CN105126165A - 一种钛牙种植体材料及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钛牙种植体材料及其制备方法与应用。采用本发明的钛种植体材料的制备方法制备的钛牙种植体材料含有基体、阳离子聚合物层、阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层和阴离子多糖层-抗菌肽层复合层,具有良好的生物相容性、抗菌、抗凋亡和促血管生成活性,能够支持多种细胞的粘附、存活、生长与分化,促进血管内皮细胞的存活、增殖、迁移和形成毛细管样的管腔结构,同时抑制牙周常见致病菌的粘附和存活,具有持久、高效的杀菌、抗感染能力,能够加速种植体周围骨创的愈合和实现种植体-骨界面的化学结合,提高了口腔种植的成功率,缩短了治疗时间,而且制备方法简单,在口腔种植领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及口腔种植材料制备技术领域中一种钛牙种植体材料及其制备方法与应用。
背景技术
随着口腔种植学的发展,牙种植体修复技术逐渐成为一种常规的治疗手段,大大地改善了牙齿修复效果,提高了患者的生活质量。但是,目前种植修复也存在植入后愈合时间较长,在骨质、骨量不良的部位失败率较高等问题。种植体-组织界面的反应是决定牙种植能否成功的重要因素之一。目前注册的牙种植体系统共220余种,都是以商业高纯钛(cpTi)及其合金(Ti-6Al-4V)为基材制作而成的。钛属于惰性材料,植入体内后组织反应表现一定的非特异性和随机性,与骨组织界面则主要表现为机械锁合方式的物理整合,缺乏有效的化学结合,更为重要的是由于其缺乏生物相容性,植入后会引起一系列的炎性反应,最终影响治疗效果。钛种植体部分暴露于口腔中,在种植体植入、愈合和行使功能的各环节中,种植体周围组织均存在着被细菌感染的危险。细菌附着在种植体上会影响新生骨的生长,导致支持骨的丧失,从而降低种植体-骨界面的机械稳定性,成为种植失败的主要原因之一,因此控制种植体表面细菌聚集和粘附,对于预防和治疗种植体周围感染具有重要意义。在种植体植入后的缺血、创伤的应激环境下,促进局部细胞的存活、抗凋亡也是影响骨整合的重要环节之一。此外,种植体周围新生血管形成也是种植体-骨界面整合的关键环节,其作用贯穿于整个种植修复过程,影响成骨细胞的粘附、增殖、分化和功能发挥,对骨再生与骨融合的方式及效果起决定作用。通过种植体表面改性,赋予其良好的生物相容性、抗菌、抗凋亡、促血管生成活性,形成种植体-骨界面的化学整合是解决上述问题的重要途径。因此,研发新的功能性口腔种植材料对于提高牙种植体种植的成功率是非常关键的因素之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高牙种植体种植的成功率。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了一种牙种植体(口腔种植体)材料。
本发明所提供的牙种植体材料含有基体、阳离子聚合物层、复合层M和复合层N;所述复合层M为阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层,所述阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由阴离子多糖层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于所述阴离子多糖层的表面;所述复合层N为阴离子多糖层-抗菌肽层复合层,所述阴离子多糖层-抗菌肽层复合层由所述阴离子多糖层和抗菌肽层组成,所述抗菌肽层位于所述阴离子多糖层的表面;
所述阳离子聚合物层由阳离子聚合物制成;所述阴离子多糖层由阴离子多糖制成;所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物层由氯化壳聚糖-多肽A偶联物制成;所述抗菌肽层由抗菌肽制成。
上述牙种植体材料中,所述阳离子聚合物层位于所述基体的表面。
上述牙种植体材料中,所述基体可为纯钛或钛合金,具体可为纯钛。
上述牙种植体材料中,所述阳离子聚合物可为聚-L-赖氨酸。
上述牙种植体材料中,所述阴离子多糖可为硫酸软骨素、透明质酸、肝素和果胶中至少一种,具体可为硫酸软骨素。
上述牙种植体材料中,所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物是以N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺为偶联剂将氯化壳聚糖和多肽A偶联得到的偶联物,所述多肽A是具有抗凋亡和促进血管生成活性的多肽。
上述牙种植体材料中,所述氯化壳聚糖和所述多肽A偶联反应中,所述氯化壳聚糖、所述多肽A、N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺的质量比可为(100-1000):(10-500):(1-10):(5-100),具体可为(500:231.5:5.5:50),(500:115.5:5.5:50)或(500:46.3:5.5:24);所述偶联反应还包括纯化的步骤,可为将反应液装入截留分子量≥8000的透析袋中置于去离子水中透析48-96h,每6h换一次水,具体可为将反应液装入截留分子量为8000的透析袋中置于去离子水中透析48h,每6h换一次水。
上述牙种植体材料中,所述多肽A的氨基酸序列为SEQIDNo.1;所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQIDNo.2。
上述牙种植体材料中,所述牙种植体材料为下述1)-4)中任一种:
1)所述牙种植体材料由所述基体、涂覆于所述基体表面的1层所述阳离子聚合物层、涂覆于1层所述阳离子聚合物层表面的1层所述复合层M和涂覆于1层所述复合层M表面的1层所述复合层N组成;
2)所述牙种植体材料由所述基体、包覆在所述基体表面的1层所述阳离子聚合物层、18-34层(如18、26或34层)所述复合层M和4-8层(如4、6或8层)所述复合层N组成;
3)所述牙种植体材料由所述基体、包覆在所述基体表面的1层所述阳离子聚合物层、18层所述复合层M和4层所述复合层N组成;
4)所述牙种植体材料由所述基体、涂覆于所述基体表面的1层所述阳离子聚合物层、涂覆于1层所述阳离子聚合物层表面的M1,涂覆于所述M1表面的N1,涂覆于所述N1表面的M4-1,涂覆于所述M4-1表面的N1-1,涂覆于所述N1-1表面的M4-2,涂覆于所述M4-2表面的N1-2,涂覆于所述N1-2表面的M4-3,涂覆于所述M4-3表面的N1-3,涂覆于所述N1-3表面的M5组成(实施例中的牙种植体材料2-B);所述M1为1层所述复合层M,所述N1为1层所述复合层N;所述N1-1、所述N1-2和所述N1-3均为1层所述复合层N;所述M4-1、所述M4-2和所述M4-3均为4层所述复合层M;所述M5为5层所述复合层M。
为解决上述技术问题,本发明还提供了所述牙种植体材料的制备方法。
本发明所提供的所述牙种植体材料的制备方法,包括在所述基体表面涂覆所述阳离子聚合物,获得涂覆有阳离子聚合物的材料;在所述涂覆有阳离子聚合物的材料表面涂覆所述阴离子多糖,获得涂覆有第一层阴离子多糖的材料;在所述涂覆有第一层阴离子多糖的材料表面涂覆所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物,获得涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料;在所述涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料表面涂覆所述阴离子多糖,获得涂覆有第二层阴离子多糖的材料;在所述涂覆有第二层阴离子多糖的材料表面涂覆所述抗菌肽,获得涂覆有抗菌肽的材料,将该涂覆有抗菌肽的材料称为牙种植体材料1。
上述牙种植体材料的制备方法包括对所述牙种植体材料1重复操作A和/或B,所述操作A为在相应的牙种植体材料表面涂覆所述阴离子多糖得到所述阴离子多糖层,在所述阴离子多糖层表面涂覆所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物,得到所述复合层M;
所述操作B为在相应的牙种植体材料表面涂覆所述阴离子多糖得到所述阴离子多糖层,在所述阴离子多糖层表面涂覆所述抗菌肽,得到所述复合层N。
上述方法中,所述操作A可重复1、20、30、40或1-40次,所述操作B可重复1、3、5、7或1-20次。
上述牙种植体材料的制备方法中,涂覆所述阳离子聚合物在阳离子聚合物溶液中进行,所述阳离子聚合物溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为所述阳离子聚合物,所述溶剂为水,所述阳离子聚合物在所述阳离子聚合物溶液中的浓度可为1.0-5.0mg/mL,具体可为2.0mg/mL;所述阳离子聚合物溶液的pH值可为6-7,具体可为7;
涂覆所述阴离子多糖在阴离子多糖溶液中进行,所述阴离子多糖溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为所述阴离子多糖,所述溶剂为水,所述阴离子多糖在所述阴离子多糖溶液中的浓度可为0.1-5mg/mL,具体可为2.0mg/mL;所述阴离子多糖溶液的pH值可为6-7,具体可为6;
涂覆所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物在氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中进行,所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物,所述溶剂为水,所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物在所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中的浓度可为1-10mg/mL,具体可为2mg/mL;所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液的pH值可为6-7,具体可为6;
涂覆所述抗菌肽在抗菌肽溶液中进行,所述抗菌肽溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为所述抗菌肽,所述溶剂为水,所述抗菌肽在所述抗菌肽溶液中的浓度可为0.1-2mg/mL,具体可为0.5或2mg/mL;所述抗菌肽溶液的pH值可为6-7,具体可为7。
上述方法中,所述阳离子聚合物溶液具体可为聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液,所述聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为聚-L-赖氨酸盐酸盐,所述溶剂为水,聚-L-赖氨酸盐酸盐在所述聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液中的浓度具体可为2.0mg/mL;所述聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液的pH值具体可为7。
上述方法中,所述阴离子多糖溶液具体可为硫酸软骨素硫酸钠盐溶液,所述硫酸软骨素硫酸钠盐溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为硫酸软骨素硫酸钠盐,所述溶剂为水,硫酸软骨素硫酸钠盐在所述硫酸软骨素硫酸钠盐溶液中的的浓度具体可为2.0mg/mL;所述硫酸软骨素硫酸钠盐溶液的pH值具体可为6。
上述牙种植体材料的制备方法包括将所述基体在酸或碱溶液中25-60℃下浸泡0.5-12h,然后用去离子水冲洗3-5次,60℃真空干燥,获得处理后的基体;所述酸溶液可为浓度为0.1-1.4M的H3PO4溶液,具体可为浓度为1.4M的H3PO4溶液;所述碱溶液可为浓度为1-7M的NaOH溶液,具体可为浓度为5M的NaOH溶液;所述浸泡温度具体可为60℃;所述浸泡时间具体可为4、6和12h;所述去离子水冲洗次数具体可为3次;将所述处理后的基体置于所述阳离子聚合物溶液中浸泡30-90min,具体可为浸泡30min,获得所述涂覆有阳离子聚合物的材料;将所述涂覆有阳离子聚合物的材料置于所述阴离子多糖溶液中浸泡5-30min,具体可为浸泡15min,获得所述涂覆有第一层阴离子多糖的材料;将所述涂覆有第一层阴离子多糖的材料置于所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中浸泡5-30min,具体可为浸泡15min,获得所述涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料;将所述涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料置于所述阴离子多糖溶液中浸泡5-30min,具体可为浸泡15min,获得所述涂覆有第二层阴离子多糖的材料;将所述涂覆有第二层阴离子多糖的材料置于所述抗菌肽溶液中浸泡5-30min,具体可为浸泡15min,获得所述牙种植体材料1。
上文中,所述氯化壳聚糖的脱乙酰度为95%,分子量为20万,所述聚-L-赖氨酸的分子量(基于粘度测定)大于3万。
本发明所提供的上述牙种植体材料,或,上述牙种植体材料的制备方法在制备口腔种植体中的应用也属于本发明保护的范围。
实验证明,本发明的牙种植体材料具有良好的生物相容性、抗菌、抗凋亡和促血管生成活性,能够支持多种细胞(如成骨细胞、软骨细胞)的粘附、存活(抗凋亡)、生长与分化,促进血管内皮细胞的存活(抗凋亡)、增殖、迁移和形成毛细管样的管腔结构,同时抑制牙周常见致病菌的粘附和存活,具有持久、高效的杀菌、抗感染能力,能够加速种植体周围骨创的愈合和实现种植体-骨界面的化学结合,提高了口腔种植的成功率,缩短了治疗时间。经过12h厌氧培养后,与牙种植体材料2-BCK相比,牙种植体材料2-B对牙龈卟啉单胞菌P.g的抗菌率达到92.26%,说明牙种植体材料2-B对种植体周围炎的敏感菌有较好的抑制作用。相对于牙种植体材料纯钛,Actin免疫荧光染色表明牙种植体材料2-B(改性组)表面的细胞黏附更多,细胞骨架蛋白表达更多,更利于细胞的黏附和伸展。相对于牙种植体材料纯钛,牙种植体材料2-B(改性组)表面细胞增殖情况明显优于纯钛组,在成骨细胞接种的第7天,改性组的表面细胞增殖率是对照组的1.2倍,差异有统计学意义(P<0.05),说明具有更强的增殖活性。本发明的牙种植体材料的制备方法简单,在口腔种植领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为牙种植体材料2-B的Actin免疫荧光染色实验结果。
图2为牙种植体材料2-B表面成骨细胞增殖结果。其中,Ti/chi代表牙种植体材料2-B(改性组);CpTi代表纯钛组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
下述实施例中的牙龈卟啉单胞菌P.g(李云鹏,刘大力,束蓉,周彦玢.牙龈卟啉单胞菌临床菌株的分离、鉴定及生长特性分析.上海交通大学学报(医学版),2012年01期),来源于四川大学华西口腔医学院,公众可从中国人民解放军第三〇七医院获得,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中的纯钛为陕西宝鸡有色金属工业公司的产品,并经过晶相砂纸逐级抛光成镜面状态;氯化壳聚糖(壳聚糖盐酸盐)(脱乙酰度95%,分子量20万,产品编号:Y0000104)、硫酸软骨素硫酸钠盐(纯度>95%,产品编号:C4384)、聚-L-赖氨酸盐酸盐(分子量>3万,产品编号:P9404)、N-羟基琥珀酰亚胺(产品编号:130672)、碳二亚胺盐酸盐(产品编号:E6383)均为sigma公司产品;透析袋(美国联合碳化,产品编号:MD77-14,);氢氧化钠和磷酸等均为分析纯。
下述实施例中的多肽A采用固相合成法制备,多肽A的纯度为>95%,多肽A的氨基酸序列为SEQIDNo.1。下述实施例中的抗菌肽(即是HBD-2)(产品编号:D9690)为sigma公司产品,抗菌肽的氨基酸序列为SEQIDNo.2。
下述实施例中相关溶液的配制方法如下:
1、pH值为6,浓度为16.67mg/mL的氯化壳聚糖溶液:称取0.5g的氯化壳聚糖,将其溶解于30mL超纯水中,搅拌至完全溶解,制备成氯化壳聚糖溶液;该氯化壳聚糖溶液由溶质和溶剂组成,溶质为氯化壳聚糖,溶剂为水,氯化壳聚糖在氯化壳聚糖溶液中的浓度为16.67mg/mL,氯化壳聚糖溶液的pH值为6。
2、pH值为7,浓度为2.0mg/mL的聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液(阳离子聚合物溶液):称取20mg的聚-L-赖氨酸盐酸盐,将其溶解于10mL超纯水中,搅拌至完全溶解,制备成聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液;该聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液由溶质和溶剂组成,溶质为聚-L-赖氨酸盐酸盐,溶剂为水,聚-L-赖氨酸盐酸盐在聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液中的浓度为2.0mg/mL,聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液的pH值为7。
3、pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液):称取20mg硫酸软骨素硫酸钠盐,将其溶解于10mL去离子水中,搅拌直至全部溶解,制备成硫酸软骨素硫酸钠盐溶液,该硫酸软骨素硫酸钠盐溶液由溶质和溶剂组成,溶质为硫酸软骨素硫酸钠盐,溶剂为水,硫酸软骨素硫酸钠盐在硫酸软骨素硫酸钠盐溶液中的浓度为2mg/mL,用NaOH溶液将该硫酸软骨素硫酸钠盐溶液的pH值调节为6。
4、pH值为7,浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液:称取5mg抗菌肽,将其溶解于10mL去离子水中,制备成抗菌肽溶液,该抗菌肽溶液由溶质和溶剂组成,溶质为抗菌肽,溶剂为水,抗菌肽在抗菌肽溶液中的浓度可为0.5mg/mL;抗菌肽溶液的pH值为7。
5、pH值为7,浓度为2mg/mL的抗菌肽溶液:称取20mg抗菌肽,将其溶解于10mL去离子水中,制备成抗菌肽溶液,该抗菌肽溶液由溶质和溶剂组成,溶质为抗菌肽,溶剂为水,抗菌肽在抗菌肽溶液中的浓度可为2mg/mL;抗菌肽溶液的pH值为7。
实施例1、制备牙种植体材料1
一、制备牙种植体材料1-A
牙种植体材料1-A由钛片(基体)、涂覆于钛片表面的聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、涂覆于聚-L-赖氨酸层表面的硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)、涂覆于硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层表面的硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成;硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
其制备方法如下:
1、称取0.2315g多肽A,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为23.15mg/mL的多肽A溶液,备用。
2、称取0.05g碳二亚胺,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液,备用。
3、向步骤1制备的10mL浓度为23.15mg/mL的多肽A溶液中加入0.0055gN-羟基琥珀酰亚胺,将多肽A活化0.5h,获得活化后的多肽A溶液。
4、将步骤3的活化后的10mL多肽A溶液加入到30mLpH值为6,浓度为16.67mg/mL的氯化壳聚糖溶液中,继续搅拌30min,获得氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液。
5、将步骤将2制备的10mL浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液加入到步骤4的氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液中,获得碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液,将碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液机械搅拌6h,获得反应后的溶液;将反应后的溶液装入截留分子量为8000的透析袋中,在去离子水中透析48,每隔6h换水一次,收集透析袋中的溶液,获得透析后的溶液。
6、将步骤5获得的透析后的溶液,在-70℃冷冻干燥,获得氯化壳聚糖-多肽A偶联物。
7、将钛片抛光后浸入浓度为1.4M的H3PO4溶液中,在60℃温度条件下浸泡6h,然后用去离子水冲洗3次,60℃真空干燥,获得磷酸处理后的钛片,备用。
8、将步骤7获得的磷酸处理后的钛片先置于pH值为7,浓度为2.0mg/mL的聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液(阳离子聚合物溶液)中浸泡30min,然后在双蒸水浸洗1min,最后在20-30℃自然干燥,获得表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料(涂覆有阳离子聚合物的材料),备用。
9、称取20mg步骤6获得的氯化壳聚糖-多肽A偶联物,将其溶解于10mL去离子水中,制备成氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液。该氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液由溶质和溶剂组成,溶质为氯化壳聚糖-多肽A偶联物,溶剂为水,氯化壳聚糖-多肽A偶联物在氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中的浓度为2mg/mL,氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液的pH值为6。
10、首先将步骤8制备的表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第一层阴离子多糖的材料);然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于步骤9制备的pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料。
11、首先将步骤10制备的涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第二层阴离子多糖的材料);将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有抗菌肽的材料,即为牙种植体材料1-A。
二、制备牙种植体材料1-B
牙种植体材料1-B由钛片(基体)、包覆在基体表面的1层聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、34层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)和8层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
牙种植体材料1-B是在步骤一制备的牙种植体材料1-A的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料1-A表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-A4,在牙种植体材料1-A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料1-A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-A4B;在牙种植体材料1-A4B的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料1-A4B表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-A4BA4,在牙种植体材料1-A4BA4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料1-A4BA4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)2;在牙种植体材料1-(A4B)2的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料1-(A4B)2表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)2A4,在牙种植体材料1-(A4B)2A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料1-(A4B)2A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)3;在牙种植体材料1-(A4B)3的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料1-(A4B)3表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)3A4,在牙种植体材料1-(A4B)3A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料1-(A4B)3A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)4;在牙种植体材料1-(A4B)4的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料1-(A4B)4表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)4A4,在牙种植体材料1-(A4B)4A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料1-(A4B)4A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)5;在牙种植体材料1-(A4B)5的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料1-(A4B)5表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)5A4,在牙种植体材料1-(A4B)5A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料1-(A4B)5A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)6;在牙种植体材料1-(A4B)6的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料1-(A4B)6表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)6A4,在牙种植体材料1-(A4B)6A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料1-(A4B)6A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-(A4B)7;在牙种植体材料1-(A4B)7的表面重复操作A五次,得到在牙种植体材料1-(A4B)7表面包覆5层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料1-B。其制备方法如下:
上述操作A均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作A中的相应的牙种植体材料为牙种植体材料1-A)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料),然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗-3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料),共进行33次重复操作A。
上述操作B均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作B中的相应的牙种植体材料为牙种植体材料1-A4)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料);将涂覆该有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-抗菌肽层复合层的材料),共进行7次重复操作B。
实施例2、制备牙种植体材料2及功能验证
一、制备牙种植体材料2-A
牙种植体材料2-A由钛片(基体)、涂覆于钛片表面的聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、涂覆于聚-L-赖氨酸层表面的硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)、涂覆于硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层表面的硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
其制备方法如下:
1、称取0.1155g多肽A,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为11.55mg/mL的多肽A溶液,备用。
2、称取0.05g碳二亚胺,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液,备用。
3、向步骤1制备的10mL浓度为11.55mg/mL的多肽A溶液中加入0.0055gN-羟基琥珀酰亚胺,将多肽A活化0.5h,获得活化后的多肽A溶液。
4、将步骤3的活化后的10mL多肽A溶液加入到30mLpH值为6,浓度为16.67mg/mL的氯化壳聚糖溶液中,继续搅拌30min,获得氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液。
5、将步骤将2制备的10mL浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液加入到步骤4的氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液中,获得碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液,将碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液机械搅拌6h,获得反应后的溶液;将反应后的溶液装入截留分子量为8000的透析袋中,在去离子水中透析48h,每隔6h换水一次,收集透析袋中的溶液,获得透析后的溶液。
6、将步骤5获得的透析后的溶液,在-70℃冷冻干燥,获得氯化壳聚糖-多肽A偶联物。
7、将钛片抛光后浸入浓度为1.4M的H3PO4溶液中,在60℃温度条件下浸泡6h,然后用去离子水冲洗3次,60℃真空干燥,获得磷酸处理后的钛片,备用。
8、将步骤7获得的磷酸处理后的钛片先置于pH值为7,浓度为2.0mg/mL的聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液(阳离子聚合物溶液)中浸泡30min,然后在双蒸水浸洗1min,最后在20-30℃自然干燥,获得表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料(涂覆有阳离子聚合物的材料),备用。
9、称取20mg步骤6获得的氯化壳聚糖-多肽A偶联物,将其溶解于10mL去离子水中,制备成氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液。该氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液由溶质和溶剂组成,溶质为氯化壳聚糖-多肽A偶联物,溶剂为水,氯化壳聚糖-多肽A偶联物在氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中的浓度为2mg/mL,氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液的pH值为6。
10、首先将步骤8制备的表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第一层阴离子多糖的材料);然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于步骤9制备的pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料。
11、首先将步骤10制备的涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第二层阴离子多糖的材料);将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有抗菌肽的材料,即为牙种植体材料2-A。
二、制备牙种植体材料2-B
牙种植体材料2-B由钛片(基体)、包覆在基体表面的1层聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、18层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)和4层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
牙种植体材料2-B是在步骤一制备的牙种植体材料2-A的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料2-A表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料2-A4,在牙种植体材料2-A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料2-A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料2-A4B;在牙种植体材料2-A4B的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料2-A4B表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料2-A4BA4,在牙种植体材料2-A4BA4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料2-A4BA4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料2-(A4B)2;在牙种植体材料2-(A4B)2的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料2-(A4B)2表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料2-(A4B)2A4,在牙种植体材料2-(A4B)2A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料2-(A4B)2A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料2-(A4B)3;在牙种植体材料2-(A4B)3的表面重复操作A五次,得到在牙种植体材料2-(A4B)3表面包覆5层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料2-B。
其制备方法如下:
上述操作A均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作A中的相应的牙种植体材料为牙种植体材料2-A)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料),然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料),共进行17次重复操作A。
上述操作B均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作B中的相应的牙种植体材料为牙种植体材料2-A4)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料);将涂覆该有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为0.5mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-抗菌肽层复合层的材料),共进行3次重复操作B。
三、制备牙种植体材料2-BCK
以牙种植体材料2-BCK为对照,牙种植体材料2-BCK由钛片(基体)、包覆在基体表面的1层聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、18层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面。
其制备方法如下:
1、称取0.1155g多肽A,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为11.55mg/mL的多肽A溶液,备用。
2、称取0.05g碳二亚胺,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液,备用。
3、向步骤1制备的10mL浓度为11.55mg/mL的多肽A溶液中加入0.0055gN-羟基琥珀酰亚胺,将多肽A活化0.5h,获得活化后的多肽A溶液。
4、将步骤3的活化后的10mL多肽A溶液加入到30mLpH值为6,浓度为16.67mg/mL的氯化壳聚糖溶液中,继续搅拌30min,获得氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液。
5、将步骤将2制备的10mL浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液加入到步骤4的氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液中,获得碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液,将碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液机械搅拌6h,获得反应后的溶液;将反应后的溶液装入截留分子量为8000的透析袋中,在去离子水中透析48h,每隔6h换水一次,收集透析袋中的溶液,获得透析后的溶液。
6、将步骤5获得的透析后的溶液,在-70℃冷冻干燥,获得氯化壳聚糖-多肽A偶联物。
7、将钛片抛光后浸入浓度为1.4M的H3PO4溶液中,在60℃温度条件下浸泡6h,然后用去离子水冲洗3次,60℃真空干燥,获得磷酸处理后的钛片,备用。
8、将步骤7获得的磷酸处理后的钛片先置于pH值为7,浓度为2.0mg/mL的聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液(阳离子聚合物溶液)中浸泡30min,然后在双蒸水浸洗1min,最后在20-30℃自然干燥,获得表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料(涂覆有阳离子聚合物的材料),备用。
9、称取20mg步骤6获得的氯化壳聚糖-多肽A偶联物,将其溶解于10mL去离子水中,制备成氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液。该氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液由溶质和溶剂组成,溶质为氯化壳聚糖-多肽A偶联物,溶剂为水,氯化壳聚糖-多肽A偶联物在氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中的浓度为2mg/mL,氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液的pH值为6。
10、首先将步骤8制备的表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第一层阴离子多糖的材料);然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于步骤9制备的pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料。
11、重复步骤10共17次,获得涂覆有18层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)的牙种植体材料,即为牙种植体材料2-BCK。
四、功能验证实验
1、牙种植体材料2-B对牙龈卟啉单胞菌P.g的抑制试验
将种植体周围炎症常见致病菌牙龈卟啉单胞菌P.g接种于CDC厌氧血琼脂培养基上传至第3代,经形态学鉴定为纯培养物。将纯的牙龈卟啉单胞菌P.g菌株接种于BHI液体培养基中,37℃厌氧条件下培养48h,得到牙龈卟啉单胞菌P.g菌液;将牙龈卟啉单胞菌P.g菌液稀释至牙龈卟啉单胞菌P.g含量为1×106cfu/mL的菌悬液。将未装载HBD-2的牙种植体材料2-BCK(对照组)和装载HBD-2的牙种植体材料2-B(实验组)两组牙种植体材料各3片置于灭菌湿润平皿中。分别取50μL牙龈卟啉单胞菌P.g含量为1×106cfu/mL的菌悬液滴加在试件表面,盖玻片覆盖,以使试验菌液散开而无溢出,厌氧培养箱中培养12h后向各平皿中加入5mLBHI液体培养基后漩涡振荡并加入无菌水进行10倍稀释,分别得到牙种植体材料2-BCK组的稀释液和牙种植体材料2-B组的稀释液。分别取100μL牙种植体材料2-BCK组的稀释液和牙种植体材料2-B组的稀释液在BHI平板上均匀推开,厌氧培养12h后平板计数。
抗菌率=(对照组菌落数-实验组菌落数)/对照组菌落数×100%。
结果如表1所示,经过12h厌氧培养后,牙种植体材料2-B对牙龈卟啉单胞菌P.g的抗菌率达到92.26%,说明牙种植体材料2-B对种植体周围炎的敏感菌有较好的抑制作用。
表1、材料表面菌落计数及抗菌率
2、Actin免疫荧光染色实验
成骨细胞的分离、培养:取鼠颅顶骨,种植于培养瓶,进行培养、传代和鉴定,获得成骨细胞的纯培养物。
将上述分离培养的纯成骨细胞接种于牙种植体材料2-B(改性组)和未涂层的牙种植体材料纯钛(对照组)表面,分别培养不同的时间段,通过细胞骨架蛋白(actin)的免疫荧光染色来观察细胞的粘附、铺展和形态。具体如下:分别将改性组和对照组的牙种植体材料放入24孔板中,每孔1片,设2个时间点(24h和3d),每组每个时间点设4孔。将第3代成骨细胞悬液接种于孔板中,每孔的细胞密度为1×104个/mL,每孔1mL,将培养板放入培养箱中继续培养。分别于接种后24h,3d进行如下处理:室温下用4%的多聚甲醛固定贴壁的成骨细胞30min,用PBS缓冲液漂洗3次洗去残留固定液,然后用0.3%TritonX-100溶液作用30min,37℃条件下用5%的山羊血清封闭半小时,加一抗4℃孵育过夜。一抗孵育结束,洗去多余一抗,加荧光二抗FITC-山羊抗兔IgG,室温条件下避光孵育2h。二抗孵育结束,洗去多余二抗,用PBS缓冲液漂洗,滴加50%缓冲甘油封片,最后荧光显微镜下观察。
结果如图1所示,相对于牙种植体材料纯钛(对照组),Actin免疫荧光染色表明牙种植体材料2-B(改性组)表面的细胞黏附更多,细胞骨架蛋白表达更多,更利于细胞的黏附和伸展。
3、成骨细胞增殖实验
将牙种植体材料纯钛(对照组)和牙种植体材料2-B(改性组)两组牙种植体材料置于24孔板中,每孔1片,设3个时间点(1d、4d和7d),每组每个时间点设4孔。将第3代成骨细胞悬液接种于孔板中,每孔的细胞密度为1×104个/mL,每孔1mL,培养板放入培养箱中继续培养。每隔三天换一次细胞培养液。
分别在接种的第1、4和7天进行MTT检测,即每次检测8孔(对照组4孔,改性组4孔)。具体方法为:采用PBS缓冲液洗涤后,每孔重新加入1mL新鲜培养基和40μL的MTT液,放入培养箱中继续培养4小时。孵育结束后,小心吸弃孔中液体,每孔加入420μL的二甲基亚砜(DMSO),培养箱中培养0.5小时,加样枪吹打使结晶物充分溶解,将24孔板内的液体转移至96孔板中,24孔板的1孔转移为96孔板的2孔,96孔板中的每孔200μL液体(严格保证量相等),用HTS7000plus多孔板高效分析仪在570nm波长处测其吸光光度值(OD值)并进行统计分析。
结果如图2所示,在成骨细胞接种的第4天和第7天,相对于牙种植体材料纯钛,牙种植体材料2-B(改性组)表面细胞增殖情况明显优于纯钛组,在成骨细胞接种的第7天,改性组的表面细胞增殖率是对照组的1.2倍,差异有统计学意义(P<0.05),说明具有更强的增殖活性。
上述结果表明,牙种植体材料2-B具有良好的生物相容性、抗凋亡和促血管生成活性,能够支持成骨细胞、软骨细胞的粘附、存活、生长与分化,促进血管内皮细胞的存活、增殖、迁移和形成毛细管样的管腔结构。同时该种植体能够抑制牙周常见致病菌的粘附和存活,具有持久、高效的杀菌能力,能够加速种植体周骨创的愈合并实现种植体-骨界面的化学结合,提高口腔种植的治疗效果,缩短治疗时间。
实施例3、制备牙种植体材料3
一、制备牙种植体材料3-A
牙种植体材料3-A由钛片(基体)、涂覆于钛片表面的聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、涂覆于聚-L-赖氨酸层表面的硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)、涂覆于硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层表面的硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
其制备方法如下:
1、称取0.0463g多肽A,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为4.63mg/mL的多肽A溶液,备用。
2、称取0.024g碳二亚胺,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为2.4mg/mL的碳二亚胺溶液,备用。
3、向步骤1制备的10mL浓度为4.63mg/mL的多肽A溶液中加入0.0055gN-羟基琥珀酰亚胺,将多肽A活化0.5h,获得活化后的多肽A溶液。
4、将步骤3的活化后的10mL多肽A溶液加入到30mLpH值为6,浓度为16.67mg/mL的氯化壳聚糖溶液中,继续搅拌30min,获得氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液。
5、将步骤将2制备的10mL浓度为2.4mg/mL的碳二亚胺溶液加入到步骤4的氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液中,获得碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液,将碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液机械搅拌6h,获得反应后的溶液;将反应后的溶液装入截留分子量为8000的透析袋中,在去离子水中透析48h,每隔6h换水一次,收集透析袋中的溶液,获得透析后的溶液。
6、将步骤5获得的透析后的溶液,在-70℃冷冻干燥,获得氯化壳聚糖-多肽A偶联物。
7、将钛片抛光后浸入浓度为1.4M的H3PO4溶液中,在60℃温度条件下浸泡4h,然后用去离子水冲洗3次,60℃真空干燥,获得磷酸处理后的钛片,备用。
8、将步骤7获得的磷酸处理后的钛片先置于pH值为7,浓度为2.0mg/mL的聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液(阳离子聚合物溶液)中浸泡30min,然后在双蒸水浸洗1min,最后在20-30℃自然干燥,获得表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料(涂覆有阳离子聚合物的材料),备用。
9、称取20mg步骤6获得的氯化壳聚糖-多肽A偶联物,将其溶解于10mL去离子水中,制备成氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液。该氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液由溶质和溶剂组成,溶质为氯化壳聚糖-多肽A偶联物,溶剂为水,氯化壳聚糖-多肽A偶联物在氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中的浓度为2mg/mL,氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液的pH值为6。
10、首先将步骤8制备的表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第一层阴离子多糖的材料);然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于步骤9制备的pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料。
11、首先将步骤10制备的涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第二层阴离子多糖的材料);将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为2mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有抗菌肽的材料,即为牙种植体材料3-A。
二、制备牙种植体材料3-B
牙种植体材料3-B由钛片(基体)、包覆在基体表面的1层聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、18层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)和4层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
牙种植体材料3-B是在步骤一制备的牙种植体材料3-A的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料3-A表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-A4,在牙种植体材料3-A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料3-A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-A4B;在牙种植体材料3-A4B的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料3-A4B表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-A4BA4,在牙种植体材料3-A4BA4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料3-A4BA4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-(A4B)2;在牙种植体材料3-(A4B)2的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料3(A4B)2表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-(A4B)2A4,在牙种植体材料3-(A4B)2A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料3-(A4B)2A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-(A4B)3;在牙种植体材料3-(A4B)3的表面重复操作A五次,得到在牙种植体材料3-(A4B)3表面包覆5层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料3-B。其制备方法如下:
上述操作A均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作A中的相应的牙种植体材料为牙种植体材料3-A)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料),然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料),共进行17次重复操作A。
上述操作B均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作B中的相应的牙种植体材料为为牙种植体材料3-A4)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料);将涂覆该有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为2mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-抗菌肽层复合层的材料),共进行3次重复操作B。
实施例4、制备牙种植体材料4
一、制备牙种植体材料4-A
牙种植体材料4-A由钛片(基体)、涂覆于钛片表面的聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、涂覆于聚-L-赖氨酸层表面的硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)、涂覆于硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层表面的硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
其制备方法如下:
1、称取0.2315g多肽A,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为23.15mg/mL的多肽A溶液,备用。
2、称取0.05g碳二亚胺,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液,备用。
3、向步骤1制备的10mL浓度为23.15mg/mL的多肽A溶液中加入0.0055gN-羟基琥珀酰亚胺,将多肽A活化0.5h,获得活化后的多肽A溶液。
4、将步骤3的活化后的10mL多肽A溶液加入到30mLpH值为6,浓度为16.67mg/mL的氯化壳聚糖溶液中,继续搅拌30min,获得氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液。
5、将步骤将2制备的10mL浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液加入到步骤4的氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液中,获得碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液,将碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液机械搅拌6h,获得反应后的溶液;将反应后的溶液装入截留分子量为8000的透析袋中,在去离子水中透析48h,每隔6h换水一次,收集透析袋中的溶液,获得透析后的溶液。
6、将步骤5获得的透析后的溶液,在-70℃冷冻干燥,获得氯化壳聚糖-多肽A偶联物。
7、将钛片抛光后浸入浓度为5M的NaOH溶液中,在60℃温度条件下浸泡12h,然后用去离子水冲洗3次,60℃真空干燥,获得NaOH处理后的钛片,备用。
8、将步骤7获得的NaOH处理后的钛片先置于pH值为7,浓度为2.0mg/mL的聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液(阳离子聚合物溶液)中浸泡30min,然后在双蒸水浸洗1min,最后在20-30℃自然干燥,获得表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料(涂覆有阳离子聚合物的材料),备用。
9、称取20mg步骤6获得的氯化壳聚糖-多肽A偶联物,将其溶解于10mL去离子水中,制备成氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液。该氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液由溶质和溶剂组成,溶质为氯化壳聚糖-多肽A偶联物,溶剂为水,氯化壳聚糖-多肽A偶联物在氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中的浓度为2mg/mL,氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液的pH值为6。
10、首先将步骤8制备的表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第一层阴离子多糖的材料);然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于步骤9制备的pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料。
11、首先将步骤10制备的涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第二层阴离子多糖的材料);将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为2mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有抗菌肽的材料,即为牙种植体材料4-A。
二、制备牙种植体材料4-B
牙种植体材料4-B由钛片(基体)、包覆在基体表面的1层聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、26层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)和6层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
牙种植体材料4-B是在步骤一制备的牙种植体材料4-A的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料4-A表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-A4,在牙种植体材料4-A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料4-A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-A4B;在牙种植体材料1-A4B的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料4-A4B表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-A4BA4,在牙种植体材料4-A4BA4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料4-A4BA4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-(A4B)2;在牙种植体材料4-(A4B)2的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料4-(A4B)2表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-(A4B)2A4,在牙种植体材料4-(A4B)2A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料4-(A4B)2A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-(A4B)3;在牙种植体材料4-(A4B)3的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料4-(A4B)3表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-(A4B)3A4,在牙种植体材料4-(A4B)3A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料4-(A4B)3A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-(A4B)4;在牙种植体材料4-(A4B)4的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料4-(A4B)4表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-(A4B)4A4,在牙种植体材料4-(A4B)4A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料4-(A4B)4A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-(A4B)5;在牙种植体材料4-(A4B)5的表面重复操作A五次,得到在牙种植体材料4-(A4B)5表面包覆5层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料4-B。其制备方法如下:
上述操作A均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作A中的相应的牙种植体材料为牙种植体材料4-A)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料),然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料),共进行25次重复操作A。
上述操作B均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作B中的相应的牙种植体材料为牙种植体材料4-A4)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料);将涂覆该有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为2mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-抗菌肽层复合层的材料),共进行5次重复操作B。
实施例5、制备牙种植体材料5
一、制备牙种植体材料5-A
牙种植体材料5-A由钛片(基体)、涂覆于钛片表面的聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、涂覆于聚-L-赖氨酸层表面的硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)、涂覆于硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层表面的硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
其制备方法如下:
1、称取0.1155g多肽A,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为11.55mg/mL的多肽A溶液,备用。
2、称取0.05g碳二亚胺,将其溶解于10mL超纯水中,制备成浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液,备用。
3、向步骤1制备的10mL浓度为11.55mg/mL的多肽A溶液中加入0.0055gN-羟基琥珀酰亚胺,将多肽A活化0.5h,获得活化后的多肽A溶液。
4、将步骤3的活化后的10mL多肽A溶液加入到30mLpH值为6,浓度为16.67mg/mL的氯化壳聚糖溶液中,继续搅拌30min,获得氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液。
5、将步骤将2制备的10mL浓度为5mg/mL的碳二亚胺溶液加入到步骤4的氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液中,获得碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液,将碳二亚胺溶液和氯化壳聚糖-多肽A的混合溶液机械搅拌6h,获得反应后的溶液;将反应后的溶液装入截留分子量为8000的透析袋中,在去离子水中透析48h,每隔6h换水一次,收集透析袋中的溶液,获得透析后的溶液。
6、将步骤5获得的透析后的溶液,在-70℃冷冻干燥,获得氯化壳聚糖-多肽A偶联物。
7、将钛片抛光后浸入浓度为5M的NaOH溶液中,在60℃温度条件下浸泡12h,然后用去离子水冲洗3次,60℃真空干燥,获得NaOH处理后的钛片,备用。
8、将步骤7获得的NaOH处理后的钛片先置于pH值为7,浓度为2.0mg/mL的聚-L-赖氨酸盐酸盐溶液(阳离子聚合物溶液)中浸泡30min,然后在双蒸水浸洗1min,最后在20-30℃自然干燥,获得表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料(涂覆有阳离子聚合物的材料),备用。
9、称取20mg步骤6获得的氯化壳聚糖-多肽A偶联物,将其溶解于10mL去离子水中,制备成氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液。该氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液由溶质和溶剂组成,溶质为氯化壳聚糖-多肽A偶联物,溶剂为水,氯化壳聚糖-多肽A偶联物在氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中的浓度为2mg/mL,氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液的pH值为6。
10、首先将步骤8制备的表面涂覆有聚-L-赖氨酸的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第一层阴离子多糖的材料);然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于步骤9制备的pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料。
11、首先将步骤10制备的涂覆有-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有第二层阴离子多糖的材料);将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为2mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有抗菌肽的材料,即为牙种植体材料5-A。
二、制备牙种植体材料5-B
牙种植体材料5-B由钛片(基体)、包覆在基体表面的1层聚-L-赖氨酸层(阳离子聚合物层)、34层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层(阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层)和8层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层(阴离子多糖层-抗菌肽层复合层)组成,硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由硫酸软骨素层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于硫酸软骨素层的表面;硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层由硫酸软骨素层和抗菌肽层组成,抗菌肽层位于硫酸软骨素层的表面。
牙种植体材料5-B是在步骤一制备的牙种植体材料5-A的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料5-A表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-A4,在牙种植体材料5-A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料5-A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-A4B;在牙种植体材料1-A4B的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料5-A4B表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-A4BA4,在牙种植体材料5-A4BA4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料5-A4BA4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)2;在牙种植体材料5-(A4B)2的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料5-(A4B)2表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)2A4,在牙种植体材料5-(A4B)2A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料5-(A4B)2A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)3;在牙种植体材料5-(A4B)3的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料5-(A4B)3表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)3A4,在牙种植体材料5-(A4B)3A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料5-(A4B)3A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)4;在牙种植体材料5-(A4B)4的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料5-(A4B)4表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)4A4,在牙种植体材料5-(A4B)4A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料5-(A4B)4A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)5;在牙种植体材料5-(A4B)5的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料5-(A4B)5表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)5A4,在牙种植体材料5-(A4B)5A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料5-(A4B)5A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)6;在牙种植体材料5-(A4B)6的表面重复操作A四次,得到在牙种植体材料5-(A4B)6表面包覆4层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)6A4,在牙种植体材料5-(A4B)6A4的表面进行操作B一次,得到在牙种植体材料5-(A4B)6A4表面包覆1层硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-(A4B)7;在牙种植体材料5-(A4B)7的表面重复操作A五次,得到在牙种植体材料5-(A4B)7表面包覆5层硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的牙种植体材料,将该牙种植体材料称为牙种植体材料5-B。其制备方法如下:
上述操作A均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作A中的相应的牙种植体材料为牙种植体材料5-A)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料),然后再将该涂覆有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为6,浓度为2mg/mL氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层的材料),共进行33次重复操作A。
上述操作B均为将相应的牙种植体材料(第一次重复操作B中的相应的牙种植体材料为牙种植体材料5-A4)在pH值为6,浓度为2mg/mL的硫酸软骨素硫酸钠盐溶液(阴离子多糖溶液)中浸泡15min,用去离子水冲洗3次后,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素的材料(涂覆有阴离子多糖的材料);将涂覆该有硫酸软骨素的材料浸泡于pH值为7,浓度为2mg/mL的抗菌肽溶液中15min,用去离子水冲洗3次,20-30℃自然干燥,获得涂覆有硫酸软骨素层-抗菌肽层复合层的材料(涂覆有阴离子多糖层-抗菌肽层复合层的材料),共进行7次重复操作B。
Claims (10)
1.牙种植体材料,其特征在于,所述牙种植体材料含有基体、阳离子聚合物层、复合层M和复合层N;所述复合层M为阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层,所述阴离子多糖层-氯化壳聚糖-多肽A偶联物层复合层由阴离子多糖层和氯化壳聚糖-多肽A偶联物层组成,所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物层位于所述阴离子多糖层的表面;所述复合层N为阴离子多糖层-抗菌肽层复合层,所述阴离子多糖层-抗菌肽层复合层由所述阴离子多糖层和抗菌肽层组成,所述抗菌肽层位于所述阴离子多糖层的表面;
所述阳离子聚合物层由阳离子聚合物制成;所述阴离子多糖层由阴离子多糖制成;所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物层由氯化壳聚糖-多肽A偶联物制成;所述抗菌肽层由抗菌肽制成。
2.根据权利要求1所述的牙种植体材料,其特征在于:所述基体为纯钛或钛合金;所述阳离子聚合物为聚-L-赖氨酸;所述阴离子多糖为硫酸软骨素、透明质酸、肝素和果胶中至少一种;所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物是以N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺为偶联剂将氯化壳聚糖和多肽A偶联得到的偶联物,所述多肽A是具有抗凋亡和促进血管生成活性的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的牙种植体材料,其特征在于:所述多肽A的氨基酸序列为SEQIDNo.1;所述抗菌肽的氨基酸序列为SEQIDNo.2。
4.根据权利要求1-3中任一所述的牙种植体材料,其特征在于:所述牙种植体材料为下述1)-4)中任一种:
1)所述牙种植体材料由所述基体、涂覆于所述基体表面的1层所述阳离子聚合物层、涂覆于1层所述阳离子聚合物层表面的1层所述复合层M和涂覆于1层所述复合层M表面的1层所述复合层N组成;
2)所述牙种植体材料由所述基体、包覆在所述基体表面的1层所述阳离子聚合物层、18-34层所述复合层M和4-8层所述复合层N组成;
3)所述牙种植体材料由所述基体、包覆在所述基体表面的1层所述阳离子聚合物层、18层所述复合层M和4层所述复合层N组成;
4)所述牙种植体材料由所述基体、涂覆于所述基体表面的1层所述阳离子聚合物层、涂覆于1层所述阳离子聚合物层表面的M1,涂覆于所述M1表面的N1,涂覆于所述N1表面的M4-1,涂覆于所述M4-1表面的N1-1,涂覆于所述N1-1表面的M4-2,涂覆于所述M4-2表面的N1-2,涂覆于所述N1-2表面的M4-3,涂覆于所述M4-3表面的N1-3,涂覆于所述N1-3表面的M5组成;所述M1为1层所述复合层M,所述N1为1层所述复合层N;所述N1-1、所述N1-2和所述N1-3均为1层所述复合层N;所述M4-1、所述M4-2和所述M4-3均为4层所述复合层M;所述M5为5层所述复合层M。
5.根据权利要求1-4中任一所述的牙种植体材料,其特征在于:所述牙种植体材料由权利要求6-9中任一所述方法制备。
6.权利要求1-4中任一所述的牙种植体材料的制备方法,包括在权利要求1-4中任一所述基体表面涂覆所述阳离子聚合物,获得涂覆有阳离子聚合物的材料;在所述涂覆有阳离子聚合物的材料表面涂覆所述阴离子多糖,获得涂覆有第一层阴离子多糖的材料;在所述涂覆有第一层阴离子多糖的材料表面涂覆所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物,获得涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料;在所述涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物的材料表面涂覆所述阴离子多糖,获得涂覆有第二层阴离子多糖的材料;在所述涂覆有第二层阴离子多糖的材料表面涂覆所述抗菌肽,获得涂覆有抗菌肽的材料,将该涂覆有抗菌肽的材料称为牙种植体材料1。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于:所述牙种植体材料的制备方法包括对所述牙种植体材料1重复操作A和/或B,所述操作A为在相应的牙种植体材料表面涂覆所述阴离子多糖得到所述阴离子多糖层,在所述阴离子多糖层表面涂覆所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物,得到所述复合层M;
所述操作B为在相应的牙种植体材料表面涂覆所述阴离子多糖得到所述阴离子多糖层,在所述阴离子多糖层表面涂覆所述抗菌肽,得到所述复合层N。
8.根据权利要求6或7所述的方法,其特征在于:涂覆所述阳离子聚合物在阳离子聚合物溶液中进行,所述阳离子聚合物溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为所述阳离子聚合物,所述溶剂为水,所述阳离子聚合物在所述阳离子聚合物溶液中的浓度为1.0-5.0mg/mL,所述阳离子聚合物溶液的pH值为6-7;
涂覆所述阴离子多糖在阴离子多糖溶液中进行,所述阴离子多糖溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为所述阴离子多糖,所述溶剂为水,所述阴离子多糖在所述阴离子多糖溶液中的浓度为0.1-5mg/mL,所述阴离子多糖溶液的pH值为6-7;
涂覆所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物在氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中进行,所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物,所述溶剂为水,所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物在所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中的浓度为1-10mg/mL,所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液的pH值为6-7;
涂覆所述抗菌肽在抗菌肽溶液中进行,所述抗菌肽溶液由溶质和溶剂组成,所述溶质为所述抗菌肽,所述溶剂为水,所述抗菌肽在所述抗菌肽溶液中的浓度为0.1-2mg/mL,所述抗菌肽溶液的pH值为6-7。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法,其特征在于:所述制备方法包括将所述基体置于所述阳离子聚合物溶液中浸泡30-90min,获得所述涂覆有阳离子聚合物的材料;将所述涂覆有阳离子聚合物的材料置于所述阴离子多糖溶液中浸泡5-30min,获得所述涂覆有第一层阴离子多糖的材料;将所述涂覆有第一层阴离子多糖的材料置于所述氯化壳聚糖-多肽A偶联物溶液中浸泡5-30min,获得涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料;将所述涂覆有氯化壳聚糖-多肽A偶联物层的材料置于所述阴离子多糖溶液中浸泡5-30min,获得涂覆有第二层阴离子多糖的材料;将所述涂覆有第二层阴离子多糖的材料置于所述抗菌肽溶液中浸泡5-30min,获得所述牙种植体材料1。
10.权利要求1-4中任一所述牙种植体材料,或,权利要求6-9中任一所述方法在制备口腔种植体中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20171208 Termination date: 20190930 |