CN105137095A - 游离甲状腺素的免疫分析试剂盒 - Google Patents

游离甲状腺素的免疫分析试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种游离甲状腺素的免疫分析试剂盒。其由以下成分组成：1)游离甲状腺素(freethyroxine,FT4)系列校准品；2)抗异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液；3)异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液；4)辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素溶液；5)化学发光底物液；6)浓缩洗涤液。

Description

游离甲状腺素的免疫分析试剂盒
技术领域
本发明属于医疗检测领域，具体涉及一种游离甲状腺素的免疫分析试剂盒。
背景技术
甲状腺肿大是我们较为多见的疾病，是患者体内缺少碘元素影响了甲状腺激素，从而患有的疾病，甲状腺肿大给患者带来的不仅仅是身体上的痛苦，还会有形象上的影响，病情严重时还会引起一些并发症的出现，给患者带来全面性的伤害甲状腺是人体内最大的内分泌腺，成人平均生理重量约为20-25g。甲状腺内含有许多大小不等的圆形或椭圆形腺泡。腺泡是由单层的上皮细胞围成，腺泡腔内充满胶质。胶质是腺泡上皮细胞的分泌物，主要成分为甲状腺球蛋白。腺泡上皮细胞是甲状腺激素的合成与释放的部位，而腺泡腔的胶质是激素的贮存库。甲状腺激素影响所有组织的成熟、生长、代谢活动和功能，是很重要的激素。
甲状腺患者的检查项目很多，常见的有血清总T3(TT3)、血清总T4(TT4)、血清游离T3(FT3)、血清游离T4(FT4)、血清促甲状腺素(TSH)、促甲状腺素释放素(TRH)、促甲状腺素受体抗体、促甲状腺刺激性抗体等，其他诸如基础代谢、血清胆固醇、超声波等因为易被干扰或化验时间长而渐渐很少使用了。
甲状腺素，又称四碘甲腺原氨酸(thyroxine，T4)，分子量大小为776.93。甲状腺素经甲状腺分泌释放进人血液循环后，立即与血浆中甲状腺素结合球蛋白结合，处于结合态的激素失去活性，仅少量处于游离状态而发挥生理作用。在正常的生理状况下，血液循环中的T4有99.97％与蛋白结合；游离甲状腺素(freethyroxine,FT4)只占0.03％。在结合型的T4中，有60％与甲状腺素结合球蛋白(thyroxinebindingglobulin，TBG)结合，30％与甲状腺结合清前白蛋白(thyroidbindingpreallbumin，TBPA)结合，另有9.97％与清蛋白(albumin，Alb)结合。血清游离甲状腺素FT4的生理浓度，不受机体甲状腺结合球蛋白浓度的影响，无论是生理性的的增加，还是病理性的减少，对FT4的生理浓度均无影响。FT4可作为下丘脑-垂体-甲状腺轴疾病可疑患者的筛选指标之一，测定血清FT4对诊断甲状腺功能性疾病，具有重要的临床价值。
发明内容
本发明的第一方面是提供一种游离甲状腺素的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒，其由以下组分组成：
1)游离甲状腺素(freethyroxine,FT4)系列校准品；
2)抗异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液；
3)异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液；
4)辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素溶液；
5)化学发光底物液；
6)浓缩洗涤液。
所述试剂盒还包括反应管；所述试剂盒中反应管的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。所述游离甲状腺素抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，A液为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和终浓度为0.2mg/mL的对碘苯酚；B液是0.1MpH值为4.5的柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢。
所述浓缩洗涤液为15mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，且该缓冲液中含有体积百分比浓度为0.02％的吐温20。
所述抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒溶液组分为：8mg/mL的抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒，溶于含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0。所述抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体的制备参见专利CN200910091849公开的内容，当然也可按照本领域常规戊二醛方法进行制备。
所述异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液的组分为：含0.3μmol/mL的异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体，0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0。所述游离甲状腺素抗体为单克隆抗体，标记方法可通过本领域已知方法进行制备，例如，按照CN200910091849公开的内容进行制备。
所述辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素溶液的组分为：含1μg/ml的辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素，含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液。
所述游离甲状腺素系列校准品为将FT4标准品溶于含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mL蔗糖的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0，FT4浓度依次为0pmol/L，1.59pmol/L，3.45pmol/L，15.6pmol/L，37.5pmol/L，122pmol/L的6瓶FT4校准品。
具体实施方式
下面将进一步的来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1
1)游离甲状腺素(freethyroxine,FT4)系列校准品；
FT4标准品溶于含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mL蔗糖的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0，FT4浓度依次为0pmol/L，1.59pmol/L，3.45pmol/L，15.6pmol/L，37.5pmol/L，122pmol/L的6瓶FT4校准品，1.5mL/瓶。
2)抗异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液；
抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒溶液组分为：8mg/mL的抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒，溶于含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0；6mL/瓶。
3)异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液；
所述异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液的组分为：含0.3μmol/mL的异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体，0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0。游离甲状腺素抗体为单克隆抗体(购自天健生物制药(天津)有限公司)
4)辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素溶液；
辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素溶液的组分为：含1μg/ml的辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素，含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；3mL/瓶。
5)化学发光底物液；
化学发光底物液包含A液和B液，其中，A液为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和终浓度为0.2mg/mL的对碘苯酚；B液是0.1MpH值为4.5的柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢。A液，12mL/瓶；B液12mL/瓶
6)浓缩洗涤液。
所述浓缩洗涤液为15mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，且该缓冲液中含有体积百分比浓度为0.02％的吐温20。6mL/瓶，使用时用新鲜制备的去离子水稀释20倍；
试剂盒还包括反应管；所述试剂盒中反应管的材料为透明聚苯乙烯。
实施例2试剂盒灵敏度测定
分别配制FT4标准品不同浓度的PBS缓冲液，浓度分别为0.1pmol/L，0.25pmol/L，0.5pmol/L，1pmol/L，5pmol/L，10pmol/L，20pmol/L，采用实施例1制备的试剂盒进行检测，并且同时使用对比例试剂盒进行同样检测，对比例为专利CN200910091849实施例1制备的试剂盒，具体检测方法如下：
使用本试剂盒进行实验前，需预先取出抗体包被的磁微粒溶液、FITC标记抗FT4抗体、酶标记的游离甲状腺素溶液在室温放置10～30分钟，使它们平衡到室温；之后，将恒温温箱或者水浴锅调至37℃；再后，准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。
(A)将圆底聚苯乙烯试管编号后，依次向各试管中加入25pLFT4系列上述标准品溶液，每管加各25pL；
(B)向各管中加入酶标记物50nL后，加入FITC标记物和抗体包被的磁微粒溶液分别为50、100pL，室温反应45min之后，置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液，将倒转的试管放在吸水纸上，拍击分离器以除去挂壁液体。然后每管加入稀释20倍后的洗涤液500pL,充分混匀，置于磁分离器上分离5min，倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体，重复4次。各管加入混合后的化学发光底物液200-400pL，充分混匀，置于37℃温育10min，然后置于磁分离器内暗处放置，待磁微粒富集于底部后，在管式化学发光测量仪上依序测量各管的发光强度(RLU)。
计算FT4标准品与空白对照的比值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的FT4标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，具体结果如下：
结果表明本发明实施例1制备的试剂盒其灵敏度可以达到0.1pmol/L，而对比例的灵敏度为0.5pmol/L。
实施例3试剂盒稳定性考察
将实施例1制备的试剂盒在37℃分别放置1个月后，按照实施例2的方法测定试剂盒的灵敏度并对试剂盒中的标准品进行测试，并对发光强度取log值与校准品浓度进行线性回归分析，计算R2值。
本实施例中对比例设定如下：
对比例1：专利CN200910091849实施例1制备的试剂盒。
对比例2：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于所述异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液的组分为：含0.3μmol/mL的异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体，0.2g/mL酪蛋白和0.4g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0。
对比例3：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于所述异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液的组分为：含0.3μmol/mL的异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体，0.01g/mL酪蛋白和0.1g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0。
对比例4：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒溶液组分为：8mg/mL的抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒，溶于含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.5。
对比例5：区别仅在于抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒溶液组分为：8mg/mL的抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒，溶于含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为7.4。
具体结果如下：
本发明实施例1制备的试剂盒线性方程为Log(Y)＝0.1745-0.3144Log(X)
实施例4
应用本发明实施例1制备的酶联免疫定量检测试剂盒的质量检测精密度：随机抽取50盒不同批次试剂盒，用同一份血清按上述操作步骤进行重复测定。计算每次测定结果，求出均值、SD和变异系数CV。精密度试验结果显示批间CV小于2％。
另外在特异性实验中，选取与T4结构类似的三碘甲状腺原氨酸(T3)、反三碘甲状腺原氨酸(rT3)和二碘甲腺原氨酸(T2)样本，每种样本的浓度为500ng/ml，采用本发明实施例1试剂盒对其测定，结果表明上述样本的测定结果均小于1pg/ml。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (8)

1.一种游离甲状腺素的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒，其由以下组分组成：
1)游离甲状腺素(freethyroxine,FT4)系列校准品；
2)抗异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液；
3)异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液；
4)辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素溶液；
5)化学发光底物液；
6)浓缩洗涤液。
2.根据权利要求1所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应管；所述试剂盒中反应管的材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃；所述游离甲状腺素抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，A液为0.1M、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为5.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和终浓度为0.2mg/mL的对碘苯酚；B液是0.1MpH值为4.5的柠檬酸缓冲液，且该缓冲液中含有终浓度为100mg/mL的过氧化氢。
4.根据权利要求1所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为15mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，且该缓冲液中含有体积百分比浓度为0.02％的吐温20。
5.根据权利要求1所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒溶液组分为：8mg/mL的抗异硫氰酸荧光素单克隆抗体包被的磁微粒，溶于含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0。
6.根据权利要求1所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体溶液的组分为：含0.3μmol/mL的异硫氰酸荧光素标记的游离甲状腺素抗体，0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0；所述游离甲状腺素抗体为单克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素溶液的组分为：含1μg/ml的辣根过氧化物酶标记的游离甲状腺素，含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mLPEG200的15mmol/L磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的免疫分析试剂盒，其特征在于，所述游离甲状腺素系列校准品为将FT4标准品溶于含0.05g/mL酪蛋白和0.2g/mL蔗糖的15mmol/L磷酸盐缓冲液；pH值为8.0，FT4浓度依次为0pmol/L，1.59pmol/L，3.45pmol/L，15.6pmol/L，37.5pmol/L，122pmol/L的6瓶FT4校准品。
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