| MAYA GEORGIEVA 等: "SYNTHESIS, STRUCTURAL AND SPECTRAL ANALYSIS OF SOME 8-SUBSTITUTED DERIVATIVES OF 1,3,7-TRIMETHYLXANTHINE WITH ANTIPROLIPHERATIVE ACTIVITY", 《WORLD JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACEUTICAL SCIENCES》 * |
| XIAOFENG XIA 等: "Image-Based Chemical Screening Identifies Drug Efflux Inhibitors in Lung Cancer Cells", 《CANCER RESEARCH》 * |
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|---|---|
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